Химерне та гуманізоване антитіло проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини

1. Химерний L-ланцюг антитіла проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, що включає С-область L-ланцюга антитіла людини і V-область L-ланцюга моноклонального антитіла миші проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, де V-область L-ланцюга включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 45. 2. Химерний L-ланцюг за п. 1, де С-область являє собою Сλ-ланцюг. 3. Химерний Н-ланцюг антитіла проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, що включає С-область Н-ланцюга антитіла людини і V-область Н-ланцюга моноклонального антитіла миші проти білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, де V-область Н-ланцюга включає амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 46. 4. Химерний Н-ланцюг за п. 3, де С-область являє собою Сγ1-ланцюг. 2 (19) 1 3 75318 4 області 1-4 вказаної V-області Н-ланцюга походять містить амінокислотну послідовність, показану в з V-області Н-ланцюга антитіла людини людської SEQ ID NO: 46. підгрупи III, і області 1-3 вказаної V-області Н24. ДНК, що включає послідовність основ, що коланцюга, які визначають комплементарність, дує V-область Н-ланцюга моноклонального антивключають амінокислотні послідовності, показані в тіла миші проти білка, спорідненого з паратиреоїSEQ ID NO: 62-64. дним гормоном людини, де послідовність основ, 13. Поліпептид, що включає V-область Н-ланцюга що кодує V-область Н-ланцюга показана в SEQ ID гуманізованого антитіла проти білка, спорідненого NO: 57. з паратиреоїдним гормоном людини, де каркасні 25. ДНК, що кодує химерний L-ланцюг за п. 1 або області 1-4 вказаної V-області Н-ланцюга по суті п. 2. ідентичні каркасним областям 1-4 антитіла людини 26. ДНК за п. 25, де ДНК, що кодує химерний Lлюдської підгрупи III, і області 1-3 вказаної Vланцюг, містить послідовність основ, показану в області Н-ланцюга, які визначають комплементарSEQ ID NO: 65. ність, включають амінокислотні послідовності, по27. ДНК, що кодує химерний Н-ланцюг за п. 3 або казані в SEQ ID NO: 62-64. п. 4. 14. Поліпептид за п. 12 або п. 13, де антитіло 28. ДНК за п. 27, де ДНК, що кодує химерний Нлюдини являє собою антитіло людини S31679. ланцюг, містить послідовність основ, показану в 15. Поліпептид за п. 12, що включає амінокислотну SEQ ID NO: 57. послідовність, показану в SEQ ID NO: 56. 29. ДНК, що включає послідовність основ, що ко16. L-ланцюг гуманізованого антитіла проти білка, дує поліпептид за будь-яким з пп. 6-11. спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, 30. ДНК за п. 29, що включає послідовність основ, що включає поліпептид, що включає С-область Lпоказану в будь-якій з SEQ ID NO: 66-74. ланцюга антитіла людини, і поліпептид за будь31. ДНК, що включає послідовність основ, що кояким з пп. 6-11. дує поліпептид за будь-яким з пп. 12-15. 17. L-ланцюг гуманізованого антитіла за п. 16, де 32. ДНК за п. 31, що включає послідовність основ, С-область являє собою Сλ-ланцюг, вказані каркапоказану в SEQ ID NO: 58. сні області 1-3 по суті ідентичні каркасним облас33. ДНК, що кодує L-ланцюг гуманізованого антитям 1-3 антитіла людини HSU03868, відповідно, і тіла за п. 16 або п. 17. вказана каркасна область 4 по суті ідентична кар34. ДНК L-ланцюга гуманізованого антитіла проти касній області 4 антитіла людини S25755, і області білка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном 1-3, які визначають комплементарність, включають людини, що включає послідовність основ, що коамінокислотні послідовності, показані в SEQ ID дує амінокислотну послідовність, показану в будьNO: 59-61, відповідно. якій з SEQ ID NO: 48-55. 18. Н-ланцюг гуманізованого антитіла проти білка, 35. ДНК за п. 34, де ДНК L-ланцюга гуманізованого спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, антитіла містить послідовність основ, показану в що включає поліпептид, що включає С-область Нбудь-якій з SEQ ID NO: 66-74. ланцюга антитіла людини і поліпептид за будь36. ДНК, що кодує Н-ланцюг гуманізованого антияким з пп. 12-15. тіла за п. 18 або п. 19. 19. Н-ланцюг гуманізованого антитіла за п. 18, де 37. ДНК Н-ланцюга гуманізованого антитіла проти С-область являє собою Сλ1-ланцюг, вказані карбілка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном касні області 1-4 походять від каркасних областей людини, що включає послідовність основ, яка ко1-4 людського HSGHI, відповідно, і області 1-3, які дує амінокислотну послідовність, показану в SEQ визначають комплементарність, включають аміноID NO: 56. кислотні послідовності, показані в SEQ ID NO: 6238. ДНК за п. 37, де ДНК Н-ланцюга гуманізова64, відповідно. ного антитіла містить послідовність основ, пока20. Гуманізоване антитіло проти білка, спорідненозану в SEQ ID NO: 58. го з паратиреоїдним гормоном людини, що вклю39. Рекомбінантний вектор, що включає ДНК за чає L-ланцюг гуманізованого антитіла за п. 16 або будь-яким з пп. 21-38. п. 17 і Н-ланцюг гуманізованого антитіла за п. 18 40. Трансформант, трансформований рекомбінанабо п. 19. тним вектором за п. 39. 21. ДНК, що включає послідовність основ, що ко41. Спосіб одержання химерного антитіла проти дує V-область L-ланцюга моноклонального антитібілка, спорідненого з паратиреоїдним гормоном ла миші проти білка, спорідненого з паратиреоїдлюдини, що включає: ним гормоном людини, де V-область L-ланцюга культивування трансформанту, трансформованого містить амінокислотну послідовність, показану в експресуючим вектором, який містить ДНК за SEQ ID NO: 45. будь-яким з пп. 21, 22, 25 та 26 та експресуючим 22. ДНК, що включає послідовність основ, що ковектором, який містить ДНК за будь-яким з пп. 23, дує V-область L-ланцюга моноклонального антиті24, 27 та 28; і ла миші проти білка, спорідненого з паратиреоїдзбирання химерного антитіла проти білка, спорідним гормоном людини, де послідовність основ, що неного з паратиреоїдним гормоном людини, з одекодує V-область L-ланцюга показана в SEQ ID NO: ржаної культури. 65. 42. Спосіб одержання гуманізованого антитіла 23. ДНК, що включає послідовність основ, що копроти білка, спорідненого з паратиреоїдним гордує V-область Н-ланцюга моноклонального антимоном людини, що включає: тіла миші проти білка, спорідненого з паратиреоїкультивування трансформанту, трансформованого дним гормоном людини, де V-область Н-ланцюга експресуючим вектором, який містить ДНК за 5 75318 6 будь-яким з пп. 29, 30, і 33-35 та експресуючим 46. Засіб для придушення гіперкальціємії за п. 45, вектором, який містить ДНК за будь-яким з пп. 31, де злоякісна пухлина являє собою, щонайменше 32 та 36-38; і одну, вибрану з групи, що включає рак підшлункозбирання гуманізованого антитіла проти білка, вої залози, рак легенів, рак глотки, рак гортані, рак спорідненого з паратиреоїдним гормоном людини, язика, рак ясен, рак стравоходу, рак шлунка, рак з одержаної культури. жовчних протоків, рак молочної залози, рак нирок, 43. Фармацевтична композиція, що включає гумарак сечового міхура, рак матки, рак передміхурової нізоване антитіло за п. 20 як активний інгредієнт. залози і злоякісну лімфому. 44. Засіб для придушення гіперкальціємії, що 47. Засіб для поліпшення стану гіпофосфатеміі, включає гуманізоване антитіло за п. 20 як активщо включає гуманізоване антитіло за п. 20 як акний інгредієнт. тивний інгредієнт. 45. Засіб для придушення гіперкальціємії, яка асо48. Засіб за п. 47, де гіпофосфатемія являє собою ціюється із злоякісною пухлиною, що включає гугіпофосфатемічний рахіт. манізоване антитіло за п. 20 як активний інгреді49. Засіб за п. 47, де гіпофосфатемія являє собою єнт. гіпофосфатемічний, стійкий до вітаміну D, рахіт. Цей винахід відноситься до химерного антитіла людини/миші, що містить варіабельну область (V-область) моноклонального антитіла миші проти білка, родинного паращитовидному гормону, і константну область (С-область) антитіла людини; до олюдненого антитіла, в якому гіперваріабельні дільниці, V-областей легенів ланцюга (L-ланцюг) і важкого ланцюга (Н-ланцюг) моноклонального антитіла миші проти білка, родинного паращитовидному гормону (РТНгР), трансплантовані в антитіло людини; до L- і Н-ланцюгам вказаного антитіла, а також до поліпептиду, який має V-область, що складається з L- або Н-ланцюга вказаного антитіла. Цей винахід відноситься також до ДНК, що містить послідовність основ, що кодує вищезгадане антитіло, зокрема, його V-область, і до ДНК, що кодує L- або Н-ланцюг, створюючий V-область. Цей винахід далі відноситься до рекомбінантного вектора, що містить дану ДНК, і до хазяїна, трансформованого вказаним вектором. Крім того, цей винахід відноситься до способів отримання химерних і олюднених антитіл проти РТНгР. Цей винахід далі відноситься до фармацевтичної композиції і лікарського засобу для придушення гіперкальціємії або поліпшення при гіпофосфатемії, яке містить антитіло проти РТНгР в якості активного інгредієнту. Гіперкальціємія, зумовлена злоякісною пухлиною, є серйозним ускладнюючим симптомом, виявленим у 5-20% всіх суб'єктів, що мають злоякісну пухлину. Це вважається термінальним симптомом злоякісної пухлини і неминуче веде до смерті суб'єкта при відсутності відповідного лікування. Контролювання гіперкальціємії може значною мірою вплинути на прогноз і якість життя суб'єкта, тому його призначення дуже велике. Як правило, гіперкальціємію у суб'єктів, що мають злоякісну пухлину, можна грубо класифікувати як гуморальну гіперкальціємію злоякісного захворювання (ННМ), виникаючу під впливом пухлинноутворюючих гуморальних чинників резорбції кісткової тканини, і як локальну остеолітичну гіперкальціємію (LOH), виникаючу внаслідок місцевого впливу пухлини, перенесеної або інфільтрованої в кісткову тканину. Вважається, що у разі гумораль ної гіперкальціємії злоякісного захворювання, вміст потоку кальцію підвищується через резорбцію кісткової тканини або із-за остеолізації, ведучих до гіперкальціємії в поєднанні з погіршенням здатності нирок виводити кальцій [S.Wada and N.Nagata, Internal Medicine, 69,644-648]. Симптоми гіперкальціємії звичайно проявляються при концентрації кальцію в сироватці більше за 12мг/мл; хоч її неспецифічні симптоми, такі як анорексія (відсутність апетиту), нудота і блювота, спостерігаються вже на ранній стадії злоякісного захворювання. По мірі розвитку гіперкальціємії у суб'єкта знижується здатність концентрувати воду внаслідок поразки ниркових периферичних канальців, що веде до підвищеного виділення сечі (поліурії), при цьому анорексія і нудота супроводяться обезводненням організму через недостатнє поглинання води. Мозелей Дж.М. і інш. виявили, що одним з гуморальних чинників, що викликають гуморальну гіперкальціємію злоякісного захворювання, є білок, родинний паращитовидному гормону (РТН) (далі визначається як "РТНгР") [Рrос. Natl. Acad. Sci., USA (1987) 84, 5048-5052]. Услід за цим був виділений ген, що кодує РТНгР [Suva L.J. et. al., Science (1987) 237, 893]. Аналіз цього гена показав наявність трьох типів РТНгР людини, що мають 139, 141 і 173 амінокислоти, внаслідок почергового сплайсінгу цього гена, і присутність в крові різних фрагментів в результаті обмеженого розщеплення РТНгР (1-139) з повною структурою [Baba, H., Clinical Calcium (1995) 5, 229-223]. У РТНгР 8 амінокислот з N-кінцевих 13 амінокислот ідентичні вказаним амінокислотам паращитовидного гормону. З цього слідує, що амінокислотний сайт, відповідний положенням 14-34, має просторову структуру, яка також подібна паращитовидному гормону. Таким чином, РТНгР і РТН зв'язуються із загальним рецептором РТН/РТНгР принаймні в N-кінцевій області [Jueppner, H. et al., Science (1991)254, 1024-1026; Abou-Samra, A-B. et. al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1992) 89, 2732-2736]. Як відомо, РТНгР продукується різними пухлинними тканинами, при цьому встановлено, що РТНгР виробляється не тільки в пухлині, але і в 7 75318 8 різних нормальних тканинах починаючи з плоду і проти РТНгР людини (1-34). кінчаючи дорослими суб'єктами. До таких тканин Моноклональні антитіла миші надають в оргавідносяться шкіра, центральна нервова система, нізмі людини сильну імуногенну дію (іноді воно матка, плацента, молочні залози в період лактації, визначається як "антигенне"), що обмежує викорищитовидна залоза, паращитовидна залоза, надпостання моноклональних антитіл для лікування лючечник, печінка, нирки і сечовий пузир [Burns, W.J., дей. Наприклад, антитіло миші, введене людині, Clin. Chem. (1992) 38, 2171-2183; Stew-art.A.F. & може бути метаболізовано як чужеродна речовиBroadus, A.E., J. Clin. Endocrmol. (1991) 71, 1410на; тому період полувиведення антитіла миші з 1414]. Крім того, вважається, що РТНгР грає важорганізму людини є відносно коротким, і воно не ливу роль в метаболічній регуляції кальцію, вміст надає необхідної дії. Крім того, підвищення рівня в якого вище у плоду і новонародженого, чим у маорганізмі людини антитіл, що виробляються проти тері. миші (НАМА), при введенні антитіл миші може виВідомо, що рецептори РТН/РТНгР знаходяться кликати імунні реакції, які неприйнятні або небезголовним чином в кістках і нирках [C.Shigeno, печні для пацієнта, наприклад, сироваточні хвороClinical Calcium (1995) 5, 353-359] і активуть декіби і інші алергічні реакції. Тому моноклональні лька систем внутрішньоклітинної передачі сигналів антитіла миші часто непридатні для введення люшляхом скріплення РТНгР з рецепторами. Одним з дям. них є аленілатциклаза, а іншим - фосфоліпаза С. Щоб вирішити ці проблеми, були розроблені Активація аленілатциклази збільшує концентрацію методи, направлені на зниження імуногенності внутрішньоклітинного циклічного аденозинмононадлюдських антитіл, зокрема, моноклональних фосфату (уАМФ), що активує протеінкіназу А. Фоантитіл миші. Одним з таких методів є створення сфоліпаза С розщеплює фосфатидилінозитол-4,5химерного антитіла, в якому варіабельна область бисфосфонат з утворенням інозитол-1,4,5(V-область) виділена з моноклонального антитіла трифосфонату і діацилгліцерола. У вказаних сисмиші і константна область (С-область) виділена з темах передачі сигналів використовується G-білок відповідного антитіла людини. [Coleman, D.T. et.al., Biochemical mechanisms of Оскільки отримане химерне антитіло має інтаparathyroid hormone action. In: "The parathyroids" ктну варіабельну область початкового антитіла (Bilezikian, J.P. et.al.), Raven Press, New York миші, можна чекати, що дане химерне антитіло (1994) 239]. буде зв'язуватися з антигеном з тією ж специфічніПід впливом цих систем передачі сигналів стю, що і початкове антитіло миші. Крім того, таке РТНгР викликає гіперкальціємію і гіпофосфотемію, химерне антитіло має значно меншу частину амізнижує здатність резорбції фосфату нирками, збінокислотної послідовності, отриманої у тварини; з льшує виділення уАМФ нирками і визначає інші вищесказаного слідує, що імуногенність цього анподібні процеси, які мають місце у разі гіперкальтитіла повинна бути нижча в порівнянні з початкоціємії злоякісного захворювання (ННМ). вим антитілом миші. Хоч химерне антитіло зв'язуТаким чином, встановлено, що РТНгР має ється зі своїм антигеном подібно початковому безпосереднє відношення до гіперкальціємії, зумоноклональному антитілу миші, характеризуюмовленої злоякісною пухлиною. Для лікування чись при цьому більш низькою імуногенністю, деякі гіперкальціємії, пов'язаної зі злоякісною пухлиною, імунні реакції на варіабельну область миші як і використовуть кальцитонін, стероїдні засоби, інраніше можуть мати місце [LoBuglip, A.F. et al., дометацин, неорганічні солі фосфату, біфосфонаProc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989]. ти і тому подібні засоби, а також засоби, для запоДругий метод зменшення імуногенності антивнення рідини. Однак для вказаних коштів тіл миші є більш складним, але, як прочитається, характерне зниження ефективності при тривалому дозволяє ще більше знизити потенційну імуногензастосуванні, виникнення серйозних побічних ефеніь антитіл миші. ктів і повільний вияв їх фармакологічної дії, тому У відповідності з цим методом у варіабельну необхідні нові лікарські засоби, що володіють область людини трансплантують тільки гіперварібільш сильною терапевтичною дією і менш вираабельну дільницю (CDR) варіабельної області анженими побічними ефектами. титіла миші з метою створення реконструйованої Кукрейя С.С. і інш. [Kukreja, S.C. et. al.] повіваріабельної області людини. При необхідності у домили, що для лікування гіперкальціємії, зумовваріабельну область людини можна трансплантуленої злоякісної пухлиною, вони використали нейвати часткову амінокислотну послідовність каркастралізуючу антисироватку проти РТНгР. При ної області (FR), що містить гіперваріабельні дільвведенні цієї антисироватки бестимусним мишам, ниці у варіабельній області антитіла миші, з метою яким були трансплантовані клітки рака легенів або створення структури гіперваріабельних дільниць в гортані людини, що викликає гіперкальціємію, спореконструйованій варіабельній області людини, стерігалося зниження вмісту кальцію в крові і рівня яка ближче структурі початкового антитіла миші. уАМФ в сечі [J. Clin. Invest. (1988) 82, 1798-1802]. Потім ці олюднені реконструйовані варіабельні Каньи Сато і інш. повідомили, що при введенні області людини з'єднують з константними обласантитіла проти РТНгР (1-34) "голим" мишам, яким тями людини. У остаточно реконструйованому була імплантована РТНгР-продукуюча пухлина олюдненому антитілі чужорідними амінокислотнилюдини, симптоми гіперкальціємії стали менш вими послідовностями є тільки гіперваріабельні діраженими і термін життя мишей істотно збільшивльниці і дуже невелика частина каркасної області. ся [J. Bone & Mine. Res. (1993) 8, 849-860]. Далі, у Гіперваріабельні дільниці складаються з гіперварівідкритій публікації заявки на патент Японії №4абельної амінокислотної послідовності і не мають 228089 описуються химерні антитіла миші/людини яких-небудь видоспецифічних послідовностей. 9 75318 10 Тому олюднене антитіло, що містить гіперваріабеОб'єктом цього винаходу є химерний Lльні дільниці миші, володіє не більш сильної імуланцюг, що містить С-область L-ланцюга антитіла ногенностю, ніж натуральне антитіло людини, що людини і V-область L-ланцюга моноклонального містить гіперваріабельні дільниці людини. антитіла миші проти РТРгН V-область L-ланцюга Використання олюднених антитіл розглядамістить одну амінокислотну послідовність, вираються в наступних посиланнях: [Riechmann, L. жену послідовністю з ідентифікаційним №45, і Сet.al., Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. область L-ланцюга включає СХ-область. et.al., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, Об'єктом цього винаходу є також химерний НC.A. et.al. Protein Engng, 4, 773-783, 1991; Maeda, ланцюг, що містить С-область Н-ланцюга антитіла H. et.al., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124людини і V-область Н-ланцюга моноклонального 134, 1991; Gorman, S.D. et.al., Proc. NatI. Acad. Sci. антитіла миші проти РТРгН. V-область Н-ланцюга USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R. et. al., містить амінокислотну послідовність, виражену Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S. et. al., послідовністю з ідентифікаційним №46, і СProc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; область включає С -область. Carter, F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, Крім тою, об'єктом цього винаходу є химерне 4285-4289, 1992; Co, M.S. et. al., J. Immunol, 148, моноклональне антитіло проти РТРгН, що містить 1149-1154, 1992; and Sato, K. et. al., Cancer Res., вказаний химерний L-ланцюг і вказаний химерний 53, 851-856, 1993]. Н-ланцюг. Хоч вважається, що олюднені антитіла повинні Об'єктом цього винаходу далі є поліпептид, що бути корисні для лікувальних цілей, у вищезгадамає V-область L-ланцюга олюдненого антитіла, них посиланнях відсутні які-небудь згадки про яка містить каркасні області 1-4 V-області Lолюднене антитіло проти РТРгН. Крім того, досі не ланцюга антитіла людини і гіперваріабельні дільрозроблений стандартізований метод, який міг ниці 1-3 V-області L-ланцюга моноклонального бути застосований до будь-яких антитіл для отриантитіла миші проти РТРгН. Гіперваріабельні дільмання олюднених антитіл; тому існує необхідність ниці 1-3 містять амінокислотні послідовності, вив створенні ефективних методів отримання олюдражені відповідно послідовностями з ідентифіканеного антитіла, що характеризується достатньою ційними №№ 59-61; каркасні області 1-3 отримані активністю скріплення і нейтралізації специфічного з каркасних областей 1-3 антитіла людини антигена [див., наприклад, Sato, До. et. al., Cancer HSU03868 і каркасна область 4 отримана з каркаRes., 53, 851-856, 1993]. сної області 4 антитіла людини S25755; або каркаОб'єктом цього винаходу є химерне антитіло сні області 1-3 по суті ідентичні каркасним обласлюдини/миші, що містить варіабельну область (Vтям 1-3 антитіла людини HSU03868, і каркасна область) моноклонального антитіла миші проти область 4 по суті ідентична каркасній області 4 РТРгН і константну область (С-область) антитіла антитіла людини S25755. людини; олюднене антитіло, в якому гіперваріаТермін "по суті ідентичний" означає, що каркабель ні дільниці V-областей легенів ланцюга (Lсні області антитіла людини, що використовуються ланцюги) і важкого ланцюга (Н-ланцюги) моноклов олюдненому антитілі, можуть мати делеції, замінального антитіла миші проти РТРгН транспланни і/або додання амінокислот необхідних для товані в антитіло людини; L- і Н-ланцюги вказаного утворення гіперваріабельних дільниць моноклонаантитіла, а також поліпептид, що містить Vльного антитіла миші, внаслідок чого олюднене область, що складається з L- або Н-ланцюги вкаантитіло повинне володіти активністю, яка еквівазаного антитіла. лентна активності моноклонального антитіла миші. Іншим об'єктом цього винаходу є отримання Таким чином, цей винахід відноситься до поліДНК, що містить послідовність основ, що кодує пептиду, що має V-область L-ланцюга олюдненого вищезгадане антитіло, зокрема, його V-область, і антитіла, в якої 36-а і 49-а амінокислоти в каркасДНК, що кодує L- або Н-ланцюг. утримуючий поліних областях відповідно до рекомендацій Кабата пептид, що містить V-область. Ще одним об'єктом [Kabat, Е.