Спосіб оцінки стійкості бур’янів до ацетохлорвмісних гербіцидів

Реферат: Спосіб оцінки стійкості бур'янів до ацетохлорвмісних гербіцидів включає визначення в бур'янах індукованої активності глутатіон-S-трансферази. В вегетаційних посудинах пророщують насіння бур'янів з досліджуваного агроценозу, обробляють бур'яни гербіцидами, вимірюють активність глутатіон-8-трансферази в оброблених гербіцидами і контрольних бур'янах, вираховують коефіцієнт відношення активності ферменту в оброблених бур'янах до активності ферменту в контрольних бур'янах. UA 80029 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ СТІЙКОСТІ БУР'ЯНІВ ДО АЦЕТОХЛОРВМІСНИХ ГЕРБІЦИДІВ UA 80029 U UA 80029 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до рослинництва, а саме до виявлення механізмів стійкості бур'янових рослин до гербіцидів. Спосіб може застосовуватись у сільському господарстві для діагностики гербіцидної стійкості бур'янів, прогнозування ефективності застосування гербіцидів та екологічному нагляді за станом агроценозів. Відомий спосіб оцінки ефективності токсичної дії гербіциду харнес [1], що базується на вирахуванні приросту врожайності кукурудзи та зниженні чисельності бур'янів за рахунок гербіцидної обробки посіву, недоліками якого є необхідність польових дослідів, необ'єктивність та неможливість прогнозування ефективності подальшого застосування гербіциду. Відомий спосіб визначення порогу чутливості рослин до хімічних речовин [2], заснований на вимірюванні різниці морфометричних показників рослин за контрольних та стресових умов, недоліком якого є неможливість визначення ефекту стресової дії до візуального прояву ушкоджень. Відомий метод тестування рослин, що зазнали дії стресорів (у тому числі гербіцидів), за визначенням комплексу біомаркерів та порівнянням результатів з передчасно створеними стандартними матрицями для кожного з досліджуваних видів рослин [3], недоліки якого полягають у трудоємності, недостатній чутливості, неможливості визначення здатності рослин до знешкодження гербіцидів. Відомий спосіб оцінки резистентності рослин до абіотичних стресів за рівнями активації в рослинах захисних ферментів супероксид-дисмутази, каталази, пероксидази, глутатіонредуктази [4], який є недостатньо об'єктивним через відсутність дослідження активації ферментів, що знешкоджують токсикант у рослинних клітинах. Найбільш близьким до запропонованого є відомий спосіб оцінки гербіцидної стійкості кукурудзи за рівнем індукованої антидотами активності ферменту глутатіон-S-трансферази (GST), який каталізує реакції біодеградації токсикантів [5]. Спосіб передбачає пророщення насіння кукурудзи на фільтрувальному папері, обробку проростків антидотами для індукції підвищення активності ферменту проти гербіцидів, відбір рослинних зразків, приготування екстрактів, очищення ферментних препаратів та визначення в них активності GST за загальновідомим методом Jakoby [6]. Запропоновані у способі експериментальні умови обмежують його використання для пророщення насіння бур'янів, до того ж спосіб не містить критеріїв оцінки гербіцидної стійкості бур'янових рослин. Крім цього спосіб застосовано тільки для оцінки стійкості рослин проти гербіцидів алахлор і атразин, які на сьогодні не мають широкого використання у рослинництві. Задача корисної моделі полягає в удосконаленні способу оцінки гербіцидної стійкості кукурудзи за рівнем активації глутатіон-S-трансферази шляхом виявлення здатності бур'янів до індукованої активації GST і встановлення об'єктивних критеріїв для оцінки в лабораторних умовах стійкості бур'янів до ацетохлорвмісних гербіцидів і забезпеченні завдяки цьому спрощення і здешевлення діагностики та прогнозування ефективності подальшого застосування гербіцидів. Задача вирішується тим, що в способі оцінки стійкості бур'янів до ацетохлорвмісних гербіцидів пророщують у вегетаційних посудинах насіння бур'янів з досліджуваного агроценозу, обробляють бур'яни гербіцидами, вимірюють активність глутатіон-S-трансферази в оброблених гербіцидами і контрольних бур'янах, вираховують коефіцієнт відношення активності ферменту в оброблених бур'янах до активності ферменту в контрольних бур'янах за виразом Kакт.