Спосіб підвищення продуктивності та захисту проти абіотичних стресів овочевих видів рослин, одержаних на основі методів мікроклонального розмноження

1. Спосіб підвищення продуктивності та захисту проти абіотичних стресів овочевих культур, одержаних на основі методів мікроклонального розмноження, який відрізняється тим, що після висадки рослин у відкритий ґрунт проводять обп C2 1 3 Відомий спосіб підвищення продуктивності сільськогосподарських культур з застосуванням препарату Ендофіт L-1 та N-оксидів піридинів [4, 5]. Завданням даного винаходу є розробка ефективних способів підвищення продуктивності та захист проти абіотичних стресів овочевих видів рослин, одержаних на основі методів біотехнології та при застосуванні відомих агроприйомів вегетативного вирощування. Поставлена мета досягається за рахунок розробки способів з використанням: 1 - N-оксиду піридину або його похідних; 2 - препарату Ендофіт L-1; 3 - композиції вищевказаних препаратів з водорозчинними сполуками біогенних елементів (цинку, марганцю, заліза, міді, кобальту, бору, молібдену в співвідношенні 1:1:1:1:0,01:1:0,01) і води у співвідношенні 4:1:2:4:5; 4 - N-оксиду піридину або його похідних з водорозчинними сполуками біогенних елементів (цинку, марганцю, заліза, міді, кобальту, бору, молібдену в співвідношенні 1:1:1:1:0,01:1:0,01) і води у співвідношенні 1:2:75-8,5; 5 - або композиції складу №3 або №4 з розчином суміші ПЕПв la-1г у співвідношенні 1:7. Для кращого розуміння опису матеріалів винаходу наведено конкретні приклади. Приклад І. Приготування мікромакроелементів, ПЕПв та композиційних біологічно-активних сумішей. 1. Приготування суміші ПЕПв - поліетиленоксидів а) у реактор, ємністю 2,5л відважують ПЕГ-200 - 452г, ПЕГ-400 - 452г, ПЕГ-1500 – 444г та води водопроводної 540г (співвідношення 1:1:0,98:1,19). Суміш нагрівають при перемішуванні на водяній бані до 60°С до однорідної маси і одержують композицію ПЕГів-1; б) композицію ПЕГів-2 отримують в аналогічних умовах із ПЕГ-200 + ПЕГ-400 + ПЕГ-1500 та води у співвідношенні 1:1:0,49:1; в) композицію ПЕГів-3 отримують в умовах, аналогічних одержанню композицію ПЕГів-1 із ПЕГ-200 + ПЕГ-600 + ПЕГ-1500 та води у співвідношенні 1:1:0,49:1; г) композицію ПЕГів-4 отримують в умовах, аналогічних одержанню композицію ПЕГів- із ПЕГ200 + ПЕГ400 + ПЕГ-600 + ПЕГ-1500 та води у співвідношенні 1:1:0,63:0,65:1,32. 2. Приготування розчину композиційної суміші №4 У двогорлий реактор, ємністю 2л, додають 200г суміші мікромакроелементів (сульфати, нітрати, галогеніди або лактати цинку + марганцю + заліза + міді + борної кислоти + кобальту + молібдату амонію (калію, натрію) у масовому співвідношенні 1:1:1:1:1:0,01:0,01), 500мл води і 100г Nоксиду 2-метилпіридину. Реакційну суміш нагрівають до 60°С при перемішуванні. До розчину додають 400,0г Ендофіту L-1, одержаний об’єм доводять водопроводною водою до 1л. 3. Приготування розчину композиційної суміші №5 89715 4 У двогорлий реактор, ємністю 2л, додають 200г суміші мікромакроелементів (такого ж складу, як і в композиції №4), 600мл води і 100г N-оксиду 2-метилпіридину. Реакційну суміш нагрівають до 60°С при перемішуванні, охолоджують до 25° і доводять одержаний об’єм водопроводною водою до 1л. 4. Приготування розчину компгаищйної суміші №6 У двогорлий реактор, ємністю 2л, додають 200г суміші мікромакроелемен-тів (такого ж складу, як і в композиції №4), 500мл