Спосіб одержання біомаси водорості desmodesmus magnus (meyen) p. tsarenko

Реферат: Спосіб одержання біомаси як сировини для біопалива, заснований на використанні зелених сценодесмусових водоростей, включає приготування інокуляту продуценту з послідовним вирощуванням посівного матеріалу на агаризованому середовищі з органічними добавками, внесенням його у рідке мінеральне середовище для адаптування суспензії та вирощування за умов інтенсивного культивування на вищезазначеному середовищі з оптимальною (200 мг/л) концентрацією нітратного азоту. Як продуцент використовується новий вид культивованої водорості Desmodesmus magnus (Meyen) P. Tsarenko, близький за продуктивністю до видів роду Scenedesmus, але резистентний до паразитів водоростей, високої концентрації нітратів і має здатність до накопичення нітритів (що є попередниками канцерогенів) у середовищі на порядок (10 разів) менше, ніж представники роду Scenedesmus і Acutodesmus. UA 80004 U (12) UA 80004 U UA 80004 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель має відношення до біотехнології, може бути використаний у виробництві біопалива, зокрема біодизеля, фармацевтичній промисловості для розробки біологічно активних добавок, сільському господарстві для збагачення кормів білком та вітамінами, і стосується одержання біомаси водоростей, що містять ліпіди, омега-3 жирні кислоти, бетакаротин та інші біологічно активні речовини. Відомі способи отримання біомаси представників роду Scenedesmus (=Acutodesmus) як сировини для харчової та фармацевтичної промисловості, тваринництва, аквакультури тощо (Музафаров A.M., Таубаев Т.Т. Культивирование и применение микроводорослей. - Ташкент: ФАН, 1984.-136 с; Borowitzka М.Ф., Borowitzka L.I. Micro-algal biotechnology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1988; Becker E.W. Microalgae. Biotechnology and Microbiology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1994.-293 pp.; Урмыч E.H., Бердыкулов Х.А., Эшпулатова М.Б. Продуктивность микроводорослей в интенсивных условиях культивирования // Альгология.-2008.-18, № 3. - С. 347-352). Авторами проведена робота з визначення оптимальних умов культивування водоростей у промислових масштабах. Для нарощування біомаси використовували як синтетичні, так і комплексні середовища з різними джерелами вуглецевого та азотного живлення, на яких кількість сухої біомаси Scenedesmus obliquus в інтенсивній культурі становила 0,3-0,7 г/л за добу на середовищі з нітратним азотом та 1-2 г/л за добу - з амонійним азотом. Особлива увага приділялась визначенню впливу на ріст та накопиченню біомаси різних абіотичних факторів (температури, інтенсивності світла, аерації, кислотності середовища, його хімічного складу тощо). Однак вплив біотичних факторів досліджено значно менше. Відомий спосіб отримання біомаси водорості Scenedesmus producto-capitatus (Пат. 2011/0076749 А1, США, Microalgae with high-efficient ability to remove carbon dioxide and use thereof/ Kim M.K., Han M.S., Jin E.S., Lee C. - G. - № 12/993,447, C12N 1/12, C02F 3/34; заяв. 22.05.2008; опубл. 31.03.2011-7 с). Цей вид водоростей, що зазвичай використовується для отримання біомаси як сировини для косметичної промисловості та аквакультури, характеризувався великою швидкістю фіксації діоксиду вуглецю за умов інтенсивного культивування, резистентністю до високої концентрації сульфітів та нітратів у живильному середовищі та значним накопиченням біомаси. Відомий спосіб отримання біомаси водоростей як сировини для біопалива з використанням змішаної культури Scenedesmus bijuga, Chlamydomonas globosa, Chlorella minutissima на промислових стоках з високим вмістом органічної речовини, нітратним та амонійним азотом (Пат. 2012/0028338 А1, США, Mixotrophic algae for the production of biofuel feedstock on wastewater / Bhatnagar A., Chinnasamy S., Das K.C. - № 13/257,351, C12N 1/12; заяв. 20.04.2009; опубл. 02.02.2012-14 с). Встановлено, що ріст кожного виду, зокрема Scenedesmus bijuga, за умов мішаної культури на вищезазначених промислових стоках був значно ефективніший ніж в окремій культурі. Найбільш близьким за технічною суттю є спосіб отримання біомаси водорості Scenedesmus obliquus та деяких видів з родів Chlorella, Dunaliella, Haematococcus за умов масового культивування як сировини для харчової та фармацевтичної промисловості і виробництва біопалива (Пат. 2011/0138682 А1, США, Algal culture production, harvesting and processing / Demaris P.B., Ravikumar R., Vandevivere P. - № 12/864,399 C12N 1/12; заяв. 22.12.2010; опубл. 