А. et.al., US Dept. Health and Human цього винаходу є створення рекомбінантного векServices, US Government Printing Offices, 1991] є тора, що містить вказану ДНК, і хазяїна, трансфовідповідно тирозиновою і аспаргіновою кислотою. рмованого вказаним вектором. Ще одним об'єктом Цей винахід відноситься також до поліпептиду, цього винаходу є способи отримання химерних і що має V-область L-ланцюга олюдненого антитіла, олюднених антитіл проти РТРгН. Ще одним об'єкяка містить амінокислотну послідовність, виражену том цього винаходу є отримання антитіла проти будь-якою послідовністю з ідентифікаційними №№ РТРгН, що володіє сильною нейтралізуюче по ак48-51. тивністю. Ще одним об'єктом цього винаходу є Цей винахід далі відноситься до поліпептиду, створення фармацевтичної композиції і засобу для що має V-область L-ланцюга олюдненого антитіла, придушення гіперкальціємії, або поліпшення гри де 45-а і 87-а амінокислоти в каркасних областях у гіпофосфатемії і алкалозі що містить антитіло або відповідності з рекомендаціями Кабата є відповідолюднене антитіло проти РТРгН в якості активного но лізином і ізолейцином. інгредієнту. Цей винахід далі відноситься до поліпептиду, Внаслідок всебічного дослідження, направлещо має V-область L-ланцюга олюдненого антитіла, ного на досягнення вищезгаданих цілей, авторами яка містить амінокислотну послідовність, виражену цього винаходу було отримане антитіло з низькою будь-якою послідовністю з ідентифікаційними №№ імуногенністю моноклональних антитіл миші проти 52-55. РТРгН в організмі людини; так був завершений Цей винахід далі відноситься до поліпептиду, даний винахід. що має V-область Н-ланцюга олюдненого антиті 11 75318 12 ла, яка містить каркасні області 1-4 V-області Намінокислотні послідовності, виражені відповідно ланцюга V-області антитіла людини і гіперваріабепослідовностями з ідентифікаційними №№ 45-46; льні дільниці 1-3 V-області Н-ланцюга V-області ДНК, що кодує V-область L-ланцюга, містить, намоноклонального антитіла миші проти РТРгН люприклад, послідовність основ, виражену послідовдини. Гіперваріабельні дільниці 1-3 містять аміноністю з ідентифікаційним №65, і ДНК, що кодує Vкислотні послідовності, виражені відповідно посліобласть Н-ланцюга, містить послідовність основ, довностями з ідентифікаційними №№ 62-64, виражену послідовністю з ідентифікаційним №57. каркасні області 1-4 виділені з каркасних областей Цей винахід далі відноситься до ДНК, що ко1-4 антитіла людини, що відноситься до людської дує вказану химерну L- або Н-ланцюг. ДНК, що підгрупи III [HSG 111, Kabat, Е.А. et. al., US Dept. кодує L-ланцюг, містить, наприклад, послідовність Health and Human Services, US Government Printing основ, виражену послідовністю з ідентифікаційним Offices. 1991], зокрема, з каркасних областей 1-4 №65, і ДНК, кодуючий Н-ланцюг, містить послідовантитіла людини S31679 відповідно, або вони по ність основ, виражену послідовністю з ідентифікасуті ідентичні каркасним областям 1-4 антитіла ційним №57. людини S31679, відповідно. Цей винахід відноситься також до ДНК, що міКрім того, цей винахід відноситься до поліпепстить послідовність основ, що кодує V-область Lтиду, що має V-область Н-ланцюга олюдненого ланцюга або V-область Н-ланцюга вказаного олюантитіла, яка містить амінокислотну послідовність, дненого антитіла. ДНК, що містить послідовність виражену послідовністю з ідентифікаційним №56. основ, що кодує V-область L-ланцюга, виражена Цей винахід відноситься також до L-ланцюга будь-якою послідовністю з ідентифікаційними №№ олюдненого антитіла проти РТНгР людини, яка 66-74, і ДНК, що містить послідовність основ, що містить поліпептид, що має V-область L-ланцюга кодує V-область Н-ланцюга, виражена послідовнівказаного олюдненого антитіла, і поліпептид, що стю з ідентифікаційним №58. має С-область L-ланцюга антитіла людини. СЦей винахід відноситься також до ДНК для Vобласті L-ланцюга олюдненого антитіла, яка місобласть включає С -область, каркасні області 1-3 тить послідовність основ, що кодує амінокислотну по суті ідентичні каркасним областям 1-3 антитіла послідовність, виражену будь-якою послідовністю людини HSU03868, каркасна область 4 по суті з ідентифікаційними №№ 47-55. Вказана ДНК місідентична каркасної області 4 антитіла людини тить послідовність основ, виражену однією з посS25755, і амінокислотні послідовності гіперваріалідовностей з ідентифікацій гами №№ 66-74. бельних дільниць 1-3 виражені відповідно посліЦей винахід далі відноситься до ДНК для Vдовностями з ідентифікаційними №№ 59-61. області Н-ланцюга олюдненого антитіла, яка кодує Цей винахід далі відноситься до Н-ланцюга амінокислотну послідовність, виражену послідоволюдненого антитіла проти РТНгР людини, який ністю з ідентифікаційним №56. Вказана ДНК місмістить поліпептиди, що мають С-область Нтить послідовність основ, виражену послідовністю ланцюга і V-область Н-ланцюга вказаного антитіла з ідентифікаційним №58. людини. С-область включає С 1-область, каркасЦей винахід далі відноситься до рекомбінантні області 1-4 виділені з каркасних області 1-4 анного вектора, що містить будь-які вказані ДНК. титіла людини, що відноситься до HSGIII, і гіперЦей винахід відноситься також до трансфорваріабельні області 1-3 містять амінокислотні манту, перетвореному за допомогою вказаного послідовності, виражені відповідно послідовностярекомбінантного вектора. ми з ідентифікаційними №№ 62-64. Крім того, цей винахід відноситься до способу Цей винахід далі відноситься до антитіла проотримання химерного або олюдненого антитіла ти РТНгР зі слабкою антигенністю і високою нейтпроти білка, родинного паращитовидному гормону ралізуючою активністю. Антитіло проти РТНгР людини, який включає культивування вказаного включає антитіло людини, олюднене антитіло, трансформанту і виділення з отриманої культури химерне антитіло і приматироване антитіло, які химерного або олюдненого антитіла проти білка, можна використати для лікування захворювань родинного паращитовидному гормону людини. людини. Вказане антитіло характеризується низьЦей винахід далі відноситься до фармацевтикою константою дисоціації. Крім того, антитіло по чної композиції або засобу, призначеного для прицьому винаходу володіє високою нейтралізуючою душення гіперкальціємії або поліпшенню при гіпоактивністю завдяки низькій константі дисоціації, фосфатемії, які містять вказане антитіло в якості тому його можна використати для лікування заактивного інгредієнту. Кальціємія виникає внасліхворювань людини. док злоякісного захворювання і гіпофосфатемія Антитіло по цьому винаходу має константу дичасто спостерігається у суб'єктів, страждаючих соціації, рівну 1,86 10-7 [М] або менше, константу гіперкальціємією, зумовленою злоякісною пухлишвидкості дисоціації, рівну 1,22 10-1 [1/сек] або ною. Таким чином, антитіло по цьому винаходу менше, і константу швидкості асоціації, рівну 4 можна використати для лікування злоякісної пух6,55 10 [1/М.сек] або більше. Ці константи можна лини або ослаблення симптомів гіперкальціємії вимір: іти за допомогою аналізу Скатчарда, викоабо гіпофосфатемії. Злоякісна тканина може ристовуючи мічені радіоактивним ізотопом ліганди включати, але не обмежуватися, принаймні одніабо резонансний сенсор поверхневого плазмону. єю, вибраною з групи рака підшлункової залози, Цей винахід далі відноситься до ДНК, що міслегенів, глотки, гортані, язика, ясен, стравоходу, тить послідовність основ, що кодує V-область Lшлунка, жовчних протоків, молочної залози, нирок, ланцюга або V-область Н-ланцюга моноклональсечового пухиря, матки і предстательної залози, а ного антитіла миші проти РТНгР людини. Vтакож злоякісної лімфоми. Засіб по цьому винахообласть L-ланцюга і V-область Н-ланцюга містять 13 75318 14 ду, призначений для придушення гіперкальціємії, нездатністю виживати у виборчому середовищі, можна використати у разі будь-якого злоякісного такому як НАТ-середа, в непов'язаному стані, і захворювання, що викликає гіперкальціємію. здатністю виживати у вказаному середовищі тільки Детально цей винахід буде описаний нижче. в пов'язаному стані. Звичайно використовує лінії 1. Отримання моноклональних антитіл миші кліток, стійкі до 8-азагуаніну, у яких відсутній гіпокпроти РТНгР людини сантин-гуанін-фосфорибозилтрансфераза і які не Моноклональні антитіла миші проти РТНгР можуть рости в гіпоксантин-аміноптеринлюдини можна отримати шляхом створення гібритимідіновому (HAT) середовищі. дом внаслідок злиття мієломних кліток і антитіло Придатними для використання мієломними утворюючих кліток, виділених у тварин, імунізоваклітками є різні відомі лінії кліток, такі як Р3 них антигеном, і вибору з отриманих гібридом кло(P3x63Ag8.653) [J. Immunоl.(1979) 123:1548-1550]; нів, продукуючих антитіла, які специфічно інгібуP3x63Ag8U.1 [Current Topics in Microbiology and ють активність РТНгР. Immunology (1978) 81:] (1-7); NS-1 [Kohler, G and (1) Отримання антигенів Milstein, C, Eur. J. Immunol. (1976) 6:511-519]; MPCРТНгР, що використовується для імунізації 11 [Margulles, D.H. et. al. Cell (1976) 8:405-415]; тварин, включає пептиди, що містять всю або часSP2/0 [Shulman, M. et. al., Nature (1978) 276:269тину амінокислотної послідовності РТНгР, отрима170]; FO (de St. Groth, S.F. et. al., J. Immunol. ної за допомогою технології отримання рекомбінаMethods (1980) 35:1-21]; S194 [Trowbridge, I.S, J. нтних ДНК або хімічного синтезу, і РТНгР, Exp. Med. (1978) 148:313-323] і R210 [Galfre, G. et. виділеного з супернатантів ракових кліток, що виal., Nature (1979) 277:131-133]. кликають гіперкальціємію. Наприклад, в якості анАнтитілоутворюючі клітки можна отримати з тигену можна використати пептид [РТНгР(1-34)], кліток селезінки, лімфатичного вузла або подібних що містить амінокислоти 1-34 відомого РТНгР кліток. З цією метою у будь-кого з вищезгаданих [Kemp, B.E. et. al.. Science (1987) 238, 1568-1570]. тварин видаляють селезінку, лімфатичний вузол РТНгР (1-34) людини має амінокислотну послідовабо інший орган і тканину подрібнюють. Отриманість, виражену послідовністю з ідентифікаційним ний подрібнений матеріал суспендують в середо№75. вищі або буфері, такому як забуференний фосфаОтриманий РТНгР приєднують до білка-носія, том фізіологічний розчин (PBS), модифікована за такого як тироглобулін, з подальшим доданням способом Дульбекко середа Ігла (DMEM) або ад'юванта. Можна змішувати будь-який ад'ювант, RPMI1640, фільтрують через фільтр з неіржавіювключаючи повні і неповні ад'юванти Фрейнда. чої сталі або тому подібне і центрифугують з (2) Імунізація і виділення антитілоутворюючих отриманням необхідних антитілоутворюючих клікліток. ток. Отриманий вище антиген вводять ссавцеві, Потім вказані мієломні клітки і антитілоутвотакому як миша, пацюк, кінь, мавпа, кролю; коза рюючі клітки піддають злиттю. або вівця. Імунізацію можна здійснювати будьЗлиття кліток можна здійснювати шляхом з'єдякими відомими методами, включаючи внутрішнання мієломних і антитілоутворюючих кліток у ньовенні, підшкірні і внутрішньочеревні ін'єкції. відношенні від 1:1 до 1:10 в середовищі для кульТимчасові інтервали між ін'єкціями з метою імунітивування тваринних кліток, такому як мінімальна зації не мають яких-небудь конкретних обмежень і підтримуюча середа (MEM), DMEM або RPMEможуть складати від декількох днів до декількох 1640, в присутності акселератора злиття при темтижнів, переважно від 4 днів до 21 дня. пературі 30-37°С протягом 1-15 хвилин. Для присЧерез два або три дні після останньої імунізакорення злиття кліток можна використати будьції виділяють антитілоутворюючі клітки. Антитілоуякий акселератор злиття або вірус, такий як поліетворюючими клітками є клітки селезінки, лімфатитиленгліколь зі середньою молекулярною масою чного вузла і периферичної крові; причому 1000-6000, полівініловий спирт або вірус Сендай. звичайно використовують клітки селезінки. ОднокЗлиття антитілоутворюючих і мієломних кліток ратна доза антигену, призначеного для імунізації, можна також здійснювати в промислово доступностановить 100мкг/миша. му апараті для злиття кліток з використанням еле(3) Визначення титрів антитіл ктричної стимуляції, такої як електропорація. Щоб визначити рівні імунної реакції імунізова(5) Відбір і клонування гібридом них тварин і вибрати ті, що представляють інтерес Гібридоми ті, що представляють інтерес, відгібридоми з кліток, підданих злиттю, вимірюють бирають з кліток після злиття кліток, наприклад, по титр антитіл в кров імунізованої тварини або титр методу селективного вирощування кліток в селекантитіл в супернатанті антитілоутворюючих кліток. тивних середовищах. Методи детектування антитіл добре відомі і З цією метою суспензію кліток розводять в включають імуноферментний аналіз (ЕІА), радіоіприйнятній середі і інокулюють на титраційному мунний аналіз (RIA) і твердофазний імуноферменмікропланшеті. У кожну лунку додають селективну тний аналіз (ELISA). середу, таку як НАТ-середа, і інкубують, періодич(4) Злиття кліток но замінюючи вказану селективну середу свіжою Мієломні клітки, що використовуйся для злиття середою. з антитілоутворюючими клітками, включають лінії Вирощені клітки збирають і використовують в кліток, які отримують у різних тварин, таких як миякості гібридом. ші, пацюки і людина, і, як правило, можуть бути Ці гібридоми потім, досліджують за допомогою легко отримані фахівцями в цій області. Прийнятні обмеженого розведення, клітинного сортера, що лінії кліток характеризуються лікарською стійкістю, активується флуоресценцією, або іншим спосо 15 75318 16 бом. І, нарешті, отримують гібридоми, продукуючі ють до 5' кінця синтезованої вище кДНК і здійснюмоноклональне антитіло. ють полімеразну реакцію синтезу ланцюга у від(6) Виділення моноклональних антитіл ношенні ДНК, що містить послідовності основ, що Для отримання моноклональних антитіл з кодують V-області L- і Н-ланцюгів. (ДНК, що місотриманих гібридом звичайно використовують тить послідовність основ, що кодує V-область Lспособи культивування кліток і утворення асцита. ланцюга, далі іноді визначається як "ДНК для VУ відповідності зі способом культивування кліобласті L-ланцюга" або "ДНК, що кодує V-область ток, гібридоми культивують в середовищі для виL-ланцюга". Те ж саме відноситься до V-області Нрощування тваринних кліток, такому як RPMI-1640, ланцюга, С-області і т.д.). що містить 10-20% сироватки плоду корови, мініПрийнятною затравкою для ампліфікації ДНК, мальна підтримуюча середа або бессироваточна що кодує V-область L-ланцюга, можливо, наприсереда, в прийнятних умовах (наприклад, 37°С, клад, зв'язуюча затравка (послідовність з іденти5% СО2) протягом 2-14 днів, після чого антитіла фікаційним №2) і затравки, отримані з консервативиділяють з супернатанту. вних послідовностей в константній області L У відповідності зі способом утворення асциту, ланцюга (С -область) антитіл миші, такі як затравгібридоми внутрішньочеревно інокулюють ссавцеві ки MLC, що має послідовність основ, виражену того ж вигляду, який використовують як джерело послідовністю з ідентифікаційним №4. Прийнятмієломних кліток, для досягнення рясного зросною затравкою для ампліфікації ДНК, що кодує Vтання гібридом. Через 1-4 тижні отримують асцит область Н-ланцюга, можливо, наприклад, зв'язуюабо сироватку. ча затравки (послідовність з ідентифікаційним №2) Для отримання обчищених антитіл використоі затравки MHC-G1 (послідовність з ідентифікаційвують окремо або в поєднанні такі відомі способи, ним №3) [S. Т. Jones, et. al., Biotechnology, 9, 88, як осадження сульфатом амоній, іонообмінну хро1991]. матографію і афінну хроматографію. (ііі) Очищення ДНК і визначення послідовності 2. Конструювання химерних антитіл основ (1) Клонування ДНК, що містить послідовність Продукти полімеразної реакції синтезу ланцюоснов, що кодує V-область моноклонального антига (PCR) піддають електрофорезу в агарозному тіла миші проти РТНгР людини. гелі відомими способами з метою вирізування, які (і) Отримання мРНК представляють інтерес фрагментів ДНК, які потім Щоб клонувати ДНК, що містить послідовність виділяють, очищають і лігують з векторної ДНК. основ, що кодує V-область моноклонального антиОчищення ДНК можна здійснювати за допомотіла миші проти РТНгР людини, отримані гібридогою промислово доступних наборів, таких як ми обробляють відомим способом наприклад, гуаGENECLEAN II; BIO101. Векторна ДНК, несуча нідин-ультрацентрифутуванням [Chirgwin, J.M. et фрагменти ДНК відома; з цією метою можна, наal., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299] або методом приклад, використати pUC19 або Bluescript. AGPC [Chomczynski, P. et al., Analytical Вказану ДНК і векторну ДНК лігують за допоBiochemistry (1987) 162, 156-159], з отриманням могою відомого набору для лігування (Takara повної РНК, з якої виділяють мРНК, наприклад, в Shuzo) з отриманням рекомбінантного вектора. розділовій колонці з оліго (тимідін) целюлозним Отриманий рекомбінантний вектор вводять в наповнювачем, яка входять в набір для очищення Escherichia coli JM109 і в стійкі до ампіцилліну комРНК (Pharmacia). Для отримання мРНК можна лонії; таким чином, векторну ДНК отримують відотакож використати набір для очищення мРНК мим способом [J. Sambrook, et. al., "Molecular Quick Prep (Pharmacia AB), при цьому не треба Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, виділяти повну РНК. 1989]. Після розщеплення векторної ДНК одним (іі) Отримання і ампліфікація кДНК або декількома рестрикційними ферментами, посЗ отриманої вище (і) мРНК синтезують кДНК в лідовність основ необхідної ДНК визначають відоV-областях L- і Н-ланцюгів з використанням зворомим способом, таким як дидезокси спосіб [J. тної транскриптази. У процесі синтезу кДНК можна Sambrook, et. al., "Molecular Cloning", Cold Spring використати затравку, таку як оліготимідін, або Harbor Laboratory Press, 1989]. При здійсненні цьобудь-яку іншу прийнятну затравку, яку гібридизує з го винаходу можна використати автоматичний С-областю L- або Н-ланцюга, наприклад, затравку пристрій для визначення послідовності основ (секМНС2, що має послідовність основ, виражену посвенатор ДНК 373А; ABI Inc.). лідовністю з ідентифікаційним №1. (iv) Гіперваріабельна дільниця Для синтезу кДНК вказану мРНК і затравку V-області Н- і L-ланцюги утворять антигензв'язмішують і піддають взаємодії в присутності звозуючий сайт, і їх повні структури володіють деякою ротної транскриптази, наприклад, при температурі схожістю. Тобто, чотири дільниці каркасної області 52°С протягом 30 хвилин. (FR) пов'язані трьома гіперваріабельними дільниАмпліфікацію кДНК як L-ланцюги, так і Нцями (CDR). Амінокислотна послідовність в каркаланцюги можна здійснювати шляхом полімеразної сній області є досить консервативною, в той час як реакції синтезу ланцюга (PCR) по методу 5'-RACE амінокислотна послідовність гіперваріабельної [Frohman, М.А. et. al., Proc. NatІ. Acad. Sci. USA, дільниці відрізняється високою варіабельностю 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et. al., Nucleic [Kabat, Е.