Спосіб визначення імунореактивності організму хворих на ювенільний ревматоїдний артрит

Реферат: Спосіб визначення імунореактивності організму хворих на ювенільний ревматоїдний артрит за допомогою цитогенетичного аналізу крові. Досліджують препарати хромосом, отримані з культури периферичної крові, і підраховують кількість лімфоцитів без асоціативної здатності акроцентричних хромосом і з асоціацією із двох акроцентричних хромосом (КЛ0+2). UA 94784 U (12) UA 94784 U UA 94784 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме, до ревматології та генетики, і може бути використана для визначення імунореактивності організму, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит (ЮРА), на підставі застосування цитогенетичного методу дослідження. Ювенільний ревматоїдний артрит - тяжке імуноагресивне хронічне захворювання, що розвивається у дітей віком до 16 років, проявами якого є переважно деструктивно-запальні зміни в суглобах. Формування ЮРА може ініціюватися багатьма факторами ендогенного (спадкова схильність) та екзогенного (травми, вірусні захворювання, проживання в несприятливих екологічних умовах) ґенезу. Перебіг ювенільного ревматоїдного артриту характеризується формуванням стійкого олігоабо поліартикулярного суглобового синдрому, хронічним неухильнопрогресуючим перебігом, формуванням деструктивних змін у суглобах, і як наслідок - швидким розвитком інвалідизації хворих, зниженням якості життя, соціальною та психологічною дезадаптацією. Оскільки ювенільний ревматоїдний артрит - це автоімунне захворювання, необхідно постійно контролювати стан імунної системи. За допомогою оцінки імунореактивності лімфоцитів периферичної крові (ЛПК), активованих в організмі людини, які є імунними клітинами, що специфічно реагують на будь-який антигенний стимул. Відомий спосіб оцінки проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові за допомогою визначення діаметру лімфоцитів, клітини з діаметром до 6,5 і менше визначають як активовані лімфоцити. (Аналог: Пат. 2080597, UA, МПК G01N 33/48, G01N 33/53. Способ определения активированных лимфоцитов в крови /А.К. Фролов [и др.]; патентовласник Запорізький державний університет. - № 5026024/14; заяв. 05.03.1991; опубл. 03.09.1992). Метод активованих лімфоцитів у крові є відносно простим, у зв'язку з чим немає необхідності в обладнанні для ведення культури клітин, але недоліком цього способу є недостатня його точність, оскільки розмір клітин це лише опосередкований показник функціонального стану клітини. Відомим способом щодо визначення імунологічної реактивності організму людини є реакція бластної трансформації лімфоцитів. Метод дозволяє оцінити проліферативну здатність лімфоцитів, потребує мінімальної кількості обладнання і реактивів для роботи з культурою клітин. (Аналог: Пат. 2008685, RU, МПК G01N 33/00. Способ прогнозирования течения хронического панкреатита /Н.Б. Губергриц; патентовласник Донецький держаний медичний інститут ім. A.M. Горького. - № 5007110/14; заяв. 30.10.1991, опубл. 28.02.1994). Але для оцінки результатів необхідно використовувати радіоізотопні методи дослідження, які є надзвичайно кошторисними. Крім того, при проведенні цієї методики робота з радіоактивністю передбачає необхідність додаткового обладнання, навичок співробітників лабораторії і спеціальних вимог до приміщення. За частотою виникнення асоціацій акроцентричних хромосом (ААХ) в ЛПК можна судити про проліферативну активність і міграцію лімфоцитів у відповідь на антигенний стимул. В нормі у людини превалюють клітини без ААХ та з двома асоціюючими аероцентричними хромосомами. Це клітини, що діляться, тому асоціації в них порушуються під час руху хромосом при