Рослинний матеріал цукрового буряку, стійкий до імідазолінонового та сульфонілсечовинного гербіциду, спосіб надання рослинам буряку стійкості до гербіцидів та спосіб боротьби з бур’янами

Винахід стосується способу отримання цукрово-бурякових рослин (Beta vulgaris L.), стійких як до імідазолінонових, так і до сульфонілмочевинних гербіцидів, що використовуються для контроля бур'янів, зокрема, стосується цукрово-бурякових рослин, що походять від сприйнятливого цукрового буряка шляхом мутації генної кодуючої ацетолактатсинтази (ALS), відомої також як ацетогідроксикислотна синтаза (AMAS) з послідовним використанням гербицидів з клітинами у середовищі культури. У патентах США 5013659, 5141870 та 5378824 описано генетичну зміну ацетолактатсинтази у гені рекомбінантними засобами. Такий спосіб модифікування цукрово-бурякових рослин ілюстровано прикладом IV у патенті 5378824. Одержані результати були незадовільними щодо отримання рослин, стійких до гербіцидів. Saunders et al. (Crop Science 32:1357-1360, 1992) також описують отримання цукрово-бурякової рослини (CR1-B), стійкої до сульфонілмочевин, з сприйнятливого автофертильного клону (REL-1) селекцією клітин мутанта у культурі, що містить гербіциди. Були одержані і піддані перехресному схрещуванню різні резистантні рослини. Hart et al. (Weed Science 40378-383, 1992 and 41:317-324, 1993) описують подальші резистантні лінії і відзначають наявність резистантності, зумовленої зміною активності ALS і відсутність перехресної резистантності до інших гербіцидів, придушуючих ALS, а також кодування її одним напівдомінантним геном. Відсутні публікації, присв'ячені отриманню стійкості до імідазолінону модифікуванням ALS у цукровобурякових рослинах. У літературі не описано рослини, стійкої як до імідазолінонових, так і до сульфонілмочевинних гербіцидів. Різні лінії кукурудзи, стійкої до імідазолінону були створені і описані Newhouse et al. (Theoretical and Applied Genetics 83:65-70, 1991). Промисловий спосіб захисту культурних рослин полягає у використанні клінічних "захисників", описаних, наприклад, у Европатенті 375875. Цей спосіб передбачає внесення у грунт іншого хіміката. Бажаним способом є створення цукрово-бурякових рослин, стійких до імідазолінонових і сульфонілмочевинних гербіцидів. У основу винаходу покладено задачу створення способу створення стійкості як до імідазолінонових, так і до сульфонілмочевинних гербіцидів у цукрово-бурякових рослинах шляхом мутації генної кодуючої ацетолактатсинтази. Крім того, задачею винаходу є отримання цукрово-бурякових рослин, стійких до цих гербіцидів. Ці задачі і ознаки винахіду пояснюються більш детально у подальшому описі з посиланням на супроводжуючі креслення. Фіг.1 містить схему способу отримання цукрово-бурякових рослин, стійких до імідазолінонових і сульфонілмочевинних гербіцидів (93R30A або В), згідно з винаходом. R - резистентний, ІМ - імідазолінон, S - чутливий, SU - сульфонілмочевина, Sur -домінанта алелі ALS для SU-R, TP-R та IM-S, SB - домінанта алелі ALS для SU-R, ТР-R та IM-R, ТР - тріазолпіримідин. 93R3B - це SUR, IM-R та TP-R. 93R30 (не 93R30B) гомозиготна за алеллю Sur (SU-R, IM-S). Ці матеріали використовуються для створення стійкості до імідазолінону. Фіг.2 ілюструє послідовність операцій створення мутанта цукрово-бурякової рослини. Фіг.3 містить графік кількісного аналізу на ALS для 93R30B, стійкої до імазетапіру. Фіг.4 містить карту заміщень амінокислот, які спостерігались у трьох мутантів диких (wt) цукрових буряків (Sir-13, Sur та SB), і дані про відповідну стійкість до гебіцидів. Розглянуто тільки ті амінокислотні залишки, які, згідно з даними у літературі, зумовлюють стійкість до гербіцидів у рослинах. Однолітерними амінокислотними кодами є: А (аланін), С (пролін), W (триптофан), S (серин) і Ф (треонін). Литери у рамках позначають зміни у послідовності дикого типу. Фіг.5А-5Г містять фотографії, що ілюструють реакцію повної рослини цукрового буряка на обробку імазетапіром після проростання. Фіг.6А-6Г