А. et.al., "Sequence of Proteins of Acids Res., 17, 2919-2932, 1989] з використанням Immunological Interest", US Dept. Health and Human набору 5'-Ampli FINDER RACE (CLONTECH Inc.). Services, 1983]. Таким чином, зв'язуючий фрагмент Ampli FINDER Багато які дільниці вказаних чотирьох каркас(послідовність з ідентифікаційним №42) приєднуних областей мають -складчасту структуру, вна 17 75318 18 слідок чого три гіперваріабельних дільниці утвовують вказаний вектор для трансформації кліткирять петлю. Гіперваріабельна дільниця може іноді хазяїна; після чого трансформовану клітки-хазяїна культивуть in vivo або in vitro з метою отримання становити частину -складчастої структури. Тому необхідного химерного антитіла. три гіперваріабельних дільниці в просторовому (і) Отримання Н-ланцюга химерного антитіла відношенні розташовані дуже близько одна до Вектор експресії Н-ланцюга химерного антитіодної через вказану структуру каркасних областей, ла можна отримати шляхом введення кДНК, що які утворять антиген-зв'язуючий сайт разом з містить послідовність основ, що кодує V-область трьома гіперваріабельними дільницями в спарених Н-ланцюга миші (далі визначається також як "кДНК областях. для V-області Н-ланцюга"), в прийнятний експреЗ урахуванням цих факторів гіперваріабельні суючий вектор, що містить геномну ДНК з послідодільниці можна виявити шляхом порівняння аміновністю основ, що кодує С-область Н-ланцюга анкислотної послідовності у варіабельній області титіла людини (далі визначається також як моноклонального антитіла миші проти РТНгР лю"геномна ДНК для С-області Н-ланцюга"), або дини з базою даних по структурі амінокислотних кДНК, що кодує вказану область (далі визначаєтьпослідовностей для антитіл, отриманих по методу ся також як "кДНК для С-області Н-ланцюга") СКабата і інш. ["Sequence of Proteins of область Н-ланцюга включає, наприклад, С 1, С 2, Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983], з метою дослідження їх гомології. С 3 або С 4 області. (2) Конструювання експресуючого вектора хи(і-а) Конструювання експресуючого вектора мерного антитіла. химерної Н-ланцюга, утримуючий геномну ДНК, Після клонування фрагментів ДНК, що кодує що кодує С-область Н-ланцюга. V-області L- і Н-ланцюги моноклонального антитіЕкспресуючі вектори, що містять геномну ДНК, ла миші (далі L- або Н-ланцюг антитіла іноді вищо кодує С-область Н-ланцюга, зокрема, що козначається як "L-ланцюг миші" і т.д. для антитіл дують С 1-область, включають, наприклад, HEFмиші і "Н-ланцюг людини" і т.д. для антитіл людиPMh-g 1 (W091/19759) i DHFR- E-RVh-PMi-f ни), ДНК, що кодують V-області миші, і ДНК, що (W092/19759). кодують константні області антитіла людини, лігуПісля введення в ці експресуючі вектори кДНК, ють і експресують з отриманням химерних антитіл що кодує V-область Н-ланцюга миші, у вказану проти РТНгР людини. кДНК можна ввести відповідну послідовність основ Стандартним способом отримання химерних способом полімеразної реакції синтезу ланцюга антитіл є лігування лідерної послідовності миші і (PCR). Наприклад, щоб ввести в експресуючий послідовності V-області, присутньої в клонованій вектор відповідні послідовності основ, полімеразну кДНК, з послідовністю, що кодує С-область антитіреакцію синтезу ланцюга можна здійснювати за ла людини, яка вже є в експресуючому векторі допомогою затравки для PCR, яка призначена для клітки ссавця. Альтернативно, лідерну послідовотримання кДНК, що містить упізнаючу послідовність миші і послідовність V-області, присутню в ність для прийнятного рестрикціонного ферменту у клонованій кДНК, лігують з послідовністю, що ко5'-кінця і узгоджену послідовність Козака, розтадує С-область антитіла людини, і потім лігують з шовану безпосередньо перед ініціюючим кодоном, експресуючим вектором клітки ссавця. з метою підвищення ефективності транскрипції, і Поліпептид, що містить С-область антитіла затравки для PCR, яка призначена для отримання людини, може являти собою будь-які С-області НкДНК, що містить упізнаючу послідовність для або L-ланцюги, включаючи, наприклад, С 1, С 2, прийнятного рестрикціонного ферменту у 3'-кінця і С 3 або С 4 для Н-ланцюгів людини або С або Ск донорську область, що необхідно для правильного для L-ланцюгів. сплайсинга первинних продуктів транскрипції геЩоб отримати химерне антитіло, спочатку номної ДНК з метою отримання мРНК, для ввеконструюють два експресуючих вектори; тобто, дення вказаних послідовностей основ в експресуекспресуючий вектор, що містить ДНК, що кодують ючий вектор. V-область L-ланцюга миші і С-область L-ланцюга Після обробки сконструйованим таким чином людини, під контролем регулюючої експресію обкДНК, що кодує V-область Н-ланцюга миші, одним ласті, такої як система енхансер/промотор, і ексабо декількома прийнятними рестрикційними фепресуючий вектор, що містить ДНК, що кодують Vрментами її вставляють у вказаний експресуючий область Н-ланцюга миші і С-область Н-ланцюга вектор з метою створення експресуючого вектора людини, під контролем регулюючої експресію обхимерного Н-ланцюга, утримуючим геномну ДНК, ласті, такої як система енхансер/промотор. Потім що кодує С-область Н-ланцюга (С 1-область). клітки-хазяїни, такі як клітки ссавців, котрансфор(і-b) Конструювання експресуючого вектора мують за допомогою цих експресуючих векторів, химерного Н-ланцюга, утримуючий кДНК з посліпісля чого трансформовані клітки культивуть in довністю основ, що кодує Н-ланцюг vitro або in vivo з метою отримання химерного анЕкспресуючі вектори, що містять кДНК, що котитіла [див., наприклад, W091/16928]. дує С-область Н-ланцюга, таку як С 1-область, Альтернативно лідерну послідовність миші, що можна сконструювати таким чином: мРНК отримує в клонованій кДНК і ДНК, що кодують V-область ють з кліток яєчника китайського хом'ячка, в які L-ланцюга миші і С-область L-ланцюга людини, а вводять експресуючий вектор DHFR- E-RVh-PMI-f також лідерну послідовність миші і ДНК, що коду[див. W091/19759], утримуючий ДНК, що кодує Vють V-область Н-ланцюга миші і С-область Нобласть Н-ланцюга олюдненого антитіла РМ1, і ланцюга людини, вводять в один експресуючий геномну ДНК С-області Н-ланцюга (С 1) антитіла вектор [див., наприклад, W094/11523] і використо 19 75318 20 людини [N. Takahashi, et.al., Cell, 29, 671-679 область L -ланцюга людини, можна синтезувати (1982)], і експресуючий вектор RV1-РМ1а [див. за допомогою синтезатора ДНК і сконструювати за W091/19759], утримуючий геномну ДНК, що кодує способом PCR. Відомо, що С-область L -ланцюга V-область L-ланцюга олюдненого антитіла РМ1, і людини, має принаймні 4 різних ізотипа, і кожний геномну ДНК С-області L -ланцюга антитіла люізотип можна використати для створення експредини; по методу RT-PCR клонують кДНК, що кодує суючого вектора. Наприклад, на основі даних об V-область Н-ланцюга олюдненого антитіла РМ1, і гомології з С-областями LA-ланцюга клонованих кДНК, що кодує С-область Н-ланцюга (С 1) антитімоноклональних антитіл миші можна вибрати ізола людини, і лігують з експресуючим вектором тип Mcg+Ke+Oz-фрагмент С-області L -ланцюга тваринної клітки, який обробляють прийнятним людини (№Х57819) [P.Dariavach et.al., Proc. Natl. рестрикційним ферментом, для конструювання Acad. Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987] і використати бажаного експресуючого вектора. його для створення експресуючого вектора. Щоб Коли кДНК, що кодує V-область Н-ланцюга сконструювати кДНК для відомої С-області L миші, лігована безпосередньо з кДНК, що кодує Сланцюга людини, такої як Mcg+Ke+Oz-, можна виобласть Н-ланцюга (С 1) антитіла людини, у фракористати чотири нижченаведені затравки, вирагмент, що містить кДНК, що кодує V-область Нжені послідовностями з ідентифікаційними №№ ланцюга, можна ввести відповідні послідовності 11-14: затравки MBC1HGP1 (послідовність з іденоснов по методу PCR. Наприклад, полімеразну тифікаційним №11) і MBC1HGP3 (послідовність з реакцію синтезу ланцюга можна здійснити за доідентифікаційним №13) містять смислові послідовпомогою спеціальної затравки для PCR, яка призності ДНК, а затравки MBC1HGP2 (послідовність з начена для отримання кДНК, що містить упізнаючу ідентифікаційний №12) і MBC1HGP4 (послідовпослідовність для прийнятного рестрикціонного ність з ідентифікаційним №14) містять антисмисферменту у 5'-кінця і узгоджену послідовність Колові послідовності ДНК, причому кожна затравки зака, розташовану безпосередньо перед ініціююмає комплементарну послідовність довжиною від чим кодоном, з метою підвищення ефективності 20 до 23 пар основ у кожного кінця. транскрипції, і затравки для PCR, яка призначена MBC1HGPS (послідовність з ідентифікаційним для отримання кДНК, що містить упізнаючу послі№15) і MBCIHGPR (послідовність з ідентифікаційдовність для прийнятного рестрикціонного ферменим №16) є зовнішніми затравки, мають послідовнту у 3'-кінця, що необхідно для прямого лігування ності, гомологічні відповідно MBC1HGP1 і з С-областю Н-ланцюга (С 1) з метою введення MBC1HGP4, і упізнаючу послідовність для прийнявказаних послідовностей основ у вказану кДНК. тного рестрикційного ферменту. Зробивши збиСконструйованим таким чином кДНК, що кодує рання чотирьох затравок по методу FCR, синтезуV-область Н-ланцюга миші, обробляють одним ють повний ланцюг кДНК і додають зовнішню або декількома прийнятними рестрикційними фезатравку для ампліфікації кДНК. рментами, лігують з кДНК, що кодує С-область НЗбирання за способом PCR проводять таким чином: у MBC1HGP1 і MBC1HGP2 або MBC1HGP3 ланцюга (С 1) і вставляють в експресуючий векі MBC1HGP4 гібридизують комплементарні послітор, такий як pCOS1 або рСНО1, з метою створендовності, синтезуючи фрагмент MBC1HGP1ня експресуючого вектора, що містить кДНК, що MBC1HGP2 і фрагмент MBC1HGP3-MBC1HGP4, кодує химерну Н-ланцюг. після чого у кожного фрагмента знов гібридизують (іі) Отримання L-ланцюга химерного антитіла комплементарні послідовності, синтезуючи кДНК, Вектор експресії L-ланцюга химерного антитіла можна отримати шляхом лігування кДНК, що що кодує непроцесийованну С-область L кодує V-область L-ланцюга миші, з геномної ДНК ланцюга людини. або кДНК, що кодує С-область L-ланцюга антитіла Сконструйовану таким чином кДНК, що кодує людини, і введення в прийнятний експресуючий С-область L -ланцюг людини, і сконструйованої вектор. С-область L-ланцюга включає, наприклад, вище кДНК, що кодує V-область L-ланцюга миші, -ланцюг і -ланцюг. можна лігувати між прийнятними сайтами рестри(іі-а) Конструювання експресуючого вектора, кційних ферментів і вставити в експресуючий вектор, такий як pCOS1 або рСНО1, з метою створенщо містить кДНК, що кодує химерний L -ланцюг ня експресуючого вектора, що містить кДНК, що Сконструювавши експресуючий вектор, що мікодує L -ланцюг химерного антитіла. стить кДНК, що кодує V-область L-ланцюга миші, у вказаний експресуючий вектор можна ввести від(іі-b) Конструювання експресуючого вектора, повідні послідовності основ по методу PCR. Нащо містить кДНК, що кодує химерну L -ланцюг приклад, полімеразну реакцію синтезу ланцюга Сконструювавши експресуючий вектор, що міможна здійснити за допомогою спеціальної затрастить кДНК, що кодує V-область L-ланцюга, у вкавки для PCR, яка призначена для отримання зану кДНК можна ввести відповідні послідовності кДНК, що містить послідовність ту, що впізнається, основ за способом PCR. Наприклад, полімеразну для прийнятного рестрикціонного ферменту у 5'реакцію синтезу ланцюга можна здійснити за докінця і узгоджену послідовність Козака, з метою помогою спеціальної затравки для PCR, яка призпідвищення ефективності транскрипції, і затравки начена для отримання кДНК, що містить упізнаючу для PCR, яка призначена для отримання кДНК, що послідовність для прийнятного рестрикціонного містить упізнаючу послідовність для прийнятного ферменту у 5'-кінця і узгоджену послідовність Корестрикціонного ферменту у 3'-кінця, що необхідно зака, з метою підвищення ефективності транскридля введення вказаних послідовностей основ у пції, і затравки для PCR, яка призначена для вказану кДНК. отримання кДНК, що містить упізнаючу послідовВсю послідовність основ кДНК, що кодує С 21 75318 22 ність для прийнятного рестрикціонного ферменту у На першій стадії конструювання ДНК, що ко3'-кінця, що необхідно для введення вказаних посдує V-область олюдненого антитіла, необхідно лідовностей основ у вказану кДНК. вибрати V-область антитіла людини як основу для вказаної конструкції. ДНК, що кодує С-область L -ланцюга людини, При здійсненні цього винаходу в олюдненому яка призначена для лігування з ДНК, що кодує Vантитілі можна використати каркасну область Vобластю L-ланцюга миші, можна сконструювати, області антитіла людини, яка гомологічна каркаснаприклад, з HEF-PMlk-gk, що містить геномну ній області V-області антитіла миші більш ніж на ДНК [див. WO 92/19759]. 80%. Каркасна область V-області Н-ланцюга, що Упізнаючі послідовності для прийнятних рествикористовується як фрагмент по суті ідентичної рикціонних ферментів можна ввести за способом каркасної області, може включати каркасну обPCR в 5'- і 3'-кінці ДНК, що кодує С-область L ласть, що відноситься до підгрупи III, таку як ланцюга, і ДНК, що кодує V-область L-ланцюга S31679 [NBRF-PDB, Cuisinier A.M. et.al., Eur. J. миші, і ДНК, що кодує С-область L -ланцюга, можImmunol, 23, 110-118, 1993]. Крім того, каркасна на лігувати один з одним і вставити в експресуюобласть V-області L-ланцюга, що використовуєтьчий вектор, такий як pCOS1 або рСНО1, з метою ся як фрагмент по суті ідентичної каркасної обласстворення експресуючого вектора, що містить ті, може включати, наприклад, FR1, FR2 і FR3, кДНК, що кодує L -ланцюг химерного антитіла. виділені з антитіла людини HSU03868 [GEN-BANK, 3. Отримання олюднених антитіл Deftos M. et.al., Scand. J. Immunol, 39, 95-103, (1) Виявлення гомології з антитілами людини 1994], і FR4, виділену з антитіла людини S25755 Щоб отримати олюднене антитіло, в якому гі(NBRF-PDB). перваріабельну дільницю моноклонального антиАнтитіло людини S311679 клоновано з бібілотіла миші трансплантированo в антитіло людини, теки кДНК печінки плоду людини, і антитіло людибажано, щоб між каркасними областями многоклони HSU03868 клоновано як новий ген для Vнального антитіла миші і антитіла людини існувала області L -ланцюга людини. значна гомологія. Тому необхідно зробити порів(3) Отримання поліпептидів, що містять Vняння V-областей Н- і L-ланцюгів моноклональнообласть олюдненого антитіла. го антитіла миші проти РТНгР людини з VУ олюдненому антитілі по цьому винаходу Собластями всіх відомих антитіл, структуру яких область і каркасні області (FR) V-області вказаного визначають на основі банку даних по структурі антитіла взяті у людини, і гіперваріабельні дільниці білка. Крім того, одночасно проводять порівняння V-області взяті у миші (Фіг.1). Поліпептид, що місз підгрупами антитіл людини (HSG: людська підгтить V-область олюдненого антитіла по цьому вирупа), класифікованими Кабатом і інш., з урахунаходу, можна отримати шляхом трансплантації ванням довжини каркасної області антитіла, гомогіперваріабельних дільниць по методу PCR з вилогії амінокислот і тому подібним [Kabat, Е.А. et.al., користанням як матриці фрагменту ДНК антитіла US Dep. Health and Human Services, US людини. Спосіб трансплантації гіперваріабельних Government Printing Offices, 1991]. дільниць полягає в тому, що отримують фрагмент V-області H-ланцюга людини можна віднести ДНК, що кодує гіперваріабельну дільницю миші, і до однієї з підгруп HSG І-III на основі класифікації замінюють його антитілом людини, що використоКабата і інш., при цьому V-області Н-ланцюга мовується як матриця. ноклонального антитіла миші проти РТНгР людини Якщо фрагмент ДНК антитіла людини, признахарактеризуються 82,7% гомологією з узгодженою ченого для використання як матриця недоступний, послідовністю підгрупи HSG III. З іншого боку, ??Vпослідовність основ, зареєстровану в базі даних, області??L (-ланцюга людини можна віднести до можна синтезувати в синтезаторі ДНК, і ДНК для однієї з підгруп HSG1-VI на основі класифікації V-області олюдненого антитіла можна отримати за Кабата і інш., при цьому V-області L -ланцюга моспособом полімеразної реакції синтезу ланцюга ноклонального антитіла миші проти РТНгР людини (PCR). Крім того, якщо в базі даних зареєстрована не володіють досить високою гомологією з узготільки амінокислотна послідовність, всю послідовдженими послідовностями V-областей L -ланцюга ність основ можна вивести з вказаної амінокислолюдини, що входять в ці підгрупи. тної послідовності з урахуванням даних про викоЯкщо необхідно олюднити моноклонільне анристання кодонів в антитілах за способом Кабата і титіло миші проти РТНгР людини, то бажано викоінш. [Kabat, E.A. et.al., in US Dep. Health and Human ристати V-область Н-ланцюга людини, яка відноServices, US Government Printing Offices, 1991]. Цю ситься до підгрупи HSG III і володіє самої високої послідовність основ синтезують в синтезаторі гомологією, або V-область Н-ланцюга людини, в ДНК, потім по методу PCR отримують ДНК Vякій каркасна область має відповідну стандартну області олюдненого антитіла і вводять в прийнятструктуру [Chothia С, et.al., J. Mol. Biol., 196, 901ного хазяїна з подальшою експресією, необхідною 917, 1987]. Крім того, оскільки не існує узгодженої для отримання необхідного поліпептиду. послідовності з високою гомологією в підгрупах VНижче описуються загальні процедури трансобластей L -ланцюга людини, для конструювання плантації гіперваріабельних дільниць по методу олюдненого антитіла бажано використати VPCR, що виконуються при наявності фрагменту область L -ланцюга антитіла людини з самої виДНК антитіла людини, що використовується як сокою гомологією, зареєстрованою в банку даних матриця. по структурі білка. (і) Трансплантація гіперваріабельних дільниць. (2) Конструювання ДНК, що кодує V-область Передбачимо, що ДНК, що кодує V-область, олюдненого антитіла. представляє собою ДНК, що кодують FR1, CDR1, 23 75318 24 FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4, які пов'язані один з травки MBC1HGP1 (послідовність з ідентифікаційодним у вказаному порядку, як це показане на ним №23) і MBC1HGP3 (послідовність з ідентифіФіг.2. каційним №24) містять смислові послідовності Спочатку синтезують фрагменти ДНК миші, віДНК, а затравки MBC1HGP2 (послідовність з ідендповідні необхідним гіперваріабельним дільницям. тифікаційним №25) і MBC1HGP4 (послідовність з Гіперваріабельні дільниці 1-3 синтезують на основі ідентифікаційним №26) містять антисмислові поспослідовностей основ раніше клонованих Vлідовності ДНК. Кожна з них повинна мати з будьобластей Н- і L-ланцюга миші. Трансплантуючі якого кінця комплементарну послідовність довжизатравки В і Е синтезують з таким розрахунком, ною від 15 до 21 пари основ. щоб затравка В мала послідовність, гібридизуючу Зовнішні затравки MBC1HVS1 (послідовність з з CDR1 миші і FR2 антитіла людини в напрямі ідентифікаційним №27) і MBC1HVR1 (послідовсмислової послідовності, і затравка Е мала посліність з ідентифікаційним №28) мають послідовдовність, гібридизуючу з CDR1 і FR1 антитіла люність, гомологічну відповідно з MBC1HGP1 і дини в напрямі антисмислової послідовності (Фіг.2 MBC1HGP4, і кожна з них містить упізнаючу послі(1)). Аналогічним чином, синтезують трансплантудовність для відповідного прийнятного рестрикційючі затравки С і F і затравки D і G. Окрім цього, ного ферменту. Чотири затравки збирають за спосинтезують так звану "зовнішню затравки", відпособом PCR і синтезують непроцессийовану кДНК, відну А і Н на Фіг.2 (1), які можуть відповідно гібрипісля чого додають зовнішні затравки для ампліфідизувати з верхніми областями від FR1 і нижніми кації ДНК. "Збирання по методу PCR" означає гібобластями від FR4. Трансплантуючі затравки моридизацію MBC1HGP1 і MBC1HGP2 або жна виділити і екстрагувати відомими методами MBC1HGP3 і MBC1HGP4 по їх комплементарним [Sambrook, et.al., Molecular Cloning: A Laboratory послідовностях з отриманням фрагмента Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. MBC1HGP1-MBC1HGP3 і фрагмента MBC1HGP2Потім виконують першу полімеразну реакцію MBC1HGP4 з подальшою гібридизацією цих фрагсинтезу ланцюга, використовучи трансплантуючу ментів по їх комплементарним послідовностях з затравку Е і зовнішню затравки А, трансплантуючі отриманням непроцессійованої ДНК для олюднезатравки В і F, трансплантуючі затравки С і G, а ної V-області Н-ланцюга. також трансплантуючу затравку D і зовнішню заС-область Н-ланцюга антитіла людини може травку Н, внаслідок чого відповідно утворяться бути будь-якою С-областю Н-ланцюга людини, фрагменти Е, B-F, C-G і D-H (Фіг.2 (2)). наприклад, С 1, С 2, С 3 або С 4 областю НОскільки верхня область трансплантуючої заланцюга людини. травки В і частина нижньої області трансплантуюДНК для V-області Н-ланцюга олюдненого анчої затравки Е були сконструйовані, щоб перекрититіла, яка отримана відповідно до приведеного вати один одну (те ж саме вірне для вище опису, можна лігувати з ДНК для будь-якої трансплантуючих затравок С і F, а також D і С), ці С-області Н-ланцюга антитіла людини, наприклад. фрагменти можуть бути гібридизовані з відповідС 1-області Н-ланцюга людини. Як вказувалося в ними комплементарними послідовностями при розділі "Отримання Н-ланцюга химерного антитіздійсненні реакції в прийнятних температурних ла", ДНК для V-області Н-ланцюга можна обробиумовах і зібрані внаслідок виконання полімеразної ти прийнятним рестрикційним ферментом і лігувареакції синтезу ланцюга з утворенням ДНК довжити з ДНК, що кодує С-область Н-ланцюга людини, ною від А до Н. Отримав фрагмент ДНК, що кодує під контролем регулюючої експресію області, такої V-область, можна додати зовнішню затравки А і Н як система енхансер/промотор, з отриманням ексі виконати другу полімеразну реакцію синтезу ланпресуючого вектора, що містить ДНК для