мітозі. Вони складають активний пул клітин в організмі, відношення цих клітин до загальної кількості клітин є показником імунореактивності організму. Найближчим аналогом є цитогенетичний спосіб оцінки функціональної активності Тлімфоцитів крові пацієнта. Суть цього методу полягає в культивуванні ЛПК на поживному середовищі, з подальшим приготуванням хромосомних препаратів, і підрахунком клітин без асоціацій (КЛ0) та з двома асоціюючими акроцентричними хромосомами (КЛ2), та з асоціаціями, які складаються з більш ніж 5-ти акроцентричних хромосом (КЛ5>). Автори визначають відсотковий вміст зазначених лімфоцитів від загальної кількості лімфоцитів, що знаходяться в метафазі. При збільшенні відсоткового вмісту КЛ0 не менше ніж на 20 % в порівнянні зі значеннями даного показника, отриманого від пацієнта раніше, і присутністю КЛ5> оцінюють активність Т-лімфоцитів, як нормальну. При збільшенні відсоткового вмісту КЛ0 не менше ніж на 60 % в порівнянні зі значеннями даного показника, отриманого раніше, і присутністю КЛ5> або при зниженні відсоткового вмісту КЛ0 не менше ніж на 60 %, і збільшенні відсоткового вмісту КЛ5> більше ніж в два рази в порівнянні з попередніми показникам, оцінюють активність Тлімфоцитів як знижену (Пат. 2112984, RU, МПК G01N 33/49. Цитогенетический способ оценки функциональной активности Т-лимфоцитов крови пациента /Т.В. Викторова [и др.]; патентовласник Викторова Татьяна Викторовна. - № 95100923/14; заяв. 02.02.1995, опубл. 10.06.1998). Недоліком найближчого аналога є те, що не враховуються асоціації, які складаються з трьох і чотирьох хромосом, адже такі асоціації також свідчать про тривалість циркуляції Т-лімфоцитів, і якщо їх не враховувати - результати не будуть відповідати дійсності. Крім того, подібне дослідження повинно проводитись для конкретної нозології, адже інтерпретація результатів 1 UA 94784 U 5 10 15 20 25 30 35 може відрізнятись при різних патологічних станах, особливо це стосується аутоімунних захворювань. Задачею даного способу є створення такого способу визначення імунореактивності організму хворих на ювенільний ревматоїдний артрит, при якому за допомогою цитогенетичного аналізу крові хворого можна було б визначити імунореактивність організму хворого підлітка з високою ефективністю в ранній період хвороби. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення імунореактивності організму хворих на ювенільний ревматоїдний артрит, що включає цитогенетичного аналізу крові, згідно з корисною моделлю дослідження препаратів хромосом, отриманих з культури периферичної крові і підрахунку кількості лімфоцитів без асоціативної здатності акроцентричних хромосом і з асоціацією із двох акроцентричних хромосом (КЛ0+2),, при значеннях показника КЛ0+235,0 % діагностують високу проліферативну активність лімфоцитів периферичної крові і підвищену імунореактивність організму хворого, при значеннях КЛ0+2≤32,0 % - низьку проліферативну активність лімфоцитів периферичної крові і знижену імунореактивність організму хворого. Цитогенетичне дослідження здійснюють за методикою Т.Е. Зерової-Любимової, Н.Г. Горовенко (2003). Матеріалом для цитогенетичного аналізу слугують препарати хромосом, отримані з культури лімфоцитів периферичної крові хворих. Суть способу полягає в тому, що у хворих дітей та підлітків проводять забір крові із ліктьової вени у кількості 1,0 мл, потім додають у два культуральних флакони з поживним середовищем, ембріональною сироваткою та фітогемагглютиніном, і культивують у термостаті при t+37 °C протягом 72 годин. На наступному етапі клітини крові гіпотенізують, потім здійснюють фіксацію препаратів розчином етилового спирту (96°) та льодяної оцтової кислоти у