містять фотографії, що ілюструють реакцію повної рослини цукрового буряка на обробку АС299263 після проростання. Фіг.7 містить фотографію, що ілюструє реакцію ензима ALS на обробку імазетапіром in vitro. Фіг.8 містить фотографію, що ілюструє реакцію ензима ALS на обробку фуметсуламом in vitro. Фіг.9А-9Г містять фотографії, що ілюструють реакцію повної рослини цукрового буряка на обробку хлорсульфуроном після проростання. Фіг.10 містить фотографію, що ілюструє реакцію ензима ALS на обробку хлорсульфуроном in vitro. Винахід стосується цукрово-бурякового рослинного матеріалу, який містить клітини, що зазнали мутації внаслідок змін у кодуючій ацетолактатсинтазі і набули стійкості як до імідазолінонових, так і до сульфонілмочевинних гербіцидів, причому стійкість передається звичайним перехресним схрещуванням рослин, одержаних з клітин. Крім того, винахід стосується способу створення стійкості до гербіцидів у цукрово-буряковій рослині, який передбачає піддання дії імідазолінонового гербіцида перших клітин цукрового буряка, які мають гомозиготну резистантність до сульфонілмочевинного гербіцида, і селекцію других клітин, стійких до обох гербіцидів, причому ця резистантність може передаватись перехресним схрещуванням рослин, що містять другі клітини. Нарешті, винахід стосується способу надання стійкості до гербіцидів у цукрово-буряковій рослині, який передбачає піддання дії імідазолінонового гербіцида перших клітин цукрового буряка, які мають гомозиготну резистантність до сульфонілмочевинного гербіцида, у культурі, селекцію других клітин, стійких до обох гербіцидів, вирощування з других клітин першої рослини, стійкої до гербіцидів, і одержання схрещеної рослини, стійкої до цих гербіцидів, перехресним схрещуванням першої рослини з другою рослиною. Цукрово-бурякову рослину REL-1 (East Lansing-1), одержану у 1987p., можна придбати безкоштовно від Dr. Josef Saunders, Research Geneticist, US Department of Agriculture, East Lansing, Michigan. REL-1 чутлива (S) до імідазолінонових (IM-S), сульфонілмочевинних (SU-S) і тріазолпіримідинсульфонанілідних гербіцидів. З використанням затверділих і суспензійних культур була створена лінія, гетерозиготна відносно імідазолінону і стійка до сульфонілмочевини. Цю клітинну лінію (насіння) було депоновано у American Type Culture Collection як АТСС 97535 6.05.1996 згідно з Будапештською угодою. У цьому тексті цю лінію позначено 93R30B. Цю клітинну лінію можна одержати за вимогою з посиланням на ім'я та номер. Схрещуванням з елітними лініями цукрово-бурякових рослин, зокрема, з Beta vulgaris L., можна отримати резистантні рослини цукрового буряка, придатні для промислового використання. Використання цукрово-бурякових рослин, стійких до імідазолінонових, особливо імазетапірових, і сульфонілмочевинних (хлорсульфоронових) гербіцидів, дозволяє вирішити проблему, пов'язану з залишками гербіцидів у грунті на ділянках, де вирощуються цукрові буряки. Сьогодні ділянку для цукрових буряків після використання цих гербіцидів треба витримувати протягом 40 місяців. Крім того, висока стійкість до імідазолінону і сульфонілмочевини дозволяє використовувати імідазолінонові гербіциди для захисту цукрового буряка від бур'янів. Подальші приклади ілюструють відокремлення і вирощування нової цукрово-бурякової рослини 93R30B (Фіг.1). Приклад 1. 1. Селекція варіанту цукрового буряка 93R30B, стійкого до імідазолінону і сульфонілмочевини. Матеріал REL-1 (East Lansing-1) - чоловіча лінія цукрового буряка високої схожісті, використана для початкової селекції резистантного мутанта, стійкого до сульфонілмочевини, і для високочутливого контроля у більшості експериментів. CR1-B - цей ізолят цукрового буряка одержано висіванням клітин REL-1 у середовищі, що містить хлорсульфурон. Цей варіант стійкий до сульфонілмочевини, має деяку стійкість тріазолпіримідинового гербіцида, флуметсулама і не стійкий до імідазолінону. Його описано у Saunders et al. (Crop Sci. 32:1357-1360) і у Hart et al. (Weed Sci. 40:378-383, 