води і 100г Nоксиду 2,6-диметилпіридину. Реакційну суміш нагрівають до 60°С при перемішуванні. До розчину додають 400,0г Ендофіту L-1, одержаний об’єм доводять водопроводною водою до 1л. 5. Приготування розчину композиційної суміші №7 У двогорлий реактор, ємністю 2л, додають 200г суміші мікромакроелементів (такого ж складу, як і в композиції №4), 600мл води і 100г N-оксиду 2,6-диметилпіридину. Реакційну суміш нагрівають до 60°С при перемішуванні, охолоджують до 25° і доводять одержаний об’єм водопроводною водою до 1л. 6. Приготування розчину композиційної суміші №8 У двогорлий реактор, ємністю 2л, додають 200г суміші мікромакроелемен-тів (такого ж складу, як і в композиції №4), 500мл води і 100г Nоксиду піридину. Реакційну суміш нагрівають до 60°С при перемішуванні, охолоджують до 25° і доводять одержаний об’єм водопроводною водою до 1л. Приклад ІІ. Проведення біотестів запропонованих біологічно-активних сполук та їх композицій на рослинних об’єктах. Приготування рослинного матеріалу і методика проведення біотестів. У досліді по адаптації до не стерильних умов вирощування клонально мікророзмножених рослин використовувалися сорти капусти білоголової Ліка і Білосніжка селекції Інституту овочівництва і баштанництва УААН. Для отримання стерильної культури насіння капусти спочатку поверхнево стерилізувати послідовним зануренням у 70% розчин етанолу на 1хв., а потім у розчин (1:3) промислового відбілювача "Білизна" на 15-20хв., що вміщував 0,1% Tween 20. Далі насіння тричі відмивати у стерильній дистильованій воді протягом 10-20хв. та висаджувати на безгормональне агаризоване живильне середовище МС [6] і розміщували у темряві для пророщування (при 25 С). Протягом 7-9 діб культивування після проростання з насіння утворювалися стерильні рослини з надмірно подовженими етіольованими гіпокотилями. Гіпокотилі з пророщеної розсади розрізали на сегменти довжиною 5-7мм і висаджували на агаризоване живильне середовище А2 [7], доповнене 1мг/л БАЛ для оптимальної індукції адвентивних пагонів. Культивування експлантів проводилось в умовах 16-годинного фотоперіоду на розсіяному світлі з низькою інтенсивністю (500 люкс) і при постійній температурі повітря 25 С. Протягом 2-х місячного росту з експлантів тканин формувалися 5 адвентивні пагони, які потім у процесі росту відокремлювали від донорних меристематичних тканин та висаджували на середовище МС з додаванням 0,1мг/л -нафтилоцтової кислоти для формування коренів. Через місяць дорощування у присутності вищевказаного ауксинового регулятора, тканин формувалися адвентивні пагони, які потім у процесі росту відокремлювали від донорних меристематичних тканин та висаджували на середовище МС з додаванням 0,1мг/л нафтилоцтової кислоти для формування коренів. Через місяць дорощування у присутності вищевказаного ауксинового регулятора, пробіркові рослинки готували до пересадки в нестерильні умови. Висадку меристемного матеріалу здійснювали у скляній теплиці у перших числах червня. При цьому ширина міжрядь становила 70см. Відстань між окремими рослинами у кожному ряду дорівнювала 45см. Для кращої приживлюваності, після висадки у щільно зволожений грунт, пробірковий матеріал витримували протягом 3 діб під плівкою для збереження від зневоднення рослинок внаслідок випаровування вологи. Після чого плівку вилучали і проводили першу обробку капусти водними розчинами випробуваних сполук за