=Ад/Ак, де Kакт. - коефіцієнт активації GST; Ад - активність GST в оброблених гербіцидом бур'янах; Ак - активність GST в контрольних бур'янах; при цьому бур'яни, в яких коефіцієнт перебільшує 3,0, відносять до стійких, коефіцієнт від 2,0 до 3,0 - до середньо стійких, від 1,0 до 2,0 - до нестійких, на основі чого у зворотній залежності прогнозують ефективність подальшого застосування гербіцидів в агроценозі. Індукована гербіцидами активація GST у бур'янах є об'єктивним кількісним критерієм здатності бур'янів до знешкодження гербіцидів. Пророщення насіння у вегетаційних посудинах і обробка бур'янів регламентованими дозами гербіцидів усувають необхідність польових дослідів для діагностики стійкості бур'янів. Дослідження насіння з певних агроценозів дозволяє саме для них зробити прогноз ефективності подальшого використання гербіцидів. Внаслідок цього забезпечуються об'єктивність, спрощення, здешевлення діагностики гербіцидної стійкості бур'янів та можливість прогнозування ефективності гербіцидної обробки агроценозів. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином. Рослини вирощують у вегетаційних посудинах з ґрунтом із стиглого насіння бур'янів, зібраного в досліджуваному агроценозі. Ацетохлорвмісні гербіциди у регламентованих дозах (у перерахунку на площу вегетаційних 1 UA 80029 U 5 10 15 20 25 30 35 посудин) вносять у ґрунт методом обприскування до появи сходів бур'янів. Контрольні рослини не піддають гербіцидній обробці. Рослинний матеріал для визначення активності глутатіон-8-трансферази у дводольних бур'янів відбирають у фазі 2-3 пар справжніх листків. Екстракти з 0,2 г сирого рослинного матеріалу готують шляхом гомогенізації зразків в 1 мл 0,1 М калій-натрій-фосфатного буфера (рН 8,0) та подальшого центрифугування при температурі 4 °С протягом 20 хвилин при 16 000 об./хв. Активність GST визначають спектрофотометричним методом за [6] при довжині хвилі 340 нм з використанням 0,02 М розчину 1-хлор-2,4-динітробензолу (CDNB) як субстрат. Реакційну суміш, яка містить 0,02 М розчин відновленого глутатіону та 0,2 мл рослинного екстракту, інкубують протягом 10 хвилин при 30 °С. Реакцію ініціюють додаванням субстрату, після чого реєструють зміни оптичної густини. Активність GST виражають у наноМоль CDNB/сек. Рослинні глутатіон-S-трансферази складають родину ферментів, які каталізують реакції детоксикації багатьох хімічних сполук [7]. Наявність у рослин різних молекулярних форм GST детермінує стійкість до речовин різної структури, тому, якщо бур'яни мають високу активність відповідних GST або здатні до індукції їх активності за дії гербіциду, то вони будуть стійкими як до цього препарату, так і до інших з тією самою діючою речовиною [8]. Отже, запропонований спосіб може бути використаний для діагностики та прогнозування ефективності групи гербіцидів (аценіт, ацетал, релай, еруніт, трофі, харнес), у яких діючою речовиною є ацетохлор (2-xлop-N(етоксиметил)-N-(2-етил-6-метилфеніл)ацетамід. На кресленні представлені результати визначення каталітичної активності глутатіон-Sтрансферази (нМольСDNВ/сек) у листках контрольних та оброблених гербіцидом харнес дводольних бур'янів, де: 1 - щириця лободовидна (Amarantus blitoides S. Watson); 2 - амброзія полинолиста (Ambrosia artemisiifolia L.); 3 - лобода біла (Chenopodium album L.); 4 - чорнощир нетреболистий (Iva xantifolia Nutt.). Діагностику стійкості бур'янів до гербіциду наведено у таблиці 1. Вираховують відношення активності глутатіон-S-трансферази в оброблених гербіцидом бур'янах до активності глутатіонS-трансферази в контрольних бур'янах (коефіцієнт активації, Какт.). Якщо значення коефіцієнта активації перебільшує 3,0, стійкість бур'яну до гербіциду визначають як високу; якщо значення коефіцієнта активації від 2,0 до 3,0 - як середню; якщо значення коефіцієнта активації від 1,0 до 2,0 - як низьку. Прогнозування ефективності подальшого застосування гербіциду у досліджуваному агроценозі наведено у таблиці 1. Для бур'янів з діагностованою високою гербіцидною стійкістю прогнозують низьку ефективність наступної обробки гербіцидом харнес; для бур'янів з середньою стійкістю - середню ефективність; для бур'янів з низькою стійкістю - високу