Спосіб мікроклонального розмноження видів тирличу жовтого gentiana lutea l. і тирличу безстеблового gentiana acaulis l.

Спосіб мікроклонального розмноження видів тирличу жовтого Gentiana lutea L. і тирличу безстеблового Gentiana acaulis L., що включає експлантацію вузлових сегментів стерильних проростків на живильні середовища, вкорінення отриманих мікроклонів на середовищах з різними концентраціями a -нафтилоцтової кислоти (НОК), який відрізняється тим, що готують живильне середовище на основі Мурасіге-Скуга, яке містить зменшені вдвічі концентрації основних макро- і мікроелементів, крім СаСl2, доповнене кінетином і 6-бензиламінопурином (БАП) при такому співвідношенні інгредієнтів, мг/л: NH4NО3 825 КNО3 950 СаСl2х2Н2O 220-440 MgSO4 x7H2 O 185 КН2РO4 85 КІ 0,415 Н3ВО3 3,15 U 2 (11) 1 3 21499 4 України (1996). Вони накопичують важливі для су; формування de novo бруньок невідомого похомедицини іридоїди (генціопікрозид, амарогентин, дження. амаросверин та амаропанін), алкалоїди (генціанін, В основу пропонованої корисної моделі постагенціанадин, генціанаїн, генціанамін), ксантони влено завдання розробити такий спосіб мікрокло(мангіферин та його похідні), флавоноїди (ізовітекнального розмноження видів тирличу жовтого син, ізоорієнтин, лютеолін, сапонарин, ізосапонаGentiana lutea L. і тирличу безстеблового Gentiana рин) тощо. Екстракти з кореневищ і коренів тирлиacaulis L. в культурі in vitro, який би дозволив збічів поліпшують функціональну діяльність травних льшити кількість отриманих життєздатних мікроорганів, а також здійснюють нормалізуючий вплив клонів шляхом підбору умов для мультиплікування на метаболічні функції печінки. Одним із основних рослин цих рідкісних фармакологічно цінних видів способів забезпечення фармацевтичної промисз одночасним їх оздоровленням від патогенної ловості рослинною сировиною є створення промимікрофлори. слових плантацій. Однак, для тирличів, зокрема Зазначене завдання вирішується пропоновакальцефільних видів, такий підхід внаслідок фізіоним способом мікроклонального розмноження вилогічних особливостей рослин (складність прородів тирличу жовтого Gentiana lutea L. і тирличу щування насіння, пізній вступ у фаз у цвітіння) є безстеблового Gentiana acaulis L., який, як і відонизькоефективним і економічно невигідним. Альмий спосіб мікроклонального розмноження видів тернативою природного розмноження є мікроклотирличу жовтого Gentiana lutea L. і тирличу безнальне розмноження в культурі in vitro. стеблового Gentiana acaulis L., включає експланВідомі спроби отримання пагонів тирличу жовтацію вузлових сегментів стерильних проростків того з ізольованих бруньок на живильному серена живильні середовища, вкорінення отриманих довищі Мурасіге-Скуга (МС) з додаванням активомікроклонів на середовищах з різними концентраваного вугілля та низьких концентрацій 6ціями a-нафтилоцтової кислоти, а, відповідно до бензиладеніну (БА), які не дали позитивних репропозиції, готують .