допомогою ручного обприскувача (контроль - обприскування водопровідною водою). Через кожні 30 діб обробку рослин повторювали. Всього протягом періоду вегетації проводилася чотирикратна обробка випробуваними речовинами. Останню обробку проводили у вересні місяці. Повторність одного варіанту досліду - 10-ти кратна. У польових умовах біологічно-активні речовини випробувалися на рослинах сорту капусти білоголової Українська осінь селекції вищевказаного інституту. Схема висадки розсади у польових умовах 70x70см. Першу обробку досліджуваними речовинами здійснювали на місячних за віком ювенільних рослинах капусти на початку липня. Протягом періоду вегетації проводилася трикратна обробка з інтервалом у місяць. В одному варіанті досліду використовувалося по 20 рослин. Для морфометричного аналізу вегетуючих рослин, задіяних в експерименті використовували наступні показники: середнє арифметичне приросту площі поверхні 3-го і 4-го справжніх листків; об’єм та вага сформованих голівок капусти на при кінці періоду вегетації. Оскільки за період вегетації вимірювані листки за своєю морфологією переважно набували наближеної овально-колоподібної форми, площу їх поверхні (І) розраховували за 89715 6 формулою площі еліпсу: S = * * b, де і b максимальні ширина і довжина окремо взятого листка відповідно. При розрахунку об’єму голівок (V) проводилася їх апроксимація до об’єму кулі за наступною формулою: V = (4/3) * * r3, де r - радіус кулі, який визначали як середнє арифметичне половинних значень висоти і ширини голівки капусти. На діаграмах та таблиці представлені середньоарифметичні значення показників та їх стандартні похибки. Результати біотестів запропонованих біологічно-активних сполук та їх композицій на вегетуючих рослинах капусти білоголової. Раніше було показано [8, 9], що диференціація зон росту капусти білоголової залежить від фазових змін в онтогенезі. Для забезпечення збалансованого розвитку рослин потрібне безперервне надходження поживних речовин, які поступають до зон росту з активною меристемою з різних органів (листя, коренів та запасаючих органів). Для повноцінного функціонування листа, що відіграє важливу роль у морфогенезі рослин, важливе значення має його вік, загальна площа асиміляційної поверхні, а також, фізіологічна активність тканини мезофілу, як центра синтезу фітогормонів та інших метаболітів [10]. В роботі Кружиліної і Шведської [8] на рослинах капусти білоголової сорту Амагер, що проходили стадію яровизації, було показано, що формування репродуктивних органів залежить не тільки від вікового стану рослин, але й площі поверхні наявного у них листя. Тим самим авторами цієї роботи було доведено існування зв’язку між фізіологічним процесом яровизації і фотосинтетичним апаратом рослин, у якому здійснюються специфічні процеси обміну речовин, які пізніше локалізуються в меристематичних зонах росту. Тому, виходячи з вищенаведеного, у біотестах по вивченню впливу випробуваних біологічно-активних сполук була досліджена динаміка росту площі поверхні листа і проаналізовано зв’язок цього процесу із формуванням продуктивного органа -голівки капусти. Як свідчать одержані результати, обробка досліджуваними речовинами вегетуючих рослин капусти, як за умов їх вирощування у закритому, так і відкритому грунті істотно вплинула на динаміку росту і зміну у часі появи фази зав’язування голівок (табл.1). Слід відзначити, що вирощування меристемних пробіркових рослинок в умовах скляної теплиці в літній період (липень-серпень). 