16.06.2011-8 с). Розроблено метод поетапного вирощування водоростей у ставках на середовищі з різною концентрацією джерела азоту. На першому етапі водорості культивували у ставках на середовищі з оптимальним вмістом мінеральної або органічної форми азоту, підтримуючи їх максимально інтенсивний ріст, а на другому - у ставках з мінімальною кількістю азоту, таким чином, викликаючи припинення росту і накопичення ліпідів. Цей спосіб враховує також методи приготування посівного матеріалу, регулювання температури та кислотності середовища у ставках. Для посівного матеріалу водорості вирощували у конічних колбах Ерленмейєра на живильному середовищі Брістоль з 2,94 mM NaNO3, 0,17 mМ СаСl2 × 2 Н2О, 0,3 mM MgSO4 × 7 Н2О, 0,43 mМ К2НРО4, 1,29 mМ КН2РО4, 0,43 mМ NaCl до щільності культури 2-3 млн кл./мл. Щільність водоростей у ставках також підтримували на рівні 2-3 млн кл./мл. Водорості вирощували у діапазоні температур від 20 до 30 °C, рН=6-8. Недоліками перелічених способів є те, що вони не враховують такі біотичні фактори як штамові особливості, чутливість/резистентність різних видів до мікроорганізмів - паразитів водоростей, високої концентрації джерела азоту, здатність водоростей до утворення небажаних біологічно активних речовин тощо. У низці публікацій (Музафаров A.M., Таубаев Т.Т. Культивирование и применение микроводорослей. - Ташкент: ФАН, 1984.-136 с; Цоглин Л.Н., Пульц О., Шторандт Р., Акыев А. Выбор продуктивных форм микроводорослей для массового культивирования // Альгология. 1 UA 80004 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1999.-9, № 3. - С. 73-81.; Soeder C.J., Hegewald E. Scenedesmus // Micro-algal biotechnology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1988. - P. 58-84.) наводиться думка щодо необхідності розробки методів культивування місцевих штамів водоростей, адаптованих до клімату помірної зони. Але в наведених вище способах всі використані водорості, як модельні об'єкти, вирощувались в країнах з теплим або субтропічним кліматом (Болгарії, Італії у Європі, Узбекистані в Азії, США у Півн. Америці). Як засвідчують літературні дані (Громов Б.В. Микроорганизмы -паразиты водорослей. Ленинград: ЛГУ, 1976.-158 с; Громов Б.В. Паразиты водорослей из группы "Монад" Ценковского родов Aphelidium, Amoeboaphelidium, Pseudoaphelidium как представители нового класса. Зоологічний журнал.-2000.-79, № 5. - С. 517-525.) саме види Scenedesmus acutus та S. obliquus, наведені у вищезазначених способах, є найбільш чутливими до мікроорганізмів - паразитів водоростей (спорових бактерій, хитридієвих грибів, протистів, вірусів). Вони викликають захворювання водоростей в масових культурах, особливо у разі різкої зміни температури, освітлення, кислотності середовища та інших умов культивування. Недоліком наявних способів є використання видів роду Scenedesmus (=Acutodesmus), які на рідкому живильному середовищі накопичують в 10 разів більше нітритів в процесі асиміляції нітратного азоту, у порівнянні з представниками близько спорідненого роду Desmodesmus (Клоченко П.Д., Медведь В.А., Борисова Е.В., Царенко П.М. Особенности накопления нітритного азота в культурах хлорококковых водорослей. - Альгология.-2000.-10, № 3. - С. 257-264). Нітрити належать до попередників нітрозамінів, які мають дуже виражені канцерогені та мутагенні властивості (Рубенчик Б.Л. Образование канцерогенов из соединений азота. - К.: Наук. думка, 1990.