живильне середовище на осзультатів - ізольовані бруньки поступово буріли і нові Мурасіге-Скуга, яке містить зменшені вдвічі відмирали [1]. Відомий спосіб отримання мікроконцентрації основних макро- і мікроелементів, клонів Gentiana lutea L. з різних типів експлантів крім СаСlз, доповнене кінетином і 6(квіткових і кореневищних бруньок, пагонових апебензиламінопурином при такому співвідношенні ксів та кінчиків стеблової меристеми із листковими інгредієнтів, мг/л: примордіями) інтактних рослин на середовищі МС, NH4NО3 825 доповненому фітогормонами БА, індолілоцтовою КNО3 950 (ІОК), індолілмасляною та гібереловою кислотаСаСl2х2Н2O 220-440 ми [2]. MgSO4 x7H2 O 185 Недоліком цього способу є необхідність КН2РO4 85 використання великої кількості вихідних рослин, КІ 0,415 що недоцільно, зважаючи на рідкісність тирличу Н3ВО3 3,15 жовтого. Використання експлантів з інтактних, а не МnSO4 х4Н2 О 11,1 асептичних, рослин, є причиною високого відсотку ZnSO4 x7H2O 4,3 інфікування і загибелі експлантів (до 89%), а також Na2MoO4 x2H2O 0,125 зниження їх життєздатності через шкідливий вплив CuSO4x5H2O 0,0125 стерилізуючого агента та утворення калюсу, що є CoSO4x6H2O 0,0125 небажаним при мультиплікації рослин. Nа2ЕДТАх2Н2O 18,65 Найбільш близьким до пропонованого за кільFeSO4 x7H2O 13,9 кістю суттєви х ознак є спосіб мікроклонального Тіамін НСl (В1) 0,1 розмноження видів тирличу жовтого Gentiana lutea Піридоксин НСl (В6) 0,5 L. і тирличу безстеблового Gentiana acaulis L., що Нікотинова кислота (РР) 0,5 включає експлантацію вузлових сегментів стери6-бензиламінопурин 0,05-0,5 льних проростків на живильні середовища, вкоріКінетин 0,1 нення отриманих мікроклонів на середовищах з Мезоінозит 100 різними концентраціями a-нафтилоцтової кислоти Сахароза 20000 (НОК) [3]. Згаданий спосіб застосовують для мікАгар 7000-8000 ророзмноження чотирьох видів роду Gentiana L. Вода до 1л, Для мікроклонального розмноження Gentiana lutea у приготованому живильному середовищі доL. і Gentiana acaulis L. використовують вузлові севодять рН до 5,5-5,7, розливають у колби, автогменти стерильних проростків, які висаджують у клавують протягом 15-20 хвилин при тиску в одну випадку Gentiana lutea L. на середовище МС, атмосферу, охолоджують його до кімнатної темпеGentiana acaulis L. - на середовище з макросолями ратури, висаджують на нього експланти - ділянки середовища WPM (Woody Plant Medium salts), мікпагонів із пазушними бруньками, вилучені з 1,5-2-х росолями МС; доповнені різними концентраціями місячних стерильних рослин, отриманих з насіння ІОК та БА [3]. тирличу жовтого Gentiana lutea L. та тирличу безНедоліками цього способу є недостатня кільстеблового Gentiana acaulis L. in vitro, готують жикість одержаних життєздатних мікроклонів через вильне середовище того ж складу, з якого вилувикористання високих концентрацій БА; утворення чають БАП, і на яке висаджують отримані на пізніших пасажах на поверхні експлантів у місмікроклони для підрощування, готують живильне цях їх контакту з живильним середовищем, калюсередовище того ж складу, з якого вилучають БАП і кінетин і додають 0,1мг/л НОК, і на нього виса 5 21499 6 джують підрощені пагони для вкорінення, вкорінені вності освітлення 1500-2000лк, вологості повітря рослини висаджують у ґр унт. 70-80%. Вибір середовища МС як базового для мікроЧерез 25-40 діб із бруньок формувалися пагоклонування Gentiana lutea L. та Gentiana acaulis L. ни. Кількість експлантів, здатних формувати пагообумовлений використанням багатьма досліднини (мікроклони), складала для Gentiana lutea L. ками його у якості живильного субстрату для росту 54% і для Gentiana acaulis L.