7 89715 8 Таблиця 1 Оцінка випробуваних біологічно-активних сполук та їх композицій на продуктивність рослин капусти білоголової за умов вирощування у закритому та відкритому грунті Умови вирощування Сорт № вар 1 2 3 Закритий грунт (скляна теплиця) ЛІКА Об’єм голівки, 3 см Вага голівки, кг 64,6 72,4 69,6 Рослини зі сформованими голівками, % 7 54,13 79,5 70,8 8 2480,03±285,16 1851,16±350,25 1889,15±360,31 9 1,22 10,33 1,80 0,42 1,70 0,45 10мг/л 70,8 72,1 1931,35±490,52 1,61 0,52 10мг/л 71,0 70,9 1998,28±460,12 1,72 0,50 0,1мл/л 84,4 85,78 2477,91±367,75 2,32 0,34 ! 0,1мл/л 97,5 82,46 1873,00±362,22 1,71 0,48 0,1мл/л 85,4 86,28 2464,15±749,31 2,33 0,53 0,1мл/л 98,8 74,72 2455,28±529,27 1,46 0,56 0,1мл/л 96,7 66,95 1968,25±438,99 1,44 0,23 0,1мл/л+0, 7мл/л 98,8 80,14 2145,69 397,25 2,26 0,49 0,1 мл/л 85,6 +0,7мл/л 63,15 1781,55±247,74 1,98Ю,37 і 0,1мл/л+0, 7мл/л 92,3 85,68 2153,12±329,30 2,24 0,28 0,1мл/л+0, 7мл/л 79,4 61,23 2147,871357,85 1,97 0,54 0,1мл/л+0, 7мл/л 75,6 64,78 1896,57 369,31 1,76 0,58 Біологічно-активні сполуки та їх композиції Концентрації, мл/л мг/л 4 Контроль - вода Ендофіт L-1 N-оксид піридіну N-оксид 2метилпіридін N-оксид 2,6диметилпіридін Композиційна суміш №4 Композиційна суміш №5 Композиційна суміш №6 Композиційна суміш №7 Композиційна суміш №8 Композиційна суміш №4 + сумішПЕПв-1а Композиційна суміш №5 + суміш ПЕҐів-1а Композиційна суміш №6 + суміш ПЕГів-1 а Композиційна суміш №7 + суміш ПЕГів-1а Композиційна суміш №8 + суміш ПЕГів-1а 5 0,1мл/л 10мг/л Приживлення рослин, % 6 9 89715 10 Продовженняі табл.1 Оцінка випробуваних біологічно-активних сполук та їх композицій на продуктивність рослин капусти білоголової за умов вирощування у закритому та відкритому грунті Умови вирощування 1 Закритий грунт (скляна теплиця) Сорт 2 Білосніжка № вар 3 №1 №2 №3 №4 Відкритий грунт (селекційний розсадник) Українська осінь 64,39 71,2 68,4 69,9 Рослини зі сформованими голівками, % 7 58,27 70,9 69,8 70,3 8 2201,34±412,84 1905,47 321,61 1870,11±317,28 1910,34±389,31 1,49 1,58 1,60 1,58 10мг/л 70,5 68,8 1798,21±361,46 1,59 0,33 0,1мл/л 97,62 74,56 2174,33 595,10 1,94 0,47 0,1мл/л 82,51 73,65 1789,21 473,82 1,51 0,37 0,1мл/л 83,78 72,23 1927,42 399,61 2,12 0,44 0,1мл/л 98,46 69,54 2369,19±270,23 1,89 0,14 0,1мл/л 97,45 81,65 1964,15±173,19 1,57 0,11 0,1мл/л+0, 7мл/л 83,11 72,48 2225,49±233,16 2,05 0,24 0,1мл/л+0, 7мл/л 75,37 71,83 1543,62 299,13 1,63 0,28 0,1 мл/л - 87,99 Ю,7мл/л 70,29 1729,511355,69 2,13 0,69 0,1мл/л0,7мл/л 71,46 64,39 2114,65 348,55 1,73 0,56 0,1мл/л+0, 7мл/л 70,43 61,65 1888,37 319,64 1,55 0,43 0,1мл/л+0, 7мл/л 100 100 3956,62 356,99 3122,55 235,63 2,93 0,11 2,96 0,17 0,1мл/л+0, 7мл/л 100 3439,17 235,27 3,29 0,19 Біологічно-активні сполуки та їх композиції Концентрації, мл/л мг/л 4 Контроль - вода Ендофіт L-1 N-оксид піридіну N-оксид 2метилпіридін N-оксид 2,6диметилпіридін Композиційна суміш №4 Композиційна суміш №5 Композиційна суміш №6 Композиційна суміш №7 Композиційна суміш №8 Композиційна суміш №4 + суміш ПЕГів-іг Композиційна суміш №5 + суміш ПЕГів-іг Композиційна суміш №6 + суміш ПЕГів-іг Композиційна суміш №7 + суміш ПЕГів-іг Композиційна суміш №8 + суміш ПЕГів-іг Контроль - вода Композиційна суміш №6 + суміш ПЕПв- 1г Композиційна суміш №4 + суміш ПЕГів-іг 5 0,1мл/л 