41:317-324). Резистантний до SU ген позначено Sur. 93R30B - цей ізолят одержано висіванням гомозиготної за Sur цукрово-бурякової рослини (нащадка CR1B) з високою здатністю до регенерації у середовищі, що містить імазетапір. EL-49 (East Landing 49) - одержано у USDA є 1993р. Цю лінію цукрового буряка, гомозиготну за геном Sur, використовували для контроля чутливості до імазетапіру і стійкості до сульфонілмочевини. а) Рослини, призначені для використання як вихідний матеріал для сомаклональної селекції, обирались за їх здатністю утворювати калус у середовищі з високим вмістом цитокініна (середовищі В1) і проростати з калуса. Середовище В1 сахароза - 30г/л міоінозитол - 100мг/л NH4NO3 - 1,65г/л KNO3 - 1,90г/л СаСІ2×2Н2О - 0,44г/л MgSO4×7H2O - 0,37г/л КН2РО4 - 0,17г/л Н3ВО3 - 6,2мг/л MnSO4×H2O - 16,8мг/л ZnSO4×7H2O - 10,6мг/л КІ - 0,88мг/л Na2МoO4×2H2O - 0,25мг/л CuSO4×5H2O - 0,025мг/л СоСІ2×6Н2О - 0,025мг/л Na2ЕДТА - 37,3мг/л FeSO4×7H2O - 27,8мг/л NH4NO3 - 1,65мг/л тіамін - 1мг/л піридоксин - 0,5мг/л нікотинова кислота - 0,5мг/л бензиламінопурин - 1мг/л рН 5,95 Тверде середовище В1 витримували у автоклаві з 9г/л агарової культури рослини і модифікували стерилізованим фільтруванням концентрованим розчином гербіциду згідно з процедурою селекції. Агарове середовище вливали у одноразові пластмасові чашки Петрі (15´100мл). Аліквотними порціями 40мл рідке середовище В1 вливали у 125 мл-ві колби Ерленмейера і витримували у автоклаві для використання з рідкими суспендованими культурами. Для селекції стійкого до імідазолінону варіанту 93R30B як вихідний матеріал був використаний 93R30 (нащадок CR1-B, гомозиготний за Sur). Зокрема: 1. Клітини Rel-1 (SU-S, IM-S, TP-S) були внесені у культуру, де були піддані селекції за їх здатністю рости на хлорсульфуроні, після чого була регенерована рослина, CR1-B (описана Saunders et al., Crop Sci., 32:13571360, 1992). 2. CR1-B була схрещена з 293 (більш типовий буряк), після чого були ідентифіковані замозапилюючі F1рослини, гомозиготні відносно SU-R, IM-S, TP-R. Рослина EL-49, що відповідає цим ознакам, була отримана Сондерсом (ген був названий Sur і був гомозиготний за Sur). 3. Пізніше була здійснена селекція нащадків CR1-B, гомозиготних за Sur, за їх здатністю до регенерацій рослини з культури. У подальшому вони використовувались як вихідний матеріал (наприклад, 93R30) для селекції відносно імазетапіру у культурі. 4. Після цієї селекції були отримані ізоляти, відомі як 93R30A і 93R30B. Вони мали характеристики CR1-B + IM-R. Ген, що відповідає за IM-R, виникає у вигляді зміненої форми Sur, і його було названо SB. Експлантати листяних дисків були приготовлені з швидко зростаючого листя вихідної рослини (93R30). Поверхню листя стерилізували (крок 1) двома послідовними 20-хвилинними обробками 15%-им комерційним відбілювачем з 0,025%-им Triton Х-100 (Т-9280, Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo) з подальшим двократним промиванням стерильною деіонізованою водою. Диски з листя вирізали за допомогою коркового бура, стерилізованого полум'ям. Листяні диски були асептично розміщені на твердому середовищі В1 (крок 2) і інкубовані у темряві при 30°С протягом 3-4 тижнів до появи з диска пухкої білої тканини калуса. Цю тканину відділяли механічно пінцетом і переносили у 125 мл-ві колби Ерленмейера (крок 3), що містили 40мл рідкого середовища В1. Колби розміщували у гірошейкер робочої частоти 50Гц і витримували під слабким флюоресцентним освітленням (30мкЕ/м2с). Через 1 тиждень рідкі культури субкультурували свіжим середовищем В1. Через два тижні після ініціювання рідкої культури грудки клітин відокремлювали за допомогою клітинного дисоціативного сита (Sigma CD-1, 60 меш). Після седиментації клітин клітин приблизно дві третини рідкого середовища було видалено, після чого клітини були ресуспендовані (крок 4) у залишку середовища і на твердому середовищі В1 були рівномірно розсіяні 1 мл-ві аліквотні проби разом з 50нМ імазетапірового гербіциду (PURSUIT, American