Спектрофотометричний спосіб визначення флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового

Реферат: Спектрофотометричний спосіб визначення флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового включає спектрофотометрію спиртового екстракту сировини в ультрафіолетовому спектрі при додаванні алюмінію хлориду та кислоти оцтової, визначення оптичної густини досліджуваної проби за довжини хвилі 411 нм, порівняння зі стандартним розчином рутину. Як рослинну сировину використовують надземну частину кураю пагорбкового, спиртовий екстракт якого одержують при кип'ятінні на водяній бані зі спиртом етиловим 70 % протягом 60 хвилин при співвідношенні сировина:екстрагент 1:20, розчин алюмінію хлориду 5 % у розчині кислоти оцтової 50 г/л у етанолі додають у кількості 1:1, розчин кислоти оцтової 50 г/л у 96 % етанолі додають у кількості 15 мл. UA 92872 U (54) СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧНИЙ СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ФЛАВОНОЇДІВ У НАДЗЕМНІЙ ЧАСТИНІ КУРАЮ ПАГОРБКОВОГО UA 92872 U UA 92872 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до фармації, зокрема до способів хімічного аналізу, а саме до контролю якості рослинної сировини за вмістом флавоноїдів. Відомо, що флавоноїди виявляють високу біологічну активність завдяки наявності у молекулі активних фенольних гідроксильних та карбонільних груп, які у ході різних біохімічних модифікацій, приймають участь у ряді фізіологічних процесів та виявляють широкий спектр фармакологічної активності, серед якої визначаються сечогінна, противірусна, кардіотонічна, гіпотензивна, капілярозміцнююча, протипухлинна та інші [1-5]. Особливої уваги набуває виражена антиоксидантна, імуномоделююча, гепатопротекторна дії та інші [6-9]. Багатий вміст флавоноїдів має рослина - курай пагорбковий (Salsola collina L.; рос. ″кувыркающийся сорняк, перекати-поле, катун, верблюжья колючка, русский или татарский чертополох)″ родини Мареві (Chenopodiaceae). Аналізуючи інформаційні джерела можна зазначити, що у надземній частині кураю пагорбкового містяться флавоноїди, які представлені головним чином, похідними кемпферолу, кверцетину і ізофлавоноїдами (5,2-дигідрокси-5-метокси-6,7-метилендіоксі-ізофлавон) [10]. Серед методик, які найчастіше зустрічаються для кількісного визначення суми флавоноїдів, можна виділити дві групи. Перша група - прямі спектрофотометричні методики з розрахунком кількісного вмісту методом показника поглинання після попереднього розділення або хроматографічного виділення флавоноїдів із сировини чи готового лікарського засобу [11-13]. Ці методики є тривалими, вони використовуються для фітохімічних досліджень нової лікарської сировини, оскільки дозволяють визначити окремі підкласи сполук і встановити власне видову належність тієї чи іншої рослинної сировини, звичайно, після попереднього хроматографічного розділення класів біологічно активних речовин (БАР). Такі методики практично не мають значення при створенні аналітичної нормативної документації на сировину чи готові лікарські засоби. Друга група методик - це методики із застосуванням стандарту [14]. Попередньо проводиться гідроліз усіх форм флавоноїдів до агліконів, а потім для отримання забарвленого продукту використовують реакцію комплексоутворення алюмінію хлориду з виділеними агліконами. Ця методика застосовується для контролю якості ЛРС відповідно до вимог чинної ДФУ [10]. Основною перевагою цього методу є можливість вибіркового визначення флавоноїдів у складних сумішах поліфенольних сполук без попереднього їх розділення. При цьому відбувається батохромний зсув першої смуги поглинання флавоноїдів, який дозволяє виключити вплив інших біологічно активних речовин фенольної структури [15, 16]. За найближчий аналог вибрано спосіб визначення флавоноїдів у траві рутки лікарської [17]. Відомий спосіб здійснюють шляхом спектрофотометрії спиртового екстракту з надземної частини рутки лікарської в ультрафіолетовому спектрі при