концентрації 3:1. Суміш наносять на предметне скло, висушують, а потім проводять ідентифікацію хромосом на препаратах, гомогенно забарвлених барвником Гімза. Препарати хромосом досліджують за допомогою бінокулярного мікроскопа Leica CME (Австрія), окуляр 10×18, об'єктив 100 х, бінокулярна насадка 1,25 х. Аналізують від 50 до 100 метафазних пластинок з визначенням асоціативної здатності акроцентричних хромосом (ААХ). За асоціацію між акроцентричними хромосомами (АХ) приймають випадки, коли їх короткі плечі взаємно орієнтовані і приєднуються одне до одного, або знаходяться на відстані, яка не перевищує діаметр хроматиди. Серед усіх АХ, які вступають в асоціацію, аналізують метафазні пластинки без асоціацій та з двома асоціюючими акроцентриками (КЛ0+2). Враховують наступні показники, які характеризують асоціативну спроможність акроцентриків: АІ (асоціативний індекс) - відсоток клітин з ААХ; А/М - відсоткове число ААХ на метафазу; КЛ0+2 - кількість лімфоцитів без ААХ і з асоціацією із двох АХ; КЛ3> - відсоткове число клітин із трьох та більше ААХ; n - кількість проаналізованих клітин. (КЛ0  2)* 40 45 50 55 100 n Запропонований спосіб визначення імунореактивності організму хворих на ювенільний ревматоїдний артрит, у котрих виявляється зменшене значення КЛ0+2, дозволяє своєчасно провести профілактичні заходи і тим самим мінімізувати несприятливі наслідки в майбутньому. Клінічний приклад 1. Хвора Христина Ш., 7 років (історія хвороби № 3231) надійшла до кардіоревматологічного відділення клініки зі скаргами на біль в суглобах верхніх кінцівок. Із анамнезу життя: дівчинка народилась від першої фізіологічної вагітності, пологів шляхом кесаревого розтину. Маса тіла при народженні – 3800 г., довжина тіла - 52 см. До року психомоторний розвиток дівчинки відповідав віковим нормам. Перші прояви захворювання з'явились в 4 роки. Перенесені захворювання: гострі респіраторні захворювання (ГРЗ), вітряна віспа. Операцій, травм не було. Об'єктивно: на момент обстеження дівчинки загальний стан здоров'я задовільний. Шкіра, слизові оболонки чисті, звичайного кольору. В легенях везикулярне дихання, тони серця ритмічні, але прискорені (тахікардія), ніжний систолічний шум на верхівці. Живіт м'який, безболісний. Печінка збільшена на 1 см, селезінка не пальпується. Помірний набряк променевозап'ястних суглобів і кистей. Решта суглобів без особливостей. За даними лабораторних досліджень: клінічний аналіз крові та сечі без особливостей. Біохімічний аналіз крові: сіалові кислоти - 127 од. (норма до 220 од.), сіромукоїди - 0,175 од. (норма 0,130-0,260 од.), глікопротеїди - 0,440 од. (0,300-0,380 од.); загальний білірубін - 10,8 мкмоль/л (8,5-20,5 мкмоль/л); прямий - 2,0 мкмоль/л (0-5,1 мкмоль/л); непрямий - 8,8 мкмоль/л (до 16 мкмоль/л); холестерин - 4,8 ммоль/л (3,9-5,2 ммоль/л); бета-ліпополісахарид - 5,1 г/л (3 2 UA 94784 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 4,5 г/л); лужна фосфатаза - 220 Е/л (до 800 Е/л); АЛТ - 19 Е/л (до 30 Е/л); ACT-16 Е/л (до 30 Е/л). Імунологічні показники: СРБ - негативний (норма); АСЛ-О - 400 од. (до 250 од.); РФ негативний (норма); комплемент - 0,42 у.о. (0,88-1,41 у.