Спосіб оцінки ультраструктурних змін в серцево-судинній системі за умов дії низьких доз радіації

Реферат: Спосіб оцінки ультраструктурних змін в серцево-судинній системі за умов дії низьких доз радіації передбачає визначення змін різних біохімічних показників. Проводять електронномікроскопічне дослідження ультраструктурної організації ендотелію аорти мишей за умов дії хронічного зовнішнього радіаційного опромінення сумарною дозою 0,43 Зв. UA 83180 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ УЛЬТРАСТРУКТУРНИХ ЗМІН В СЕРЦЕВО-СУДИННІЙ СИСТЕМІ ЗА УМОВ ДІЇ НИЗЬКИХ ДОЗ РАДІАЦІЇ UA 83180 U UA 83180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, точніше до радіаційної медицини (радіобіології) і може бути використана для оцінки ультраструктурних змін в серцево-судинній системі за умов дії низьких доз радіації. Проблема впливу низьких доз радіації на організм надзвичайно складна і залишається актуальною і недостатньо вивченою [2, 4, 6]. Після аварії на Чорнобильській АЕС у 1986 р. великі контингенти людей, а також тварин і рослин підпали під тривалу або постійну дію низьких доз іонізуючого опромінення [7, 10, 15]. Патологічні процеси, які є наслідком опромінення, часто супроводжуються порушенням судинного тонусу. Це, у свою чергу, призводить до розвитку хвороб серця і судин [9]. Ендотелій, де синтезується і вивільняється низка біологічно активних речовин [8], є найбільш радіочутливим елементом судинної стінки [3, 11]. Раніше нами було показано вплив низьких доз радіації на ендотелійзалежний механізм судинної регуляції і окисний метаболізм реактивних форм кисню і азоту в серцево-судинній системі [12, 13]. Найбільш близьким до способу, що заявляється, вибраний як прототип [14] є спосіб визначення змін різних біохімічних показників за інтенсивність утворення реактивних форм кисню (РФК) та реактивних форм азоту (РФА) у різних за радіочутливістю ліній мишей за умов постійного перебування у зоні відчуження. Недоліком цього способу є те, що він не дозволяє отримати достовірні дані про зміни судинної реактивності за умов дії низьких доз радіації. В основу корисної моделі поставлено задачу, яка полягає у дослідженні ультраструктурної організації ендотелію аорти мишей лінії BALB/c за умов дії хронічного зовнішнього радіаційного опромінення сумарною дозою 0,43 Зв. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, що передбачає визначення змін різних біохімічних показників, згідно з корисною моделлю, проводять електронномікроскопічне дослідження ультраструктурної організації ендотелію аорти мишей за умов дії хронічного зовнішнього радіаційного опромінення сумарною дозою 0,43 Зв. Електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктурної організації ендотелію грудного відділу аорти проводилося на мишах радіочутливої лінії BALB/c [1] масою тіла 20-22 г, яких було розподілено на дві групи: 1 група (контроль) - тварини віком 8-9 міс., які народилися і протягом усього життя перебували в м. Києві; 2 група - тварини, які з тримісячного віку протягом 6 міс. постійно перебували у клітках з плоскими джерелами іонізуючого опромінення (тварини народилися і протягом усього свого життя знаходилися у лабораторії експериментальної радіобіології і засобів радіозахисту Інституту проблем безпеки атомних електростанцій НАН України, м. Чорнобиль). Накопичена доза зовнішнього опромінення, яку вимірювали приладом 3 МКС-0,1р на висоті 10 см над поверхнею джерела, становила 96,9 мк в/год., що відповідало 3 430,1 мл в за 187 діб експозиції. Для експерименту були виготовлені спеціальні плоскі джерела іонізуючого опромінення іммобілізовані бетоном гарячі частинки з пропаленого ґрунту "рудого лісу", що моделюють іонізуюче опромінення "чорнобильського