додаванні алюмінію хлориду та кислоти оцтової та визначенні оптичної густини досліджуваної проби за довжини хвилі 411 нм, у порівнянні зі стандартним розчином рутину. Спиртовий екстракт рутки лікарської одержують при кип'ятінні на водяній бані зі спиртом етиловим 50 % протягом 30 хвилин при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10. Недоліком даного способу є неможливість визначення флавоноїдів в екстрактах з надземної частини кураю пагорбкового (Salsola collina L.). В основу корисної моделі поставлено задачу, що полягає у створенні способу визначення флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового, придатного для стандартизації за показником - вміст флавоноїдів. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб кількісного визначення флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового шляхом спектрофотометрії водно-спиртового екстракту сировини в ультрафіолетовому спектрі при додаванні алюмінію хлориду та кислоти оцтової та визначенні оптичної густини досліджуваної проби за довжини хвилі 411 нм, у порівнянні зі стандартним розчином рутину, у відповідності з корисною моделлю, передбачає, що як рослинну сировину використовують надземну частину кураю пагорбкового, спиртовий екстракт якого одержують при кип'ятінні на водяній бані зі спиртом етиловим 70 % протягом 60 хвилин при співвідношенні сировина:екстрагент 1:20, розчин алюмінію хлориду 5 % у розчині кислоти оцтової 50 г/л в етанолі додають у кількості 1:1. Розчин кислоти оцтової 50 г/л у 96 % етанолі додають у кількості 15 мл. Ознаки заявленого способу визначені експериментальним шляхом. Спиртовий екстракт кураю пагорбкового, одержаний описаним вище методом, є оптимальним для подальшого спектрофотометричного дослідження. Використання даного екстракту у поєднанні з визначеними концентраціями та кількістю розчинів алюмінію хлориду та 1 UA 92872 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кислоти оцтової при довжині хвилі 411 нм дають найбільш виражений максимум поглинання, що забезпечує точність визначення, збіжність та відтворюваність результатів. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: висушену надземну частину кураю пагорбкового подрібнюють до розміру часток, що проходять крізь сито з діаметром отвору 0,350 мм. 5,0000 (точна наважка) подрібненої сировини вміщують у мірну колбу, додають 100 мл 70 % етанолу та кип'ятять на водяній бані протягом 60 хвилин. Отриманий розчин охолоджують, фільтрують. 1 мл отриманого екстракту вміщують у мірну колбу ємкістю 25 мл, додають 10 мл 96 % спирту етилового, 1 мл 5 % розчину алюмінію хлориду у розчині кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому. Через 10 хвилин доводять об'єм розчином кислоти оцтової 50 г/л у 96 % етанолі до мітки та перемішують. Через 30 хвилин вимірюють оптичну густину досліджуваного розчину на спектрофотометрі за довжини хвили 411 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Як розчин порівняння використовують розчин, приготований наступним чином: аліквоту 1 мл фільтрату вміщують у мірну колбу місткістю 25 мл, додають 10 мл 96 % спирту етилового. Через 10 хвилин доводять об'єм розчином кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому до мітки та перемішують. Паралельно вимірюють оптичну густину розчину стандартного зразка рутину, приготованого наступним чином: 0,0200 (точна наважка) рутину вміщують у мірну колбу місткістю 50 мл, розчиняють у 30 мл 96 % етанолу, перемішують та доводять 96 % етанолом до мітки. Аліквоту 1 мл отриманого розчину вміщують у мірну колбу місткістю 25 мл, додають 10 мл 96 % спирту етилового, 1 мл 5 % розчину алюмінію хлориду у розчині кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому. Через 10 хвилин доводять об'єм розчином кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому до мітки та перемішують. УФ-спектр флавоноїдів кураю після реакції з розчином алюмінію хлориду характеризується наявністю максимуму поглинання за довжини хвилі 411 