олюднецюга, що дає ДНК, що кодує V-область олюдненоної V-області Н-ланцюга і С-області Н-ланцюга го антитіла, в якому каркасні області 1-4 виділені у людини. людини і гіперваріабельні дільниці 1-3 виділені у (ііі) Конструювання ДНК і експресуючого векмиші. Потім цю ДНК можна ввести в прийнятний тора, що кодує олюднену V-область L-ланцюга. хазяїн для експресії з отриманням необхідного При здійсненні цього винаходу всю послідовполіпептида (Фіг.2 (3)). ність основ ДНК, що кодує V-область L-ланцюга (іі) Конструювання ДНК і експресуючого вектоантитіла людини, що використовується як матрира, що кодує олюднену V-область Н-ланцюга. ця, можна синтезувати в синтезаторі ДНК і сконстПри здійсненні цього винаходу всю послідовруювати за способом PCR, хоч ДНК для V-області ність основ ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга L-ланцюга не доступна так само, як ДНК, що кодує антитіла людини, яка призначена для використанV-область Н-ланцюга. ня як матриця олюдненого антитіла, можна синтеЩоб сконструювати ДНК для олюдненої Vзувати в синтезаторі ДНК і сконструювати за спообласті L-ланцюга, використовучи як матриця ансобом PCR, хоч вказану ДНК не можна отримати з титіло людини SU03868, що характеризується природних джерел. найбільшою гомологією з V-областю L-ланцюга V-область Н-ланцюга моноклокального антитімоноклонального антитіла миші проти РТНгР люла миші проти РТНгР людини характеризується дини, необхідні чотири затравки, виражені, напривисокої гомологічністю з S31679, що входить в клад, послідовностями з ідентифікаційними №№ людську підгрупу III. Для використання цього анти29-32. Затравки MBC1LGP1 (послідовність з ідентіла людини як матриця для конструювання ДНК, тифікаційним №29) і MBC1LGP3 (послідовність з що кодує олюднену V-область Н-ланцюга, необідентифікаційним №30) містять смислові послідовхідні чотири затравки, виражені, наприклад, посліності ДНК, а затравки МВС1LGP2 (послідовність з довностями з ідентифікаційними №№ 23-26. Заідентифікаційним №31) і MBC1LGP4 (послідов 25 75318 26 ність з ідентифікаційним №32) містять антисмисфрагментом каркасної області, виділеним у миші, лові послідовності ДНК. Всі вони були сконструйопісля чого кожну область аналізують у відношенні вані, для того, щоб мати комплементарну послідоолюднення. вність довжиною від 15 до 21 пари основ у будьЯк показано на Фіг.3, отримують антитіло з поякого кінця. ліпептидом, що містить рекомбінантну V-область, Зовнішні затравки MBC1LVS1 (послідовність з в якої FR1 і FR2 виділені з антитіла людини і FR3 і ідентифікаційним №33) і MBC1LVR1 (послідовність FR4 виділені з антитіла миші (таке антитіло, що з ідентифікаційним №34) мають послідовність, має рекомбінантний фрагмент, визначається як гомологічну відповідно з MBC1LGP1 і MBC1LGP4, і "гібридне антитіло"), гібридне антитіло, в якому містять упізнаючу послідовність для відповідного тільки FR1 виділена у людини, і гібридне антитіло, прийнятного рестрикціонного ферменту. Чотири в якому тільки FR2 виділена у людини. Кожну ДНК, затравки збирають по методу PCR з отриманням що кодує ці гібридні антитіла, вводять в експресунепроцессійованої ДНК і додають зовнішню затраючий вектор і тимчасово експресують олюднені вку для ампліфікації ДНК. "Збирання по методу антитіла для дослідження на наявність необхідної PCR" означає гібридизацію затравки MBC1LGP1 і активності. MBC1LGP3 або затравки MBC1LGP2 і MBC1LGP4 За допомогою цього способу автор цього випо їх комплементарним послідовностям з отринаходу досліджував поліпептиди, що містять Vманням фрагмента MBC1LGP1-MBC1LGP3 і фраобласті L-ланцюга, у відношенні антигензв'язуючої гмента MBC1LGP2-MBC1LGP4 з подальшою гібі нейтралізуючій активності і виявив, що певні аміридизацією цих фрагментів по їх нокислоти, що замінюються знаходяться в каркаскомплементарним послідовностям з отриманням них областях FR2 і FR3. непроцессійованої ДНК, що кодує олюднену VВиявивши, що амінокислоти, що визначають область Н-ланцюга. дану активність, знаходяться в областях FR2 і С-область L-ланцюга антитіла людини може FR3, автор цього винаходу встановив, що вказабути будь-якою С-областю L-ланцюга людини, ною активністю володіють 36-а, 45-ая і 49-а амінокислоти в області FR2 і 87-а амінокислота в обланаприклад, С - або С -областю L-ланцюга людисті FR3 (нумерація амінокислот в антитілах ни. визначена Кабатом [Kabat, E.A. et. al., US Dep. ДНК для V-області L-ланцюга олюдненого анHealth and Human Services, US Government Printing титіла, яка отримана відповідно до приведеного Offices, 1991]). вище опису, можна лігувати з ДНК для будь-якої Таким чином, при здійсненні цього винаходу С-області L-ланцюга антитіла людини, наприклад, отримують поліпептид, що містить V-область, в С -області L-ланцюга людини. ДНК для V-області якої мутована одна або декілька таких амінокислот L-ланцюга можна обробити прийнятним рестрик(наприклад, замінена). ційним ферментом і лігувати з ДНК, що кодує СВідповідно до розглянутого вище способу траобласть L -ланцюга людини, під контролем регунсплантації гіперваріабельних дільниць спочатку люючої експресію області, такої як система енханотримують поліпептид, що містить V-область з сер/промотор, з отриманням експресуючого вектоамінокислотною послідовністю як основу для мура, що містить ДНК, що кодують олюднену Vтації амінокислоти. Цей початковий поліпептид область L-ланцюга і С-область LX-ланцюга людимістить амінокислотну послідовність, виражену ни. послідовністю з ідентифікаційним №47, і визначаФакт отримання, поліпептиду способом, опиється як "варіант а" ("а" в таблиці І). саним вище, утримуючого V-область олюдненого Потім, використовуючи як основу "варіант а", антитіла, зовсім не означає, що вказаний поліпепотримують різні варіантні фрагменти, в яких мутотид буде володіти активністю як антитіло, напривана одна або декілька амінокислот каркасної обклад, володіти зв'язуючою або нейтралізуючою ласті. активністю проти свого антигена. Це, зокрема, Мутацію можна здійснити шляхом конструювідноситься до L-ланцюга, оскільки V-область Lвання олігонуклеотидної затравки (мутагенная ланцюга моноклонального антитіла миші проти затравки), що кодує амінокислоту, що вводиться РТНгР людини виділена з дуже рідкого V x-гена, як необхідна мутація, яку використовують для витому необхідно дослідити вказаний поліпептид конання полімеразної реакції синтезу ланцюга з відносно наявності або відсутності у нього даної використанням вказаної затравки. активності шляхом з'єднання його з олюдненої НТак отримують поліпептиди, що містять Vланцюгом і експресії в тваринній клітці, такій як області (варіанти b-t), в яких мутовані конкретні COS-7. амінокислоти в областях FR2 і FR3 (b-t в таблиці Ефективним способом виявлення каркасної 1). області в V-області олюдненого антитіла, володіючою зв'язуючою і нейтралізуючою активністю олюдненого антитіла, може бути конструювання гібридної V-області [Ohtomo, T.et.al., Molecular Immunology, 32, 407-416, 1995] і підтвердження отриманих результатів. Щоб виявити амінокислоту в V-області L-ланцюга олюдненого антитіла по цьому винаходу, яку необхідно мутувати з отриманням амінокислоти, що володіє необхідною активністю, конструюють ДНК, в якій фрагмент каркасної області олюдненого антитіла рекомбінован 27 75318 28 днену V-область L-ланцюга і С-область L-ланцюга людини, можна також ввести в один експресуючий вектор, описаний в патенті W094/11523, причому вказаний вектор можна використати для трансформації клітки-хазяїна і трансформований хазяїн можна культивувати in vivo або in vitro з отриманням необхідного олюдненого антитіла. 4. Отримання химерного антитіла і олюдненого антитіла Щоб отримати химерне або олюднене антитіло, необхідно приготувати два вищезгаданих експресуючих вектори. Так, у разі химерного антитіла конструюють експресуючий вектор, що містить ДНК, що кодує V-область Н-ланцюги миші і Собласть Н-ланцюга людини, під контролем регулюючої експресію області, такої як система енхансер/промотор, і експресуючий вектор, що містить ДНК, що кодує V-область L-ланцюга миші і Собласть L-ланцюга людини, під контролем регулюючої експресію області, такої як система енхансер/промотор. У разі олюдненого антитіла конструюють експресуючий вектор, що містить ДНК, що кодує олюднену V-область Н-ланцюга і Собласть Н-ланцюга людини, під контролем регулюючої експресію області, такої як система енхансер/промотор і експресуючий вектор, що містить ДНК, що кодує олюднену V-область L-ланцюга і Собласть L-ланцюга людини, під контролем регулюючої експресію області, такої як система підсилювача енхансер/промотор. Потім клітки-хазяїна, таку як клітка ссавця, котрансформують цими експресуючими векторами і отриману трансформовану клітку культивуть in vitro або in vivo з отриманням химерного або олюдненого антитла [див., наприклад, W091/16928]. Альтернативно ДНК, що кодує V- і С-області Н-ланцюга, і ДНК, що кодує V- і С-області Lланцюга, можна лігувати з одиничним вектором і трансформувати в прийнятну клітку-хазяїн з отриманням антитіла. Так, для експресії химерного антитіла ДНК, що кодує лідерну послідовність миші, що є в клонованій кДНК, V-область Н-ланцюга миші і С-область Н-ланцюга людини, а також ДНК, що кодує лідерну послідовність миші, V-область Lланцюга миші і С-область L-ланцюга людини, вводять в один експресуючий вектор, описаний, наприклад, в W094/11523. Для експресії олюдненого антитіла, ДНК, що кодує олюднену V-область Нланцюга і С-область Н-ланцюга людини, і ДНК, що кодує олюднену V-область L-ланцюга і С-область L-ланцюга людини, вводять в одиничний експреОтриману вище ДНК, що кодує кожний варіант суючий вектор, описаний, наприклад, в V-області L-ланцюга олюдненого антитіла, можна W094/11523. Такий вектор використовує для транлігувати з ДНК будь-якої С-області L-ланцюга ансформації клітки-хазяїна, після чого трансформотитіла людини, такої як С -область L-ланцюга люваного хазяїна культивуть in vivo або in vitro з дини. З цією метою її обробляють прийнятним реотриманням представляючого інтерес химерного стрикційним ферментом і лігують з ДНК, що кодує або олюдненого антитіла. С-область LX-ланцюга людини, під контролем реПредставляюче інтерес химерне або олюднегулюючої експресію області, такої як система енне антитіло, отримане шляхом культивування трахансер/промотор з отриманням експресуючого нсформанта, перетвореного за допомогою ДНК, вектора, що містить ДНК, що кодує кожний варіант що кодує вказане химерне або олюднене антитіло, олюдненої V-області L-ланцюга, і ДНК, що кодує можна виділити з внутрішньої або зовнішньої часолюднену С-область L -ланцюга. тини клітки і очистити до однорідного стану. Сконструйовану вище ДНК, що кодує VПредставляюче інтерес химерне або олюднеобласть Н-ланцюга олюдненого антитіла і Сне антитіло по цьому винаходу можна виділити і область Н-ланцюга людини, і ДНК, що кодує олюочистити в колонці, заповненій білком А і агаро 29 75318 30 зою. Для цієї мети можна також використати будьпресовано химерне, гібридне або олюднене антиякі інші способи, що застосовуться для виділення і тіло або очищене химерне, гібридне або олюднене очищення звичайних білків, причому їх вибір нічим антитіло; 100мкл кон'югованого з лужни. Фосфатане обмежений. Наприклад, для виділення і очизо, антитіла кози проти IgG людини і 1мг/мл розчищення химерного або олюдненого антитіла можна ни субстрат (Sigma 104, паранітрофенілфосфорна використати по окремості або в поєднанні різні кислота, SIGMA), після чого за допомогою апарату види хроматографії, ультрафильтрації, висалюдля прочитування мікропланшетів (Bio Rad) вимівання і диаліза. рюють оптичну щільність при довжині хвилі 405нм. Для отримання химерного або олюдненого анЯк еталон для визначення концентрацій можна титіла проти РТНгР людини по цьому винаходу використати обчищений IgGI людини (сайт скріпможна використати будь-яку експресуючу систему. лення). Наприклад, еукариотичні клітки включають тва(2) Визначення антигензв'язуючої здатності. ринні клітки, зокрема, виділені лінії кліток ссавців, Планшети для визначення антигензв'язуючої клітки плісняви, грибів і дріжджів; прокріотичні клітздатності за способом ELISA отримують таким ки включають бактерійні клітки, такі як клітки чином: в кожній лунка 96-луночного планшета для Escherichia coli. Химерне або олюднене антитіло аналізу ELISA (наприклад, Maxisorp, NUNC) іммопо цьому винаходу переважне експресують в клітці білізують 100мкл PRHгP людини (1-34) з концентссавця, такій як клітки COS або СНО. рацією 1мкг/мл. Вміст лунка блокують 200мкл розМожна використати будь-які відомі промотори, бавляючих буфери, в кожну лунку додають призначені для експресії в клітках ссавців. Наприпоступово розбавлений супернатант кліток COS-7 клад, переважно використовуть швидкодіючий або СНО, в якому експресовано химерне, гібридне протомор цитомегаловіруса людини (HCMV). Приабо олюднене антитіло або очищене химерне, кладами експресуючих векторів, що містять прогібридне або олюднене антитіло, 100мкл кон'югомотор HCMV, є HCMV-VH-HС 1 і HCMV-VL-HCK, ваного з лужної фосфатази антитіла кози проти виділені з pSV2neo [W092/19759]. IgG людини і 1мг/мл розчини субстрат (Sigma 104, Крім того, при здійсненні цього винаходу в паранітрофенілфосфорна кислота, SIGMA), після якості проиоторів для експресії гена в клітках ссачого за допомогою апарату для прочитування міквців можна використати вірусні промотори, такі як ропланшетів (Bio Rad) вимірюють оптичну щільретровірус, вірус поліоми, аденовірус і вірус мавпи ність при довжині хвилі 405нм. (SV) 40, і промотори, виділені з кліток ссавців, на(3) Визначення нейтралізуючої активності. Нейтралізуючу активність антитіла миші, хиприклад, з фактора-1 елонгації ланцюга поліпепмерного антитіла і олюдненого антитіла можна тиду людини (HEF-1 ). Наприклад, промотор SV40 визначити, використовучи, наприклад, лінію кліток можна легко використати за способом Муллігана і остеосаркоми пацюків ROS17/2,8-5 [Sato, K.et.al., інш. [Mulligan et.al., Nature, 277, 108, 1979] і промоActa Endocrinology, 116, 113-120, 1987]. Клітки тор HEF-1 . можна ефективно використати за споROS 17/2,8-5 стимулюють, використовучи 4мМ собом Мізушима і інш. [Mizushima, S. et. al., Nucleic гідрокортізону, щоб індукувати рецептор Acids Research, 18, 5322, 1990]. РТН/РТНгР. Фермент, що виродився, для циклічПочатковим матеріалом для реплікації, що виного аденозинмонофосфата (сАМР) інгібують 1мМ користовується при здійсненні цього винаходу, ізобутил-1-метилксантину (ІВМХ, SIGMA). Антитіло отримують з вірусу SV40, вірусу поліоми, аденовімиші, або химерне або олюднене антитіло, призруса або вірусу папілломи великої рогатої худоби начене для визначення нейтралізуючої активності, (BPV). Крім того, експресуючий вектор може містизмішують з рівною кількістю РТНгР (1-34) і в кожну ти ген для фосфотрансферази АРН(3') II або І лунку додають отриману суміш антитіла і РТНгР (nео), тимідін-кінази (ТК), ксантин-гуанін(1-34). Нейтралізуючу активність антитіла миші, фосфорибозіл-трансферази (Ecogpt) E.coli або химерного або олюдненого антитіла можна визнадигідрофолат-редуктази (DHFR) як селективного чити шляхом вимірювання кількості сАМР, продумаркера для збільшення кількості копій гена в сисцированого лініями кліток остеосаркоми пацюків темі клітки-хазяїна. ROS 17/2,8-5 внаслідок стимуляції РТНгР. 5. Оцінка антигензв'язуючої і нейтралізуючої (4) Кінетичний аналіз взаємодії між РТНгР і анактивності химерного і олюдненого антитіл. титілом проти РТНгР. (1) Визначення концентрації антитіла. При здійсненні цього винаходу, кінетику взаєКонцентрацію отриманого обчищеного антитімодії між РТНгР і анти-РТНгР можна визначити ла можна визначити за способом твердофазного різними засобами і способами. Зокрема, константи імуноферментного аналізу (ELISA). диссоциації, константи швидкості диссоциації і Планшети для визначення концентрації антиконстанти швидкості асоціації можна виміряти по тіл за способом ELISA отримують таким чином: в методу Скатчарда (Scatchard) і з допомогою резокожній лунка 96-луночного планшету для аналізу нансного сенсора поверхневого плазмона ELISA (наприклад, Maxisorp, NUNC) іммобілізують BIACORE (розроблений і продається фірмою 100мкл антитіла кози проти імуноглобулі у G (IgG) Pharmacia Biotech). Аналіз з допомогою резонанслюдини з концентрацією, рівною, наприклад, ного сенсора поверхневого плазмона BIOCORE 1мкг/мл. Вміст лунки блокують 200мкл розбавляюбуде описаний нижче в одному з прикладів. чих буфери (наприклад, 50мМ трис-НСІ, 1мМ BIACORE складається з оптичного джерела, MgCl2, 0,1М NaCI, 0,05% твіна-20, 0,02% NaN3, 1% призми, детектора і мікроканала. У процесі пракбичачого сироваточного альбуміна (BSA), pH 7,2), тичного застосування лиганд іммобілізують на в кожну лунку додають поступово розбавлений кінці сенсора касетного типу і ін'їцiюють в нього супернатант кліток COS-7 або СНО, в якому екс 31 75318 32 речовину, що аналізується. При наявності між нинаходу мають значення KD в діапазоні від 1,02 1011 ми спорідненість оптично визначає міру скріплендо 1,86 10-7 [М], переважно від 1,01 10-10 до ня. 1,86 10-8 [М], більш переважне від 1,34 10-10 до Принцип детектування цього методу визнача3,58 10-10 [М], найбільш переважно від 2,25 10-10 ється як резонанс поверхневого плазмону. Пададо 3,58 10-10) lМ]. юче світло направляють на поверхню розділу між Значення Kdiss знаходяться в діапазоні від склом і металевою плівкою так, щоб відбувалося 7,38 10-6 до 1,22 10-1 [1/сек], переважно від повне відображення, при цьому світло, падаюче 7,38 10-5 до 1,22 10-2 [1/сек], більш переважно від під певним кутом, спричиняє збудження поверхне1,66 10-4 до 3,16 10-4 [1/сек], найбільш переважно вого плазмона. Кут падіння світла змінюється в від 1,66 10-4 до 2,32 10-4 [1/сек]. залежності від зміни концентрації розчинника, що Значення Kass знаходяться в діапазоні від торкається металевої плівки (сенсор). BIACORE 6,55 10-4 до 1,24 10-7 [1/М.сек], переважно від визначає цю зміну. 6,55 105 до 1,24 106 [1/М.сек], більш переважно У BIACORE ця зміна називається резонансним від 7,23 105 до 1,03 106 [1/М.сек], найбільш пересигналом (SPR-сигнал), і зміна, на 0,1 градус ставажно від 0,883 106 до 1,03 106 [1/М.сек]. новить 1000 резонансних одиниць (RU). 1000 реЦі значення KD, Kdiss і Kass можна отримати зонансних одиниць відповідає зміні скріплення, за допомогою аналізу Скетчарда або резонансного рівному приблизно 1нг білкa на тонкому золотому сенсора поверхневого плазмона, такого як сенсорі з площею поверхні 1мм2. Для білка можна BlACORE, і переважне BIACORE.oм. повністю визначити зміну, рівну приблизно 50 ре6. Фармацевтична композиція і лікарський зазонансним одиницям (50пг). сіб для придушення гіперкальціємії, що містить Виявлені сигнали перетворюються в приєднаантитіло проти РТНгР або олюднене антитіло в ному до BIACORE комп'ютері в криву скріплення, якості активного інгредієнту. що іменується сенсор-грамою, яка будується на Терапевтичний ефект олюдненого антитіла на моніторі комп'ютера в реальному часі [Natsume, Т., РТНгР можна перевірити шляхом введення антиet. al., (1995) Experimental Medicine, 13, 563-569) тіла проти РТНгР або олюдненого антитіла твари(Karlsson, R., et. al.) ((1991) J.Immunol.) (Methods ні, страждаючій гіперкальціємією, і вимірювання 145, 229-240)]. індексу гіперкальціємії. У тварин з гіперкальцієміЗа допомогою вишеописанного приладу єю і у суб'єктів, страждаючих гіперкальціємією, BIACORE можна виміряти кінетичні параметри, часто спостерігається гіпофосфатемія; антитіла по тобто константу диссоциації (KD), константу швидцьому винаходу можна також використати для кості диссоциації (Kdiss) і константу швидкості поліпшення гіпофосфатемії. асоціації (Kass) антитіл проти РТНгР по цьому виПри здійсненні цього винаходу використовуть находу. антитіло проти РТНгР, включаючи антитіло людиАнтитіла проти РТНгР по цьому винаходу пени, химерне антитіло, приматироване антитіло або реважно мають як можна меншу константу диссоолюднене антитіло проти РТНгР, які мають знациації (значення KD) з точки зору нейтралізуючої чення константи диссоциації, константи швидкості активності. Проти РТНгР антитіла по цьому винадиссоциації і констант швидкості асоціації. Антитіходу переважно мають значення KD, рівну ло, яке буде нейтралізувати активність РТНгР, 1,86 10-7 або менше, більш переважне 1,86 10-8 зв'язуючись з ним, переважно включає олюднене або менше і найбільш переважно 3,58 10-10 або антитіло №23-57-137-1. Спосіб отримання олюдменше. неного антитіла №23-57-137-1 описується в прикЗначення KD визначають на основі двох паладах 1-3. раметрів: Антитіло по цьому винаходу можна очистити з констант швидкості диссоциації (Kdiss) і консдосягненням високої міри очищення за допомогою тант швидкості асоціації (Kass) (KD=Kdiss/Kass). будь-якої комбінації відомих способів очищення, Тому абсолютно очевидно, що значення KD потаких як висалювання, гель-фільтрація з викорисвинні бути менше при менших значеннях Kdiss і танням рідинної хроматографії високого розрізвеликих значеннях Kass. нення і т.