Cyanamid, Waine, NJ). Чашки були обгорнуті і інкубовані у неяскравому флюоресцентному світлі (5-10мкЕ/м2с) протягом 8-12 тижнів. в. При 50нМ-ій концентрації імазетапіру усі чутливі клітини загинули. Грудки клітин, що залишились живими при цій концентрації, були відзначені як можливі резистентні варіанти. Ці грудки (діаметром 1-3мм) були перенесені (крок 5) у тверде безгербіцидне середовище і залишені рости під слабким освітленням (1020мкЕ/м2с). Кожний з можливих резистантних варіантів ідентифікували і доглядали індивідуально. г. Білий пухкий калус розділяли кожні 4-6 тижнів і тримали у свіжому твердому середовищі В1, до виростання з калуса окремих пагінців. Ці пагінці були перенесені у середовище М20 для догляду за ними. Середовище М20 сахароза - 30г/л міоінозитол - 100мг/л NH4NO3 - 1,65г/л KNO3 - 1,90г/л CaCl2×2H2O - 0,44г/л MgSO4×7H2O - 0,37г/л KH2PO4 - 0,17г/л Н3ВО3 - 6,2мг/л MnSO4×H2O - 16,8мг/л ZnSO4×7H2O - 10,6мг/л Kl - 0,88мг/л Na2MoO4×2H2O - 0,25мг/л CuSO4×5H2O - 0,025мг/л CoCl2×6H2O - 0,025мг/л Na2ЕДТА - 37,3мг/л FeSO4×7H2O - 27,8мг/л NH4NO3 - 1,65мг/л тіамін - 1мг/л піридоксин - 0,5мг/л нікотинова кислота - 0,5мг/л бензиламінопурин - 1мг/л рН 5,95 Тверде середовище М20 витримували у автоклаві з 9г/л агарової культури рослини і модифікували стерилізованим фільтруванням концентрованим розчином гербіциду згідно з процедурою селекції. Агарове середовище вливали у одноразові пластмасові чашки Петрі (20´100мл). Культури пагінців були під доглядом під флюоресцентним освітленням (10-20мкЕ/м2с), і їх розповсюджували розсіченням культур скальпелем. Культури-кандидати розповсюджували і оцінювали за рівнем резистантності, як це описано далі. 2. Рівень стійкості культури пагінців до імідазолінону, сульфонілмочевини і тріазолпіримідинсульфонаніліду. Оцінювання гербіцидної резистантнрості проводилось розміщенням трьох малих відрізків пагінця відповідної довжини у чашки з середовищем М20 з доданням імідазолінонового гербіцида, сульфонілмочевини або тріазолпіримідинсульфонаніліду у логарифмічно зростаючої концентрації у межах від 1нМ до 0,1мМ. Реакцію культури 93R30 порівнювали з реакцією культур пагінців контрольної чутливої групи (Rel-1) і контрольної групи стійкої до хлорсульфурону і чутливою до імідазолінону (EL-49). Пагінцеві культури витримувались при освітленні 20мкЕ/м2с протягом 3 тижнів. Реакцію пагінців визначали кількісним оцінюванням пошкоджень і маси (свіжої) через три тижні після перенесення у селекційне середовище. Резистантність до гербіцида (R/S) визначали як відношення значень І50 для резистантних рослин до I50 для чутливих (І50 - концентрація гербіцида, що викликає пошкодження 50% зразків). Комплексні характеристики резистантності кожного з варіантів визначались у спосіб, описаний вище, але з заміною гербіцидів, що уводились у середовище. У пагінцевій культурі 93R30B було виявлено 3600-кратний рівень стійкості до імазетапірового, 10000-кратний рівень стійкості до хлорсульфоронового і 60-кратний рівень стійкості до тріазолпіримідинсульфонанілідового (флуметсулам) гербіцидів (табл.1). Порівняно з цим EL-49 виявив тільки 3-кратний рівень стійкості до імазетапіру. Таблиця 1 Кількісні оцінки резистантності і комплексної резистантності пагінцевої культури. Гербіцид Имазетапір Имазаметабензметил Имазакін АС2992631 Хлорсульфурон2 Флуметсулам3 Родина гербіцида6 ІМ ІМ ІМ ІМ SU ТР Rel-1 І505(мкМ) 0,018 0,80 0,040 0,030 0,0025 0,028 93R30B І50(мкМ) 64 >100 16 40 25 1,7 R/S4 3600х >125х 400х 1400х 10000х 60х EL-49 І50(мкМ) 0,053 20 0,040 0,070 25 1,1 R/S 3х 25х 1х 3х 10000х 40х 1 - Імідазолінон RAPTOR (American Cyanamid, Waine, NJ) 2 - Сульфонмочевина (Dupont, Wilmington, DE) 3 - Тріазолпіримідинсульфонанілід (BROADSTRIKE, Dow Elanco, Indianapolis, IN) 4 - відношення значень I50 для резистантних рослин до I50 для чутливих 5 - концентрація гербіцида, що викликає пошкодження 50% пагінцевої культури 6 Класифікація гербіцидів: ІМ імідазолінон, SU сульфонілмочевина, ТР тріазолпіримідинсульфонанілід 3. Регенерація