-220 с). В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу отримання біомаси водоростей шляхом використання нового виду, близького за фізіологічними властивостями та продуктивністю до видів роду Scenedesmus, але резистентного до паразитів водоростей і зі здатністю виділяти у середовище значно меншу кількість нітритів в процесі асиміляції нітратного азоту, розробки нових режимів культивування, оптимізації живильного середовища. Для забезпечення вирішення задачі спосіб отримання біомаси передбачає використання в як продуцента водорості Desmodesmus magnus (Десмодесмус великий), включає вирощування посівного матеріалу на агаризованому живильному середовищі з органічними добавками, приготування та адаптацію інокуляту на рідкому мінеральному середовищі, підбір оптимальної концентрації нітратного азоту для інтенсивного культивування продуцента. Новим в способі є використання як продуцента водорості Desmodesmus magnus, близької за фізіологічними властивостями та продуктивністю до видів Scenedesmus, але резистентної до паразитів водоростей і з деякими іншими біохімічними властивостями, приготування інокуляту, яке включає послідовне вирощування посівного матеріалу на агаризованому середовищі ФДАГА (нітратне середовище (Ф), з добавкою глюкози (Г), дріжджового автолізату (ДА) та агару (А)) з глюкозою та дріжджовим екстрактом протягом 7 діб, внесення його у рідке мінеральне середовище Бурреллі для адаптування суспензії протягом 5 діб, перед інтенсивним вирощуванням на вищезазначеному середовищі з оптимальною концентрацією нітратного азоту, що становить 200 мг/л. Суть корисної моделі, що заявляється, пояснюється прикладами. В наведених нижче прикладах поставлена задача вирішувалася шляхом спеціальної підготовки інокулята та порівняльного культивування Scenedesmus (=Acutudesmus) obliquus та S. acutus, відомих продуцентів біомаси, і Desmodesmus magnus, нового виду-продуцента. Посівний матеріал вирощували на агаризованому живильному середовищі ФДАГА (Квитко К.В., Борщевская Т.Н., Чунаев А.С., Тугаринов В.В. Петергофская коллекция штаммов водорослей // Культивирование коллекционных штаммов водорослей / Под ред. Б.И. Громова. Ленинград, 1983. - С. 28-56) такого складу: KNO3 1440 мг/л MgSO4 100 мг/л К2НРО4 160 мг/л СаСl2 20 мг/л Со(NO3)2 × 6Н2О 0,02 мг/л CuSO4 × 5Н2О 0,01 мг/л Zn4 × 7Н2О 0,04 мг/л MgSO4 × 7H2O 1,0 мг/л Н3ВО3 1,4 мг/л (NH4)2MoO4 0,5 мг/л глюкоза 2,5 г/л 2 UA 80004 U дріжджовий екстракт 2,0 г/л агар 20 г/л. Культивування проводили при температурі 26 °C. Отриманий посівний матеріал вносили у рідке мінеральне середовище Бурреллі (Soeder C.J., Hegewald E. Scenedesmus // Micro-algal biotechnology. Cambridge: Cambridge Univ. Press, 1988. - P. 58-84.) такого складу: KNO3 200 мг/л MgSO4 30 мг/л Ca(NO3)2 30 мг/л K2HPO4 40 мг/л FeSO4 3,3 мг/л мікроелементи 10 мл. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Розчин мікроелементів Н3ВО3 МnСl2·4Н2О ZnSO4·7H2O Co(NO3)2·4H2O NH4VO3 CuSO4·5 Н2О 2,86 мг/л 1,81 мг/л 0,22 мг/л 0,15 мг/л 2,3 мг/л 0,01 мг/л. Інтенсивне культивування водоростей проводили протягом 10 діб на люміностаті з цілодобовим освітлюванням лампами ЛБ-40 (освітленості 3-4 тис. лк) за контролем температурного фактора (26-30 °C) та барботуванням. Водорості вирощували у конічних колбах Ерленмейєра об'ємом 1000 мл за стерильних умов у рідкому середовищі Бурреллі (рН - 7,0) з різною концентрацією KNO3-20, 200 та 2000 мг/л. Об'єм середовища - 200 мл. Товщину шару суспензії постійно підтримували на рівні 3 см. Інтенсивність росту водоростей оцінювали шляхом щодобового підрахунку кількості клітин у камері Горяєва, а також за зміною вмісту абсолютно сухої біомаси (а.с.б.) у певному об'ємі культуральної рідини (Методы физиологобиохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Отв. ред. А.В. Топачевский. - К.: Наук, думка, 1975.-247 с). На підставі одержаних даних розраховували питому швидкість росту (μ) та продуктивність (Р) (Тренкеншу Р.П. Простейшие модели роста микроводорослей. 1. Периодическая культура // Экология моря.-2005. - вып. 67. - С. 89-97). Приклад 1. Контроль 1. Посівний матеріал Scenedesmus obliquus (прототип 1) вирощували на агаризованому середовищі ФДАГА з глюкозою та дріжджовим автолізатом при температурі 26 °C Одержану біомасу переносили у колбу з рідким мінеральним середовищем Бурреллі вищевказаного складу і підрощували. Адаптований таким чином інокулят засівали у середовище для інтенсивного вирощування у кількості 5 млн. кл./мл. Інтенсивне культивування водоростей проводили у конічних колбах Ерленмейєра об'ємом 1000 мл з 200 мл середовища Бурреллі на люміностаті з цілодобовим освітлюванням лампами ЛБ-40 (освітленості 3-4 тис. лк) за контролем температурного фактора (26-30 °C) та барботуванням. Тривалість одержання посівного матеріалу - 7 діб; інокуляту - 5 діб; інтенсивне вирощування - 10 діб. За досліджуваних -1 умов питома швидкість росту становила 0,32 доби , продуктивність 6,4 млн. кл./мл·добу. Максимальна кількість клітин досягала 35 млн./мл. Приріст біомаси за добу дорівнював 0,84 г/л абсолютно сухої біомаси (а. б. с). Протягом усього періоду вирощування культура була представлена одноклітинною формою. Приклад 2. Контроль 2. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводили так само, як і в контролі 1 (приклад 1), лише у якості посівного матеріалу використовували Scenedesmus acutus (прототип 2). Тривалість одержання посівного матеріалу - 7 діб; інокуляту - 5 діб; -1 інтенсивне вирощування - 10 діб. Питома швидкість росту становила 0,46 доби , продуктивність 9,2 млн. кл./мл·добу. Максимальна кількість клітин досягала 39 млн./мл. Приріст біомаси за добу дорівнював 1,2 г/л а. б. с Протягом усього періоду вирощування культура була представлена одноклітинною формою. Приклад 3. Дослід 1. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводили так само, як і в контролі 1 (приклад 1), лише як посівний матеріал використовували Desmodesmus magnus. Тривалість одержання посівного матеріалу - 7 діб; інокуляту - 5 діб; інтенсивне вирощування -1 10 діб. Питома швидкість росту становила 1,2 доби , продуктивність 29 млн. кл./мл·добу. Максимальна кількість клітин досягала 84,5 млн./мл. Приріст біомаси за добу дорівнював 0,98 г/л а. б. с Протягом усього періоду вирощування культури зберігала ценобіальну форму. Приклад 4. Дослід 2. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводили так само, як і в контролі 1 (приклад 1), лише як посівний матеріал використовували Desmodesmus magnus і 3 UA 80004 U 5 10 концентрацію нітратного азоту у середовищі Бурреллі зменшили до 20 мг/л. Тривалість одержання посівного матеріалу - 7 діб; інокуляту - 5 діб; інтенсивне вирощування - 10 діб. -1 Питома швидкість росту становила 0,22 доби , продуктивність 6,4 млн. кл./мл·добу. Максимальна кількість клітин досягає 34 млн./мл. На п'яту добу вирощування ріст культури різко сповільнився в результаті зменшення концентрації азоту у живильному середовищі, а приріст біомаси при цьому за добу дорівнював 0,4 г/л а. б. с Приклад 5. Дослід 3. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводили так само, як і в контролі 1 (приклад 1), лише як посівний матеріалу використовували Desmodesmus magnus і концентрацію нітратного азоту у середовищі Бурреллі збільшили до 2000 мг/л. Тривалість одержання посівного матеріалу - 7 діб; інокуляту - 5 діб; інтенсивне вирощування - 10 діб. -1 Питома швидкість росту становила 0,8 доби , продуктивність 30,5 млн. кл./мл·добу. Приріст біомаси за добу дорівнював 1,1 г/л а. б. с Максимальна кількість клітин досягала 96,7 млн./мл. Протягом усього періоду вирощування культури зберігала ценобіальну форму. Способи одержання біомаси водоростей з культур Scenedesmus obliquus (прототип 1), Sc. acutus (прототип 2) та Desmodesmus magnus (оригінальні дані) Прототип 1 Температура, С° рН середовища Концентрація нітратного азоту, мг/л Приріст біомаси, а.с.б./доба, г/л Прототип 2 26-30 6,5-8,5 26-30 6,5-8,5 Desmodesmus magnus (оригінальні дані) 26-30 6,5-8,5 200 200 200 0,84 1,2 0,98 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб одержання біомаси як сировини для біопалива, заснований на використанні зелених сценодесмусових водоростей, що включає приготування інокуляту продуценту з послідовним вирощуванням посівного матеріалу на агаризованому середовищі з органічними добавками, внесенням його у рідке мінеральне середовище для адаптування суспензії та вирощування за умов інтенсивного культивування на вищезазначеному середовищі з оптимальною (200 мг/л) концентрацією нітратного азоту, який відрізняється тим, що як продуцент використовується новий вид культивованої водорості Desmodesmus magnus (Meyen) P. Tsarenko, близький за продуктивністю до видів роду Scenedesmus, але резистентний до паразитів водоростей, високої концентрації нітратів і має здатність до накопичення нітритів (що є попередниками канцерогенів) у середовищі на порядок (10 разів) менше, ніж представники роду Scenedesmus і Acutodesmus. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4