10мг/л 10мг/л супроводжувалося досить високими денними температурами, які періодично сягали 35-37°С опівдні і тривали ще на такому рівні протягом наступних 3-4 годин. За цих умов різко зростала втрата вологи рослинами, що призводило до їх надмірного зневоднення. Тому випробування досліджуваних сполук в умовах скляної теплиці здійснювалася за постійної присутності абіотичного стресу, пов’язаного довготривалою денною жарою. Аналіз динаміки ростових процесів свідчить, що у 2-х досліджених сортів капусти усі проаналізовані сполуки стимулювали кращий приріст листкової поверхні на протязі всього періоду вегетації, як на рівні тенденції до зростання, так і зі статистично достовірною різницею по відношенню до контрольних рослин. За ефективністю, серед проаналізованих біологічно Приживлення рослин, % 6 Об’єм голівки,3 см Вага голівки, кг 9 0,29 0,41 0,31 0,14 активних сполук та їх композицій особливо виділяються композиції №4, №7, №8 та комбінації ПЕПв-1а з композицією №5 та №7, які при випробуванні на рослинах сорту капусти білоголової Ліка стимулювали статистично достовірний приріст площі поверхні листя по закінченні періоду вегетації порівняно з контролем на 82,33%, 66%, 63,64%, 71% і 72,12%, відповідно. При обробці рослин сорту капусти Білосніжка було виявлено, що вище вказана група біологічно-активних сполук була, також, найбільш активна на відміну від інших досліджуваних речовин у стимуляції ростових процесів. Зокрема, наприкінці періоду вегетації максимальне статистично достовірне збільшення приросту листової поверхні у цього сорту капусти відмічено при застосуванні композиції №7 (на 70,82%), а мінімальне при обробці композицією 11 89715 речовин суміші ПЕГів-1а з композицією №7 (на 38,03%). Для 2-х сортів капусти білоголової, що вирощувалися у скляній теплиці за комплексом регуляторних функцій, пов’язаних з кращою приживлюваністю пробіркових рослин, стимуляцією зав’язування та формуванням голівки наприкінці періоду вегетації нами було виділено композиції №5 та №7 (табл. 1). Фенологічні спостереження за реакцією рослин капусти на обробку випробуваними речовинами, засвідчила, що комплекс поліетиленоксидів (ПЕГів)-1а; 1б; 1в; та 1г при їх використанні, як окремих інгредієнтів не досить ефективне, але при її випробувані у комбінації з композиціями №5 - №9 нами спостерігався кращий приріст ваги голівок і збільшення їх щільності на прикінці періоду вегетації порівняно з контрольним варіантом досліду (табл. 1). Зокрема, найкращий статистично достовірний приріст ваги голівок капусти білоголової сорту Ліка відзначено у варіанті застосування композиції №7 (у 1,9 рази). Аналогічний приріст для сорту Білосніжка складає 1,43 рази при застосуванні комбінації композиції №7 з сумішшю ПЕГів-1г. Проведені дослідження показали, що заявлені препарати виявили регуляторну властивість до прискорення фази зав’язування голівок у 2-х вищевказаних сортів капусти (на 6-8 діб раніше, ніж у контрольних рослин). Особливо ця регуляторна властивість була притаманна композиції №8, №7, №5, при застосуванні яких, нами спостерігалася стійка тенденція до кращого зростання ваги голівок, ніж у необроблених рослин. Як відзначалося вище, вирощування капусти в умовах закритого грунту протягом літніх місяців 2000-2001pp. відзначалося високими позитивними денними температурами (до 35-37°С), що не є типовим фактором вирощування даної овочевої рослини, і