і розведення рослини На кроці 8 пагінцеві культури 93R30B регенерують до повних рослин. Через два тижні після пагінцевої субкультури пагінці 93R30B для розвитку коріння були перенесені у 125 мл-ві колби Ерленмейера, які містили 40мл середовища N3. Середовище N3 сахароза - 30г/л міоінозитол - 100мг/л NH4NO3 - 1,65г/л KNO3 - 1,90г/л СаСІ2×2Н2О - 0,44г/л MgSO4×7H2O - 0,37г/л КН2РО4 - 0,17г/л Н3ВО3 - 6,2мг/л MnSO4×H2O - 16,8мг/л ZnSO4×7H2O-10,6мг/л КІ - 0,88мг/л Na2MoO4×2H2O - 0,25мг/л CuSO4×5H2O - 0,025мг/л CoCI2×6H2O - 0,025мг/л Na2ЕДТА - 37,3мг/л FeSO4×7H2O - 27,8мг/л NH4NO3 - 1,65мг/л тіамін - 1мг/л піридоксин - 0,5мг/л нікотинова кислота - 0,5мг/л нафтилоцтова кислота - 3мг/л рН 5,95 У 125 мл-ві колби Ерленмейера порціями 40мл додавали середовище N3 і 0,45г агару (конц, 9г/л) і витримували у автоклаві, щоб потім використати для розвитку коріння у пагінцевих культурах. Культури потім на 24год. кожного дня переносили під світло середньої інтенсивності (40-60мкЕ/м2с) при температурі 25°С. Формування коріння звичайно відбувалось через 6-8 тижнів. Пагінці з корінням (генерація R0) потім переносили (крок 9) у горщикову суміш (Michigan Peat Co., Houston, TX) у теплиці. Після цього рослини R0 регенератів 93SR30B схрещували з гладкокорінним цукровим буряком 293 або з REL-1. Насіння F1 цих гібридів були піддані самозаплідненню і було одержане насіння F2. Вважалось, що стійкість до імідазолінону зумовлюється домінантним або напівдомінантним моногеном. Рослини генерації F2, одержані самозаплідненням стійких до імідазолінону і сульфонімочевини рослин F1, мають розщеплюватись у пропорції “гомозиготні резистантні:гетерозиготні резистантні:гомозиготні чутливі =1:2:1” як для стійких до імідазолінону, так і для стійких до сульфонілмочевини. Є свідоцтва домінантності резистантності у 93R30B, які можна бачити у нащадків схрещення між 93R30B і чутливим до гербіцида цукровим буряком чоловічих ліній 203 або Rel-1, які розщеплюються у пропорції 1:1 для IM-R і IM-S. Подібним чином для усіх рослин F2 або Backcross (ВС1), що були піддані тестуванню, IM-R і IM-S розщеплювались разом. Це дозволяє зробити висновок, що ці резистантності пов'язані і є результатом окремих змін у одній алелі ALS. Резистантність або чутливість рослин F1 до імазетапіру і хлорсульфурону визначались за допомогою непошкоджуючого кількісного аналізу розростання листяних дисків. Протокол аналізу Аналіз являє собою неруйнуючий тест, призначений для раннього визначення розділення буряків відносно стійкості або сприйнятності до гербіцидів без обприскування буряків після сходження у теплиці. 1. Лист, що щойно розгорнувся (щонайменше 4-й справжній), зрізали. 2. Стерилізували поверхню листа, двічі обробляючи 15%-им комерційним відбілювачем з 0,025%-им Triton X-100 протягом 20хвил. з подальшим двократним промиванням стерильною дистильованою водою. 3. Корковим буром, стерилізованим полум'ям, були вирізані листяні диски. 4. Листяні диски були перенесені у безгербіцидне середовище В1 з 100нМ імазетапіру або 100нМ хлорсульфурону. Чашки були розділени на 4 секції кожна і, таким чином, можна було проводити тест для чотирьох зразків у одній чашці. До кожного зразка у кожній чашці було додано 4-5 листяних дисків. 5. Чашки були обгорнуті і інкубувались протягом 4-7 днів при слабкому освітленні (приблизно 10мкЕ/м2с). 6. Резистантні зразки ідентифікувались за життєздатністю і розростанням у селекційному середовищі. Чутливі зразки не розростаються і набирають забарвлення від жовтого до коричневого. Для точного визначення розростання проводилось порівняння з листяними дисками, поміщеними у безгербіцидне середовище. 