Гени та способи забезпечення стійкості до фітофторозу пасльонових

Реферат: Винахід належить до ізольованого гена стійкості Rpi, який здатний опосередковувати відповідь проти ооміцетного патогену Phytophthora infestans. Також винахід належить до ізольованого білка, який кодований ізольованим геном стійкості Rpi, рослини або потомства рослини, що несе даний гетерологічний ген, та способу забезпечення тривалої стійкості до захворювання у картоплі. UA 106345 C2 (12) UA 106345 C2 UA 106345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Нові гени, композиції та способи підвищення стійкості сільськогосподарської культури до фітофторозу пасльонових. Рівень техніки Картопля (Solanum tuberosum L.) є четвертою по важливості сільськогосподарською культурою й найбільш важливою незерновою сільськогосподарською культурою у світі. При вирощуванні картоплі основним природним фактором, що обмежує врожайність, є фітофтороз пасльонових, що викликаний патогеном Phytophthora infestans (Mont.) групи ооміцетів, виявленим деБарі. При відсутності контролю це руйнівне захворювання може призвести до повної втрати врожаю сільськогосподарської культури (Świeżyński і Zimnoch-Guzowska 2001). Обробка фунгіцидом на сьогодні є найпоширенішим способом контролювання фітофторозу пасльонових. Проте, висока вартість застосування фунгіциду є проблемою, оскільки застосування фунгіциду може негативно позначатися на здоров'ї й екологічній безпеці, а застосування хімічних препаратів починають обмежувати. Крім того, даний патоген швидко еволюціонує, і деякі з нових його варіантів нечутливі до використовуваних фунгіцидів (Day і Shattock 1997; Goodwin й ін. 1996). Отже, надання генетичної стійкості культивованій картоплі розглядають як важливий спосіб досягнення тривалої стійкості до фітофторозу пасльонових. Описано два основних типи стійкості до фітофторозу картоплі (Umaerus і Umaerus 1994). Перший, загальний вид стійкості часто оснований на мажорних локусах кількісних ознак (QTL) і декількох мінорних QTL, і забезпечує часткову стійкість. Другий, специфічний вид стійкості оснований на мажорних домінантних генах стійкості (R-генів). У ранніх програмах з розведення в першій половині минулого століття було ідентифіковано 11 R-генів (R1-R11), одержаних з S. demissum. Дев'ять R-генів, R3 (у цей час розділені на R3a і R3b) і R5-R11 локалізовані на хромосомі 11 (Bradshaw й ін. 2006; El-Kharbotly 1994, 1996; Huang й ін. 2004; Huang 2005). Інші R-гени, що виходять з S. demissum, були картовані в різних положеннях, включаючи R1 на хромосомі 5 (El-Kharbotly й ін. 1994; Leonards-Schippers й ін. 1992) і R2 на хромосомі 4 (Li й ін., 1998). Всі R-гени з S. demissum, що залучені до культивованої картоплі, були переборені патогеном, оскільки нові штами швидко еволюціонували й здобували вірулентність відносно раніше стійких хазяїнів (Umaerus і Umaerus 1994). Відповідно, часткова стійкість, забезпечувана QTL, вважалася більш тривалою, ніж стійкість, яку надають окремі R-гени (Turkensteen 1993). Проте, часткова стійкість у значній мірі корелювала з типом дозрівання, що ускладнювало збереження стійкості при розведенні (Wastie 1991). Також положення QTL у геномі часто відповідали ділянці кластерів R-генів (Gebhart і Valkonen 2001; Grube й ін. 2000). Таким чином, недавні зусилля, направлені на ідентифікацію стійкості до фітофторозу пасльонових були зосереджені на мажорних R-генах, що обумовлюють широкий спектр стійкості й одержаних з різних диких видів Solanum. Сповіщалося, що крім S. demissum, інші дикі види Solanum, такі як S. acaule, S. chacoense, S. berthaultii, S. brevidens, S. bulbocastanum, S. microdontum, S. sparsipilum, S. spegazzinii, S. stoloniferum, S. sucrense, S. toralapanum, S. vernei і S. verrucosum, є новими джерелами стійкості до фітофторозу пасльонових (огляд підготовлений Jansky 2000; Hawkes 1990). На сьогодня, три R-гени, RB/Rpi-blb1, Rpi-blb2 і Rpi-blb3 з S. bulbocastanum були картовані на хромосомах 8, 6 і 4, відповідно (Nasess й ін. 2000; Park й ін. 2005a; van der Vossen й ін. 2003, 2005). Інший R-ген, Rpi-abpt, імовірно з S. bulbocastanum, був локалізований на хромосомі 4 (Parkй ін. 2005b). Rpi1 з S. pinnatisectum на хромосомі 7 (Kuhl й ін. 2001), Rpi-mcq1 з S. mochiquense (Smilde й ін. 2005) і Rpi-phu1 з S. phureja на хромосомі 9 (Śliwka й ін. 2006), про що також повідомлялося. Як випливає з огляду рівня техніки в цій галузі, існує значна потреба в нових генах, композиціях і способах надання стійкості до фітофторозу пасльонових. Описаний в даному документі винахід задовольняє цю потребу шляхом скринінгу диких видів Solanum і шляхом клонування, а також введення й експресування нових генів стійкості Rpi у картоплі. Короткий опис винаходу Автори даного винаходу виділили, ідентифікували й описали декілька різних R-генів фітофторозу пасльонових, одержаних з диких видів картоплі S. okadae, а також з S. mochiquense і S. neorossii. Згідно з даним винаходом запропоновані нові послідовності генів, композиції та способи підвищення стійкості сільськогосподарських культур, зокрема, але не обмежуючись, картоплі, до фітофторозу пасльонових, викликаного патогенним ооміцетом Phytophthora infestans. Короткий опис креслень Фіг. 1 Походження генотипів, що використовуються для створення BAC-бібліотек. (a): K39 і (b): K182 Фіг. 2 Аналіз розміру вставки відібраних випадковим чином BAC-клонів із двох BAC 1 UA 106345 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бібліотек, K39 (a) і K182 (b), за допомогою гель-електрофорезу в пульсуючому полі. BAC-клони розщеплювали рестриктазою Not. Одержували смуги, що відповідають 7.5 т.п.н., з вектора клонування pIndigoBAC-5. Значення молекулярних мас по маркерах фагу лямбда (Sigma Chemical), показані на фігурах праворуч. Фіг. 3 Положення генів стійкості до фітофторозу пасльонових Rpi-oka1, Rpi-oka2 і Rpi-oka3 з S. okadae і Rpi-nrs1 з S. neorossii. Фіг. 4 Зображення SCAR-маркерів, що використовувалися для скринінгу двох BAC-бібліотек. TG551, розщеплений рестриктазою Taq (a), пов'язаний з Rpi-oka1, TG551, розщепленим рестриктазою Mwo (b), і TG35 (c) пов'язані з Rpi-oka1, і U296361 (d) і TG591 (e) пов'язані з Rpimcq1. Зазначені маркер розміру 1 т.п.н. і вихідні генотипи (A624, A613, A618 і A988), а інші являють собою BAC-пули, позитивні по деяким маркерам, ідентифікованим за допомогою ПЛР із наступним розщепленням рестриктазою. Стійка алель позначена '