Спосіб моделювання метаболічного синдрому у морських свинок

Реферат: Спосіб моделювання метаболічного синдрому у морських свинок включає внутрішньом'язове введення дослідним тваринам 15 мг/кг протамін-сульфату двічі на добу протягом 35 днів до формування стійкої гіперглікемії. UA 98122 U (12) UA 98122 U UA 98122 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ендокринології, а більш конкретно - до способів моделювання метаболічного синдрому у морських свинок, і призначена для дослідження патологічних процесів при метаболічному синдромі для розробки нових препаратів для лікування даного захворювання. Для скринінгу та детального вивчення антидіабетичних препаратів використовують різноманітні експериментальні моделі метаболічного синдрому (МС) та цукрового діабету (ЦД). Незважаючи на те, що ці моделі не зовсім еквівалентні до патогенетичних механізмів даного захворювання у людини, кожна з них виступає як важливий інструмент для дослідження генетичних, ендокринних, метаболічних та морфологічних змін, які лежать в основі даного захворювання. На сьогодні існує ряд спеціалізованих ліній тварин зі спонтанно отриманими мутаціями або направленим нокаутом генів, що викликає у даних тварин розвиток метаболічного синдрому та цукрового діабету. В негенетичних експериментальних моделях використовуються гідрофільні β-клітинні глюкозні аналоги, такі як алоксан, стрептозотоцин, хлорозотацин, ципрогептадин тощо [4, 5, 6]. Вони застосовуються в основному для відтворення діабету 1 типу. Існуючим моделям МС та ЦД 2 типу властиві певні недоліки, які не дозволяють проводити об'єктивну оцінку фармакологічної дії дослідних препаратів. Проблеми експериментальної біології та фармакології, пов'язані з контролем гіперглікемії, застосуванням інсуліну або пероральних антидіабетичних препаратів вимагають подальших покращень експериментальних умов [3]. Це обумовлює необхідність пошуку нових експериментальних моделей МС та ЦД 2 типу. Метод моделювання метаболічного синдрому шляхом внутрішньом'язового введення 15 мг/кг протамін-сульфату двічі на добу протягом 35 днів відтворювався на щурах. Проте відомо, що завдяки своїм фізіологічним особливостям щури мають високою резистентністю до пов'язаних з вільнорадикальним ураженням патологічних процесів, таких як МС та ЦД [8]. Зокрема, це обумовлено тим, що в організмі щурів та мишей, на відміну від людського, синтезується вітамін С, який є потужним антиоксидантом та може справляти значний вплив на розвиток МС та ЦД [9, 7]. При дослідженні антидіабетичних препаратів на щурах це може бути причиною невірної оцінки впливу даних препаратів на перебіг захворювання. Для усунення такої побічної дії вітаміну С в роботі було використано морських свинок, в організмі яких, на відміну від інших гризунів, не синтезується вітамін С [1]. Ця особливість властива і людині, що дозволяє екстраполювати отримані результати на людський організм при дослідженні МС та цукрового діабету. В основу корисної моделі поставлена задача розробки такого способу моделювання метаболічного синдрому у морських свинок, який з високим ступенем подібності відтворював би патологічні процеси при цьому захворюванні в організмі людини. Це дозволить здійснювати попередню оцінку фармакологічної дії антидіабетичних препаратів перед їх клінічним дослідженням. Поставлена задача вирішується запропонованим способом моделювання метаболічного синдрому у морських свинок, який, згідно з корисною моделлю, викликають шляхом внутрішньом'язового введення дослідним тваринам 15 мг/кг протамін-сульфату двічі на добу протягом 35 днів до формування стійкої гіперглікемії. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де - на фіг. 1 схематично представлено супресія протамін-сульфатом агрегації інсуліну, - на фіг. 2 схематично представлено імуногістохімічне визначення інсуліну в острівцях Лангерганса, LeicaDM 1000, 400 х.: А - контроль; В - МС. - на фіг. 3 гістохімічне визначення функціонального стану бета-клітин в острівцях Лангерганса (забарвлення гранул інсуліну в клітинах альдегід-фуксином), Leica DM 1000, 400 х.: А - контроль; В - МС. За основу було взято модель інсулінорезистентності та гіперглікемії, що основана на тривалому введенні дослідним тваринам протамін-сульфату [10]. Протамін-сульфат полікатіонний пептид, який використовується для нейтралізації протизгортального ефекту гепарину. Принцип методу заснований на зв'язуванні протамін-сульфатом ендогенного гепарину, який за результатами досліджень є синергістом інсуліну [2]. Гепарин запобігає агрегації інсуліну, який є найбільш функціонально активним у вигляді мономеру або димеру (фіг. 1). Зв'язування гепарину призводить до формування тетра- та гексамерів інсуліну, які функціонально менш активні, та до швидкого росту ендотеліальних, в тому числі жирових клітин. При зв'язуванні всього ендогенного гепарину у здорових тварин розвивається стан резистентності до гіпоглікемічної дії інсуліну. Для подолання інсулінорезистентності 1 UA 98122 U 5 10 15 підшлунковою залозою синтезуються великі кількості інсуліну, що врешті призводить до виснаження бета-клітин та зменшення їх кількості. За пропонованим способом моделювання метаболічного синдрому у морських свинок відтворювали метаболічний синдром. В роботі було використано 30 чотиримісячних самців морських свинок із середньою вагою 370 г. Більшість біохімічних реагентів та субстратів були придбані у Sigma-Aldrich. Всі експерименти на тваринах проводились з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей. Тварини були розміщені в окремих клітках з нержавіючої сталі в приміщенні з контрольованою температурою (20-23 °C) та режимом освітлення (12 год. період світла/ темряви). Тварини утримувались на стандартному раціоні. Розвиток метаболічного синдрому викликали внутрішньом'язовим введенням 15 мг/кг протамін сульфату двічі на день впродовж 5 тижнів. Через 2 тижні у тварин констатували розвиток метаболічного синдрому (група МС). Ще одна група тварин (МС+) утримувалась протягом наступних 2 тижнів за нормальних умов для контролю ремісії. Загальним контролем була група інтактних тварин (n=5), які протягом всього періоду утримувались за нормальних умов. Результати біохімічного аналізу сироватки крові тварин з метаболічним синдромом наведено в таблиці. Таблиця Показники біохімічного аналізу сироватки крові тварин з метаболічним синдромом Глюкоза, ммоль/л Контроль МС МС+ Холестерин, ммоль/л Креатинін, ммоль/л АЛТ, УО/л ACT, УО/л 5,2±0,2 11,2±0,3* 10,2±0,3* 0,58±0,03 1,27±0,1* 1,5±0,09* 18,95±0,5 38,0±1,2* 40,0±1,1* 37,5±2,6 91,5±4,9* 107,0±6,2* 39,5±2,7 268,0±12,1* 255,0±15,1* Лужна фосфатаза, УО/л 68,75±1,2 133,0±3,3* 126,0±4,1* * - Достовірна різниця у порівнянні з інтактними тваринами, р≤0,05, n=5 20 25 30 35 40 45 Показано, що на початкових етапах МС у дослідних тварин спостерігаються типові ознаки захворювання, такі як гіперглікемія (майже 2-кратне збільшення рівня глюкози в крові) і гіперліпідемія (більш ніж 2-кратне збільшення холестерину). Також виявлено, що розвиток МС у дослідних тварин супроводжується гепатотоксичністю, про що свідчить зростання вмісту маркерів цитолізу та некрозу гепатоцитів, зокрема більш ніж 2-кратне збільшення порівняно з контролем вмісту АЛТ та лужної фосфатази, а також 6-кратне збільшення