4. Реакція ензима ALS на дію імазетапіру. Для часткового очищення ALS від швидко розвиненого листя цукрово-бурякових рослин, вирощених у теплиці, були використані стандартні процедури (Hart et al., Weed Science, 40:378-383, 1992). Екстракти з гетерозиготних F1-рослин 93R390B і S1-насіння Rel-1 були піддані кількісному аналізу для визначення активності ALS у присутності логарифмічно зростаючої концентрації імазетапіру. Активність ALS визначали у екстрактах з листя цукрових буряків ліній 93R390B і Rel-1. Рослини вирощувались у теплиці, як це описано вище, до стадії 4-6-го листа. Активність ALS визначали у свіжих екстрактах у присутності імазетапіру і хлорсульфурону у логарифмічно зростаючих концентраціях. Способи і процедури були модифіковані порівняно з описаними у Ray (Plant Physiol., 75:827-831, 1984) і Shaner et al. (Plant Physiol., 76:545-546, 1984). 10г листя цукрового буряка гомогенізували у 40мл холодного гомогенізаційного буфера (0,1М К2НРO4, рН 7,5, 1мМ пірувата натрію, 0,5мМ МgСІ2, 0,5мМ тіамінпірофосфату, 10мкМ флавінаденіндинуклеотиду, 10% (обє'мних) гліцеролу) з 2,5г полівінілполіпіролідону. Гомогенат фільтрували через 8 шарів тонкої бавовняної тканини і центрифугували при 27000g протягом 20хвил. Верхній шар зняли і довели до 50%-го насичення доданням (NH4)2SO4. Розчин витримували при 0°С протягом 1год., після чого центрифугували при 18000g протягом 15хвил., гранули знову розчиняли у 1мл суспендуючого буфера (0,1М К2НРО4, рН 7,5, 20мМ пірувата натрію, 0,5мМ МgCl2) і опріснювали на колонці Sephadex G-25 PD-105. Екстракти ензима були піддані кількісному аналізу негайно. Активність ALS виміряли доданням 0,2мл препарату ензима (розрідженого до концентрації 1:3 суспензійним буфером) до 1,3мл реакційного буфера (25мМ К2НР04, рН 7,0, 0,625мМ МgСІ2, 25мМ пірувата натрію, 0,625мМ тіамінпірофосфату, 1,25мк флавінаденіндинуклеотиду) і інкубували при 35°С протягом 1год. Реакційні суміші мали фінальні концентрації 0, 4, 40, 400, 4000, 40000, 400000 або 4000000нМ імазетапіру або 0, 0,9, 9, 90, 900, 9000, 90000нМ хлорсульфурону. Реакцію зупиняли доданням 50мкл 6Н H2SO4 і інкубуванням при 60°С протягом 15хвил. Цією процедурою (див. Westerfield, J. Biol. Chem., 16:495-502, 1945) можна також видаляти з ензимного ALS-продукта (ацетолактата) карбоксилати, одержуючи ацетоїн. Кольоровий ацетоїновий комплекс був зформований доданням 1мл 2,5%-го (за масою) a-нафтолу і 0,25%го (за масою) креатину у 2,5 N NaOH з подальшим інкубуванням при 60°С протягом 15хвил. Як стандарт для колориметричної реакції був використаний комерційний ацетоїн. Концентрації ацетоїну визначались вимірюванням абсорбції реакційною сумішшю при 530нм. Експерименти з кожним гербіцидом були повторені з трьома реплікаціями. Концентрацію протеїну визначали способом, описаним у Bradford (Anal. Biochem., 72:248-254, 1976), з використанням альбуміну бичачої сироватки для стандартної кривої. Експерименти виконували двічі і тричі повторювали обробку. На Фіг.3 наведено реакцію екстрактів ALS з 93R30B і чутливої Rel-1. У 93R30B було виявлено 1750-кратну резистентність до імазетапіру на рівні ензима (за відношенням І50 для резистантної і чутливої ліній). 5. Кількість копій гену ALS Для визначення кількості копій гену ALS у чутливому цукровому буряку був проведений аналіз з використанням електрофорезної процедури для ДНК. Геномну ДНК ізолювали від чутливих рослин F3 нащадків мутанта первісної Sir-13 і аналізували, застосовуючи загальноприйняту процедуру (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New york, 1991) . Подібним чином був підданий аналізу комерційний сорт цукрового буряка. У обох лініях цукрового буряка був виявлений тільки один екземпляр геномної ДНК. Це може вказувати на те, що уся ензимна активність ALS у гомозиготному мутанті цукрового буряка зумовлюється резистантною формою ензима. Це підтверджує також припущення, що зміна SB у ізоляті 93R30B являє собою зміну у алелі ALS Sur. Далі наведено підтвердження цього. 