нм. Вміст суми флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового у перерахунку на рутин розраховують за емпіричною формулою: A1  m0  V2  V4  V6  100 x  100 % , A 0  m1  V1  V3  V5  100  d де: A 0 - оптична густина розчину стандартної речовини рутину за довжини хвилі 411 нм; A 1 - оптична густина досліджуваного розчину за довжини хвилі 411 нм; m0 - маса наважки рутину, г; m1 - маса наважки надземної частини кураю пагорбкового для приготування спиртового екстракту, г; V1 - об'єм мірної колби (50 мл) для приготування розчину рутину, мл; V2 - об'єм аліквоти (1 мл) отриманого розчину рутину, мл; V3 - об'єм мірної колби (25 мл) для розведення розчину рутину, мл; V4 - об'єм мірної колби (100 мл) для приготування екстракту з надземної частини кураю пагорбкового, мл; V5 - об'єм аліквоти (1 мл) екстракту з надземної частини кураю пагорбкового для приготування досліджуваного розчину, мл; V6 - об'єм мірної колби (25 мл) для приготування досліджуваного розчину, мл; d - показник вологості лікарської рослинної сировини надземної частини кураю пагорбкового, %. Корисна модель пояснюється прикладом. Приклад 1. У відповідності із заявленим способом висушену надземну частину кураю пагорбкового подрібнили до розміру часток 0,350 мм. 5,0124 г (точна наважка) подрібненої сировини помістили у мірну колбу, додали 100 мл 70 % етанолу та кип'ятили на водяній бані протягом 60 хвилин. Отриманий розчин охолодили, відфільтрували. 1 мл отриманого екстракту помістили у мірну колбу ємністю 25 мл, додали 10 мл 96 % спирту етилового, 1 мл 5 % розчину алюмінію хлориду у розчині кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому. Через 10 хвилин довели об'єм розчином кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому до мітки та перемішали. Через 30 хвилин вимірювали оптичну густину досліджуваного розчину на спектрофотометрі за довжини хвилі 411 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. Як компенсаційний розчин використовували розчин, приготований наступним чином: аліквоту 1 мл фільтрату помістили у мірну колбу місткістю 25 мл, додали 10 мл 96 % етанолу. Через 10 хвилин 2 UA 92872 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 доводили об'єм розчином кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому до мітки та перемішали. Паралельно вимірювали оптичну густину розчину стандартного зразка рутину, приготованого наступним чином: 0,0214 г (точна наважка) рутину помістили у мірну колбу місткістю 50 мл, розчинили у 30 мл 96 % етанолу, перемішали та довели 96 % етанолом до мітки. Аліквоту 1 мл отриманого розчину помістили у мірну колбу ємністю 25 мл, додали 10 мл 96 % етанолу, 1 мл 5 % розчину алюмінію хлориду у розчині кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому. Через 10 хвилин довели об'єм розчином кислоти оцтової концентрованої 50 г/л у спирті етиловому до мітки та перемішали. Вміст суми флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового у перерахунку на рутин розраховували за емпіричною формулою: 0,131  0,0214  1 100  25  100 x  100 % . 0,243  4,9124  50  25  1 100  12  x  0,523 % Отримані результати відповідають даним, відомим з джерел інформації, і свідчать про достовірність результатів, одержаних заявленим способом. Таким чином, заявлено спосіб визначення флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового, який дозволяє ідентифікувати та визначити вміст суми флавоноїдів у лікарській рослинній сировині надземної частині кураю пагорбкового та відзначається точністю, доступністю, збіжністю, відтворюваністю в умовах різних лабораторій та є ефективним для використання як в умовах виробництва, так і в умовах аптек при визначенні якості лікарської рослинної сировини. Джерела інформації: 1. Доркина Е.Г. Изучение гепатозащитного действия природных флавоноидных соединений / Е.Г. Доркина // Эксперим. клин, фармакол. - 2004. - Т. 67, № 6. - С. 41-44. 2. Оценка антиоксидантной и антитоксической эффективности природного флавоноида дигидрокверцетина / О.