о.); ЦІК - 0,88 г/л (0,71-1,96 г/л); ЦІК конст. - 1.25 г/л (0,81-1,60 г/л); Ig G-10,6 г/л (8,5-16,6 г/л); Ig А - 1,4 г/л (1,3-2,86 г/л); Ig M-1,3 г/л (0,90-1,80 г/л). На рентгенографії кистей і променевозап'ястних суглобів у прямій проекції змін не виявлено. За даними клініко-генеалогічного аналізу - спадковість не обтяжена щодо захворювань суглобів. При проведенні цитогенетичного аналізу було встановлено каріотип 46,ХХ, який відповідав нормальному жіночому, рівень хромосомних аберацій склав - 13 % (4 - парних фрагменти; 7 одиночних фрагментів, 1 - поліплоїдна клітина, 1 - розрив по центромері). Показник КЛ0+2 знижений, дорівнює 20,5 % (норма - 32,0-35,0 %), що вказує на знижену імунореактивність організму хворої дитини. Клінічний діагноз: ювенільний ревматоїдний артрит, суглобово-вісцеральна форма, активність І ст.; резидуальна енцефалопатія; емоційно-лабільний розлад. Клінічний приклад 2. Хвора Тетяна С., 12 років (історія хвороби № 3719) надійшла до кардіоревматологічного відділення клініки зі скаргами на біль і набрякання в дрібних суглобах кистей, лівому колінному суглобі, головні болі. Із анамнезу життя: дівчинка народилась від першої нормальної вагітності, перших фізіологічних пологів. Маса тіла при народженні - 2900 г., довжина тіла - 47 см. До року психомоторний розвиток дівчинки відповідав віковим нормам. Перші прояви захворювання з'явились за 3 місяці до звернення в Інститут. Перенесені захворювання: часті ГРЗ. Операцій, травм не було. Об'єктивно: на момент обстеження дівчинки загальний стан здоров'я задовільний. Шкіра, слизові оболонки чисті, звичайного кольору, але мигдалини пухкі. Лімфовузли без особливостей. В легенях везикулярне дихання, тони серця ритмічні, приглушені, ніжний систолічний шум на верхівці. Живіт м'який, безболісний. Печінка біля краю реберної дуги, селезінка не збільшена. Набряки, дефігурація дрібних суглобів кистей, лівого колінного суглоба. За даними лабораторних досліджень: клінічний аналіз крові та сечі без особливостей. Біохімічні показники: загальний білірубін - 23,5 мкмоль/л (8,5-20,5 мкмоль/л); прямий - 4,0 мкмоль/л (до 5,1 мкмоль/л); непрямий - 18,8 мкмоль/л (до 16 мкмоль/л); холестерин - 5,1 мкмоль/л (3,9-5,2 ммоль/л); бета-ліпополісахариди - 5,9 г/л (3-4,5 г/л); АЛТ - 13 Е/л (до 30 Е/л); ACT-10 Е/л (до 30 Е/л); сіромукоїди - 0,192 од. (норма 0,130-0,260 од.); глікопротеїди -0,422 од. (0,300-0,380 од.); сіалові кислоти - 158 од. (норма до 220 од.). Імунологічні показники: СРБ негат. (норма); АСЛ-О-200 од. (до 250 од.); РФ - негативний (норма); ЦІК - 1,21 г/л (0,71-1,96 г/л); ЦІК конст - 1,28 г/л (0,81-1,60 г/л); Ig G-16,9 г/л (8,5-16,6 г/л); Ig А - 1,56 г/л (1,3-2,86 г/л); Ig М - 1,56 г/л (0,90-1,80 г/л). УЗД суглобів: колінні - без патології, структура хряща гомогенна, ущільнені суглобові поверхні, в тазостегнових суглобах розширення шийково-капсулярного простору до 17 мм праворуч, і до 9 мл ліворуч. Гіперехогенність рідини, гіперплазія оболонки. Променезап'ястні, гомілковостопні без патології. За даними клініко-генеалогічного аналізу - спадковість не обтяжена щодо захворювань суглобів. При проведенні цитогенетичного аналізу було встановлено каріотип 46,ХХ, якій відповідав нормальному чоловічому, і підвищений рівень хромосомних аберацій - 12 % (9 - одиночних фрагментів, 2 - парних фрагмента, 1- розрив по центромері). Показник КЛ0+2 нижче норми 16,0 %, що вказує на знижену імунологічну реактивність організму хворого. Клінічний діагноз: ювенільний ревматоїдний артрит, суглобова форма, активність І ст., хронічний тонзиліт. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб визначення імунореактивності організму хворих на ювенільний ревматоїдний артрит за допомогою цитогенетичного аналізу крові, який відрізняється тим, що досліджують препарати хромосом, отримані з культури периферичної крові, і підраховують кількість лімфоцитів без асоціативної здатності акроцентричних хромосом і з асоціацією із двох акроцентричних хромосом (КЛ0+2), і при значеннях показника КЛ0+235,0 % діагностують підвищену імунореактивність організму хворого, при значеннях КЛ0+2≤32,0 % - знижену імунореактивність. 3 UA 94784 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4