-46%. Кількість пагонів та диференціації в культурі in vitro представників у розрахунку на один висаджений живець складароду Gentiana L. [4]. Авторами експериментально ла 1,5 і 0,8, відповідно (таблиця 1). встановлені оптимальні склад і кількість інгредієнПриклад 2. Готували живильне середовище за тів пропонованого живильного середовища. Зваприкладом 1, в якому концентрацію СаСl2х2Н2O жаючи на те, що Gentiana lutea L. і Gentiana acaulis збільшували в 2 рази - до 440мг/л. L. є кальцефільними видами [5, 6], для підвищення За ти х самих умов вирощування експлантів ефективності мікроклонування у живильне серечерез 25-40 діб формувалися адвентивні пагони. довище Мурасіге-Скуга із зменшеною вдвічі конКількість експлантів, здатних формувати пагони центрацією макро- та мікросолей (МС/2) додавали (мікроклони), складала для Gentiana lutea L. 92% і вдвічі вищі концентрації СаСl2x2Н2O. Також вносидля Gentiana acaulis L.-83%. Кількість пагонів у ли цитокініни БАП та кінетин, оскільки вони стимурозрахунку на один висаджений живець складала люють клітинний поділ, і, таким чином, сприяють 4,2 і 2,6, відповідно (таблиця 1). формуванню мікроклонів. Для активації процесів При необхідності одержання великої кількості коренеутворення у мікроклонів використовували рослин отримані мікроклони відділяли від первинауксин НОК. Згадана кількість кожного інгредієнту ного експланту, розрізали на фрагменти - кожен з визначена авторами експериментально і є оптибічними бруньками, і повторно висаджували на мальною для отримання позитивного результату. живильні середовища, наведені в прикладах 1 і 2. Індукували регенерацію мікроклонів наступним Для росту пагонів (мікроклонів) використовучином. Вилучені з вирощених із насіння in vitro 1,5вали живильні середовища, наведені в прикладах 2-x місячних стерильних рослин ділянки пагонів 1 і 2, зі складу яких вилучали БАП. довжиною 10-15мм з пазушними бруньками висаПагони висотою 4-5см укорінювали на живиджували на живильне середовище МС/2, доповнельних середовищах, наведених у прикладах 1 і 2, не 0,1мг/л кінетину і 0,05мг/л БАП для Gentiana зі складу яких вилучали БАП і кінетин і доповнюlutea L. та 0,1мг/л кінетину і 0,5мг/л БАП для вали 0,1мг/л НОК. Відсоток мікроклонів, що утвоGentiana acaulis L. рили корені на середовищі за прикладом 1 склаПриклад 1. Готували живильне середовище дав для Gentiana lutea L. 14% і для Gentiana МС/2 наступного складу, мг/л: acaulis L. - 10%; за прикладом 2 - для Gentiana NH4NО3 825 lutea L. 79% і для Gentiana acaulis L.-71% (таблиця КNО3 950 2). СаСl2х2Н2О 220 Укорінені рослини висаджували у ґрунт і виMgSO4 x7H2 O 185 рощували із врахуванням біологічних потреб виКН2РO4 85 дів. Відсоток життєздатних, морфологічно нормаКІ 0,415 льних рослин, що адаптувалися до росту в ґрунті, Н3ВО3 3,15 складав для Gentiana lutea L. 37% і для Gentiana MnSO4 x4H2 O 11,1 acaulis L. - 32% (таблиця 2). Отримані в умовах in ZnSO4 х7Н2О 4,3 vitro і висаджені в ґрунт рослини нормально росли Na2MoO4 x2H2O 0,125 і розвивалися, вирізняючись здоровим зовнішнім CuSO4x5H2O 0,0125 виглядом. CoSO4x6H2O 0,0125 Використання живильних середовищ МС та Nа2ЕДТАх2Н2O 18,65 МС/2 з іншими комбінаціями фітогормонів було FeSO4 x7H2O 13,9 малоефективним - формування мікроклонів не Тіамін НСl (В1) 0,1 перевищувало 20-30%, а до росту в ґрунті адаптуПіридоксин НСl (В6) 0,5 валися 5-9% рослин. Нікотинова кислота (РР) 0,5 Таким чином, запропонований спосіб