спектра" низької інтенсивності. Спектр γ-поля опромінення мишей лінії BALB/c, який визначали за допомогою спектрометричної системи Microspec-2 фірми "Bubble Technology Industries, Inc." (Канада), в основному (біля 90 %) 137 складався з комптоновського випромінювання, Cs (7 %), а також інших радіонуклідів. Матеріал після подрібнення фіксували у 1 % розчині чотириокису осмію за Колфільдом протягом 2 год. на холоді, зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, починаючи з 70° до 100° спирту, ацетоні, просочували сумішшю епоксидних смол (аралдит і епон) та заключали в епоксидні смоли за загальноприйнятою методикою [5]. Після полімеризації при температурі 60 °C на ультратомах "Reichard "(Австрія) і LKB-III (Швеція) для прицільної орієнтації виготовлялися напівтонкі зрізи, які забарвлювалися толуїдиновим синім, а потім ультратонкі зрізи. Останні контрастували уранілацетатом і цитратом свинцю, потім їх вивчали під електронним мікроскопом ПЕМ-125К ("Selmi", Україна) і фотографували при збільшеннях від 3000 до 20000 разів. Електронно-мікроскопне дослідження аорти мишей контрольної групи свідчить про наявність суцільного ендотеліального вистелення. Ендотеліоцити мають витягнуту форму і досить великі розміри з чітким поділом на периферійну і ядровмісну зони. Ядро, як правило, видовжене овальної форми з рівномірною кількістю еу- та гетерохроматину і одним чи декількома ядерцями. В цитоплазмі біля ядра розміщуються органели загального призначення: комплекс Гольджі, зерниста ендоплазматична сітка, клітинний центр, мітохондрії. Слід відзначити, що у більшості ендотеліоцитів у цитоплазмі розміщуються тільця Вейбеля-Паладе, які містять біологічно активні речовини, переважно фактор Віллебранда та селектини, які сприяють адгезії до поверхні ендотелію деяких формених елементів крові. Цитоплазма периферійної зони 1 UA 83180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 значно стоншена і має мікропіноцитозні пухирці, а на люменальній поверхні плазматичної мембрани розміщені невеликі кавеоли і мікровирости. Підендотеліальний шар внутрішньої оболонки (tunika intima) аорти представлений пухкою волокнистою сполучною тканиною. Кількість останньої незначна і до неї входять колагенові волокна та поодинокі малодиференційовані клітини. В деяких ділянках внутрішнього вистелення спостерігаються пухирі, які піднімають базальну мембрану епітеліоцитів і, таким чином, відбувається трансендотеліальний перенос речовин. Колагенові волокна іноді утворюють скупчення, куди проникає невелика кількість еластичних волокон. Розділяє внутрішню і середню оболонки у аорті мишей внутрішня еластична мембрана, яка відрізняється від еластичних мембран середньої оболонки більшою щільністю і меншою кількістю пор. У рівній кількості в середній оболонці присутні гладкі м'язові клітини. Останні орієнтовані косо відносно еластичних мембран. Таке розміщення обумовлене високим тиском та великою швидкістю крові у аорті. Ближче до внутрішньої еластичної мембрани розміщуються темні гладкі міоцити, які мають електроннощільну цитоплазму і, можливо, іншу функціональну спрямованість у порівнянні з клітинами, які розміщені між вікончатими еластичними мембранами. Цитоплазма таких клітин вміщує велику кількість міофіламентів, практично вони повністю виповнюють її. Невелика кількість мітохондрій розміщується між ними і забезпечує енергією їх скорочення. Трапляються міоцити, у яких є канальці зернистої ендоплазматичної сітки, очевидно, ці клітини спеціалізуються на синтезі колагену та еластину. Ядра цих клітин також витягнутої форми. У мишей лінії BALB/c, які отримали сумарну дозу опромінення 0,43 Зв, характер та спрямованість змін свідчать про високу ступень і поширеність пошкоджень. Переважають