ефективність подальшої оброки гербіцидом харнес. Таблиця 1 Діагностика стійкості бур'янів до гербіциду харнес та прогнозування ефективності подальшої гербіцидної обробки Вид бур'янових рослин Щириця лободовидна Амброзія полинолиста Коефіцієнт Індукована активність Діагностована Прогнозована активації GST, GST, нМольСDNВ/сек стійкість бур'янів активність гербіциду Какт. 4,0 Висока 4,39 2,8 Середня Лобода біла 2,09 1,9 Низька Чорнощир нетреболистий 40 6,36 1,30 1,0 Низька Низька Від низької середньої Від середньої високої до до Висока Перевірку адекватності запропонованого способу оцінки стійкості бур'янів до ацетохлорвмісних гербіцидів та прогнозування ефективності подальшого застосування гербіцидів здійснюють на прикладі наведених у таблиці 2 даних щодо впливу гербіциду харнес на чисельність бур'янів за умов щорічного використання гербіциду. Прогнозовані рівні ефективності подальшого використання гербіциду харнес в досліджуваних агроценозах для 2 UA 80029 U знищення вивчених бур'янів підтверджуються показниками чисельності кожного виду бур'янів та відсотків від загальної кількості бур'янів на ділянці. Таблиця 2 2 Вплив гербіциду харнес на чисельність (шт./м ) бур'янів за умов щорічного використання гербіциду в агроценозі (2007-2009 pp.) 2 Вид бур'янових рослини Щириця лободовидна Амброзія полинолиста Лобода біла Чорнощир нетреболистий 5 10 15 20 25 Кількість бур'янів, шт./м 2007 р. 2008 р. 2009 р. 1,13 1,47 1,27 1,30 1,03 0,90 0,87 0,80 0,63 0,57 0*87 0,47 Частка від загальної кількості бур'янів, % 20,8 17,4 12,4 10,3 Таким чином, запропонований спосіб використовує кількісне визначення ступеня активації глутатіон-8-трансферази як критерій здатності бур'янів до детоксикації ацетохлорвмісних гербіцидів, що забезпечує об'єктивність та чутливість визначення гербіцидної стійкості бур'янів. Дослідження активації GST у лабораторних умовах усуває необхідність польових експериментів, що забезпечує спрощення та здешевлення діагностики гербіцидної стійкості бур'янів. За рахунок використання насіння бур'янів з досліджуваного агроценозу забезпечується можливість прогнозування ефективності подальшого застосування гербіцидів. Адекватність запропонованого способу оцінки стійкості бур'янів до ацетохлорвмісних гербіцидів та прогнозування ефективності подальшого застосування гербіцидів в агроценозах підтверджується даними польових випробувань. Джерела інформації: 1. Патент U № 201002219, МПК А01С 21/00, 2009. 2. Патент U № 201014543, МПК A01G 7/00,2011. 3. Патент WO № 2001092879, МПК G01N 33/50, 2001. 4. Патент WO № 2006105477, МПК A01N 65/00, 2006. 5. Патент WO № 1990008826, МПК C12N 15/82, 1990. 6. Jakoby W. В. Glutathion transferases. In: Methods in enzymology. - Acad. Press. INC, 1985.-P. 495-510. 7. Lamoureux G., Shimabukuro R., Swanson H., Frear D. Metabolism of atrazine in excised sorghum leaf sections // J. Agr. Food Chem.-1970. - Vol. 18. - P. 81-86. 8. Мордерер E. Ю. Избирательная фитотоксичность гербицидов / НАНУ, Ин-т физ. раст. и генетики. - К.: Логос, 2001.-240 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 Спосіб оцінки стійкості бур'янів до ацетохлорвмісних гербіцидів, що включає визначення в бур'янах індукованої активності глутатіон-S-трансферази, який відрізняється тим, що в вегетаційних посудинах пророщують насіння бур'янів з досліджуваного агроценозу, обробляють бур'яни гербіцидами, вимірюють активність глутатіон-8-трансферази в оброблених гербіцидами і контрольних бур'янах, вираховують коефіцієнт відношення активності ферменту в оброблених бур'янах до активності ферменту в контрольних бур'янах за виразом Какт. = Ад/Ак, де Какт.- коефіцієнт активації глутатіон-8-трансферази; Ад - активність глутатіон-8-трансферази в оброблених гербіцидом бур'янах; Ак - активність глутатіон-8-трансферази в контрольних бур'янах; і якщо значення К акт., перебільшує 3,0, стійкість бур'янів визначають як високу, при К акт. від 2,0 до 3,0 - як середню, а при Какт. від 1,0 до 2,0 - як низьку, на основі чого у зворотній залежності прогнозують ефективність подальшого застосування гербіцидів в досліджуваному агроценозі. 3 UA 80029 U Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4