в цьому аспекті слід відмітити позитивну роль усіх випробуваних речовин, які підвищували стійкість капустяних рослин до цього абіотичного стресу. Про це свідчить краща динаміка приросту листя та зменшення кількості недогонів після їх обробки усіма випробуваними біологічно-активними речовинами (табл. 1). Для аналізу регуляторних властивостей досліджуваних речовин у польових умовах нами було відібрано кращі з них розчин композиції’ №7, №5. Ці речовини випробувалися нами у комбінації’ з комплексом поліетиленоксидів - ПЕПв-1а-г Дослідження ефективності сполук проводилося на вегетуючих рослинах капусти білоголової сорту Українська осінь. Наприкінці періоду вегетації, перед збиранням врожаю було проведено біометричні заміри ваги і об’єму голівок капусти (див. табл. 1). Ці дані дозволили виявити одержану раніше закономірність по формуванню товарних голівок, яка мала місце у досліджених сортів капусти білоголоКомп’ютерна верстка Д. Шеверун 12 вої, що вирощувалися в умовах закритого грунту. А саме, порівняно з контролем у оброблених рослин спостерігалося статистично достовірне зниження об’єму голівок при одночасному зростанні їх ваги. Найбільшу ефективність виявила комбінація суміші ПЕГів-1г з композицією №5. При її застосуванні нами спостерігалося статистично достовірне збільшення ваги голівок у 1,13 рази. При цьому їх об’єм статистично достовірно зменшився на 13,08%. Така ж закономірність спостерігалась при обробці рослин капусти композицією №7 і суміші ПЕГів-1г, при цьому зменшення об’єму голівок було також статистично достовірним, порівняно з контролем на 21,08% з вираженою тенденцією до збільшення їх ваги в межах похибки досліду. у контрольному варіанті. Виявлений позитивний ефект по збільшенню щільності голівок від дії випробуваних бюлогічнсьактивних сполук у майбутньому нами планується використати для удосконалення технології зберігання капусти у зимовий період з метою кращого її захисту від ураження шкодочинними мікроорганізмами. Список літератури: 1. Патент України №73889, 15.09.2005, Бюл. №9. Спосіб обробки сільськогосподарських культур. Дульнєв П.Г. 2. Патент України №56313, 15.03.2003, Бюл. №5. Спосіб вирощування сільськогосподарських культур. Шакула M.К, Дульнєв П.Г та ін. 3. Марьяхина И.Я., Крашенниник Н.В., Китаєва И.Е. Разработка метода клонального размножения кочанной капусты в культуре ткани// Докл. ВАСХНИЛ. - 1979. - №7. - С.15-16. 4. Моисеева Н.А. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений// Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. -М.: Наука, 1992 - С.166-185. 5. Методика досліджень в культурі ізольованих тканин овочевих рослин// C.I. Кондратенко, В.П. Мірошніченко, О.Ф. Сергієнко та ін. - Мерефа, 2004. - 25с. 6. Murashige Т., Skoog F. A. revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// Physiol. Plant. - 1962. - V.15. - P.473-497. 7. Кондратенко С.И. Теоретическое обоснование для разработки экспериментальных подходов по устранению витрификации растенийрегенерантов белокочанной капусты in vitro II Овочівництво і баштанництво. - Харків, 2002. - Вип.47. - С.54-63. 8. Кружилин А.С., Шведская З.М. Биология двулетних растений. -М.: Наука, 1966. - 326с. 9. Лизгунова Т.В. Культурная флора СССР, Т. XI. Капуста. -Л.: Колос, 1984. - 328с. 10. Юсуфов А.Г. Регенерация высших растений. -М.: Знание, 1981. - 64с Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601