6. Мутація гена ALS Для виявлення молекулярної основи стійкості ALS до ензима була використана стандартна процедура секвенування двох ділянок гена ALS, де мали місце усі раніше виявлені мутації, що сприяли стійкості до гербіцидів (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York, 1991). Ген ALS цукрового буряка був раніше секвенований (патент США 5378824) і були створені праймери ланцюгової реакції полімерази для підсилення двох ділянок гена, відповідальних за раніше виявлені випадки стійкості рослини до гербіцидів. Порівняння даних секвенування для SU-R IM-S TP-R (Sur), SU-R IM-R TP-R (SB) і чутливих цукрових буряків вказує на те, що гербіцидну резистентність 93R30B зумовлюють дві незалежні мутації гена ALS. Мутація, що викликає SU-R IM-S TP-R (Sur), є результатом єдиної зміни нуклеотида з цитозина на тимін у позиції 562 нуклеотидної послідовності, що призводить до заміни серина проліном у позиції 188 амінокислотної послідовності у ALS цукрового буряка. Раніше вже був виявлений вплив цього сайта на стійкість до сульфонілмочевини у Arabidopsis thaliana (Haughn et al., Molecular and General Genetics, 211:266271, 1988), у тютюні (Lee et al., EMBO J., 7:1241-1248, 1988) і у дріжджах (патент США 5378824). Дослідження не виявили ніяких інших базових змін у нуклеотидних послідовностях дикого типу у цих двох ділянках гена ALS. Мутація, що викликає SU-R IM-S TP-R (SB), є результатом двох незалежних мутацій у нуклеотидній послідовності ALS, які викликають зміни у двох різних амінокислотах. Перша з змін подібна до описаної вище мутації Sur. Цього можна було очікувати, оскільки як вихідна для селекції за IM-R використовувалась цукровобурякова рослина 93R30. Окрім цієї точкової мутації, була виявлена одиночна заміна гуніна аденіном у позиції 337. Ця друга мутація викликає заміну треоніна аланіном у позиції 113 амінокислотної послідовності ALS цукрового буряка. Раніше вже був виявлений вплив цього сайта на стійкість до імідазолінону у дурнишнику (Bernasconi et al., J. Biol. Chem., 270:17381-17385, 1995), і стійкість до сульфонілмочевини у дріжджах (патент США 5378824). Дослідження не виявили ніяких інших базових змін у нуклеотидних послідовностях дикого типу у цих двох ділянках гена ALS. Далі наведено дані про синергізм гербіцидної резистантності, пов'язаний з можливими мутаціями Ala113 ®Thr і Рro118 ®Ser. Подвійна мутація гена ALS цукрового буряка SB забезпечує гербіцидну резистантність до комбінації хімічних родин, притаманну кожному з одиночних мутантів цукрового буряка (тобто Sur і Sir-13). На Фіг.4 зображено базову сукупність характеристик перехресної резистантності двох одиночних мутантів (Sur і Sir-13) і подвійного мутанта (SB). Амінокислоти, зображені на Фіг.4, репрезентують 5 строго збережених залишків, які, як це відзначено у літературі, пов'язані з гербіцидною резистантністю, що придушує ALS у рослинах. Взаємодія незалежних мутацій у подвійному мутанті ензима (і відповідних рослин) є унікальною. Сполучення стійкості до lМ, пов'язаної з підстановкою амінокислот АІа113 ®Thr у Sir-13, з стійкістю до SU і ТР, пов'язаною з підстановкою Рro118 ®Ser, дає цукровий буряк 93R30B (інакше кажучи, SB), стійкий до усіх трьох хімічних класів гербіцидів. Резистантності, однак, не є адитивними, але мутації виявляють синергічність відносно стійкості до імідазолінонових гербіцидів імазетапіру і АС 299263. Це явище ілюстровано на Фіг.5, 6 і кількісно характеризується табл. 2. Таблиця 2 Повна реакція цукрового буряка на гербіциди, що придушують ALS. Гербіцид імазетапір АС 299263 Хлорсульфурон Сульфометурон Клас ІМІ ІМІ SU SU Rel-1 І50 (г/га) 0,5 1,1 0,07 0,2 Линія цукрового буряка Sir-13 Sur R/S R/S 100х 3х 130х 4х 1х >1000х 1х 23х 93R30B R/S 300х 250х 20х 4х Цукрові буряки Sur і Sir-13 з одиночними мутаціями виявляють 3- і 100-кратну стійкість до імазетапіру в той час, як подвійний мутант SB має 300-кратну стійкість до гербіциду, внесеного після повного сходження рослин. Такий синергізм зумовлюється реакцією ензима ALS від кожного з мутантів на імазетапір (Фіг.7). Синергічна резистентність до гербіциду у подвійному мутанті SB складає більше 1000х проти резистентності одиночних мутантів Sur (1х) і Sir-13 (40х). Схожий синергізм існує відносно гербіцидів класу ТР. Стійкість пагінців одиночних мутантів Sur і Sir-13 складає, відповідно, 40х і 1х, а для подвійного мутанта - 60х. Це