д., а також аффінної хроматографії з виЗокрема, значення Kdiss антитіл проти РТНгР користанням колонки, заповненої білком А, і т.д. по цьому винаходу можуть бути рівні 1,22 10-1 Точність пізнавання РТНгР очищеним антитілом [1/сек] або менше. Значення Kdiss переважно рівні -2 -4 можна перевірити відомими імунологічними засо1,22 10 або менше, більш переважне 3,16 10 бами, такими як радіоімунний аналіз (RIA), імуноабо менше і найбільш переважно 2,32 10-4 [1/сек] ферментний аналіз (ЕІА, ELISA) і імунофлуоресабо менше. центний аналіз. З іншого боку, значення Kass можуть бути рівні Як випробувану тварину з симптомами гіпер4 6,55 10 [1/М.сек] або більше. Значення Kass пекальціємії можна використати тваринну модель, 5 реважно рівні 6,55 10 або більше, більш переваотриману шляхом трансплантації РТНгРжне 0,883 106 або більше і найбільш переважно продукуючих ракових кліток експериментальній 6 1,03 10 [1/М.сек] або більше. тварині із зниженою або відсутньою імунологічною Крім того, переважні антитіла проти РТНгР, що функцією. Трансплантовані ракові клітки, які перемають значення Kdiss, рівну 1,22 10-1 [1/сек], і важно беруть у людини, включають, наприклад, значення Kass, рівну 6,55 104 [1/М.сек] або більракові клітки підшлункової залози людини PAN-7. ше. Тварина із зниженою або відсутньою імунологічЗокрема, антитіла проти РТНгР по цьому виний функцією, якій трансплантують ракові клітки, є 33 75318 34 "голою" мишшю і мишшю лінії SCID. вання антиген-зв'язуючої активності антитіл. Міру придушення гіперкальціємії можна визнаНа Фіг.7 показаний графік результатів вимірючити шляхом вимірювання концентрації кальцію в вання антиген-зв'язуючої активності антитіл. крові, маси тіла або відновлення активності руху На Фіг.8 показаний графік результатів вимірюпісля закінчення певного періоду часу з подальвання антиген-зв'язуючої активності антитіл. шою оцінкою зміни стану суб'єкта на основі отриНа Фіг.9 показаний графік результатів вимірюманих даних. вання антиген-зв'язуючої активності антитіл. Фармацевтичну композицію і засіб для придуНа Фіг.10 показаний графік результатів вимішення гіперкальціємії, що містять антитіло або рювання антиген-зв'язуючої активності антитіл. олюднене антитіло проти РТНгР по цьому винахоНа Фіг.11 показаний графік результатів виміду в якості активного інгредієнту, можна вводити рювання антиген-зв'язуючої активності антитіл. парентеральним способом системно або місцево. На Фіг.12 показаний графік нейтралізуючої акНаприклад, можна виробляти внутрішньовенні тивності олюднених антитіл. ін'єкції, включаючи краплинні, внутрішньом'язові На Фіг.13 показаний графік нейтралізуючої акін'єкції, внутрішньочеревні ін'єкції або підшкірні тивності олюднених антитіл. ін'єкції. Спосіб введення вибирають в залежності На Фіг.14 показаний графік нейтралізуючої аквід віку суб'єкта і важкості захворювання. Ефектитивності олюднених антитіл. вна однократна доза може складати від 0,01 до На Фіг.15 показані графіки, що ілюструють 1000мг/кг маси тіла. Альтернативно, вказана доза вплив антитіл по цьому винаходу на тваринну моможе складати від 5 до 10000мг/маса тіла, передель гіперкальціємії. важно від 50 до 1000мг/маса тіла. На Фіг.16 показані графіки, що ілюструють Фармацевтична композиція і засіб для придувплив антитіл по цьому винаходу на тваринну мошення гіперкальціємії, що містить антитіло або дель гіперкальціємії. олюднене антитіло проти РТНгР по цьому винахоНа Фіг.17 показані графіки, що ілюструють ду в якості активного інгредієнту, можуть далі вплив антитіл по цьому винаходу на тваринну мовключати фармацевтично прийнятний носій і/або дель гіперкальціємії. добавку або добавки в залежності від способу На Фіг.18 показані графіки, що ілюструють введення. Прикладами таких носіїв і добавок є вплив антитіл по цьому винаходу на тваринну мовода, фармацевтично прийнятні органічні розчиндель гіперкальціємії. ники, коллаген, полівініловий спирт, полівінілпірНа Фіг.19 показана сенсорграмма, що ілюструє ролідон, карбоксивініл полімер, натрійіммобілізацію РТНгР на кінці сенсора. карбоксиметилцеллюлоза, полі (акрилат натрію), На Фіг.20 показаний графік результатів кінетиаргінат натрію, водорозчинний декстран, натрійчного аналізу антитіла по цьому винаходу. карбоксиметиловий крохмаль, пектин, метилцелНа Фіг.21 показаний графік результатів кінетилюлоза, етилцеллюлоза, ксантанова смола, арачного аналізу антитіла по цьому винаходу. війська камедь, казеїн, желатин, агар, дигліцерин, На Фіг.22 показаний графік результатів кінетигліцерин, пропиленгліколь, поліетиленгліколь, вачного аналізу антитіла по цьому винаходу. зелін, парафін, стеариловий спирт, стеаринова На Фіг.23 показаний графік результатів кінетикислота, сироваточний альбумін людини (HSA), чного аналізу антитіла по цьому винаходу. маннітол, сорбітол, лактоза і сурорантанти, придаНа Фіг.24 показаний графік результатів кінетитні для використання як фармацевтичні добавки. чного аналізу антитіла по цьому винаходу. Добавки можна використати по окремості або в На Фіг.25 показаний графік результатів впливу поєднанні, не обмежуючись вищезгаданими речоолюдненого антитіла по цьому винаходу на фраквинами. ціональну екскрецію фосфату. Антитіло по цьому винаходу можна використаНа Фіг.26 показаний графік результатів впливу ти для лікування гіперкальціємії, виникаючої внаолюдненого антитіла по цьому винаходу на концеслідок різних видів раку (злоякісних пухлин). Ці нтрацію фосфору в плазмі. види раку не мають яких-небудь конкретних обмеНа Фіг.27 показана фотографія виражених кліжень і включають не тільки який-небудь один винічних симптомів у випробуваних мишей, стражгляд раку, але і комбінацію різних видів раку. Види даючих гіперкальціємією, після введення антитіла рак можуть, наприклад включати рак підшлункової проти РТНгР по цьому винаходу (морфологія жизалози, легенів, глотки, гортані, язика, ясен, стравої тварини). воходу, шлунку, жовчних протоків, молочної залоНа Фіг.28 показана фотографія виражених клізи, нирок, сечового пухиря, матки і предстательної нічних симптомів у випробуваних мишей, стражзалози, а також злоякісну лімфому. даючих гіперкальціємією, після введення антитіла На Фіг.1 дане схематичне зображення антитіпроти РТНгР по цьому винаходу (морфологія жила по цьому винаходу. вої тварини). На Фіг.2 дане схематичне зображення транспНа Фіг.29 показаний графік зміни у часі активлантації гіперваріабельних дільниць. ності руху у випробуваної тварини, страждаючої На Фіг.3 показане визначення каркасних облагіперкальціємією, після введення антитіла проти стей і гіперваріабельних дільниць V-області. РТНгР по цьому винаходу в порівнянні з тим же На Фіг.4 показаний графік результатів вимірюпоказником у контрольної тварини, якій вводили вання антиген-зв'язуючої активності антитіл. фізіологічний розчин. На Фіг.5 показаний графік результатів вимірюНа Фіг.30 показаний графік зміни під часі темвання антиген-зв'язуючої активності антитіл. ператури тіла у випробуваної тварини, страждаюНа Фіг.6 показаний графік результатів вимірючої гіперкальціємією, після введення антитіла про 35 75318 36 ти РТНгР по цьому винаходу в порівнянні з тим же середовищі RPMI-1640, що містить 15% фетальної показником у контрольної тварини, якій вводили телячої сироватки (FCS) і ОРІ-добавку (Sigma), фізіологічний розчин. уніфікують по методу обмеженого розбавлення, На Фіг.31 показаний графік зміни під часі покащо дає два типи гібридомних клонів, №23-57-154 і зника pH крові у випробуваної тварини, страждаю№23-57-137-1, кожний з яких володіє сильною здачої гіперкальціємією, після введення антитіла протністю скріплення з РТНгР (1-34). ти РТНгР по цьому винаходу в порівнянні з Гібридомний клон №23-57-137-1, що отримав показником pH у контрольної тварини, якій вводиназву "гібридома типу миша-миша №23-57-137-1", ли фізіологічний розчин. був включений в колекцію Національного інституту Приклади Біонауки Людських технологій, агентство промисДалі приведений більш докладний опис цього лової науки і технології, Японія (1-3, Higashi 1винаходу з посиланням на нижченаведені приклаchome, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Японія) під номеди, які не повинні обмежувати об'єм цього винахором FERM ВР-5631 на основі Будапештського доду. говору від 15 серпня 1996р. Довідковий приклад 1 Приклад 1 Спосіб отримання гібридоми, продукуючої моКлонування ДНК, що кодує V-область монокноклональне антитіло миші проти РТНгР (1-34) лонального антитіла миші проти РТНгР людини (1Гібридоми, здатні продукувати моноклональне 34) антитіло проти РТНгР людини (1-34), №23-57-154 і Клонування ДНК, що кодує V-область отрима№23-57-137-1, отримують у відповідності зі спосоного вище моноклонального антитіла миші проти бом, описаним Каньі Сато і інш. [Sato, ДО. et. al., J. РТНгР людини (1-34) №23-57-137-1, виконуть таBone Miner. Res. 8, 849-860, 1993]. ким чином. У якості імуногена використовуть РТНгР (1-34) (1) Отримання мРНК (Peninsula), з яким кон'югують білок-носій і тирогмРНК отримують з гібридоми №23-57-137-1 з лобулін, використовучи карбодиімід (Dojinn). Кон'використанням набору для очищення мРНК Quick югований з тироглобуліном РТНгР (1-34) диалізуPrep (Pharmacia Biotech) аналогічно описаній нижють, для отримання розчину з концентрацією білка че процедурі. 2мкг/мл. Отриманий розчин змішують з ад'юванКлітки oтриманої вище гібридоми №23-57-137том Фрейнда (Difco) у відношенні 1:1 з отриманням 1 повністю гомогенізують екстракціонним буфеемульсії. Цю емульсію вводять у вигляді дорсальром, після чого мРНК екстрагують з цього буфера но-підшкірної або внутрішньочеревної ін'єкції 16 в колонці з оліго (тимідін) целюлозним наповнювасамицям мишей BALB/C в дозі 100мкг/миша з мечем відповідно до інструкції виробника цього натою імунізації вказаних мишей. Цю ін'єкцію викобору. мРНК осаджують етанолом з екстракціоннонуть 11 разів. Для першої імунізації використовуть го розчину і розчиняють отриманий осадок мРНК в повний ад'ювант Фрейнда і для подальших імунібуфері для елюювання. зацій використовуть неповний ад'ювант Фрейнда. (2) Отримання і ампліфікація кДНК гена, що У імунізованхй мишей визначають титри антикодує V-область Н-ланцюга антигену миші. тіл в сироватках таким чином: (і) Клонування кДНК для V-області Н-ланцюга У всіх мишей беруть кров з хвостової вени і антитіла №23-57-137-1 ДНК, що кодує V-oбласть центрифугують її з отриманням сироватки. Цю Н-ланцюга моноклонального антитіла миші проти сироватку розбавляють буфером для радіоімунноРТНгР людини, клоніють по методу 5'-RACE го аналізу (RIA), змішують з 125-І міченим РТНгР(1[Frohman, M.A. et. al., Prov. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 34) і визначають її зв'язуючу активність. Мишам, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et. al., Nucieic Acias що володіють досить високим титром антитіл, внуRes. 17, 2919-2932, 1989]. Цей (метод виконуть з трішньочеревно вводять РТНгР (1-34) без білкавикористанням набору 5'-Ampli FINDER RACE носія в кількості 50мкг/миша для остаточної імуні(CLONETECH) відповідно до інструкцій виробника. зації. При здійсненні цього методу використовуті| затраЧерез три дні після остаточної імунізації мивки для синтезу кДНК, наприклад, затравки МНС2 шей умертвляють і видаляють у них селезінку. (послідовність з ідентифікаційним №1), яку гібриПотім проводять злиття кліток селезінки з лінією дизує з С-областю Н-ланцюга антитіла миші. Примієломних кліток миші P3x63Aq8U.1 відповідно до близно 2мкг отриманої вище мРНК, яка є матривідомого методу на основі використання 50% поліцею для синтезу кДНК, змішують з 10 пмолями етиленгліколя 4000. Отримані пов'язані клітки інозатравки МНС2. Отриману суміш піддають взаєкулюють в лунки 96-луночних планшетів (всього 85 модії із зворотною транскриптазою при температурі 52°С протягом 30 хвилин, для приготування планшетів) в кількості 2 104/лунка. Скринінг гібрикДНК, комплементарну мРНК. дом, що представляють інтерес, виробляють з Отриману речовину змішують з 6н NaOH для використанням гіпоксантин-аміноптерингідролізу мРНК (при температурі 65°С протягом 30 тимідійової (HAT) середи, таким чином. хвилин) і осаджують кДНК етанолом. Виділеним Гібридоми досліджують на наявність РТНгРтаким чином кДНК лігують з Ampli FINDER (посліупізнаючих антитіл в культуральному супернатандовність з ідентифікаційним №42) у 5'-кінця внаті, тієї лунки, де спостерігалося зростання кліток в слідок взаємодії з РНК-лігазою Т4 при температурі HAT- середовищі, за допомогою твердофазного 37°С протягом би годин і потім при кімнатній темрадіоімунного аналізу. Гібридоми збирають з лунпературі протягом 16 годин. Як затравки для ампки, в якій достовірно встановлена здатність кульліфікації кДНК по методу PCR використовуть затури зв'язуватися з РТНгР-упізнаючим антитілом. травки Anchor (послідовність з ідентифікаційнім Отримані таким чином гібридоми суспендують в 37 75318 38 №2) і затравки MHC-G1 (послідовність з ідентифіВсі фрагменти ДНК, ампліфіковані описаними каційним №3) [S.T. Jones, et.al., Biotechnology, 9, вище методами PCR, розділяють з допомогою 88, 1991]. електрофорезу в агарозном гелі з використанням Розчин для полімеразної реакції синтезу лан3% агарози Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). Для цюга (50мкл), що використовується при здійсненні кожної V-області Н-ланцюга і V-області L-ланцюга цього методу, складається з 10мМ трис-НСІ (pH з геля вирізають відповідно фракцію агарозного 8,3), 50мМ КСl, 0,25мМ dNTP (dATP, dGTP, dCTP, геля, що містить фрагмент ДНК довжиною біля dTTP), 1,5мМ MgCl2, 2,5 одиниці TaKaRa Taq 550 пар основ. З всіх отриманих гель-фракцій ви(Takara Shuzo), 10пмолей затравки Anchor і 1мкл діляють ДНК, використовучи набір GENECLEAN II реакційних суміші кДНК, з якої лігують затравки (BIO 101) відповідно до інструкцій виробника. ОбMHC-G1 і затравки Ampli FINDER Anchor, вміщуючищену ДНК осаджують з розчину етанолом і розчи зверху 50мкл мінерального масла. У термоцикчиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трислізаторі моделі 480J (Perkin Elmer) виконуть триНСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. Один мкл отриманого дцять циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга таким чином розчину ДНК розщеплюють рестриквідповідно до програми циклічної зміни темпераційним ферментом Xmal (New England Biolabs) при тури в наступній послідовності: 94°С протягом 45 температурі 37 °С протягом 1 години і рестрикційсекунд; 60°С протягом 45 секунд і 72°С протягом 2 ний ферментом EcoRI (Takara Shuzo) при темпехвилин. ратурі 37°С протягом ще 1 години. Гіді(юлізовану (іі) Клонування кДНК для V-області L-ланцюга суміш екстрагують фенолом і хлороформом і осаантитіла №23-57-137-1 ДНК, що кодує У-0бласть джують ДНК етанолом. L-ланцюга моноклонального антитіла миші проти Аналогічні|лї чином отримують ДНК, що кодує РТНгР людини, клонують по методу 5'-RACE V-областъ Н-ланцюга миші, ДНК, що кодУє V[Frohman, M.A. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, область L-ланцюга миші, які мають EcoRI8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et. al., Nucleic Acids упізнаючу послідовність у 5'-кінця і Xmal-упізнаючу Res. 17, 2919-2932, 1989]. Цей Цетод виконуть з послідовність у 3'-кінця. використанням набору 5'-Ampli Finder RACE Всі фрагменти ДНК EcoRI-Xmal, що містять ві(CloneTech) відповідно до інструкцій виробника. дповідно ДНК, що кодує V область Н-ланцюга миПри здійсненні цього методу, як затравки для синші, і ДНК, що кодує V-областьL-ланцюга миші, тезу кДНК використовуть оліго (тимідінову) затравпіддаюті взаємодії з вектором pUC19, який заздаку. Приблизно 2 мкг отриманії вище мРНК, яка є легідь розщеплюють EcoRI і Xmal, прі температурі матрицею для синтезу кДНК, змішують з оліготи16°С протягом 1 години з використанням набору мідіновою затравкою. Отриману суміш піддають для лігування ДНК варіант 2 (Такаra Shuzo) відповзаємодії із зворотною транскриптазoю при темвідно до інструкцій виробника. Отриману таким пературі 52°С протягом 30 хвилин з отриманням чинод ліговану суміш (10мкл) додають до 100мкл кДНК. Отриману речовину змішують з 6н NaOH розчину, що містить компетентнi клітки Е.соlі, JM для гідролізу РНК (при температурі 65°С протягом 109 (Nippon Gene). Суміш кліток залишають ви30 хвилин). Отриману суміш осаджують етанолом стоюватися на льоду протягом 15 хвилин, потім для виділення кДНК у вигляді осадка, виділеним при температурі 42° С протягом 1 хвилини і знов таким чином кДНК лігують зі зв'язуючим фрагменна льоду протягом ще 1 хвилини. Отриманий протом Ampli FINDERJ Anchor у 5'-кінця внаслідок дукт змішують з 300мкл культуральної середи взаємодії з РНК-лігазою Т4 при температурі 37°С SOC [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, протягом 6 годин і потім при кімнатній температурі Sambrook et. al., Cold Spring-Harbor Laboratory протягом 16 годин. Press, 1989] і інкубують при температурі 37°С проЗатравки MLC (послідовність з ідентифікаційтягом 30 хвилин. Отриманий розчин кліток вміщуним №4) для полімеразної реакції синтезу ланцюють на агарову середу LB або 2xYT [Molecular га конструюють на основі консервативної послідоCloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et. al., Cold Spring Harbo Laboratory Press, 1989], що місвності С-області -ланцюга L-ланцюга миші і тить 100 або 50мкг/мл ампіцилліну, 0,1мМ ІPTG синтезують в синтезаторі 394 ДНК/РНК (ABI). 20мкг/мл X-gal, і інкубують при температурі 37°С Розчин для полімеразної реакції синтезу ланпротягом ночі. Аналогічнил чином отримують трацюга (100мкл), що використовується в процесі нсформанти Е.соІі. отримання затравки, складається з 10мМ трис-НСІ Трансформанти культивуть протягом ночі в (pH 8,3), 50мМ КСl, 0,25мМ dNTP (dATP, dGTP, 2мл середи LB або 2xYT, що містить 100 або dCTP, dTTP), 1,5мМ MgCl2, 2,5 одиниці AmpliTaq 50мкг/мл ампіцилліну, при температурі 37°С, після (PERKIN ELMER), 50пмолей затравки Anchor (посчого з клітинної фракції отримують плазмідну ДНК лідовність з ідентифікаційним №2) і 1мкл реакційз допомогою плазмідного екстракторі P1-100Z них суміші кДНК, з якої лігують затравки MLC (пос(Kurabou) або набору для виділення плазмід лідовність з ідентифікаційним №4) і затравки Ampli QIAprep (QIAGEN). У отриманий таким чином плаFINDER Anchor лігували, вміщуючи зверху 50мкл змідних ДНК визначають послідовності ДНК. мінерального масла. У термоциклізаторної моделі (4) Секвенування кДНК, що кодує V-область 480J (Perkin Elmer) виконуть тридцять п'ять циклів антитіла миші. полімеразної реакції синтезу ланцюга відповідно Послідовність кДНК, що кодує область плазмідо програми циклічної зміни температури в настуди, визначають з допомогою секвестора ДНК 373А пній послідовності: 94°С протягом 45 секунд, 60°С (ABI; Perkin-Elmer), використовучи набір длз цикліпротягом 45 секунд і 72°С протягом 2 хвилин. чного секвенування з фарбуванням термінатора (3) Очищення і фрагментація продукту поліме(Perkin-Elmer). Для визначення цієї послідовності разної реакції синтезу ланцюга. 39 75318 40 ДНК досліджують послідовності основ в обо: орієТаблиця 2 нтаціях за допомогою таких затравок, як затравки М13 Primer M4 (Takara Shuzo) (послідовність з Послідовність з ідентифікаційним №5) і затравки М13 Primer RV V-область ідентифікаційним CDR1 CDR2 CDR3 (Takara Shuzo) (послідовність з ідентифікаційним № №6). V-область 57 31-35 50-66 99-107 Отримані таким чином плазміди, що містять Н-ланцюга кДНК, що кодує V-область Н-ланцюга миші, і кДНК, V-область 65 23-34 50-60 93-105 що кодує V-область L-ланцюга миші, виділені з L- ланцюга гібридоми №23-57-137-1, названі відповідно "МВС1Н04" і "MBC1L24". Послідовності (включаюПриклад 2 чи відповідні амінокислотні послідовності) ДНК, що Конструювання химерного антитіла кодує V-область Н-ланцюга, і ДНК, що кодує V(1) Конструювання Н-ланцюга химерного антиобласть L-ланцюга антитіла миші №23-57-137-1 тіла (що відносяться відповідно до плазмідів МВС1Н04 (і) Конструювання V-області Н-ланцюга і МВС1Н24), представлені відповідно послідовносКлоновану кДНК, що кодує V-область Нтями з ідентифікаційними №№ 57 і 65. Обидва ланцюга миші, модифікують по методу PCR і лігуполіпептида для фрагмента V-області Н-ланцюга і ють з експресуючим вектором, що містить геном фрагмента V-області L-ланцюга трансльовані, пону ДНК для С 1 С-області Н-ланцюга людини. Ничинаючи з 58-ої основи (яка кодує глутамин) в пожню затравку MBC1-S1 (послідовність з ідентифіслідовностях ДНК, виражених послідовностями з каційним №7) конструюють таким чином, щоб вона ідентифікаційними №№ 57 і 65. Амінокислотні погібридизувала з ДНК, що кодує 5'-кінцеву область слідовності для V-області Н-ланцюга і V-області Lлідерної послідовності V-області, і мала узгоджену ланцюга виражені відповідно послідовностями з послідовність Козака [Kozak, М. et. al., J. Mol. Biol, ідентифікаційними №№ -6 і 45. 196, 947-950, 1987] і Hindlll-упізнаючу послідовШтамм Е.соІі, що має плазміду МВС1Н04, і ність. Верхню затравку МВС1-а (послідовність з штамм Е.