В. Кравченко, С.В. Морозов, Л.И. Авреньева и [др.] // Токсикол. вестник. 2005. - № 1. - С. 14-20. 3. Чернов Ю.Н. Полифенольные соединения: структура, свойства и прикладные аспекты применения / Ю.Н. Чернов, А.В. Бузлама, Ю.М. Дронова // Фарматека. - 2004. - № 8. - С. 43-48. 4. Distinctive antioxidant and antiinflammatory effects of flavonols / L. Wang, Yi-Chen Tu, Tzi-Wei Lian [et al.] // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2006. - Vol. 54, № 26. - P. 9798-9804. 5. Flavonoids: Old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs / Giulia Di Carlo, Nicola Mascolo, Angelo A. Izzo [et al.] // Life Sciences. - 1999. - V. 65, Issue 4. - P. 337-353. 6. Chemical and biologically active constituents of Salsola collina / Yong-Sheng Jin, Jing-Ling Du, Yan Yang[et al.] // Chemistry of Natural Compounds. - 2011. - V. 47(2). P. 257-260 7. Flavonoids of Salsola collina / A.I. Syrchina, A.L. Vereshchagin, M.F. Larin [et al.] // Chemistry of Natural Compounds. - 1989. - V. 25(5). - P. 619-620 8. Active oxygens generation by flavonoids / Y.H. Miura, I. Tomita, T.Watanabe [et al.] // Biol. Pharm. Bull. - 1998. - Vol. 21, № 2. - P. 93-96. 9. Effects of quercetin on liver damage in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis / A. Pavanato M, J. Tunon, S. Sanchez-Campos [et al.] // Dig. Dis. Sei. 2003. - Vol. 48(4). - P. 824-829. 10. Державна Фармакопея України / Держ. п-во "Науково-експертний фармакопейний центр". - 1-е вид., 2 доп. - X.: РІРЕГ, 2008. - 620 с. 11. Кемертелидзе Э.П. Физико-химические методы анализа некоторых биологически активных веществ растительного происхождения / Э.П. Камертелидзе, В.П. Георгиевский. Тбилиси: Изд-во "Мецниереба", 1976. - 222 с. 12. Клыков А.Г. Сезонная динамика содержания рутина и репродуктивность надземной фитомассы у трех видов Fagopyrum Mill., выращиваемых в Приморском крае / А.Г. Клыков, Л.М. Моисеенко, П.Г. Горовой // Растит. Ресурсы. - 2003. - Т. 39, № 3. - С. 77-82. 13. Оценка содержания суммы флавоноидов в настойке / Е.К. Слуева, Е.Н. Жукович, Л.А. Шарикова и др. // Фармация. - 2003. - № 1. - С. 13-15. 14. Котова Э.Э. Стандартизация плодов боярышника и лекарственных препаратов на их основе по показателю "Количественное определение" / Э.Э. Котова, А.Г. Котов, Н.П. Хованская // Фармаком. - 2004. - № 4. - С. 35-41. 15. Использование физико-химических методов в анализе лекарственных средств растительного происхождения / О.М. Маркова, В.А. Карпенко, А.С. Саушкина и др. // Вестник ВГУ. Серия химия, биология, фармация. - 2003. - № 1. - С. 99-100. 3 UA 92872 U 5 16. Криворучко О.В. Кількісне визначення флавоноїдів і полісахаридів у лікарських засобах з листя смородини чорної / О.В. Криворучко, О.Ю. Ткаченко, B.C. Кисличенко // Фармацевтичний журнал. - 2003. - №4. - С 76-78. 17. Україна Пат. № 62370 UA, МПК G01J 3/30 (2006.01) G01N 21/00 А61К 36/50 (2006.01). / НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ. - З. № u201101354; Заявл. 07.02.2011; Опубл. 25.08.2011. СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ФЛАВОНОЇДІВ У ТРАВІ РУТКИ ЛІКАРСЬКОЇ. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спектрофотометричний спосіб визначення флавоноїдів у надземній частині кураю пагорбкового шляхом спектрофотометрії спиртового екстракту сировини в ультрафіолетовому спектрі при додаванні алюмінію хлориду та кислоти оцтової та визначенні оптичної густини досліджуваної проби за довжини хвилі 411 нм, у порівнянні зі стандартним розчином рутину, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують надземну частину кураю пагорбкового, спиртовий екстракт якого одержують при кип'ятінні на водяній бані зі спиртом етиловим 70 % протягом 60 хвилин при співвідношенні сировина:екстрагент 1:20, розчин алюмінію хлориду 5 % у розчині кислоти оцтової 50 г/л у етанолі додають у кількості 1:1, розчин кислоти оцтової 50 г/л у 96 % етанолі додають у кількості 15 мл. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4