спостереження підтверджується даними щодо ензима ALS, а саме, тим, що одиночні мутанти Sur і Sir-13 мали стійкість до флуметсаму, відповідно, 50х і 3х, a подвійний мутант SB - 200х (Фіг.8). Друга мутація у SB фактично зменшує стійкість до хлорсульфурону (гербіцида класу SU) повних рослин (20х) більш, як у 50 разів, що є наслідком мутації АІа113 ®Thr резистантного до SU гена Sur (> 1000х), яка має місце у Sir-13 (Фіг.9, табл.2). Причина антагонізму між одиночним мутантом Sur і подвійним мутантом SB невідома. Для хлорсульфурона також спостерігалась синергічна стійкість на рівні ензима ALS. Зрозуміло, що спочатку треба проводити селекцію на стійкість до імілозолінону, а потім до сульфонілмочевини. Наведений опис лише ілюструє винахід, об'єм якого визначено Формулою. Амінокислотні послідовності Фіг.4 відповідають послідовностям 1, 2, 3, 4. додаток 1 (1) Загальна інформація (і) Заявник: Дональд Пеннер, Тері Р. Райт (іі) Назва винаходу: рослини цукрового буряка, стійкі до імідазолінового гербіциду (ііі) Кількість послідовностей: 4 (iv) Адреса для кореспонденції: (А) Адресат: Іан К. Маклеод (Б) Вулиця: 2190 Комонс Паркуей (В) Місто: Окимос (Г) Штат: Мічиган (Д) Країна: США (Є) Зональний номер: 48864 (V) Дані для комп'ютера: (А) Тип носія: дискета 5,25дюймів, 360кб (Б) Комп'ютер: Сумісний з ІБМ (В) Операційна система: МС-ДОС (Г) Програмне забезпечення: WordPerfect 5.1 (vi) Дані заявки: (А) Номер заявки: (Б) Дата подання: (В) Класифікація: (vii) дані попередньої заявки: (А) Номер заявки: 08/683 533 (Б) Дата подання: 17.07.1996 (viii) Інформація про повіреного/агента: (А) Ім'я: Іан К. Маклеод (Б) Реєстраційний номер: 20 931 (В) номер для посилань: MSU 4.1-344 (іх) Інформація для телекомунікаційного зв'язку: (А) Телефон: (517) 347-4100 (Б) Факс: (517) 347-4103 (В) Телекс: Відсутній (2) Інформація про послідовність No. 1: (і) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 5 (Б) Тип: Амінокислота (В) Нитки: Одиночна (В) Топологія: Лінійна (іі) Тип молекули: (А) Опис: Пептид (ііі) Гіпотези: Відсутні (iv) Комплементарна нитка: Відсутня (vi) Первісне джерело: (А) Організм: Цукровий буряк (Б) Штам: wt (В) Індивідуальний ізолят: (Г) Тип клітини: (іх) Особливості: (А) Ім'я/ключ: (Б) Місце: (В) Спосіб ідентифікування: Послідовностями (Г) Інша інформація: (іх) Опис послідовності: Послідовність No. 1: Аla Рro Аla Тrp Ser (3) Інформація про послідовність No. 2: (і) Характеристики послідовності: (А) довжина: 5 (Б) Тип: амінокислота (В) Нитки: Одиночна (В) Топологія: Лінійна (іі) Тип молекули: (А) Опис: Пептид (ііі) Гіпотези: Відсутні (iv) Комплементарна нитка: Відсутня (vi) Первісне джерело: (А) Організм: Цукровий буряк (Б) Штам: Sir-13 (В) Індивідуальний ізолят: (Г) Тип клітини: (іх) Особливості: (А) Ім'я/ключ: (Б) Місце: (В) Спосіб ідентифікування: Послідовностями (Г) Інша інформація: (іх) Опис послідовності: Послідовність No. 3: Тhr Рro Аla Тrp Ser (4) Інформація про послідовність No. 3: (і) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 5 (Б) Тип: Амінокислота (В) Нитки: Одиночна (В) Топологія: Лінійна (іі) Тип молекули: (А) Опис: Пептид (ііі) Гіпотези: Відсутні (iv) Комплементарна нитка: Відсутня (vi) Первісне джерело: (А) Організм: цукровий буряк (Б) Штам: Sur (В) Індивідуальний ізолят: (Г) Тип клітини: (іх) Особливості: (А) Ім'я/ключ: (Б) Місце: (В) Спосіб ідентифікування: Послідовностями (Г) Інша інформація: (іх) Опис послідовності: Послідовність No. 3: Аla Ser Ala Trp Ser (4) Інформація про послідовність No. 4: (і) Характеристики послідовності: (А) довжина: 5 (Б) Тип: Амінокислота (В) Нитки: Одиночна (В) Топологія: Лінійна (іі) Тип молекули: (А) Опис: Пептид (ііі) Гіпотези: Відсутні (iv) Комплементарна нитка: Відсутня (vi) Первісне джерело: (А) Організм: Цукровий буряк (Б) Штам: 93R30B (В) Індивідуальний ізолят: (Г) Тип клітини: (іх) Особливості: (А) Ім'я/ключ: (Б) Місце: (В) спосіб ідентифікування: послідовностями (Г) Інша інформація: (іх) Опис послідовності: Послідовність No. 4: Thr Ser Ala Trp Ser