мікро6-бензиламінопурин 0,05-0,5 клонального розмноження кальцефільних видів Кінетин 0,1 тирличу жовтого Gentiana lutea L. і тирличу безМезоінозит 100 стеблового Gentiana acaulis L. на живильному сеСахароза 20000 редовищі Мурасіге-Скуга, яке містить зменшені Агар 7000-8000 вдвічі концентрації макро- і мікросолей, окрім Вода до 1 л, СаСl2х2Н2O, дозволяє: 1) мультиплікувати рослиу приготованому живильному середовищі дони рідкісних фармакологічно цінних видів з одноводили рН до 5,5-5,7. часним їх оздоровленням від патогенної мікроСередовище розливали у колби і стерилізувафлори; 2) в 1,7-1,8 рази підвищити відсоток ли гарячою парою при 1атм. протягом 15-20хв. формування мікроклонів і в 2,8-3,1 рази збільшити Колби з висадженими в асептичних умовах кількість мікроклонів у перерахунку на один жиексплантами культивували при температурі +22вець; 3) в 5,7 рази підвищити відсоток укорінення 25°С, 12-16-годинним світловим днем при інтенсипагонів для Gentiana lutea L. і в 7,1 рази - для Gentiana acaulis L. 7 21499 8 Таблиця 1 Результати мікроклонального розмноження тирличу жовтого Gentiana lutea L. та тирличу безстеблового Gentiana acaulis L. на основі культивування in vitro ділянок пагонів з пазушними бруньками за прикладами 1 і 2 Вид Gentiana lutea L. Gentiana acaulis L. Висаджено живців з брунькам и, шт. Формування мікроклонів Приклад 1 Сформували Кількість мік- Висаджено жимікроклони, роклоні в на 1 вців з брунька% живець, шт. ми, шт. Приклад 2 Сформували Кількість мікмікроклони, роклоні в на 1 % живець, шт. 24 54,2±10,17 1,5±0,11 24 91,7±5,63 4,25±0,41 24 45,8±10,17 0,83±0,07 24 83,3±7,61 2,63±0,24 Таблиця 2 Результати вкорінення мікроклонів тирличу жовтого Gentiana lutea L. та тирличу безстеблового Gentiana acaulis L. за прикладами 1 і 2 та адаптації висаджених рослин до росту в ґр унті Вкорінення пагонів Приклад 1 Вид Приклад 2 Висаджено пагонів, шт. Gentiana lutea L. Gentiana acaulis L. Укорінили ся, % Висаджено па- Укорінилися, гонів, шт. % 36 13,9±5,77 102 20 10±6,71 63 Література: 1. Демків Л.О. Вегетативне розмноження in vitro видів роду Gentiana L. (Gentianaceae) // Укр. ботан. журн. - 1993. - Т.50, №1. - С.146-149. 2. Feijoo M.C., Iglesias I. Multiplication of an endangered plant: Gentiana lutea L. subsp. Aurantiaca Lainz, using in vitro culture // Plant Tissue Cult. Biotechnol. - 1998. - Vol.4, №2. - P.87-94. 3. Momcilovic I., Grubisic D., Neskovic M. Micropropagation of four Gentiana species (G. lutea, G. cruciata, G. purpurea and G. acaulis) II Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1997. - Vol.49, №2. - P.141-144. Комп’ютерна в ерстка В. Мацело Кількість життєздатних, морфологічно нормальних рослин, які прижилися в ґрунті Висаджено, % % 79,4±4,01 73 36,9±5,65 71,4±5,69 37 32,4±7,69 4. Голубенко А.В. Мор фогенез та особливості вегетативного розмноження видів роду Gentiana L. in vitro: Дис. канд. біол. наук: 03.00.12. К., 2005. - 193с. 5. Малиновський К.А., Міркін Б.М., Ішбірдін А.Р., Комендар B.I., Крічфалушій В.В. Синтаксономія прибережно-водних, болотних, лучни х, чагарникових і чагарничкових угр уповань високогір’я Українських Карпат // Укр. ботан. журн. - 1992. - Т. 49, №4. - С.5-13. 6. Стойко С.М., Саїк Д.С., Татаринов К.А. Карпатський заповідник. - Ужгород: Карпати, 1982. 128с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601