соІі, що має плазміду MBC1L24, відповіідентифікаційним №8) конструюють таким чином, дно названі "Escherichia coli JM109 (МВС1Н04)" і щоб вона гібридизувала з ДНК, що кодує 3'-кінцеву "Escherichia coli JM109 (MBC1L24)". Ці штамми область J-області, і мала донорську послідовність Е.coli включені в колекцію Національного інституту сплайсованого фрагмента і ВаmНІ-упізнаючу посбіонауки людської технології, агентство промислолідовність. Полімеразну реакцію синтезу ланцюга вої науки і технології, Японія (1-3, Higashi 1-chome, здійснюють з використанням TaKaRa Ex Taq Tsukuba-shi, Ibaragi-ken, Японія), під номерами (Takara Shuzo) і відповідного буфера. Розчин для FERM ВР-5628 для Escherichia coli JM109 полімеразної реакції синтезу ланцюга (50мкл) міс(МВС1Н04) і FERM ВР-5627 для Escherichia coli тить 0,07мкг плазміди МВС1Н04 в якості матричної JM109 (MBC1L24) на основі Будапештського догоДНК, 50пмолей МВС1-а і 50пмолей MBC1-S1 як вору від 15 серпня 1996р. затравки, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq і 0,25мМ (5) Визначення гіперваріабельної дільниці моdNTP в буфері, понад якого вміщують 50мкл міненоклонального антитіла миші №23-57-137-1 пройрального масла. Виконуть тридцять циклів полімети РТНгР людини. разної реакції синтезу ланцюга відповідно до проЗагальні структури V-області Н-ланцюга і Vграми циклічної зміни температури в наступній області L-ланцюга володіють значною схожістю. послідовності: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С проТобто обидві структури мають чотири каркасні тягом 1 хвилини, 72°С протягом 2 хвилин. Фрагмеобласті, дотовані за допомогою трьох гиперваріанти ДНК, ампліфіковані внаслідок виконання полібельних дільниць [тобто, CDR]. Амінокислотні померазної реакції синтезу ланцюга, розділяють за слідовності каркасних областей є досить консердопомогою електрофорезу в агарозному гелі з вативними, в той час як амінокислотні використанням 3% агарози Nu Sieve GTG (FMC послідовності гіперваріабельних дільниць харакBio. Products). теризуються сильною мутагенністю [Kabat, E.A. et. Потім вирізають дільницю агарозного геля, що al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest", містить фрагмент ДНК довжиною 437 пар основ, і US Dept. Health and Human Services, 1983]. очищають вказаний фрагмент ДНК за допомогою На основі вищезгаданих чинників, гіперваріанабору GENECLEAN II (BIO 101) відповідно до бельні дільниці (CDR) визначають шляхом пошуку прикладених до нього інструкцій. Обчищену ДНК гомології амінокислотних послідовностей Vосаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчиобласті моноклонального антитіла миші внаслідок ну, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ етизвернення до бази даних по структурі амінокислолендиаминтетраоцтової кислоти (EDTA). Один мкл тних послідовностей для антитіл, створеної Кабаотриманого розчину ДНК розщеплюють рестриктом і інш. ційними ферментами BamHI і Hindlll (Ta-kara Амінокислотні послідовності гіперваріабельних Shuzo) при температурі 37°С протягом 1 години. дільниць 1-3 V-області L-ланцюга виражені відпоГідролізованну суміш екстрагують фенолом і хловідно послідовностями з ідентифікаційними роформом і осаджують ДНК етанолом. №№59-61, і амінокислотні послідовності гіперваріОтриманий фрагмент ДНК HindlII-BamHI, який абельних дільниць 1-3 V-області Н-ланцюга вирамістить ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга миші, жені відповідно послідовностями з ідентифікаційсубклонують у векторі pUC19, який заздалегідь ними №№62-64. розщеплюють ферментами HindIll і BamHI. Отриману плазміду секвенують секвенатором ДНК 41 75318 42 373А (Perkin-Elmer), використовучи затравки М13 щеплюють ферментами EcoRI і Smal. Отриману Primer M4 і М13 Primer RV і набір для циклічного плазміду секвенують секвенатором ДНК 373А секвенування з фарбуванням термінатора (Perkin(Perkin-Elmer), використовучи затравки М13 Primer Elmer). Вказана плазміда, яка містить ДНК з необM4 і М13 Primer RV і набір для циклічного секвенухідною послідовністю основ, що кодує V-область вання з фарбуванням термінатора (Perkin-Elmer). Н-ланцюга миші, виділену з гібридоми №23-57Вказана плазміда, яка містить ДНК з необхідною 137-1, і має HindIII-упізнаючу послідовність, посліпослідовністю основ, що кодує V-область Ндовність Козака в 5'-кінцевій області і ВаmНІланцюга миші, виділену з гібридоми №23-57-137-1, упізнаючу послідовність в 3'-кінцевій області, наі має HindIII-упізнаючу послідовність, послідовність звана "MBC1H/pUC19. Козака в 5'-кінцевій області і АраІ- і Smal-упізнаючі (іі) Конструювання V-області Н-ланцюга, що послідовності в 3'-кінцевій області, названа використовується для отримання кДНК химерної "MBC1Hv/pUC19". Н-ланцюга типу "миша-людина" (ііі) Конструювання експресуючого вектора для Отриману на попередній стадії ДНК, що кодує Н-ланцюга химерного антитіла V-область Н-ланцюга миші, модифікують по метокДНК, що містить С 1 С-області Н-ланцюга анду PCR і лігують з кДНК для С 1 С-області Нтитіла людини, отримують таким чином. ланцюга людини. Зворотну затравку MRC1PVS2 З клітки яєчника китайського хом'ячка, в яку (послідовність з ідентифікаційним №9), що викозаздалегідь вводять експресуючий вектор DHFRристовується для модифікації V-області НE-RVh-PM-1f [див. W092/19759], кодуючий геномланцюга, конструюють таким чином, щоб замінити ні ДНК V-області Н-ланцюга олюдненого антитіла гліцином другу амінокислоту (тобто аспаргін) посРМ1 і IgGI С-області Н-ланцюга антитіла людини, і лідовності, що кодує передню частину лідерної експресуючий вектор RVl-PMla [див. W092/19759], послідовності V-області, і отримати узгоджену покодуючий генокгаі ДНК V-області L-ланцюга олюдслідовність Козака [Kozak, N. et.al., J. Mol. Biol., неного антитіла РМ1 і С-області -ланцюга L196, 947-950, 1987] і HindIII-і EcoRI-упізнаючі посланцюга антитіла людини, отримують мРНК. лідовності. Пряму затравку MBC1PVR2 (послідовОтриману мРНК використовує для клонування по ність з ідентифікаційним №10), що використовуметоду RT-PCR кДНК, що містить V-область Нється для модифікації V-області Н-ланцюга, ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і С 1 С-області конструюють таким чином, щоб вона гібридизуваантитіла людини, які потім субклонують н сайті ла з послідовністю ДНК, що кодує 3'-кінцеву обHindlll-BamHI плазміди pUC19. У субклонованій ласть J-області, і з послідовністю ДНК, що кодує плазміді визначають послідовність ДНК. Плазміда 5'-кінцеву область С-області, і мала Ара1- і Smalз необхідною послідовністю основ названа "pRVhупізнаючі послідовності. PM1f-кДНК". Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійсЩоб сконструювати експресуючий вектор для нюють з використанням TaKaRa Ex Taq (Takara кДНК, що містить V-область Н-ланцюга олюдненоShuzo) і відповідного буфера. Розчин для полімего антитіла РМ1 і С 1 С-області антитіла людини, разної реакції синтезу ланцюга (50мкл) містить отримують експресуючий вектор DHFR- E-RVh0,6мкг плазміди MBC1H/pUC19 в якості матричної PM-1-f з делеціями в сайті Hindlll між промотором ДНК, 50пмолей MBC1HVS2 і 50пмолей MBC1HVR2 SV40 і геном DHFR і в сайті EcoRl між промотором як затравки, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq і 0,25мМ EF-1 і V-областю Н-ланцюга олюдненого антитіла dNTP в буфері, понад якого вміщують 50мкл мінеРМ1. рального масла. Виконуть тридцять циклів полімеОтриману плазмі ду pRVh-PM1f-кДНК розщепразної реакції синтезу ланцюга відповідно до пролюють BamHI, дефосфолюкуфь фрагментом Клеграми циклічної зміни температури в наступній нова і ще раз розщеплюють Hindlll з отриманням послідовності: 94°С протягом 1 хвилини; 55°С продефосфольованого фрагмента Hindlll-BamHI. Цей тягом 1 хвилини; 72°С протягом 1 хвилини. Фрагдефосфольований фрагмент Hindlll-BamHl лігують менти ДНК, ампліфіковані внаслідок виконання з експресуючим вектором DHFR- E-RVh-PM-1-f, полімеразної реакції синтезу, розділяють за допощо має делеції в сайтіах Hindlll і EcoRl, який замогою електрофорезу в агарозному гелі з викориздалегідь розщеплюють Hindlll і BamHI, з метою станням 1% агарози Sea Kern GTG (FMC Bio. конструювання експресуючого вектора RVh-PM1fProducts). Потім вирізають дільницю агарозного кДНК, що містить кДНК, що кодують відповідно Vгелю, що містить фрагмент ДНК довжиною 456 пар область Н-ланцюга олюдненого антитіла РМ1 і С 1 основ, і очищають вказаний фрагмент ДНК за доС-області антитіла людини. помогою набору GENECLEAN II (BIO 101) відповіЕкспресуючий вектор RVh-PM1f-кДНК, що місдно до інструкцій виробника. Очищені фрагменти тить кДНК, що кодують V-область Н-ланцюга олюДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл дненого антитіла РМ1 і С 1 С-області антитіла розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ людини, розщеплюють АраІ і BamHI, після чого EDTA. отримують фрагмент ДНК, що містить С-область Один мкл отриманого розчину ДНК розщепН-ланцюга. Отриманий фрагмент ДНК вводять у люють рестрикційними ферментами EcoRl і Smal вищезгадану плазміду MBC1Hv/pUC19, яку зазда(Takara Shuzo) при температурі 37°С протягом 1 легідь розщеплюють Aral і BamHI. Отримана таким години. Гідролізованну суміш екстрагують феночином плазм да названа "МВС1НкДНК/рUС19". Ця лом і хлороформом і осаджують етанолом ДНК. плазміда містить кДНК, які кодують відповідно VОтримані фрагменти ДНК EcoRI-Smal, які містять область Н-ланцюга антитіла миші і С 1 С-області ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга миші, субклоантитіла людини і мають EcoRI- і HindIII-упізнаючі нують у векторі pUC19, плазміду заздалегідь роз 43 75318 44 послідовності у 5'-кінця і BamHI-упізнаючу посліSOC і інкубують при температурі 37°С протягом 1 довність у 3'-кінця. години. Отриманий розчин вміщують на агарову Плазміда МВС1НcДНК/рUС19 була розщепсереду 2xYT (утримуючу 50мкг/мл ампіцилліну), на ленням EcoRI і BamHI для отримання ДHК, що поверхню якої заздалегідь нанесені X-gal і IPTG кодує Н-ланцюг химерного антитіла. Отриманий [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Samorook, фрагмент ДНК вводять в експресуючий вектор et.al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], і pCOS1, який заздалегідь розщеплюють EcoRI і культивують при температурі 37°С протягом ночі, BamHI. Отриманий таким чином експресуючий отримуючи таким чином трансформант. вектор для химерного антитіла названий Цей трaнсформант культивуть на середі 2xYT, "МВС1HкДНК/pCOS1". Експресуючий вектор pCOщо містить 50мкг/мл ампіцилліну при температурі 37°С протягом ночі. З кліткової фракції культураSI конструюють з використанням HEF-PMh-g 1 льної середи виділяють плазмідну ДНК, викорис[див. W092/19759], видаляючи ген антитіла шлятовучи для цього ланцюга мінінабор для очищення хом розщеплення з допомогою EcoRI і Smal і лігуплазмід (QlAGEN) відповідно до прикладених до ючи його з адаптером EcoRI-Notl-BamHI (Takari нього інструкцій. Обчищену плaзміду розщеплюShuzo). ють Hindlll. Ця плазміда з делецією сайта Hindlll Щоб отримати плазміду для експресії в клітці названа "pUC19 Hindlll". яєчника китайського хом'ячка, плазміду МВС1НкДНК/рUС19 розщеплюють EcoRI і BamHI з (іі) Конструювання ДНК, що кодує С-область отриманням ДНК, що кодує Ннланцюг химерного ланцюга L-ланцюга людини антитіла, який потім вводять в експресуючу плазВідомо, що С-область -ланцюга L-ланцюга міду рСНOI, яку заздалегідь розщеплюють EcoRI і антитіла людини має принаймні чотири ізотипа, BamHI. Отриманий таким чином експресуюча плащо включають Mcg+Ke+Oz-, Mcg-Ke-Oz-, Mcg-Ke-Oz+ зміда для химерного антитіла названа і І Mcg-Ke+Oz- [P. Dariavach, et. al., Proc. Natl. Acad. "МВС1НкДНК/pCHO1. Експресуючий вектор Sci. USA, 84, 9074-9078, 1987]. На основі бази даpCHO1 конструюють з використанням DHFR- Eних EMBL зроблений пошук С-області -ланцюга rvH-PM1-f [див. W092/19759], видаляючи ген антиL-ланцюга антитіла людини, яка гомологічна Стіла шляхом розщеплення з допомогою EcoRI і області -ланцюга L-ланцюга миші №23-57-137-1. Smal і лігуючи його з адаптером EcoRI-Notl-BamHl Внаслідoк цього встановлено, що ізотип (iakara Shuzo). Mcg+Ke+Oz- (№ доступу 1X57819) [P. Dariavach, et. (2) Конструювання С-області L-ланцюга людиal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,9074-9078, 1987] ни -ланцюги L-ланцюга антитіла людини в найбіль(і) Отримання клонуючого вектора шій мірі гомологічен С-області -ланцюга LЩоб сконструювати вектор pUC19, що містить ланцюга миші №23-57-137-1, характеризуючись С-область L-ланцюга людини, отримують вектор 64,4% гомологією відносно амінокислотної посліpUC19 з делецією сайта Hindlll. Два мкг вектори довності і 73,4% гомологією відносно послідовносpUC19 розщеплюють в 20мкл реакційного розчину, ті ДНК. що містить 20мМ трис-НСІ (pH 8,5), 10мМ MgCl2 Потім по методу PCR конструюють ДНК, що 1мМ дитіотреітола (DTT), 100мМ КСI, 8 одиниць кодує С-область -ланцюга L-ланцюга антитіла Hindlll (Takara Shuzo), при Температурі 37°С пролюдини. Всі нижченаведені затравки синтезують тягом 1 години. Отриману гідролізованну суміш за допомогою синтезатора ДНК/РНК 394 (ABI). екстрагують фенолом і хлороформом і осаджують Синтезують затравки HLAMB1 (послідовність з необхідну ДНК етанолом. ідентифікаційним №11) і HLAMB3 (послідовність з Отрима|гу ДНК піддають взаємодії в 50мкл реідентифікаційним №13), які містять смислову посакційного розчину, що містить 50мМ трис-НСІ (pH лідовність ДНК, і затравки HLAMB2 (послідовність 7,5), 10мМ MgCl2, 1мМ дитіотреітола (DTT), 100мМ з ідентифікаційним №12) і HLAMB4 (послідовність NaCl, 0,5мМ dNTP і 6 одиниць фрагмента Кленова з ідентифікаційним №14), які містять антисмислову (GIBCO BRL), при кімнатній температурі протягом послідовність ДНК, при цьому всі затравки мають з 20 хвилин, внаслідок чого відбувається дефосфообох кінців комплементарну послідовність довжилювання ДНК. Отриману реакційну суміш екстраною 20-23 пари основ. гують фенолом і хлороформом і осаджують етаЗовнішні затравки HLAMBS (послідовність з нолом векторної ДНК. ідентифікаційним №15) і HLAMBR (послідовність з Отриману векторну ДНК піддають взаємодії в ідентифікаційним №16) мають послідовність, ком10мкл реакційного розчину, що містить 50мМ трисплементарну затравкам HLAMB1 і HLAMB4, відпоНСІ (pH 7,6), 10мМ MgCI2, 1мМ аденозин-5'відно, а також містять відповідно EcoRI-, Hindlll- і трифосфата (АТР), 1мМ іитіотреітола (DTT), 5% (в В1nl-yпізнаючі послідовності і EcoRI-упізнаючу об'ємному відношенні) поліетиленгліколя-8000 і послідовність. Під час першої полімеразної реакції 0,5 одиниці ДНК-лігази Т4 (GIBCO BRL), при темсинтезу ланцюга відбувається взаємодія HLAMB 1пературі 16°С протягом 2 годин, внаслідок чого HLAMB2 і HLAMB3-HLAMB4. Після завершення відбувається аутолігування векторної ДНК. Реаквказаних реакцій обидва отриманих продукта зміційну суміш (5мкл) додають до 100мкл розчину, шують один з одним в еквівалентних кількостях і того, що містить компетентні клітки штамма JM109 проводять їх збирання під час другої полімеразної Е.coli (Nippon Gene) і отриманий розчин залишареакції синтезу ланцюга. До отриманого продукту ють вистоюватися на льоду протягом 30 хвилин, додають зовнішні затравки HLAMBS і HLAMBR. потім при температурі 42°С протягом 1 хвилини і Цю реакційну суміш піддають третій полімеразній знов на льоду протягом 1 хвилини. До реакційного реакції синтезу ланцюга з метою ампліфікації нерозчину додають 500мл культуральної середи 45 75318 46 процессійованої ДНК. Один мкл обробленої фосфатазою бактерій Полімеразні реакції синтезу ланцюга виконуть плазміди pUC19 НіndllІ змішують з 4мкл ДНК, з допомогою TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) відпоотриманої внаслідок вищезгаданої полімеразної відно до інструкцій виробника. Під час здійснення реакції синтезу ланцюга, щоб лігувати їх один з першої полімеразної реакції синтезу ланцюги виодним за допомогою набору для лігування ДНК, користовуть 100мкл реакційного розчину, що місваріант 2 (Takara Shuzo). Отриману плазміду ввотить 5пмолей HLAMB 1, 0,5пмолей HLAMB2 і 5 дять в компетентну клітку Е.coli, JM109, для утвоодиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), або реакрення трансформанту. Трансформант культивуть ційний розчин, що містить 0,5пмолей HLAMBS, протягом ночі в 2мл середи 2xYT, що містить 5пмолей HLAMB4 і 5 одиниць TaKaRa Ex Taq 5мкг/мл ампіцилліну. Отриману з цієї клітки плаз(Takara Shuzo), понад якого вміщують 50мкл мінеміду очищають за допомогою набору для очищенрального масла, і виконуть п'ять циклів полімеразня плазмід QIAprep (QIAGEN). ної реакції синтезу ланцюга відповідно до програУ вищеописаній плазміді підтверджують посліми циклічної зміни температури в наступній довність клонованої ДНК. Для визначення посліпослідовності: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С продовності ДНК використовуть секвенатор ДНК 373А тягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Під (ABI) і затравки "M13 Primer M4" і "M13 Primer RV" час здійснення другої полімеразної реакції синтезу (Takara Shuzo). Це дозволяє встановити, що клоланцюга використовуть суміш, що містить по нована ДНК має делецію довжиною 12 пар основ. 50мкл кожного реакційного розчинну, понад якою Вказана плазміда, що містить цю ДНК, названа вміщують 50мкл мінерального масла, і виконуть "c /pUC19". Потім для отримання рекомбінантної три цикли полімеразної реакції синтезу ланцюга частини знову синтезують затравки HCLMS (посвідповідно до програми циклічної зміни темпералідовність з ідентифікаційним №17) і HCLMR (постури в наступній послідовності: 94°С протягом 1 лідовність з ідентифікаційним №18) і по методу хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом полімеразної реакції синтезу ланцюга (PCR) реко1 хвилини. Під час здійснення третьої полімеразнструюють необхідну ДНК. ної реакції синтезу ланцюга використовуть реакПершу полімеразну реакцію синтезу ланцюга ційний розчин, до якого додають по 50пмолей зовздійснюють, використовучи плазміду з c /pUC19, нішніх затравок HLAMBS і HLAMBR, і виконуть що містить видалену ДНК як матриця, і затравки тридцять циклів полімеразної реакції синтезу ланHLAMBS і HCLMS або затравки HCLMS і HLAMB4. цюга відповідно до програми циклічної зміни темВсі продукти полімеразної реакції синтезу ланцюга ператури в наступній послідовності: 94°С протягом послідовно очищають. При здійсненні другої полі1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С протямеразної реакції синтезу ланцюги проводять збигом 1 хвилини. рання продуктів PCR. До отриманого продукту Фрагмент ДНК, отриманий внаслідок третьої додають зовнішню затравки HLAMBS і HLAMB4, полімеразної реакції синтезу ланцюга, піддають після чого виконуть третю полімеразну реакцію електрофорезу в 3% низькоплавкому агарозному синтезу ланцюга для ампліфікації непроцессійовагелі (NuSieve GTG Agarose, FMC), після чого його ної ДНК. виділяють і очищають від гелю за допомогою наПід час здійснення першої полімеразної реакбору GENECLEAN II (BIO 101) відповідно до прикції синтезу ланцюги використовуть 100мкл реакладених до нього інструкцій. ційного розчину, що містить 0,1мкг cXA/pUC19 як Отриманий таким чином фрагмент ДНК розматриця, по 50пмолей затравки HLAMBS і HCLMR щеплюють в 20мкл реакційного розчину, що місабо по 50пмолей затравки HCLMS і HLAMB4 і 5 тить 50мМ трис-НСІ (pH 7,5), 10мМ MgCl2, 1мМ одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), понад дитіотреітола (DTT), 100мМ NaCl і 8 одиниць якого вміщують 50мкл мінерального масла, і викоEcoRI (Takara Shuzo), при температурі 37°С протянуть тридцять циклів полімеразної реакції синтезу гом 1 години. Гідролізований розчин екстрагують ланцюга відповідно до програми циклічної зміни фенолом і хлороформом і осаджують ДНК етанотемператури в наступній послідовності: 94°С пролом. Отриману ДНК збирають і розчиняють в 8мкл тягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ протягом 1 хвилини. етилендиаминтетраоцтової кислоти (EDTA). Продукти полімеразної реакції синтезу ланцюПлазмі ду pUC19 НіndllІ (0,8мкг) розщеплюга, HLAMBS-HCLMR (236 пар основ) і HCLMSють EcoRI аналогічно вищеописаної процедурі. HLAMB4 (147 пар основ) піддають електрофорезу Гідролізований розчин екстрагують фенолом і в 3% низькоплавкому агарозному гелі, щоб виділихлороформом і осаджують етанолом, що дає розти фрагмент ДНК. Фрагмент ДНК збирають і очищеплену плазміду pUC19 НіndllІ. Розщеплену щають від гелю за допомогою набору плазміду піддають взаємодії в реакційному розчині GENECLEAN II (BIO 101). Під час здійснення дру(50мкл), що містить 50мМ трис-НСІ (pH 9,0), 1мМ гої полімеразної реакції синтезу ланцюги викорисMgCl2 і лужну фосфатазу (Е.coli C75; Takara товуть 20мкл реакційного розчину, що містить 40нг Shuzo), при температурі 37°С протягом 30 хвилин, обчищених фрагментів ДНК і 1 одиницю TaKaRa внаслідок чого відбувається дефосфолювання Ex Taq (Takara Shuzo), понад якого вміщують вказаної плазміди (тобто обробляють лужною фо25мкл мінерального масла, і виконуть п'ять циклів сфатазою бактерій). Реакційний розчин екстрагуполімеразної реакції синтезу ланцюга відповідно ють фенолом і хлороформом і осаджують ДНК до програми циклічної зміни температури в настуетанолом. Отриману таким чином ДНК розчиняють пній послідовності: 94°С протягом 1 хвилини, 60° С в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (pH протягом 1 хвилини і 72° С протягом 1 хвилини. 