ендотеліоцити з виразними змінами. Ендотелій не контактує з базальною мембраною на значних відстанях. Стоншені периферійні ділянки нерівномірно видаються у просвіт судини, надаючи ендотеліальному вистеленню хвилястого вигляду. Спостерігаються ділянки набряку та лізису цитоплазми. Разом з тим, в окремих клітинах відмічаються скупчення тілець ВейбеляПаладе, які оточують чисельні мікропіноцитозні везикули. Останні інколи відособлюються мембраною, утворюючи мультивезикулярні тільця і, можливо, так виводяться за межі клітини. Ще однією особливістю ультраструктури аорти мишей лінії BALB/c, які отримали дозу опромінення 0,43 Зв, є наявність ендотеліоцитів з підвищеною електронною щільністю цитоплазми. Це відбувається внаслідок зменшення кількості органел та мікропіноцитозних везикул і накопичення дрібнодисперсного, електроннощільного матеріалу. Такий стан клітини може відповідати початковій стадії апоптозу. Ділянки десквамації ендотелію і оголення базальної мембрани набувають поширеності в експериментальній групі. Базальна мембрана, як правило, розпушена, деструктурована. За звичай, в зоні десквамації ендотелію гладком'язові клітини гіпертрофовані. Ядра таких клітин мають глибокі інвагінації та транскрипційно неактивний гетерохроматин. В цитоплазмі більшості клітин переважають міофіламенти, що розміщені хаотично, при цьому не виявляються щільні тільця, які є місцями прикріплення тонких актинових міофіламентів та проміжних філаментів. В зоні плазматичної мембрани щільні тільця спостерігаються не так часто, як у контрольних тварин. Порушення скоротливого апарата, можливо, зумовлено недостатністю енергетичного забезпечення цих клітин, в результаті зменшення кількості мітохондрій у порівнянні з контрольними тваринами, просвітлення їх матриксу та деструкції крист. Раніше нами показано, що у мишей лінії BALB/c, які за наслідками опромінення отримали сумарну дозу 0,43 3в, порушуються не тільки залежні (на ацетилхолін йодид), але і незалежні (на нітропрусид натрію) від ендотелію вазодилататорні реакції. Це свідчить про функціональні ушкодження скорочувального апарата судин і значно збільшує ризик розвитку вазоспастичних реакцій. Більшому рівню пошкодження ендотелійзалежних реакцій розслаблення гладеньких м'язів аорти за умов дії низьких доз радіації відповідає менший рівень синтезу оксиду азоту (NO) і менший рівень окисного аргіназного метаболізму аргініну. Зниження синтезу NO за цих умов обумовлюється підвищенням генерації реактивних форм кисню, а саме супероксидного · ‾ · ( О2 ) і гідроксильного ( ОН) радикалів, основним джерелом утворення, яких можуть бути мітохондрії. Більшому рівню пошкодження ендотелію за умов тривалої дії низьких доз радіації відповідає менший рівень генерації NO [при цьому окисний метаболізм L-аргініну спрямований ˉ на утворення не NO, а пероксинітриту (ONOO ) за умов окисного стресу при одночасній · ˉ генерації значних кількостей і NO, і О2 ] і менший рівень неокисного аргіназного метаболізму аргініну, про що свідчать пули сечовини. За умов постійної дії низьких доз радіації більшому рівню пошкодження ендотелійзалежних реакцій відповідає менший рівень нітрозилювання білків, аналогічно, як і менший рівень генерації ОН-радикала. 2 UA 83180 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Отримані дані передбачають можливість проапоптичної дії низьких доз радіації (за умов тривалої їх дії), внаслідок чого спостерігається практично повне знищення ендотелію, а отже і ендотелійзалежного розслаблення. Біохімічними причинами проапоптичної дії низьких доз ˉ радіації може бути, з одного боку, стимуляція генерації реактивних форм кисню і ONOO в мітохондріях (індуктори відкриття пори і ініціатори апоптозу), а з іншого - пригнічення утворення NO і ГАМК (інгібітори відкриття пори). Таким чином, проведене електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктурної організації аорти показало, що за умов тривалої дії низьких доз радіації найбільш уразливим є ендотелій. Підтверджує це і пригнічення ендотелійзалежних реакцій аортальних смужок на ацетилхолін, і порушення метаболізму реактивних форм кисню і стабільних метаболітів азоту. Джерела інформації: 1. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.Н. и др. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. - М: Наука, 1983.-180 с. 2. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Горбунова Н.В. и др. Особенности биологического действия "малых" доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология.-1996. - Т. 36, № 4. С. 610-631. 3. Воробьѐв Е.И., Степанов Р.П. Ионизирующие излучения и кровеносные сосуды. - М.: Энергоатомиздат, 1985.-296 с. 4. Готлиб В.Я., Пелевина И.И., Конопля Е.Ф. и др. Некоторые аспекты биологического действия малых доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология.-1991. - Т. 31, № 3. С. 318-325. 5. Карупу В.Я. Электронная микроскопия. - К.: Вища школа, 1984.-208 с. 6. Котеров А.Н. Малые дозы и малые мощности доз ионизирующей радиации: регламентация диапазонов, критерии их формирования и реалии XXI века // Мед. радиол, и рад. безопасность.-2009. - Т. 54, № 3. - С. 5-26. 7. Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: 1986-2011. За ред. A.M. Сердюка, В.Г. Бебешка, Д.А. Базики. - Тернопіль: ТДМУ, "Укрмедкнига", 2011.-1092 с. 8. Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., Ткаченко М.М. та ін. Фундаментальні механізми дії оксиду азоту на серцево-судинну систему як основи патогенетичного лікування її захворювань // Фізіол. журн.-2004. - Т. 50, № 1. - C. 11-30. 9. Москалѐв Ю.И. Отдалѐнные последствия ионизирующих излучений. - М.: Медицина, 1991.-464 с. 10.Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Конрадов А.А. 20 лет изучения последствий Чернобыльской аварии - это много или мало для оценки их характера и масштабов? // Радиационная биология. Радиоэкология.-2006. - Т. 46, № 2. - С. 240-247. 11. Ткаченко М.М., Сагач В.Ф., Базілюк О.В. та ін. Вікові особливості змін скорочувальних судинних реакцій і вміст вільних радикалів кисню та метаболітів оксиду азоту у мишей лінії BALB/c за умов перебування у зоні відчуження // Фізіол. журнал.-2005. - Т. 51, № 3. - С. 32-41. 12. Ткаченко М.Н., Коцюруба А.В., Базилюк О.В. и др. Сосудистая реактивность и метаболизм реактивных форм кислорода и азота при действии низких доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология.-2009. - Т. 49, № 4. - С. 462-472. 13. Ткаченко М.М., Коцюруба А.В., Гороть І.В. Особливості метаболізму реактивних форм кисню та азоту у мишей різних радіочутливих ліній за умов перебування у зоні відчуження // Наук, вісник НМУ імені О.О. Богомольця.-2009. - № 4 (26). - С. 64-68. 14. Ткаченко М.М., Коцюруба А.В., Базілюк О.В., Гороть І.В., Сагач В.Ф. Зміни судинної реактивності та реактивних форм кисню за умов постійного перебування мишей у зоні відчуження // Фізіол. журнал.-2010. - Т. 56, № 4. - С. 47-58. 15. Чернобыльская катастрофа / Гл. ред. В.Г. Барьяхтар. - К.: Наук, думка, 1995.-560 с. 50 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб оцінки ультраструктурних змін в серцево-судинній системі за умов дії низьких доз радіації, що передбачає визначення змін різних біохімічних показників, який відрізняється тим, що проводять електронно-мікроскопічне дослідження ультраструктурної організації ендотелію аорти мишей за умов дії хронічного зовнішнього радіаційного опромінення сумарною дозою 0,43 Зв. 3 UA 83180 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4