ACT. Спостерігається зростання рівня креатиніну, кінцевого продукту азотистого обміну, що вказує на ниркову недостатність в гострій або ж хронічній формі. Гістохімічний та імуногістохімічний аналіз тканин підшлункової залози при моделюванні захворювання показав дистрофію β-клітин та порушення синтезу інсуліну (фіг. 2). Неоднорідність синтезу інсуліну бета-клітинами вказує на їх виснаження та компенсаторну гіперпродукцію інсуліну. Зменшення кількості функціонально активних бета-клітин свідчить про ураження підшлункової залози (фіг. 3). Серед інших симптомів, які відмічені у дослідних тварин з експериментальним МС (дані не наведені): - мікроальбумінурія; - падіння кількості глікогену в печінці; - зростання вмісту вільних радикалів в крові. Таким чином, введення протамін-сульфату протягом 35 днів морським свинкам призводить до формування стійкої гіперглікемії, порушення синтезу інсуліну та чутливості до нього клітин організму, а також спричиняє ряд інших симптомів метаболічного синдрому. Створена модель метаболічного синдрому у морських свинок характеризується високою доступністю, відтворюваністю та подібністю за патогенетичними процесами до тих, які відбуваються в організмі людини. Пропонований спосіб дозволяє здійснювати об'єктивну оцінку фармакологічної дії антидіабетичних препаратів перед їх клінічним випробуванням. Джерела інформації: 2 UA 98122 U 5 10 15 20 25 1. Ahn, Т., Yun, С. Н., Oh, D. В., Tissue-specific effect of ascorbic acid supplementation on the expression of cytochrome P450 2E1 and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats // Toxicology Lett. - 2006. - № 166. - P. 27-36. 2. Giger K., Vanam R.P. Suppression of insulin aggregation by heparin. Biomacromolecules 2008, 9, 2338-2344. 3. Herrera, E., Palacin, M., Martin, A., Lasuncion, M.A. Relationship between maternal and fetal fuels and placental glucose transfer in rats with maternal diabetes of varying severity. Diabetes, Vol. 34, Suppl. 2, pp. 42-46. ISSN 0012-1797. 4. Junod, A., Lambert, A. E., Stauffacher, W. and Renold, A. E. Diabetogenic action of streptozotocin: Relationship of dose to metabolic response. J. Clin. Invest., Vol. 48, No. 11 (1 November 1969), pp. 2129-2139. ISSN 0021.9738. 5. Lenzen, S. The mechanisms of alloxan-and streptozotocin-induced diabetes. Diabetologia, Vol. 51, No. 2 (February 2008), pp. 216-226. ISSN 0012-186X. 6. Lenzen, S., Panten, U. Alloxan: history and mechanism of action. Diabetologia, Vol. 31, No. 6 (June 1988), pp. 337-342. ISSN 0012-186X 7. Scott, J. A., King, G. L. Oxidative stress and antioxidant treatment in diabetes // Annals NY Acad.Sci. - 2004. - № 1031. - P. 204-213. 8. Yamamoto M1, Yasuda M. Recovery in the fetal pancreatic islet following fetal administration of streptozotocin in the rat in vivo and in vitro. Anat Rec A Discov Моl Cell Evol Biol. 2004 Dec; 281(2):1319-25. 9. Занозина О.В., Боровков Н.Н., Балаболкин М.И. Необходимость и достаточность использования антиоксидантов в терапии больных сахарным диабетом 2 типа // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2006., прил. 1. - С. 112-118. 10. Ульянов A.M., Тарасов Ю.А. Инсулярная система животных при хроническом дефиците гепарина // Вопросы мед. химии. - 2000. - 46, № 2 - С. 149-154. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб моделювання метаболічного синдрому у морських свинок, який відрізняється тим, що метаболічний синдром викликають шляхом внутрішньом'язового введення дослідним тваринам 15 мг/кг протамін-сульфату двічі на добу протягом 35 днів до формування стійкої гіперглікемії. 3 UA 98122 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4