7,4) і 1мМ EDTA. Під час здійснення третьої полімеразної реак 47 75318 48 ції синтезу ланцюга використовуть 100мкл реакфатазою бактерій (ВАР). Отриману плазміду ввоційного розчину, що містить 2мкл реакційного роздять в компетентну клітку Е.coli, JM109, для утвочину, отриманого при виконанні другої полімеразрення трансформанту. Отриманий таким чином ної реакції синтезу ланцюга, по 50пмолей затравки трансформант культивуть протягом ночі в 2мл HLAMBS і HLAMB4 і 5 одиниць TaKaRa EX Taq середи 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіцилліну. (Takara Shuzo), понад якого вміщують 50мкл мінеВиділену з клітинної фракції плазміду очищають за рального масла, і виконуть тридцять циклів полідопомогою набору для очищення плазмід QIAprep меразної реакції синтезу ланцюга відповідно до (QIAGEN). програми циклічної зміни температури в наступній Обчищену плазмідну ДНК секвенують, викорипослідовності: 94°С протягом 1 хвилини, 60°С простовучи затравки М13 Primer М4 і М13 Primer RV тягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини, що дає (Takara Shuzo), з допомогою секвенатора ДНК фрагмент ДНК довжиною 357 пар основ (продукт 373А (АВІ). Плазміда, з підтвердженою правильтретьої полімеразної реакції синтезу ланцюга). ною послідовністю основ, названа "C /pUC19" Фрагмент ДНК піддають електрофорезу в 3% ни(3) Конструювання експресуючого вектор Lзькоплавкому агарозному гелі. Отриманий фрагланцюга химерного антитіла мент ДНК видаляють і очищають за допомогою Конструюють експресуючий вектор L-ланцюга набору GENECLEAN (BIO 101). химерного антитіла №23-57-137-1. ДНК, що кодує Отриманий таким чином фрагмент ДНК V-область L-ланцюга №23-57-137-1, лігують з сай(0,1мкг) розщеплюють EcoRI і субклонують в платами Hindlll і Blnl, розташованими безпосередньо зміді pUC19 Hindlll, яку заздалегідь обробляють перед С-областю антитіла людини, обох плазмід лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Отриману C /pUC19 і С /рUС19, внаслідок чого отримують плазміду вводять в компетентну клітку Е.coli, вектори pUC19, що містять ДНК, що кодує VJM109, для утворення трансформанту. Отриманий область L-ланцюга химерного антитіла №23-57таким чином трансформант культивуть протягом 137-1 і С-область - або -ланцюги L-ланцюга. ночі в 2мл середи 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіОбидва вектори потім розщеплюють EcoRI, щоб цилліну. Виділену з клітинної фракції плазміду вирізати ДНК, що кодує L-ланцюг химерного антиочищають за допомогою набору для очищення тіла, який потім субклонують в експресуючому плазмід QIAprep (QlAGEN). векторі HEF. Послідовність ДНК отриманої плазміди підтвеДНК, що кодує V-область L-ланцюга антитіла рджують за допомогою затравок М13 Primer М4 і №23-57-137-1, клонують з плазміди MBC1L24 по Ml3 Primer RV (Takara Shuzo) і визначають на секметоду PCR. Окремі затравки синтезують за довенатора ДНК 373А (АВl). Плазміда, з підтверджепомогою синтезатора ДНК/РНК 394 (ABI). Зворотною правильною послідовністю ДНК без якийну затравку MBCCHL1 (послідовність з ідентифінебудь делеції, названа "С /pUC19". каційним №21) конструюють таким чином, щоб (ііі) Конструювання ДНК, що кодує С-область вона містила Hindlll-упізнаючу послідовність і пос-ланцюга L-ланцюга людини лідовність Козака [Kozak, М. et. al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987], і пряму затравку MBCCHL3 (посліФрагмент ДНК, що кодує С-область -ланцюга довність з ідентифікаційним №22) конструююсь L-ланцюга, клонують з плазміди HEF-PMIk-gk таким чином, щоб вона містила Bgll- і RcoRI-y (ВД092/19759) по методу PCR. Пряму затравку знаючі послідовності. HKAPS (послідовність з ідентифікаційним №19) Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійсконструюють таким чином, щоб вона містила нюють, використовучи 100мкл реакційного розчиEcoRI-, Hindlll- і Blnl-упізнаючі послідовності, і звону, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 8,3), 50мМ КСI, ротну затравку НКАРА (послідовність з ідентифі1,5мМ MgCl2, 0,2мM dNTP, 0,1мкг MBC1L24, по каційним №20) конструюють таким чином, щоб 50пмолей затравки MBCCHL1 і MBCCHL3 і 1мкл вона містила EcoRI-упізнаючу послідовність, викоAmpliTaq (Perkin Elmer), понад якого вміщують ристовучи для їх синтезу синтезатор ДНК/РНК 394 50мкл мінерального масла. Виконуть тридцять (ABI). циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга відПолімеразну реакцію синтезу ланцюга здійсповідно до програми циклічної зміни температури нюють, використовучи 100мкл реакційного розчив наступній послідовності: 94°С протягом 45 сену, що містить 0,1мкг плазміди HEF-PMlk-gk як кунд, 60°С протягом 45 секунд і 72°С протягом 2 матриця, по 50пмолей затравки HKAPS і НКАРА і 5 хвилин. одиниць TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo), понад Фрагмент ДНК довжиною 444 пари основ підякого вміщують 50мкл мінерального масла. Викодають електрофорезу в 3% низькоплавкому агаронуть тридцять циклів полімеразної реакції синтезу зному гелі, збирають і очищають за допомогою ланцюга відповідно до програми циклічної зміни набору GENECLEAN (ВЮ 101). Обчищений фрагтемператури в наступній послідовності: 94°С промент ДНК розчиняють в 20мкл розчину, що містить тягом 1 хвилини, 60°С протягом 1 хвилини і 72°С 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. Один мкл протягом 1 хвилини, внаслідок чого отримують продукту полімеразної реакції синтезу ланцюга фрагмент ДНК довжиною 360 пар основ. Отримарозщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що ний фрагмент ДНК виділяють електрофорезом в містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,5), 10мМ MgCl2, 1мМ 3% низькоплавкому агарозному гелі, видаляють і дитіотреітода, 50мМ NaCl, 8 одиниць Hindlll очищають за допомогою набору GENECLEAN II (Takara Shuzo) і 8 одиниць EcoRI (Takara Shuzo), (BIO 101). при температурі 37°С протягом 1 години. ГідроліОтриманий таким чином фрагмент ДНК роззований розчин екстрагують фенолом і хлорофорщеплюють EcoRI і клонують в плазміді pUC19 мом і осаджують ДНК етанолом. Отриманий таким Hindlll, яку заздалегідь обробляють лужною фос 49 75318 50 чином ДНК розчиняють в 8мкл розчину, що міф/pUC19 розщеплюють EcoRI і піддають електротить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. форезу в 3% низькоплавкому агарозному гелі. ВиОдин мкг плазмі ди pUC19 розщеплюють діляють фрагмент ДНК довжиною 743 пари основ, Hindlll і EcoRI аналогічно вищеописаної процедурі, очищають його від гелю за допомогою набору екстрагують фенолом і хлороформом, після чого GEBECJLEANII (BIO 101) і розчиняють в 10мкл розщеплену щіазміду осаджують етанолом. Отрирозчину, що містить 10мМ трис-НСІ (рн 7,4) і 1мМ маний продукт обробляють лужною фосфатазою EDTA. бактерій [тобто лужною фосфатазою (Е.coli C75; Експресуючий вектор плазміди HEF-PM1k-gk Takara Shuzo)], екстрагують фенолом і хлорофор(2,7мкг) розщеплюють EcoRI, екстрагують феномом і осаджують ДНК етанолом. Отриману ДНК лом і хлороформом і осаджують фрагмент ДНК розчиняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ етанолом. Отриманий фрагмент ДНК обробляють трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. лужною фосфатазою бактерій і піддають електроОдин мкл обробленої лужною фосфатазою форезу в 1% низькоплавкому агарозному гелі. плазміди pUC19 змішують з 4мкл вищезгаданого Фрагмент ДНК довжиною 6561 пари основ виділяпродукту полімеразної реакції синтезу ланцюга, ють і очищають від гелю за допомогою набору щоб лігувати їх один з одним за допомогою набору GENECLEANII (BIO 101). Фрагмент ДНК розчинядля лігування ДНК, варіант 2 (Takara Shuzo). ють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НCI Отриману плазміду вводять в компетентну клітку (pH 7,4) і 1мМ EDTA. Е.coli, JM109 (Nippon Gene) аналогічне процедурі, Отриманий таким чином вектор HEF обробляописаній вище для утворення трансформанту. ють лужною фосфатазою бактерій і 2мкл обробОтриманий трансформант інокулюють протягом лених лужною фосфатазою вектори HEF змішують ночі на агаровій середі 2xYT, що містить 50мкг/мл з 3мкл EcoRI-фрагментів плазмід MBC1L ( ) ампіциліну, при температурі 37°С. Потім отрима/pUC19 або MBC1L ( ) /pUC19, щоб лігувати їх ний трансформант культивуть протягом ночі в 2мл один з одним. Продукт лігування вводять в компесереди 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіцилліну, тентну клітку Е.coli, JM109, для утворення транспри температурі 37°С. Виділену з клітинної фракції форманту. Отриманий трансформант культивуть в плазміду очищають за допомогою набору для 2мл середи 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіцилліочищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Після вину. Виділену з клітинної фракції плазміду очищазначення послідовності ДНК, плазміда, з підтверють за допомогою набору для очищення плазмід дженою правителькою послідовністю ДНК, назваQIPprep (QIAGEN). на "CHL/pUC19". Очищеним таким чином плазмідну ДНК розПо одному мкг плазмід C /pUC19 і С /рUС19 щеплюють в 20мкл реакційного розчину, що місрозщеплюють в 20мкл реакційного розчину, що тить 20мМ трис-НСІ (pH 8,5), 10мМ MgCI2, 1мМ містить 20мМ трис-НСІ (pH 8,5), 10мМ MgCl2, 1мМ дитіотреітола, 100мМ КСI, S одиниць Hindlll дитіотреітола, 100мМ КСI, 8 одиниць Hindlll (Takara Shuzo) і 2 одиниці Pvul (Takara Shuzo), при (Takara Shuzo) і 2 одиниці ВіпІ (Такага Shuzo), при температурі 37°C протягом 1 години. Передбачатемпературі 37°С протягом 1 години. Гідролізовається, що, якщо вищезгаданий фрагмент ДНК ввений розчин екстрагують фенолом і хлороформом і дений у вектор з правильною орієнтацією, то в осаджують ДНК етанолом. Отриману ДНК обробрезультаті гідролізу буде отриманий розщеплений ляють лужною фосфатазою бактерій при темперафрагмент довжиною 5104/2195 пар основ, і якщо турі 37°С протягом 30 хвилин, екстрагують феновищезгаданий фрагмент ДНК введений у вектор із лом і хлороформом і осаджують етанолом. зворотною орієнтацією, то буде отриманий розщеОтриманий продукт розчиняють в 10мкл розчину, плений фрагмент довжиною 4387/2926 пар основ. що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. Виходячи з (цього припущення, плазміди, в яких Вісім мкг плазміди CHL/pUC19, яка містить даний фрагмент орієнтований правильно, названі ДНК, що кодує V-область L-ланцюга №23-57-137відповідно "MBC1L ( ) /nео" і "МВС1Ц ( ) / nео". 1, розщеплюють Hindlll і ВІnІ так, як це описане (4) Трансфекція кліток CОS-7 вище. Отриманий таким чином фрагмент ДНК доОтримані вище експресуючі плазміди тимчавжиною 409 пар основ піддають електрофорезу в сове експресують в клітках COS-7, щоб визначити 3% низькоплавкому агарозному гелі, збирають і зв'язуючу і нейтралізуючу активність химерного очищають від гелю за допомогою набору антитіла проти антигену. GENECLEAN (BIO 101). Цей фрагмент ДНК розчиТимчасову експресію химерного антитіла здійняють в 10мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ снюють, використовучи комбінацію плазмід (pH 7,4) і 1мМ EDTA. МВС1НкДНК/pCOSІ і MBC1L ( ) / nео або плазмід Чотири мкл ДНК V-області L-ланцюги субклоМВС1HкДНК/pCOSl і MBC1L ( ) / nео, по методу нують в 1мкл оброблених лужною фосфатазою електропорації за допомогою електроімпульсного плазмід C /pUC19 або С /риС19 і вводять в компристрою Gene Pulser (Bio Rad) для котрансфекції петентну клітку Е.соlі, JM109, з метою отримання цих комбінацій плазмідних ДНК в клітки COS-7. трансформанту. Отриманий трансформант кульТобто до 0,8мл суспензії кліток COS-7 в забуфетивуть протягом ночі в 3мл середи 2xYT, що місреному фосфатом фізіологічному розчині (PBS(-)) тить 50мкг/мл ампіциліну. Виділену з клітинної з концентрацією 1 107кліток/мл додають 10мкг фракції плазміду очищають за допомогою набору кожної плазмідної ДНК. Отриманий розчин піддадля очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). Отриють впливу імпульсів при електростатичній місткомані, таким чином плазміди відповідно названі сті 1500В і амперажу 2мкф, щоб викликати елект"MBC1L ( ) /pUC19" і "MBC1L ( ) /pUC19". ропорацію. Розчин витримують протягом 10 Плазміди MBC1L ( ) /pUC19 і MBC1L ( ) хвилин при кімнатній температурі, після чого клітки 51 75318 52 суспендують в модифікованому за способом Дурозчину кон'югованих з лужною фосфатазою антильбекко середовищі Игла, утримуючої 2% фетальтіл кози проти IgG людини (TAGO). Отриману суної телячої сироватки з ультранизьким вмістом IgG міш інкубують при кімнатній температурі, проми(GIBCO), і культивуть в 10см чашці в інкубаторі з вають сумішшю забуференого фосфатом СО2. Клітки культивуть протягом 72 годин, після фізіологічного розчину і твіна-20 і додають в кожну чого культуральний супернатант збирають, лунку 1мг/мл розчин субстрату ("Sigma 104", парацентрифугують для видалення клітинного дебріса і нітрофенілфосфорна кислота, SIGMA). У отримавикористовуть як зразок для твердофазного імуного розчину вимірюють оптичну щільність при ноферментного аналізу (ELISA). довжині хвилі 405нм, використовучи апарат для При виконанні цієї процедури очищення химепрочитування мікропланшетів (Bio Rad). рних антитіл від культурального супернатанта кліРезультати цього аналізу показують, що химеток COS-7 проводять за допомогою набору AffiGel рне антитіло володіє зв'язуючою здатністю проти Protein A MAPSII (Bio Rad) відповідно до приклаРТНгР людини (1-34) і має правильну структуру Vдених до нього інструкцій. області клонованого антитіла миші (Фіг.4). Крім (5) Твердофазний імуноферментний аналіз того, встановлено, що не існує відмінності між (ELISA) зв'язуючою здатністю проти РТНгР (1-34) химерно(і) Визначення концентрації антитіл го антитіла, в якому С-область L-ланцюга має Планшет для твердофазного імуноферментланцюг, і химерного антитіла, в якому С-область Lного аналізу (ELISA), призначений для визначення ланцюга має -ланцюг. Тому С-область L-ланцюга концентрації антитіл, готують таким чином. У всі олюдненого антитіла конструюють з використанлунки 96-луночного планшета для ELISA ням Х-ланцюга L-ланцюга олюдненого антитіла. (Maxisorp, NUNC) вводять 100мкл розчину, що (6) Створення стабільно трансформованої лінії містить антитіло кози проти IgG людини (TAGO), в кліток яєчника китайського хом'ячка (СНО) буфері для сенсибилизації поверхонь (0,1М розЩоб створити стабільний трансформант для чин NaHCO3, 0,02% NaN3), з концентрацією химерного антитіла, вищезгадану експресуючу 1мкг/мл і блокують 200мкл буфери для розведенплазміду вводять в клітку СНО (DXB11). ня [50мМ трис-НСІ, 1мМ MgCl2, 0,1М NaCl, 0,05% Стабільний трансформант для химерного антвіна-20, 0,02% NaN3, 1% бичачого сироваточного титіла створюють, використовучи комбінації ексальбуміна (BSA); pH 7,2]. У всі лунки додають купресуючих плазмід для клітки СНО, льтуральний супернатант кліток COS-7, в яких МВС1НкДНК/pCHO1 і MBC1L ( ) / nео, або експребули експресировани химерні антитіла або очисуючих плазмід для клітки СНО, щені химерні антитіла, отримані внаслідок посліМВС1НкДНК/pCHO1 і MBC1L ( ) /пео. Ці комбінації довного розведення. Вміст лунка інкубують при плазмід по окремості котрансфецують в клітки кімнатній температурі протягом 1 години і промиСНО по методу електропорації за допомогою привають сумішшю забуференого фосфатом фізіолострою Gene Pulser (Bio Rad). Всі експресуючі векгічного розчину і твіна-20, після чого в кожну лунку тори розщеплюють рестрикційним ферментом додають 100мкл розчину кон'югованих з лужною Pvul з отриманням лінійної ДНК. Отриману ДНК фосфатазою антитіл кози проти IgG людини екстрагують фенолом і хлороформом і осаджують (TAGO). Отриману суміш інкубують при кімнатній етанолом. Отримані таким чином плазмідні ДНК температурі протягом 1 години, промивають суміпіддають електропорації. До 0,8мл суспензії кліток шшю забуференого фосфатом фізіологічного розСНО в PBS(-) з концентрацією 1 107кліток/мл дочину і твіна-20 і додають в кожну лунку 1мг/мл роздають 10мкг кожної плазмідної ДНК. Отриману чину субстрат ("Sigma 104", суміш піддають впливу імпульсів при електростапаранітрофенілфосфорна кислота, SIGMA). У тичній місткості 1500В і амперажу 2мкф. Електроотриманого розчину вимірюють оптичну щільність порировані клітки витримують при кімнатній темпри довжині хвилі 405нм, використовучи апарат пературі протягом 10 хвилин і суспендують в для прочитування мікропланшетів (Bio Rad). Як середовищі МЕМ- (GlBCO), утримуючої 10% фееталон при виконанні цього вимірювання використальної телячої сироватки (GlBCO). Отриману сутовуть обчищений імуноглобулін IgGl людини спензію культивуть на трьох 96-луночних планше(сайт скріплення). тах (Falcon) в інкубаторі з СО2. На наступний день (іі) Визначення антигензв'язуючої здатності. після початку культивування цю середу замінюють Планшет для твердофазного імуноферментселективною середою [середа МЕМ- , утримуючої ного аналізу (ELISA), призначений для визначення 10% фетальної телячої сироватки (GlBCO) і антигензв'язуючої здатності, готують таким чином. 500мг/мл GENETICIN (G418Sulfate; GlBCO) без У всі лунки 96-луночного планшету вводять рибонуклеозида або дезоксирибонуклеозида]. З 100мкл розчину, що містить РТНгР людини (1-34) культуральної середи відбирають клітки, в які вве(Peptide Research Institute), в буфері для сенсибидений ген антитіла. Селективну середу замінюють лизації поверхонь з концентрацією 1мкг/мл, і блосвіжою середою до культивування і через два тикують 200мкл буфери для розведення. У всі лунки жні культивування, після чого клітки досліджують додають культуральний супернатант кліток COS-7, під мікроскопом. У клітках, що характеризуються в яких були експресовані химерні антитіла або задовільним зростанням, визначають кількість очищені химерні антитіла, отримані внаслідок посантитіл, отриманих внаслідок виконання вищезгалідовного розведення. Вміст лунок інкубують при даного твердофазного імуноферментного аналізу. кімнатній температурі і промивають сумішшю заВиборчо збирають клітки, які продукували найбібуференого фосфатом фізіологічного розчину і льшу кількість антитіл. твіна-20, після чого в кожну лунку додають 100мкл Підвищення рівня культури стабільного тран 53 75318 54 сформанту для отриманих антитіл проводять у ультрафіолетом, і видаляють їх методом подрібфлаконі, що обертається з використанням мініманення і вимочування. Отриманий продукт розчильної підтримуючої середи (MEM), доповненої 2% няють в 20мкл розчину, що містить 10мМ трис-НСІ фетальною телячою сироваткою з ультра низьким (pH 7,4) і 1мМ EDTA. Полімеразну реакцію синтезу вмістом IgG без рибонуклеозида або дезоксириланцюга здійснюють з використанням TaKaRa Ex бонуклеозида. На 3-ий і 4-ий день культивування Taq (Takara Shuzo). Реакційний розчин (100мкл), культуральний супернатант збирають і фільтрують що використовується для здійснення полімеразної через фільтр з розміром пір 0,2мкм (Мillіроrе), щоб реакції синтезу ланцюга, містить по 1мкл вищезгавидалити клітинний дебріс. даних затравок для трансплантації гіперваріабеПотім химерні антитіла очищають від культульних дільниць MBC1HGP1, MBC1HGP2, рального супернатанту кліток СНО в колонці MBC1HGP3 і MBC1HGP4, 0,25мМ dNTP і 2,5 одиPOROS, заповненій білком А (PerSeptive ниці TaKaRa Ex Taq в буфері. Виконуть п'ять цикBiosystems), на ConSep LC100 (Мillіроге) у відповілів полімеразної реакції синтезу ланцюга відповіддності з прикладеними інструкціями. Очищені хино до програми циклічної зміни температури в мерні антитіла використовуть як зразки для визнанаступній послідовності: 94°С протягом 1 хвилини, чення нейтралізуючої активності і для дослідження 55°С протягом 1 хвилин і 72°С протягом 1 хвилиефективності на тваринних моделях гіперкальцієни. До отриманої реакційної суміші додають обидві мії. Концентрацію і зв'язуючу активність обчищезовнішні затравки MBC1HVS1 і MBC1HVR1 в кільних химерних антитіл проти антигену визначають кості 50пмолей. Використовучи цю реакційну суза допомогою аналогічної системи для твердофаміш, виконуть ще 30 циклів полімеразної реакції зного імуноферментного аналізу ELISA. синтезу ланцюга відповідно до тієї ж програми Приклад 3 циклічної зміни температури. Амплифіцьований Конструювання олюдненого антитіла таким чином фрагмент ДНК виділяють шляхом (1) Конструювання Н-ланцюга олюдненого анелектрофорезу в агарозному гелі з використанням титіла 4% агарози Nu Sieve GTG (FMC Bio. Products). (і) Конструювання олюдненої V-області НПотім вирізають дільницю агарози, що містить ланцюга фрагмент ДНК довжиною 421 пари основ, і очиН-ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 щають вказаний фрагмент ДНК за допомогою наотримують шляхом трансплантації гіперваріабебору GENECLEANH (BIO 101) відповідно до прикльної дільниці по методу PCR. Щоб отримати Нладених до нього інструкцій. Обчищений фрагмент ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 (варіДНК осаджують етанолом і розчиняють в 20мкл ант "а"), що має каркасну область, виділену з анрозчину, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ титіла людини S31679 [NMRF-PDB; Cuisinier, A.M. EDTA. Реакційну суміш для полімеразної реакції et.al., Eur. J.Immunol., 23, 110-118, 1993], викориссинтезу ланцюга використовуть для субклонувантовуть наступні шість типів затравки для полімераня цього фрагменту ДНК в плазміді pUC19, яку зної реакції синтезу ланцюга: затравки для трансзаздалегідь розщеплюють BamHI і Hindlll, після плантації гіперваріабельних дільниць MBC1PGP1 чого визначають послідовність основ отриманої (послідовність з ідентифікаційним №23) і плазміди. Плазміда, що має правильну послідовMBC1HGP3 (послідовність з ідентифікаційним ність, названа "hMBCHv/pUC19". №24) (обидві містять смислову послідовність ДНК) (іі) Конструювання V-області Н-ланцюга для і MBC1HGP2 (послідовність з ідентифікаційним кДНК олюдненого Н-ланцюга №25) і MBC1HGP4 (послідовність з ідентифікаційДНК олюдненої V-області Н-ланцюга, отриманим №26) (обидві містять антисмислову послідовну на попередній стадії, модифікують по методу ність ДНК), які з обох кінців мають комплементарну PCR, щоблігувати її з кДНК олюдненої С 1 Спослідовність довжиною 15-21 пари основ; зовнішобласті Н-ланцюга. Для цього конструюють звороні затравки MBC1HVS1 (послідовність з ідентифітну затравку MVC1HVS1 так, щоб вона гібридизукаційним №27) і MBC1HVR1 (послідовність з іденвала з послідовністю, що кодує 5'- кінцеву область тифікаційним №28), які відповідно гомологічні лідерної послідовності V-області, мала узгоджену затравкам для трансплантації гіперваріабельних послідовність Козака [Kozak et. al., J. Mol. Biol. 196, дільниць MBC1HGP1 і MBC1HGP4. 947-950, 1987] і Hindlll- і EcoRI-упізнаючі послідовЗатравки для трансплантації гіперваріабельності. Пряму затравки MBC1HVR2, що використоних дільниць MBC1HGP1, MBC1HGP2, MBC1HGP3 вується для модифікації ДНК для V-області Ні MBC1HGP4 виділяють з допомогою денатуроваланцюга, конструюють таким чином, щоб вона гібного мочевиною поліакриламідного геля [Molecular ридизувала з послідовністю ДНК, що кодує 3'Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et. al., кінцеву область J-області, і з послідовністю ДНК, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] і екстращо кодує 5'-кінцеву область С-області, і мала АІаІгують з гель-фракції методом подрібнення і вимоупізнаючі послідовності. чування [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Полімеразну реакцію синтезу ланцюга викоSambrook, et.al., Cold Spring Harbor Laboratory нуть з використанням TaKaRa Ex Taq (Takara Press, 1989], виконучи цю процедуру таким чином. Shuzo) і відповідного буфера. Реакційний розчин, З допомогою 6% денатурованого поліакрилатой, що використовується для полімеразної реакції мідного геля виділяють по одному нмолю всіх засинтезу ланцюга містить 0,4мкг hMBCH/pUC19 як травок для трансплантації гіперваріабельної дільматриця ДНК, по 50пмолей затравки MBC1HVS2 і ниці з отриманням фрагментів ДНК. Отримані MBC1HVR2, 2,5 одиниці TaKaRaExTaq і 0,25мМ фрагменти ДНК необхідної довжини ідентифікують dNTP в буфері. Виконуть тридцять циклів полімена тонкій пластинці силікагеля, що опромінюється разної реакції синтезу ланцюга відповідно до про 55 75318 56 грами циклічної зміни температури в наступній неного антитіла і (химерного) антитіла миші, і оціпослідовності: 94°С протягом 1 хвилини, 55°С пронюють вказані області відносно їх придатності для тягом 1 хвилини і 72°С протягом 1 хвилини. Амполюднення. На цьому етапі, використовує сайт лифіцьований таким чином фрагмент ДНК виділярестрикції AflII, що є в CDR2, отримують гібридне ють за допомогою електрофорезу в агарозному антитіло, що містить FR1 і FR2, виділені з антитіла гелі з використанням 3% агарози Nu Sieve GTG людини, і FR3 і FR4, виділених з антитіла миші. (FMC Bio. Products). У 100мкл реакційного розчину, що містить Фрагмент ДНК довжиною 456 пар основ вирі10мМ трис-НСІ (pH 7,5), 10мМ MgCl2, 1мМ дитіотзають і очищають за допомогою набору реітола, 50мМ NaCl, 0,01% (у відношенні ваги до GENECLEANIl (BIO 101) відповідно до прикладеоб'єму) бичачого сироваточного альбуміна і 10 них до нього інструкцій. Обчищений фрагмент ДНК одиниць Aflll (Takara Shuzo), розщеплюють по деосаджують етанолом і розчиняють в 20мкл розчисять мкг плазмід MBC1L ( ) / nео і hMBCIL ( ) / ну, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ пnео при температурі 37°С протягом 1 години. EDTA. Отриману таким чином реакційну суміш Реакційний розчин піддають електрофорезу в 2% використовуть для субклонування цього фрагменнизькоплавкому агарозному гелі, видаляють фрату ДНК у плазміді pUC19, яку заздалегідь розщепгменти ДНК довжиною 6282 пари основ (визначалювали EcoRI і Smal, після чого визначають посліються як "с1") і довжиною 1022 пари основ (визнадовність ДНК отриманої плазміди. Плазмідна ДНК, чаються як "h1") і очищають їх від гелю за яка містить ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга допомогою набору GENECLEANII (BIO 101). миші, виділену з гібридоми №23-57-137-1, і має Один мкг отриманих фрагментів с1 і h1 обробEcoRI- і Hindlll-упізнаючі послідовності, послідовляють лужною фосфатазою бактерій (ВАР). Отриність Козака у 5' кінця і АраІ - і Smal-впізнані посліманий фрагмент ДНК екстрагують фенолом і етадовності у 3'-кінця, названа "hMBC1Hv/pUC19". нолом, осаджують етанолом і розчиняють в 10мкл (2) Конструювання експресуючого вектора для розчину, що містить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ Н-ланцюга олюдненого антитіла EDTA. Плазміду RVh-PM1f-кДНК, що містить послідоОдин мкл фрагментів с1 і h1, оброблених лужвність кДНК Н-ланцюга антитіла hPM1, розщепною фосфатазою, змішують відповідно з 4мкл люють АраІ і BamHI з отриманням фрагменту ДНК, фрагментів ДНК h2 і с2, щоб лігувати їх один з що містить послідовність основ С-області Нодним (при температурі 4°С протягом ночі). Проланцюга. Отриманий фрагмент ДНК вводять в дукт лігування вводять в компетентну клітку Е.coli, плазміду hMBC1Hv/pUC19, яку заздалегідь розщеJM109, з метою отримання трансформанту. Отриплюють АраІ і BamHI. Отримана таким чином пламаний трансформант культивуть в 2мл середи зміда названа "hМВС1НкДНК/pUC19". Ця плазміда 2xYT, що містить 50мкг/мл ампіцилліну. Виділену з містить ДНК, що кодує V-область Н-ланцюга олюклітинної фракції плазміду очищають за допомодненого антитіла №23-57-137-1, і ДНК, що кодує гою набору для очищення плазмід QIAprep С 1 С-області Н-ланцюга людини, має EcoRI- i (QIAGEN). HindIII-упізнаючі послідовності в 5'-кінцевій області Обчищену плазмідну ДНК розщеплюють в 20 і BamHI-упізнаючу послідовність в 3'-кінцевій обмкл реакційного розчину, що містить 10мМ трисласті. Ця послідовність основ і відповідна амінокиНСІ (pH 7,5), 10мМ MgCl2 1мМ дитіотреітола, 2 слотна послідовність олюдненого Н-ланцюга варіодиниці ApaLI (Takara Shuzo) і 8 одиниць ВашНІ анту "а", що є у плазміді hМВС1НкДНК/рUС19, (Takara Shuzo) або HindIII (Takara Shuzo), при темвиражені відповідно послідовностями з ідентифіпературі 37°С протягом 1 години. На цій стадії каційними №№ 58 і 56. проводять ідентифікацію плазміди вважаючи що, Плазміду hМВС1НкДНК/рUС19 розщеплюють якщо фрагмент c1-h2 правильно лігований у плазEcoRI і BamHI з отриманням фрагменту ДНК, що міді, це лігування повинно давати АраІЛмістить послідовність основ, що кодує Н-ланцюг. розщегшений фрагмент, що містить 5560/1246/498 Отриманий фрагмент ДНК вводять в експресуючу пару основ, або BamHI/HindIII-розщеплений фрагплазміду pCOS1, яку заздалегідь розщеплюють мент, що містить 7134/269 пар основ. EcoRI і BamHI. Отримана таким чином експресуюЕкспресуючий вектор, що кодує L-ланцюг гібча плазміда для олюдненого антитіла названа ридного антитіла миші, утримуючу FR1,2 людину і "hМВС1HкДНК/рСОS1". FR3,4 миші, названий "h/mMBCIL ( ) / nео". 3 іншоЩоб отримати плазміду для експресії в клітці го боку, не можна отримати клон для h1-c1. Тому СНО, плазміду hМВС1HкДНК/рUС19 розщеплюють проводять рекомбінацію на векторі pUC з подальEcoRI і BamHI з отриманням фрагмент ДНК, що шим клонуванням у векторі HEF. Як матриці викокодує Н-ланцюг. Отриманий фрагмент ДНК ввористовуть плазміду hMBCILa /pUC19, яка містить дять в експресуючий вектор pCHO1, який отримуДНК, що кодує V- область L-ланцюга олюдненого ють шляхом розщеплення плазміди EcoRI і BamHI. антитіла без амінокислотних замін, і плазміду Отримана таким чином експресуюча плазміда для hMBCILd /pUC19, яка містить ДНК, що кодує Vолюдненого антитіла названа область L-ланцюга олюдненого антитіла із замі"hВС1НкДНК/рСНО1". ною амінокислоти в 91-положенні каркасної облас(3) Конструювання L-ланцюга для варіабельті FR3 (амінокислота №87 відповідно до визначенної області гібридного антитіла ня Кабата), тобто тирозина, ізолейцином. (і) Отримання гібридного антитіла FR1, У 30мкл реакційних розчини, що містить 10мМ 2/FR3,4 трис-НСІ (pH 7,5), 10мМ MgCl2, 1мМ дитіотреітола, Конструюють ДНК, що кодує L-ланцюг, в якому 50мМ NaCl, 0,01% (у відношенні ваги до об'єму) каркасні області рекомбіновані областями олюдбичачого сироваточного альбуміна, 16 одиниць 57 75318 58 Hindlll і 4 одиниці Aflll, розщеплюють по десять мкл бичачого сироваточного альбуміна і 6 одиниць SnaBI (Takara Shuzo), розщеплюють по десять мкг плазмід MBC1L ( ) /pUC19, hMBCILa /UC19 і плазмід MBC1L /neo і mMBC1L /neo при темпераhMBCILd /pUC19 при температурі 37°С протягом 1 турі 37°С протягом 1 години. Отриманий реакційгодини. Реакційний розчин обробляють електроний розчин далі гідролізуют в 50мкл реакційного форезом в 2% низькоплавкому агарозному гелі, розчину, що містить 20мМ трис-НСІ (pH 8,5), 10мМ після чого збирають і очищають за допомогою наMgCl2, 1мМ дитіотреітола, 100мМ КСl, 0,01% (у бору GENECLEANII (BIO 101) наступні фрагменти відношенні ваги до об'єму) бичачого сироваточноДНК: фрагмент ДНК довжиною 215 пар основ з го альбуміна і 6 одиниць Pvul, при температурі плазміди MBC1L ( ) /pUC19 (визначається як "с2'") 37°С протягом 1 години. або фрагмент ДНК довжиною 3218 пар основ з Отриманий реакційний розчин обробляють плазмід hMBCILa /pUC19 і hMBCILd /pUC19 (виелектрофорезом в 1,5% низькоплавкому агароззначаються відповідно як "ha1'" і "hd1'"). ному гелі, після чого фрагменти ДНК довжиною Фрагменти ha1' і hd1' по окремості лігують з 4955 і 2349 пар основ видаляють і очищають від фрагментом с2' і вводять в компетентну клітку гелю за допомогою набору GENECLEANII (BIO Е.coli з метою отримання трасформанту. Отрима101). Фрагменти ДНК, отримані з плазміди MBC1L ний трансформант культивуть в 2мл середи 2xYT, ( ) / nео, названі "m1" (4955 пар основ) і "m2" (2349 що містить 50мк/мл ампіциліну. Виділену з клітинпар основ), і фрагменти ДНК, отримані з плазміди ної фракції плазміду очищають за допомогою наh/mMBC1L ( ) / nео, названі "hm1" (4955 пар осбору для очищення плазмід QIAprep (Q1AGEN). нов) і "hm2" (2349 пар основ). Всі отримані фрагОтримані плазмідні ДНК, що містять фрагмент hal' менти ДНК розчиняють в 40мкл розчину, що місі фрагмент hdl', названі відповідно тить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. "m/hMBCILa /pUC19" і "m/hMBCILd /pUC19". ПлаПо одному мкл фрагментів m1 і hm1 лігують зміди m/hMBCILa /pUC19 і m/hMBCILd /pUCIS відповідно з 4мкл фрагментів hm2 і m2, а потім розщеплюють EcoRl. Фрагмент ДНК довжиною 743 вводять в компетентну клітку E.coli, JM109, з мепари основ обробляють електрофорезом в 2% тою отримання трасформанту. Отриманий транснизькоплавкому агарозному гелі, видаляють і формант культивуть в 2мл середи 2xYT, що місочищають від гелю за допомогою набору тить 50мкг/мл ампіцилліну. Виділену з клітинної GENECLEANII (B10101). Отриманий продукт розфракції плазмідну ДНК очищають за допомогою чиняють в 20мкл розчину, що містить 10мМ триснабору для очищення плазмід QIAprep (QIAGEN). НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. Обчищену плазмідну ДНК розщеплюють в Чотири мкл отриманих фрагменти ДНК змішу20мкл реакційного розчину, що містить 10мМ трисють з 1мкл вищезгаданого вектора HEF, оброблеНСІ (pH 7,5), 10мМ MgCl2:, 1мМ дитіотреітола і 8 ного лужною фосфатазою бактерій, щоб лігувати одиниць Араі (Takara Shuzo) або 2 одиниці Alall їх один з одним. Продукт лігування вводять в ком(Takara Shuzo), при температурі 37°С протягом 1 петентну клітку Е.coli, JM109, з метою отримання години. трансформанту. Отриманий трансформант кульОтримані таким чином плазміди (m1-hm2 і тивуть в 2мл середи 2xYT, доповненої 50мкг/мл hm1-m2) ідентифікують, виходячи з припущення ампіцилліну. Виділену з клітинної фракції плазмідпро те, що, якщо фрагменти ДНК ліговані у плазну ДНК очищають за допомогою набору для очиміді з правильною орієнтацією, то в результаті щення плазмід QIAprep (QIAGEN). гідроліза плазміди (m1-hm2) АраІ і AlaLI будуть Обчищену плазмідну ДНК розщеплюють в відповідно отримані розщеплений фрагмент дов20мкл реакційного розчину, що містить 20мМ трисжиною 7304 пари основ і фрагменти довжиною НСІ (pH 8,5), 10мМ MgCl2, 1мМ дитіотреітола, 5560/1246/498 пар основ, і в результаті гідроліза 100мМ КСI, 8 одиниць НіпdllІ (Takara Shuzo) і 2 плазміди (hm1-m2) Араl і АріLI будуть відповідно одиниці Pvui (Takara Shuzo), при температурі 37°С отримані фрагменти довжиною 6538/766 пар основ протягом 1 години. На цій стадії плазмі дну ДНК і фрагмент довжиною 3535/2025/1246/498 пар осідентифікують, виходячи з припущення про те, що, нов. якщо фрагмент ДНК введений в плазміду з правиЕкспресуючий вектор, що кодує L-ланцюг гібльною орієнтацією, то в результаті гідролізу буде ридного антитіла, утримуючого FR1 людини і отриманий розщеплений фрагмент довжиною FR2,3,4 миші, названий "hmmMBCIL ( ) /nео", і 5104/2195 пар основ, і якщо вказаний фрагмент експресуючий вектор, що кодує L-ланцюг гібридноДНК введений в плазміду із зворотною орієнтаціго антитіла FR1 миші, FR2 людини і FR3,4 миші, єю, то буде отриманий розщеплений фрагмент названий "mhmMBC1L ( ) /nео". довжиною 4387/2526 пар основ. Отримані таким (4) Конструювання L-ланцюга олюдненого анчином плазміди є експресуючими векторами, що титіла кодують L-ланцюг гібридного антитіла, що містить L-ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 FR1,2 миші і FR3,4 людини, які названі відповідно отримують шляхом трансплантації гіперваріабе"m/hMBCILa /neo" і "m/hMBCILd /neo". льної дільниці по методу PCR. Тобто отримують L(іі) Отримання гібридного антитіла FR1/FR2 ланцюг олюдненого антитіла №23-57-137-1 (варіГібридне антитіло FR1/FR2 отримують так саант "а"), який містить області FR1, FR2 і FR3, видімо, як описано вище, використовучи сайт рестриклені з антитіла людини HSU03868 [GEN-BANK, ції SnaBI, що є в гіперваріабельном дільниці Deftos, M. et.al., Scand. J. Immunol, 39, 95-103, CDR1. 1994], і область FR4, виділену з антитіла людини У 20мкл реакційного розчину, що містить 10мМ S25755 (NBRF-PDB), використовучи шість типів трис-НСІ (pH 7,9), 10мМ MgCI2, 1мМ дитіотреітола, затравки для полімеразної реакції синтезу ланцю50мМ NaCl, 0,01% (у відношенні ваги до об'єму) 59 75318 60 значають послідовність днк отриманої плазміди. затравки для трансплантації гіперваріабельВказана плазміда названа "hMBCL/pUC19". Однак них дільниць MBC1LGP1 (послідовність з ідентивстановлено, що в цій плазміді амінокислота в фікаційним №29) і MBC1LGP3 (послідовність з 104-положенні (амінокислота №96 відповідно до ідентифікаційним №30), які містять смислову посвизначення Кабата) гіперваріа-бельної дільниці лідовність ДНК, затравки для трансплантації гіперCDR4 цієї плазміди замінена аргініном. Щоб заміваріабельних дільниць, MBC1LGP2 (послідовність нити цю амінокислоту тирозином, конструюють і з ідентифікаційним №31) і MBC1LGP4 (послідовсинтезують затравки MBC1LGP10R (послідовність ність з ідентифікаційним №32), які містять антисз ідентифікаційним №35). Потім здійснюють полімислову послідовність ДНК, при цьому всі вказані меразну реакцію синтезу ланцюга, використовучи затравки для трансплантації гіперваріабельних TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) з буфером. Реакдільниць мають з обох кінців комплементарну посційний розчин (100мкл), що використовується для лідовність довжиною 15-21 пари основ; і зовнішні виконання полімеразної реакції синтезу ланцюга, затравки MBC1LVS1 (послідовність з ідентифікамістить 0,6мкг плазміди hMBCL/pUC19 в якості ційним №33) і MBC1LVR1 (послідовність з ідентиматричної ДНК, 50пмолей затравки MBC1LVS1 і фікаційним №34), які гомологічні відповідно затраMBC1LGP10R, 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq (Takara вки для трансплантації гіперваріабельних дільниць Shuzo) і 0,25мМ dNTP в буфері, понад якого вміMBC1LGP1 і MBC1LGP4. щують шар мінерального масла. Виконуть триЗатравки для трансплантації гіперваріабельдцять циклів полімеразної реакції синтезу ланцюга них дільниць MBC1LGP1, MBC1LGP2, MBG1LGP3 відповідно до програми циклічної зміни темпераі MBC1LGP4 виділяють з допомогою денатуроватури в наступній послідовності: 94°С протягом 1 ного мочевиною поліакриламідного геля [Molecular хвилини, 55°С протягом 1 хвилини і 72°С протягом Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et. al., Gold 1 хвилини. Амплифіцьований фрагмент ДНК видіSpring Harbor Laboratory Press, 1989] і екстрагують ляють за допомогою електрофорезу в агарозному з гель-фракції методом подрібнення і вимочування гелі, використовучи 3% агарозу Nu Sieve GTG [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook (FMC Bio. Products). et. al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]. Фрагмент ДНК довжиною 421 пари основ виріЗ допомогою 6% денатурованого поліакрилазають і очищають від гелю за допомогою набору мідного геля виділяють по одному нмолю всіх заGENECLEANII (BIO 101) відповідно до прикладетравки для трансплантації гіперваріабельних дільних до нього інструкцій. Отриману реакційну суміш ниць. Фрагменти отриманої ДНК необхідної для полімеразної реакції синтезу ланцюга викоридовжини ідентифікують на тонкій пластинці силікастовуть для субклонування фрагменту ДНК в плагеля, що опромінюється ультрафіолетом, і видазміду pUC19, яка була приготована шляхом розляють методом подрібнення і вимочування. Отрищеплення плазміди BamHI і Hindlll. маний продукт розчиняють в 20мкл розчину, що У отриманої плазміді визначають послідовмістить 10мМ трис-НСІ (pH 7,4) і 1мМ EDTA. ність ДНК, використовучи затравки М 13 Primer М4 Полімеразну реакцію синтезу ланцюга здійсі М13 Primer RV. Отримані результати підтвернюють, використовучи TaKaRa Ex Taq (Takara джують, що плазміда має правильну послідовShuzo) з буфером. Реакційний розчин (100мкл), ність. Цю плазміду розщеплюють Hindlll і ВІпІ і за призначений для полімеразної реакції синтезу допомогою електрофореза в 1% агарозному гелі ланцюга, містить по 1мкл затравки для транспланвиділяють з неї фрагмент ДНК довжиною 416 пар тації гіперваріабельних дільниць MBC1LGP1, основ. Отриманий фрагмент ДНК очищають за MBC1LGP2, MBC1LGP3 і MBC1LGP4, 0,25мМ допомогою набору GENECLEANII (BIO 101) у відdNTP і 2,5 одиниці TaKaRa Ex Taq в буфері. Викоповідності з прикладеними до нього інструкціями і нуть п'ять циклів полімеразної реакції синтезу лавводять в плазміду C /pUC, яка була приготована нцюга відповідно до програми циклічної зміни темшляхом розщеплення плазміди Hindlll і Вlnl. Отриператури в наступній послідовності: 94°С протягом мана плазміда названа "hMBCILa /pUC19". Цю 1 хвилини, 55°С протягом 1 хвилин і 72°С протяплазміду розщеплюють EcoRI з отриманням фрагом 1 хвилини. У отриману реакційну суміш додагменту ДНК, що кодує олюднений L-ланцюг. Отриють по 50пмолей зовнішніх затравок MBC1LVS1 і маний фрагмент ДНК вводять в плазміду pCOS1 MBC1LVR1. Використовучи цю реакційну суміш так, щоб ініціюючий кодон олюдненого L-ланцюга виконуть ще 30 циклів полімеразної реакції синтерозташовувався внизу від промотору EF1 . Отризу ланцюга відповідно до тієї ж програми циклічної мана таким чином плазміда названа зміни температури. Амплифіцьований фрагмент "hMBCILa /pCOS1". Послідовність ДНК (включаюДНК виділяють шляхом електрофорезу в агарозчи відповідну амінокислотну послідовність) олюдному гелі з використанням 3% агарози Nu Sieve неного L-ланцюга (варіант "а") виражена послідовGTG (FMC Bio. Products). ністю з ідентифікаційним №66. Амінокислотна Вирізають дільницю агарози, що містить фрапослідовність варіанту "а" виражена послідовністю гмент ДНК довжиною 421 пари основ, і очищають з ідентифікаційним №47. від гелю вказаний фрагмент ДНК за допомогою Варіант "b" отримують шляхом введення мутанабору GENECLEANII (B10101) відповідно до пригену по методу PCR. Варіант "b" конструюють такладених до нього інструкцій. Отриману таким чиким чином, щоб замінити амінокислоту в 43ном реакційну суміш для полімеразної реакції синположенні, тобто гліцин (амінокислота №43 відпотезу ланцюга використовуть для субклонування відно до визначення Кабата), проліном і амінокисцього фрагменту ДНК у плазміді pUC19, яку залоту в 49-положенні, тобто лізин (амінокислота здалегідь розщеплюють BamHI і Hindlll. Потім ви№49 відповідно до визначення Кабата), аспаргінога: