Виділене антитіло, яке специфічно зв’язує gdf-8, та його застосування

1. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує GDF-8, що містить щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з: a) SEQ ID NO:14; b) SEQ ID NO:26; 2 (19) 1 3 91815 4 тить SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, де існує зменшення зв'язування щонайменше на SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36. 10 % у другій суміші для зв'язування в порівнянні з 3. Антитіло за п. 1, що містить першою сумішшю для зв'язування. (а) варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН), що 11. Антитіло за п. 10, де вказане антитіло конкурує містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4 з Myo22 і зв'язує епітоп в перших 44 N-кінцевих та варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що амінокислотних залишках амінокислотної послідомістить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:6 вності зрілого GDF-8, конкурує з Myo28 і зв'язує (Myo22); епітоп в перших 98 N-кінцевих амінокислотних (b) варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН), що залишках зрілого GDF-8 або конкурує з Myo29 і містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:10 зв'язує епітоп між амінокислотними залишками 72 і і варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що 88 зрілого GDF-8, де амінокислотна послідовність містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:12 зрілого GDF-8 представлена в SEQ ID NO:49. (Myo28); 12. Фармацевтична композиція, що містить антиті(с) варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН), що ло за п. 1 і фармацевтично прийнятний ексципієнт. містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:16 13. Застосування фармацевтичної композиції за п. та варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що 12 для приготування лікарського засобу для лікумістить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:18 вання або профілактики порушення, асоційованого (Myo29); з GDF-8 або ВМР-11. (d) варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН), що 14. Застосування за п. 13, де порушення являє містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:22 собою м'язове, нервово-м'язове або дегенеративта варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що не кісткове порушення. містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:24 15. Застосування за п. 13, де порушення вибрано(Myo28 зародкового типу); або го з м'язової дистрофії, м'язової дистрофії Дюшен(е) варіабельну ділянку важкого ланцюга (VН), що на, м'язової атрофії, атрофії органа, синдрому містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:28 каналу зап'ястя, хронічної обструктивної хвороби та варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що легень, саркопенії, кахексії, синдрому м'язового містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:30 виснаження й бічного аміотрофічного склерозу. (Myo29 зародкового типу). 16. Застосування за п. 13, де порушення являє 4. Антитіло за п. 1, де це антитіло здатне специфісобою м'язову дистрофію Дюшенна. чно зв'язуватися з білком, що містить амінокислот17. Застосування за п. 13, де порушення вибране з ну послідовність, представлену в SEQ ID NO:54. ожиріння і порушення жирової тканини. 5. Антитіло за п. 1, де це антитіло є антитілом лю18. Застосування за п. 13, де порушення вибране з дини. остеопорозу, остеоартриту, синдрому Х, поруше6. Антитіло за п. 3, де це антитіло містить констанної толерантності до глюкози, індукованої травмою тний домен важкого ланцюга і додатково містить інсулінорезистентності і діабету типу 2. константний домен легкого ланцюга. 19. Застосування за п. 13, де порушення являє 7. Антитіло за п. 6, де вказаний константний дособою діабет типу 2. мен важкого ланцюга отриманий з підкласу ізотипу 20. Застосування за п. 13, де порушення являє IgG1 або IgG4 людини і, де вказаний константний собою ожиріння. домен легкого ланцюга отриманий з ланцюга кап21. Застосування за п. 13, де порушення являє па людини або ланцюга лямбда людини. собою ушкоджений м'яз. 8. Антитіло за п. 7, де вказаний константний домен 22. Застосування за п. 21, де ушкодженим м'язом є важкого ланцюга являє собою С-кінцевий фрагміокард. мент IgG1 людини, що містить амінокислотну пос23. Застосування за п. 21, де ушкодженим м'язом є лідовність, показану в SEQ ID NO:53, і де вказаний діафрагма. константний домен легкого ланцюга являє собою 24. Застосування за будь-яким з пп. 13-23, де ліС-кінцевий фрагмент ланцюга λ людини, що міскарський засіб містить ефективну дозу, вибрану з тить амінокислотну послідовність, показану в SEQ 1 мкг/кг – 20 мг/кг, 1 мкг/кг – 10 мг/кг, 1 мкг/кг – 1 ID NO:51. мг/кг, 10 мкг/кг – 1 мг/кг, 10 мкг/кг – 100 мг/кг, 100 9. Антитіло за п. 8, де вказана константна ділянка мкг/кг – 1 мг/кг і 500 мкг/кг – 1 мг/кг. важкого ланцюга модифікована для зменшення 25. Виділена нуклеїнова кислота, що кодує антитіефекторної функції, де модифікація містить щоло за будь-яким з пп. 1-11. найменше одну мутацію, вибрану з групи, що 26. Експресуючий вектор, що містить нуклеїнову складається з мутації в амінокислотному залишку кислоту за п. 25. під номером 117 і мутації в амінокислотному за27. Ізольована клітина-хазяїн, що містить вектор лишку під номером 120 згідно амінокислотам SEQ за п. 26. ID NO:53. 28. Нуклеїнова кислота за п. 25, де нуклеїнова 10. Антитіло, яке конкурує з антитілом за п. 3 за кислота містить щонайменше одну нуклеотидну зв'язування із зрілим GDF-8, що ідентифікується послідовність, вибрану з групи, що складається з шляхом: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID утворення першої суміші для зв'язування, що місNO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, тить антитіло за п. 3 і GDF-8; SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ вимірювання зв'язування антитіла і GDF-8 в перID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID шій суміші для зв'язування; NO:27 або SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52. 5 91815 6 29. Антитіло, що кодується нуклеїнової кислотою 33. Антитіло за п. 1, одержане перетворенням в за п. 28, де вказане антитіло зв'язує епітоп, що послідовності зародкового типу. містить Lys-Xaa1-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn (SEQ ID 34. Антитіло за п. 1, де антитіло здатне інгібувати NO:54), де незалежно один від одного Xaa1 являє зв'язування CDF-8 c ActRIIB. собою Met, Xaa2 являє собою Ser, і Xaa3 являє 35. Антитіло за п. 1, де антитіло здатне специфічсобою Ile. но зв'язувати ВМР-11. 30. Антитіло за п. 29, де вказане антитіло зв'язує 36. Антитіло за п. 12, яке специфічно зв'язує епітоп епітоп, що містить Lys-Met-Ser-Pro-Ile-Asn. в перших 44 N-кінцевих амінокислотах амінокисло31. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 1-11 тної послідовності SEQ ID NO:49. для приготування лікарського засобу для збіль37. Антитіло за п. 1, де вказане антитіло конкурує з шення у ссавця м'язової сили або маси. Myo29 і зв'язує епітоп, що містить Lys-Xaa1-Xaa232. Антитіло за п. 1, де антитіло містить VH домен і Pro-Xaa3-Asn (SEQ ID NO:54), де незалежно один VL домен, які продуковані E.coli, що має номер від одного Xaa1 являє собою Met, Xaa2 являє содепозиту в АТСС, вибраний з групи, яка складабою Ser, і Xaa3 являє собою Ile. ється з РТА-4741, РТА-4740 і РТА-4739. 38. Антитіло за п. 37, де вказане антитіло зв'язує епітоп, що містить Lys-Met-Ser-Pro-Ile-Asn. По даній заявці вимагається пріоритет по попередній заявці на видачу патенту Сполучених Штатів Америки № 60/419964, поданій 22 жовтня 2002 року, яка повністю включена в даний опис як посилання. Галузь техніки, до якої відноситься винахід Галузь техніки відноситься до антитіл проти фактора-8 росту та диференціювання (GDF-8), зокрема, антитіл людини та фрагментів антитіл, зокрема, до антитіл та фрагментів антитіл, які інгібують активність GDF-8 in vitro і/або in vivo. Ця галузь додатково відноситься до діагностики, профілактики або лікування дегенеративних порушень м'яза або кістки або порушень метаболізму інсуліну. Рівень техніки Фактор-8 росту та диференціювання (GDF-8), також відомий як міостатин, є білком, що секретується, і є членом надсімейства трансформуючого фактора росту бета (TGF- ) структурно споріднених факторів росту, кожний з яких має фізіологічно важливі регулюючі ріст і морфогенетичні властивості (Kingsley et al. (1994) Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998 Curr. Topics Microbiol. Immunol., 228: 235-272). Подібно до TGF- , GDF-8 людини синтезується у вигляді білка-попередника розміром 375 амінокислот. Цей білок-попередник GDF-8 утворює гомодимер. Під час процесинга амінокінцевий пропептид відщеплюється при Arg266. Цей відщеплений пропептид, відомий як «асоційований з латентністю пептид» (LAP), може залишатися нековалентно зв'язаним з гомодимером, інактивуючи за допомогою цього цей комплекс (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; Brown et al. (1990 Growth Factors, 3: 35-43 та Thies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259). Комплекс зрілого GDF-8 з пропептидом зазвичай називають «малим латентним комплексом» (Gentry et al. (1990) Biochemistry, 29: 68516857; Derynck et al. (1995) Nature, 316: 701-705 і Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol., 12: 597-641). Відомо, що інші білки також зв'язують зрілий GDF8 та інгібують його біологічну активність. Такі інгібіторні білки включають в себе фолістатин та фоліс татин-споріднені білки (Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232). Зіставлення розшифрованих амінокислотних послідовностей з різних видів демонструє, що GDF-8 є висококонсервативним у ході еволюції (McPherron et al. (1997) Proс. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461). Дійсно, послідовності GDF-8 людини, миші, щура, свині та курки є на 100% ідентичними в С-кінцевому районі, тоді як у випадку павіана, корови та вівці вони розрізнюються тільки 3 амінокислотами. GDF-8 зубастого карася є найбільш дивергентним; однак, він ідентичний на 88% GDF-8 людини. Висока міра збереження передбачає, що GDF8 має важливу функцію. GDF-8 експресується у високій мірі в скелетному м'язі, що розвивається, та в зрілому і було виявлено, що він бере участь в регуляції критичних біологічних процесів в м'язі та в остеогенезі. Наприклад, трансгенні миші з виключеним GDF-8 характеризуються яскраво вираженою гіпертрофією та гіперплазією скелетних м'язів (McPherron et al. (1997) Nature, 387: 83-90) та зміненою структурою кортикального шару кісток (Hamrick et al. (2000) Bone, 27 (3):343-349). Схожі збільшення маси скелетних м'язів виявляються в мутаціях GDF-8 у великої рогатої худоби, що зустрічаються природно, (Ashmore et al. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci., 38: 752-757; McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461 та Kambadur et al. (1997) Genome Res., 7: 910-915). Дослідження показали, що м'язове виснаження, асоційоване з ВІЛ-інфекцією, супроводжується збільшенням експресії GDF-8 (Gonzalez-Cadavid et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: 14938-14943). Передбачалося також, що GDF-8 бере участь в продукуванні специфічних для м'язів ферментів (наприклад, креатинкінази) та проліферації міобласних клітин (WO 00/43781). Вважається, що крім його регулюючих ріст та морфогенетичних властивостей, GDF-8 бере участь також у ряді інших фізіологічних процесів, в тому числі гомеостазі глюкози в розвитку діабету типу 2, порушеної толерантності до глюкози, метаболічних синдромах (наприклад, синдромі X), інсулінорезистентності, що викликана травмою, такою як опіки або порушення азотного 7 91815 8 балансу, та порушеннях жирової тканини (напринтарність районів (CDR) будь-якого з VH- та/або клад, ожирінні) (Kim et al. (2001) BBRC, 281: 902VL-доменів Myo29, Myo28 або Муо22. 906). Інші аспекти забезпечують композиції, що місРяд порушень у людини і тварин асоційовані з тять антитіла даного винаходу або їх антигензв'яфункціонально порушеною м'язовою тканиною, зувальні фрагменти, та їх застосування в способах наприклад, м'язова дистрофія (в тому числі м'язоінгібування або нейтралізації GDF-8, в тому числі ва дистрофія Дюшенна), бічний аміотрофічний способах лікування людини або тварин. Антитіла склероз, м'язова атрофія, атрофія органів, крихданого винаходу можуть бути використані для лікість, хронічна обструктивна хвороба легень, саркування або попередження станів, при яких бажакопенія, кахексія та синдроми м'язового виснаженним є збільшення м'язової тканини або щільності ня, що викликаються іншими захворюваннями та кісток. Наприклад, описані тут антитіла можуть станами. До даного часу дуже мало надійних або бути використані в способах лікування для відновефективних способів терапії було розроблено для лення пошкодженого м'яза, наприклад, міокарда, лікування цих порушень. діафрагми тощо. Приклади захворювань та поруЄ ряд станів, асоційованих з розрідженням кісшень включають в себе м'язові та нервово-м'язові тки, які включають в себе остеопороз і остеоартпорушення, такі як м'язова дистрофія (в тому числі рит, зокрема, у літніх і/або постклімактеричних м'язова дистрофія Дюшенна); бічний аміотрофічжінок. Крім того, метаболічні кісткові захворювання ний склероз; м'язову атрофію; атрофію органів; та порушення включають в себе низьку кісткову крихкість; синдром каналу зап'ястка; хронічну обмасу внаслідок тривалої глюкокортикоїдної терапії, структивну хворобу легень; саркопенію, кахексію передчасну недостатність статевих залоз, супрета інші синдроми м'язового виснаження; порушенсію андрогенів, недостатність вітаміну D, повторня жирової тканини (наприклад, ожиріння); діабет ний гіперпаратиреоз, порушення харчування та типу 2; порушену толерантність до глюкози; метанервово-психічну анорексію. Доступні в даний час болічні синдроми (наприклад, синдром X); інсулітерапії для цих станів діють за допомогою інгібунорезистентність, індуковану травмою, такою як вання резорбції кістки. Бажаною альтернативою опіки або порушення азотного балансу; та кісткові цим терапіям була б терапія, яка стимулює новодегенеративні захворювання (наприклад, остеоарутворення кістки. трит і остеопороз). Таким чином, існує потреба в розробці нових Крім того, описані в даний час антитіла можуть способів лікування, які сприяють загальному збібути використані як діагностичний інструмент для льшенню м'язової маси і/або міцності і/або щількількісного або якісного детектування GDF-8 або ності кісток, зокрема, у людини. його фрагментів в біологічному зразку. ДетектоваСуть винаходу на присутність або кількість GDF-8 може корелюОдними об'єктами даного винаходу є безпечні вати з одним або декількома медичними станами, та ефективні способи лікування асоційованих з перерахованими вище. м'язами і/або кістками порушень. Інший аспект відноситься до виділеної нуклеїІншими об'єктами даного винаходу є способи нової кислоти, яка містить послідовність, що кодує збільшення м'язової маси і/або міцності і/або VH- або VL-домен з Fv-фрагмента Муо29, Муо28 щільності кісток у хребетних тварин. або Муо22. Описана також виділена нуклеїнова Ще одними об'єктами даного винаходу є інгібікислота, яка містить послідовність, що кодує щотори GDF-8, які є безпечними і ефективними in найменше один CDR з будь-якого з описаних в vivo. даний час VH- та VL-доменів. Інший аспект відноІншими об'єктами даного винаходу є антитіла ситься до клітин-хазяїв, що містять таку нуклеїнолюдини та їх фрагменти, які зв'язують GDF-8 з ву кислоту. високою специфічністю та афінністю. Ще один аспект відноситься до способу отриТаким чином, розкриті способи лікування демання нових VH- та VL-доменів і/або функціональгенеративних порушень м'язів і кістки. Ці способи них антитіл, що містять усі домени або частину застосовні також для збільшення м'язової маси та таких доменів, вироблених з VH- або VL-доменів щільності кісток у здорових тварин. Забезпечені Муо29, Муо28 або Муо22. також нові анти-GDF-8-антитіла людини, названі Додаткові цілі даного винаходу будуть виклаМуо29, Муо28 та Муо22, та вироблені з них антидені частково в наступному описі, а частково бутіла та антигензв'язувальні фрагменти. Антитіла дуть очевидними з даного опису, або можуть бути даного винаходу мають ряд корисних властивосвизначені при застосуванні даного винаходу на тей. По-перше, ці антитіла здатні зв'язувати зрілий практиці. Різні цілі, аспекти та переваги даного GDF-8 з високою афінністю. По-друге, описані анвинаходу будуть зрозумілі та досягнуті з використитіла інгібують активність GDF-8 in vitro та in vivo, танням елементів і комбінацій, конкретно вказаних як показано, наприклад, інгібуванням зв'язування в доданій формулі винаходу. ActRIIB і аналізами з використанням репортерних Потрібно розуміти, що як попередній загальгенів. По-третє, описані антитіла можуть інгібувати ний опис, так і подальший докладний опис носять активність GDF-8, асоційовану з негативною регулише зразковий та роз'яснюючий характер і не ляцією маси скелетних м'язів та щільності кісток. обмежують даний винахід, який заявлений у форДеякі варіанти здійснення даного винаходу мімулі винаходу. стять VH- та/або VL-домен Fv-фрагмента Муо29, Опис фігур Муо28 або Муо22. Додаткові варіанти здійснення На Фігурі 1 показано, що біотинільовані GDF-8 містять один або декілька визначаючих комплемета ВМР-11 зв'язують рецептор ActRIIB з ED50 15 нг/мл та 40 нг/мл, відповідно. 9 91815 10 На Фігурі 2 показане інгібування зв'язування На Фігурі 11А та 11В показана відповідно маса GDF-8 з рецептором ActRIIB scFv-фрагментами ікроножних та чотириголових м'язів у самиць миданого винаходу. Як показано, ІС50 для scFv шей СВ17 SCID, що отримували один раз на тижMyo29, Муо28 та Муо22 дорівнюють 2,4 нМ, 1,7 нМ день різні дози Муо29 (10, 5, 2,5 та 1 мг/кг) або та 60 нМ, відповідно. ЗФР протягом дванадцяти тижнів. Миші, що отриНа Фігурах 3А та 3В показано, що передінкумували Муо29, показують збільшення м'язової бація Муо29 з біотинільованим GDF-8 або ВМР-11 маси в діапазоні 12-28%. при 10 нг/мл інгібує зв'язування GDF-8 або ВМР-11 На Фігурі 12 показана м'язова сила передньої з ActRIIB в аналізі зв'язування ActRIIB з ІС50 0,2-0,4 кінцівки, виміряна вимірювачем сили хапання, у нМ. самиць мишей СВ17 SCID, що отримували один На Фігурі 4В та 4С показані результати аналіраз на тиждень Муо29 (10 та 5 мг/кг) або ЗФР прозів з використанням репортерного гена тягом дванадцяти тижнів. Сила передньої кінцівки pGL3(CAGA)12, в яких тестували Муо29. Фігура 4А збільшувалася на 17% та 23% у мишей, що отридемонструє умови базової лінії (фону), тобто індумували Муо29 при 5 мг/кг та 10 мг/кг, відповідно. кцію активності репортерного гена GDF-8, ВМР-11 Докладний опис та активіном. Фігури 4В і 4С показують, що Муо29 І. Визначення зменшує активність GDF-8 залежним від дози чиТермін «антитіло» в даному контексті відноном з ІС50 15-30 нг/мл та інгібує біологічну активситься до імуноглобуліну або його частини та ність ВМР-11 в тій самій мірі. Фігура 4D ілюструє, включає в себе будь-який поліпептид, що містить що Муо29 не впливає на активність активіну в антигензв'язувальний сайт, незалежно від джерецьому аналізі. ла, виду походження, способу отримання та хараНа Фігурі 5 показані результати картування ктеристик. Як приклад, що не обмежує, термін епітопу для Муо22, Муо28 та Муо29. Епітоп Муо29 «антитіло» включає в себе антитіла людини, оранбув картований від амінокислоти 72 до амінокисгутанга, миші, щура, кози, вівці та курки. Цей терлоти 88 зрілого GDF-8; для Муо22, від амінокисломін включає в себе, але не обмежується ними, ти 1 до амінокислоти 44; для Муо28, від амінокисполіклональні, моноклональні, моноспецифічні, лоти 1 до амінокислоти 98. поліспецифічні, неспецифічні, гуманізовані, одноНа Фігурі 6 показані результати аналізу замін ланцюгові, химерні, синтетичні, рекомбінантні, епітопу Муо29. Мабуть, залишки Lys-78, Pro-81 та гібридні, мутовані та CDR-трансплантовані антитіAsn-83 в зрілому GDF-8 є важливими для зв'язула. Для цілей даного винаходу цей термін включає вання Муо29 з GDF-8. в себе також, якщо немає інших вказівок, фрагмеНа Фігурі 7 показані результати експерименту нти антитіл, такі як Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAB з імунопреципітації, що виконується з Муо29 та та інші фрагменти антитіл, які зберігають антигенМуо28. Кондиціоноване середовище від клітин зв'язувальну функцію. СНО, експресуючих GDF-8, які були радіоактивно Антитіла можуть бути отримані, наприклад, за мічені 35S-метіоніном/цистеїном, піддавали імунодопомогою традиційних гібридомних способів преципітації з використанням Муо29 або Муо28. (Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499), Потім імунопреципітати аналізували електрофореметодами рекомбінантних ДНК (Патент США № зом у ДСН-ПААГ за відновлювальних умов. Смуги 4816567) або способами фагового дисплея з викона гелі ідентифікували як зрілий GDF-8, пропептид ристанням бібліотек антитіл (Clackson et al. (1991) GDF-8 та непроцесований GDF-8. Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. На Фігурі 8 показані результати фармакокінеBiol., 222: 581-597). По відношенню до інших спотичного дослідження, в якому миші C57B6/SCID собів отримання антитіл див. Antibodies: A отримували дозу 1 мг/кг у вигляді єдиного внутріLaboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring шньовенного (IV) або внутрішньочеревинного (IP) Harbor Laboratory, 1988. введення Муо29. Муо29 показує пролонгований Термін «антигензв'язувальний домен» віднокінцевий напівперіод існування біля одного тижня ситься до частини молекули антитіла, яка містить та низький кліренс приблизно 1 мл/годину/кг. Фразону, що специфічно зв'язується з частиною антикція, абсорбована після ІР-ін'єкції, становить пригену або з усім антигеном або комплементарну близно 77%. частини антигену або всього антигену. Якщо антиНа Фігурі 9 показані порівняння маси чотириген є великим, антитіло може зв'язувати тільки голових м'язів стегна у самців мишей СВ17 SCID, конкретну частину цього антигену. «Епітоп» або що отримували один раз на тиждень різні дози «антигенна детермінанта» є частиною молекули Муо29 (60, 10 та 1 мг/кг) або носій (ЗФР). Лікуванантигену, яка є відповідальною за специфічні взаня Муо29 за рівнях доз 10 та 60 мг/кг протягом ємодії з антигензв'язувальним доменом антитіла. чотирьох тижнів приводить до статистично значуАнтигензв'язувальний домен може бути забезпещого збільшення м'язової маси 19% та 23%, відчений одним або декількома варіабельними домеповідно. нами антитіла (наприклад, так званим FdНа Фігурі 10А та 10В показана маса ікроножфрагментом антитіла, що складається з VHних та чотириголових м'язів у самиць мишей СВ17 домену). Антигензв'язу вальний домен містить SCID, що отримували один раз на тиждень різні варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL) та варіадози Муо29 (10, 5, 2,5 та 1 мг/кг) або ЗФР протягом бельну ділянку важкого ланцюга (Vн). чотирьох тижнів. М'язова маса збільшується на 10Термін «репертуар» відноситься до генетично 20% у мишах, що отримували Муо29, в порівнянні різного набору нуклеотидів, наприклад, ДНК, посз контролем-носієм. лідовностей, що походять повністю або частково з послідовностей, які кодують експресовані імуног 11 91815 12 лобуліни. Ці послідовності генеруються реаранжуідентичний GDF-8 за амінокислотною послідовнісванням in vivo, наприклад, V-, D- та J- сегментів тю (Gamer et al. (1999) Dev. Biol. 208, 222-232; для Н-ланцюгів і, наприклад, V- та J-сегмента для Nakshima et al. (1999) Mech. Dev. 80: 185-189). L-ланцюгів. Альтернативно, ці послідовності моТермін «GDF-8» відноситься до специфічного жуть бути генеровані з клітинної лінії стимуляцією фактора-8 росту та диференціювання і, де це зруin vitro, у відповідь на яку може відбуватися реарачно, до факторів, які структурно або функціональнжування. Альтернативно, частина цих послідовно споріднені GDF-8, наприклад, BMP-11 та інших ностей або всі ці послідовності можуть бути отрифакторів росту, що належать до надсімейства мані об'єднанням неаранжованих V-сегментів з DTGF- Цей термін відноситься до повнорозмірної та J-сегментами, за допомогою нуклеотидного непроцесованої форми-попередника GDF-8, а тасинтезу, неспецифічного мутагенезу та інших спокож до форм зрілого білка та пропептиду, виникасобів, як описано в Патенті США №5565332. ючих внаслідок посттрансляційного розщеплення. Термін «специфічна взаємодія" або "специфіЦей термін відноситься також до будь-яких фрагчно зв'язується" або т.п. означає, що дві молекули ментів і варіантів GDF-8, які зберігають щонаймеутворюють комплекс, який є відносно стабільним нше деяку біологічну активність, асоційовану зі за фізіологічних умов. Цей термін може бути також зрілим GDF-8, як обговорюється тут, в тому числі застосовний коли, наприклад, антигензв'язувальпослідовностям, які можуть бути модифіковані. ний домен є специфічним по відношенню до конкАмінокислотна послідовність зрілого GDF-8 людиретного епітопу, який несуть ряд антигенів, і в ни представлена в SEQ ID NO:49. Даний винахід цьому випадку дане антитіло несе антигензв'язувідноситься до GDF-8 з усіх видів хребетних, в вальний домен, який може бути здатний зв'язуватому числі, але не тільки, людини, корови, курки, тися з різноманітими антигенами, що несуть цей миші, щура, свині, вівці, індички, павіана та риби епітоп. Таким чином, антитіло може специфічно (відносно інформації про послідовність див., назв'язувати, наприклад, BMP-11 та GDF-8, поки воприклад, McPherron et al. (1997) Proc. Natl. Acad. но зв'язується з епітопом, який несуть обидва ці Sci. U.S.A., 94: 12457-12461). фактори. Термін «зрілий GDF-8» відноситься до білка, Специфічне зв'язування характеризується виякий відщеплений від карбоксикінцевого домену сокою афінністю та низькою - помірною продуктибілка-попередника GDF-8. Зрілий GDF-8 може бувністю. Неспецифічне зв'язування зазвичай має ти присутнім у вигляді мономера, гомодимера або низьку афінність з помірною - високою продуктиву вигляді латентного комплексу GDF-8. В залежноністю. Зазвичай зв'язування вважається специфічсті від умов, зрілий GDF-8 може встановлювати ним, коли константа афінності Ка вища, ніж 106 Μ-1 рівновагу між будь-якими або всіма з цих різних 8 -1 або переважно вища, ніж 10 Μ . Якщо необхідно, форм. В його біологічно активній формі зрілий неспецифічне зв'язування може бути зменшене по GDF-8 називають також «активним GDF-8». суті без впливу на специфічне зв'язування варіюТермін «пропептид GDF-8» відноситься до пованням умов зв'язування. Такі умови відомі в даній ліпептиду, який відщеплений від амінокінцевого галузі і фахівець з кваліфікацією в даній галузі з домену білка-попередника GDF-8. Пропептид використанням рутинних способів може вибрати GDF-8 здатний зв'язуватися з пропептидзв'язувапридатні умови. Ці умови зазвичай визначають у льним доменом на зрілому GDF-8. вигляді концентрації антитіл, іонної сили розчину, Термін "латентний комплекс GDF-8" віднотемператури, часу, що дозволяє зв'язування, конситься до комплексу білків, утворених між зрілим центрації неспоріднених молекул (наприклад, сигомодимером GDF-8 та пропептидом GDF-8. Ввароваткового альбуміну, казеїну молока) тощо. жається, що два пропептиди GDF-8 зв'язуються з Приклади умов представлені в прикладах 4, 7 та двома молекулами зрілого GDF-8 в гомодимері з 10. утворенням неактивного тетравимірного комплекФраза "по суті, як представлені" означає, що су. Латентний комплекс може включати в себе інші релевантні CDR, VH- або VL-домен будуть або ідеінгібітори GDF, замість одного або більше пропепнтичними, або у високій мірі схожими зі вказаними тидів GDF-8 або нарівні з одним або більше прорайонами, послідовність яких представлена тут. пептидами GDF-8. Наприклад, такі заміни включають в себе 1 або 2 з Термін "активність GDF-8" відноситься до одбудь-яких 5 амінокислот в послідовності CDR (Н1, нієї або декількох фізіологічно регулюючих ріст Н2, Н3, L1, L2 або L3). або морфогенетичних активностей, асоційованих з активним білком GDF-8. Наприклад, активний Термін "надсімейство TGF- " відноситься до GDF-8 є негативним регулятором маси скелетних сімейства структурно споріднених факторів росту. м'язів. Активний GDF-8 може також модулювати Це сімейство споріднених факторів росту добре продукування специфічних для м'язів ферментів відоме в даній галузі (Kingsley et al. (1994) Genes (наприклад, креатинкінази), стимулювати проліDev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics ферацію міобластів та модулювати диференціюMicrobiol. Immunol., 228: 235-72). Надсімейство вання пре-адипоцитів в адипоцити. Приклади проTGF- включає в себе кісткові морфогенетичні цедур для вимірювання активності GDF-8 in vivo та білки (BMP), активін, інгібін, інгібуючу речовину in vitro наведені у прикладах 2, 3, 6 і 13. Мюллера, отриманий з глії нейротрофічний факТермін "інгібітор GDF-8" включає в себе будьтор і весь час зростаючий ряд факторів росту та який агент, здатний інгібувати активність, експредиференціювання (GDF), таких як GDF-8 (міостасію, процесинг або секрецію GDF-8. Такі інгібітори тин). Багато яких з таких білків є структурно і/або включають в себе білки, антитіла, пептиди, пептифункціонально спорідненими GDF-8. Наприклад, доміметики, рибозими, антисмислові олігонуклеоBMP-11 людини, також відомий як GDF-11, на 90% 13 91815 14 тиди, дволанцюгові РНК та інші малі молекули, які ла даного винаходу здатні також специфічно зв'яспецифічно інгібують GDF-8. Кажуть, що такі інгібізувати і/або інгібувати активність ВМР-11, як покатори "інгібують", "нейтралізують" або "зменшують" зано, наприклад, інгібуванням зв'язування ActRIIB і біологічну активність GDF-8. аналізами з використанням репортерних генів. ПоТерміни "нейтралізували", "нейтралізуючий", третє, описані антитіла можуть інгібувати актив"інгібіторний" та близькі до них слова відносяться ність GDF-8, асоційовану з негативною регуляцією до зменшення активності GDF-8 інгібітором GDF-8 маси скелетних м'язів та щільності кісток. відносно активності GDF-8 за відсутності того саУ зразковому варіанті здійснення описані в дамого інгібітору. Зменшення активності становить ний час антитіла здатні специфічно зв'язувати як переважно приблизно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, GDF-8, так і ВМР-11. Передбачається, що ці анти60%, 70%, 80%, 90% або більше. тіла можуть також взаємодіяти з іншими білками, Термін "лікування" використовується тут взаєнаприклад, з білками, що належать до надсімейстмозамінно з терміном "терапевтичний спосіб" і ва TGF-P, такими як інгібуюча речовина Мюллера, відноситься як до терапевтичного лікування, так і отриманий з глії нейротрофічний фактор або факдо профілактичних/превентивних заходів. Ті, хто тори росту та диференціювання, інші, ніж GDF-8. У потребують лікування, можуть включати в себе деяких варіантах здійснення Муо29 взаємодіє з індивідуумів, що вже мають конкретне медичне білком, який містить послідовність, ідентичну аміпорушення, а також індивідуумів, які можуть зрешнокислотам 72-88 SEQ ID NO:49. У додаткових тою набути цього порушення (тобто індивідуумів, варіантах здійснення Муо29 зв'язується з білком, потребуючих превентивних заходів). що містить послідовність Lys-Xaa1-Xaa2-Pro-Xaa3Термін "виділений" відноситься до молекули, Asn (SEQ ID NO:54), де Xaa1, Xaa2 та Хаа3, кожяка по суті не містить її природного оточення. Наний, означають будь-яку амінокислоту. У додаткоприклад, виділений білок по суті не містить клітинвих варіантах здійснення задовольняється щоного матеріалу або інших білків з клітинного або найменше одна з наступних умов: (1) Xaa1=Met, тканинного джерела, з якого він отриманий. Цей (2) Хаа2=Ser та (3) Xaa3=llе; в кожному випадку термін відноситься до препаратів, в яких виділенезалежно один від іншого. В інших варіантах ний білок є досить чистим для введення як тераздійснення Муо22 впізнає епітоп у перших 44 Nпевтичної композиції або щонайменше на 70 мас. кінцевих амінокислотах у послідовності зрілого % - 80 мас. % чистим, більш переважно щонаймеGDF-8 (амінокислоти 1-44 SEQ ID NO:49). нше на 80 мас. % - 90 мас. % чистим, ще більш Фахівцеві з кваліфікацією в даній галузі буде переважно на 90-95 мас. % чистим; і, найбільш зрозуміло, що антитіла даного винаходу можуть переважно, щонайменше на 95 мас. %, 96 мас. %, бути використані для виявлення, вимірювання та 97 мас. %, 98 мас. %, 99 мас. % або 100 мас. % інгібування білків, які відрізняються від білків, вкачистим. заних вище. Загалом, антитіла даного винаходу Термін "ссавець" відноситься до будь-якої можуть бути використані з будь-яким білком, який тварини, що класифікується як ссавець, в тому містить послідовність, яка є щонайменше на прибчислі людей, домашніх та сільськогосподарських лизно 70%, 80%, 90%, 95% або більше ідентичною тварин, тварин зоопарку, спортивних тварин або будь-якій послідовності з щонайменше 100, 80, 60, кімнатних тварин, таких як собаки, коні, кішки, вів40 або 20 суміжних амінокислот в послідовності ці, свині, корови тощо. зрілої форми GDF-8, представленій SEQ ID NO:49. Термін "ефективна доза" або "ефективна кільНеобмежувальні приклади таких білків включають кість" відноситься до кількості сполуки, яка привов себе послідовності GDF-8, отримані з різних видить до послаблення симптомів у пацієнта або дів, які описані в даному описі. Відсоткову ідентичбажаного біологічного результату (наприклад, збіність визначають стандартними алгоритмами зісльшеної маси скелетних м'язів і/або щільності кіставлень, такими як, наприклад, Basic Local ток). Така кількість повинна бути достатньою для Alignment Tool (BLAST), описаний в Altschul et al. зменшення активності GDF-8, пов'язаної з негати(1990) J. Vol. Biol., 215: 403-410, алгоритм вною регуляцією маси скелетних м'язів і щільності Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453 кістки. Ця ефективна кількість може бути визначеабо алгоритм Meyers et al. (1988) Comput. Appl. на, як описано в подальших розділах. Biosci., 4: 11-17. II. Антитіла проти GDF-8 і антигензв'язувальні В. Варіабельні домени фрагменти Інтактні антитіла, також відомі як імуноглобуліА. Антитіла Муо29, Муо28 або Муо22 людини ни, є зазвичай тетравимірними глікозильованими Даний винахід відноситься до нових антитіл білками, що складаються з двох легких (L) ланцюпроти GDF-8 і їх антигензв'язувальних фрагментів. гів масою приблизно 25 кДа кожний і двох важких Необмежувальні ілюстративні варіанти таких анти(Н) ланцюгів масою приблизно 50 кДа кожний. Два тіл названі Муо29, Муо28 або Муо22. Ці приклади типи легкого ланцюга, названі та , виявлені в варіантів даного винаходу забезпечені в формі антитілах. В залежності від амінокислотної посліIgG1-антитіл людини. довності константного домену важких ланцюгів, Антитіла даного винаходу мають унікальні та імуноглобуліни можуть бути віднесені до п'яти оскорисні властивості. По-перше, ці антитіла здатні новних класів: A, D, Е, G та М, і деякі з них можуть зв'язувати з високою афінністю зрілий GDF-8. Побути додатково поділені на підкласи (ізотипи), надруге, антитіла даного винаходу можуть інгібувати приклад, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Структуактивність GDF-8 in vitro та in vivo, як показано, ри субодиниць та тривимірні конфігурації різних наприклад, інгібуванням зв'язування ActRIIB і анакласів імуноглобулінів добре відомі в даній галузі. лізами з використанням репортерних генів. АнтитіВідносно структури антитіл див. Antibodies: A 15 91815 16 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ного генних сегментів з утворенням повної VLeds. Harlow et al., 1988. Коротко, кожний легкий ділянки. Сам процес рекомбінації є неточним, що ланцюг складається з N-кінцевого варіабельного приводить до втрати або додавання амінокислот в (V) домену (VL) і константного (С) домену (CL). Коцих V(D)J-ділянках з'єднань. Ці механізми різножний важкий ланцюг складається з N-кінцевого Vманітності зустрічаються в В-клітині, що розвивадомену, трьох або чотирьох С-доменів і шарнірної ється перед піддаванням дії антигену. Після стиділянки. СН-домен, найбільш проксимальний відмуляції антигеном гени антитіл в В-клітинах, що носно VH, названий СН1. VH- та VL-домен складаекспресуються, зазнають соматичної мутації. На ються з чотирьох районів відносно консервативної підставі наближено визначеної кількості генних послідовності, що називаються каркасними райосегментів зародкового типу, випадкової рекомбінами (FR1, FR2, FR3 та FR4), які утворюють карнації цих сегментів і випадкового спарювання VHкас для трьох районів гіперваріабельної послідовVL можуть бути утворені до 1,6 107 різних антитіл ності (визначаючих комплементарність районів, (Fundamental Immunology, 3rd ed., ed. Paul, Raven CDR). CDR містять більшість залишків, відповідаPress, New York, NY, 1993). З урахуванням інших льних за специфічні взаємодії з антигеном. CDR процесів, сприяючих різноманітності антитіл (таких називають CDR1, CDR2 та CDR3. Таким чином, як соматична мутація), вважається, що можуть CDR-компоненти на важкому ланцюгу називають генеруватися до 1 1010 різних антитіл H1, Н2 та H3, тоді як CDR на легкому ланцюгу на(Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., зивають L1, L2 та L3. CDR3 є найважливішою діAcademic Press, San Diego, CA, 1995). Внаслідок лянкою молекулярної різноманітності в антигензцих багатьох процесів, що беруть участь в генерув'язувальному сайті. H3, наприклад, може бути ванні різноманітності антитіл, навряд чи ймовірно, таким коротким, як два амінокислотних залишки, що незалежно отримані моноклональні антитіла зі або більшим, ніж 26 амінокислотних залишків. специфічністю відносно одного і того самого антиНайменшим антигензв'язувальним фрагментом є гену будуть мати ідентичні амінокислотні послідоFv, який складається з доменів VH та VL. Fabвності. фрагмент (фрагмент зв'язування антигену) склаТаким чином, даний винахід додатково віднодається з доменів VH-СН1 та VH-CL, ковалентне ситься до нових CDR, отриманих з бібліотек генів зв'язаних дисульфідним зв'язком між константниімуноглобулінів людини. Структурою для несіння ми ділянками. Для подолання тенденції нековалеCDR даного винаходу буде зазвичай послідовність нтно зв'язаних доменів VH та VL в Fv дисоціювати в важкого або легкого ланцюга антитіла або його клітині-хазяїні може бути сконструйований так зваістотна частина, в якій CDR знаходиться в полоний одноланцюговий (sc) Fv-фрагмент (scFv), в женні, що відповідає CDR VH та VL, які зустрічаякому гнучкий і досить довгий поліпептид зв'язує ються природно. Структури та місцерозташування або С-кінець VH з N-кінцем VL, або С-кінець VL з Nваріабельних доменів імуноглобуліну можуть бути кінцем VH. Лінкером, що найчастіше використовувизначені, як описано в Sequences of Proteins of вався, був пептид з 15 амінокислотних залишків Immunological Interest, US Department of Health and (Gly4Ser)3, але в даній галузі відомі також і інші Human Services, eds. Kabat et al., 1991. лінкери. ДНК-послідовності та амінокислотні (АА) посРізноманітність антитіл створюється з викорилідовності описаних тут антитіл, їх scFv-фрагмент, станням багатьох генів зародкової лінії клітин, що домени VH та VL і CDR наведені в Списку послідокодують варіабельні ділянки, та різних соматичних вностей і мають нумерацію, показану в таблиці 1. подій. Ці соматичні події включають в себе рекомДля зручності положення для кожного CDR в добінацію сегментів варіабельних генних сегментів з менах VH та VL наведені в таблиці 2. Послідовності генними сегментами різноманітності (Dважкого та легкого ланцюгів, включаючи в себе сегментами) та з'єднувальними генними сегмендомени VH та VL, є ідентичними в Муо29, Муо28 тами (J-сегментами) з утворенням повної VHабо Муо22. ділянки та рекомбінацію варіабельного та сполуч 17 91815 18 Таблиця 1 ДНК-послідовності та амінокислотні послідовності scFv, доменів VH та VL і CDR ДНК-послідовність scFv АА-послідовність scFv ДНК-послідовність VH АА-послідовність VH ДНК-послідовність VL АА-послідовність VL ДНК-послідовність scFv зародкового типу АА-послідовність scFv зародкового типу ДНК-послідовність VH зародкового типу АА-послідовність VH зародкового типу ДНК-послідовність VL зародкового типу АА-послідовність VL зародкового типу АА-послідовність H1 АА-послідовність Н2 АА-послідовність H3 АА-послідовність L1 АА-послідовність L2 АА-послідовність L3 Муо29 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID NO:30 SEQ ID NO:31 SEQ ID NO:32 SEQ ID NO:33 SEQ ID NO:34 SEQ ID NO:35 SEQ ID NO:36 Myo28 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:37 SEQ ID NO:38 SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:41 SEQ ID NO:42 Myo22 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:43 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:45 SEQ ID NO:46 SEQ ID NO:47 SEQ ID NO:48 Таблиця 2 Положення CDR в scFv CDR H1 H2 H3 L1 L2 L3 Myo29 (SEQ ID NO:26) 31-35 50-66 99-106 157-167 183-189 222-226 Myo28 (SEQ ID NO:20) 31-35 50-66 99-110 160-173 189-195 228-233 Антитіла, що заявляються тут, можуть додатково містити константні ділянки антитіл або їх частини. Наприклад, домен VL може бути приєднаний до С-кінцевого боку константних ділянок легкого ланцюга антитіла, в тому числі ланцюгів С або С , переважно ланцюгів С . Подібним чином, специфічний антигензв'язувальний фрагмент на основі домену VH може бути приєднаний на його Скінцевому боці до всього важкого ланцюга імуноглобуліну або до частини важкого ланцюга імуноглобуліну, отриманої з будь-якого ізотипу антитіл, наприклад, IgG, IgA, IgE та IgM, і будь-яких підкласів антитіл, зокрема, IgG1 і IgG4. У прикладах варіантів здійснення антитіла містять С-кінцеві фрагменти важкого і легкого ланцюгів IgG1 людини. ДНК-послідовності та амінокислотні послідовності для С-кінцевого фрагмента легкого ланцюга зображені в SEQ ID NO:50 та SEQ ID NO:51, відповідно. ДНК-послідовності та амінокислотні послідовності для С-кінцевого фрагмента важкого ланцюга IgG1 зображені в SEQ ID NO:52 та SEQ ID NO:53, відповідно. Деякі варіанти здійснення даного винаходу включають в себе домен VH і/або VL Fv-фрагмента Муо29, Муо28 або Муо22. Додаткові варіанти здійснення включають в себе один або більше визначаючих комплементарність районів (CDR) будь Myo22 (SEQ ID NO:2) 31-35 50-66 99-113 163-176 192-198 231-242 якого з цих доменів VH та VL. Один варіант здійснення включає в себе H3-фрагмент домену VH Myo29, Муо28 або Муо22. Домени VH та VL даного винаходу в деяких варіантах зроблені доменами зародкового типу, тобто каркасні ділянки (FR) цих доменів змінені з використанням загальноприйнятих способів молекулярної біології таким чином, що вони відповідають консенсусним амінокислотним послідовностям генних продуктів зародкового типу людини. В інших варіантах ці каркасні ділянки залишаються відмінними від каркасних ділянок зародкового типу. С. Модифіковані антитіла та їх фрагменти Наступний аспект даного винаходу відноситься до способу отримання антигензв'язувального домену антитіла, специфічного по відношенню до GDF-8. Фахівцеві з кваліфікацією в даній галузі буде зрозуміло, що антитіла даного винаходу не обмежуються специфічними послідовностями VH та VL, показаними в Таблиці 1, але включають в себе також варіанти цих послідовностей, які зберігають антигензв'язувальну здатність. Такі варіанти можуть бути вироблені із забезпечених послідовностей з використанням способів, відомих в даній галузі. Амінокислотні заміни, делеції або додавання можуть бути зроблені або в FR, або в CDR. У той час як зміни в каркасних ділянках зазвичай 19 91815 20 призначені для поліпшення стабільності та зменконсенсусними праймерами для третього каркасшення імуногенності антитіла, зміни в CDR зазвиного району генів VH людини для забезпечення чай призначені для збільшення афінності антитіла спектра варіабельних доменів VH, позбавлених відносно його мішені. Такі зміни, що збільшують CDR3. Цей спектр може комбінуватися з CDR3 афінність, зазвичай визначаються емпірично зміконкретного антитіла. З використанням аналогічною району CDR і випробуванням цього антитіла. них способів отримані з CDR3 послідовності даноТакі зміни можуть бути зроблені способами, опиго винаходу можуть бути перетасовані зі спектрасаними в Antibody Engineering, 2nd ed., ed. ми VH- або VL-доменів, позбавлених CDR3, і ці Borrebaeck, Oxford University Press, 1995. перетасовані повні VH- або VL-домени комбінують Спосіб отримання VH-домену, який є варіантом зі спорідненим VL-або VH-доменом з отриманням амінокислотної послідовності VH-домену, предстаспецифічних антигензв'язувальних фрагментів вленого тут, передбачає стадію додавання, деледаного винаходу. Потім цей спектр може бути ції, заміни або інсерції однієї або декількох амінопредставлений у придатній системі-хазяїні, такій кислот в амінокислотній послідовності заявленого як система фагового дисплея WO 92/01047, таким тут VH-домену, необов'язково об'єднання забезпечином, що можуть бути відібрані відповідні антигеченого таким чином VH-домену з одним або декінзв'язувальні фрагменти. лькома VL-домену та випробування цього VHАналогічні способи перетасування або комбідомену або VH/VL-комбінації або комбінацій на наторні способи описані також Stemmer (Nature специфічне зв'язування з GDF-8, необов'язково (1994) 370: 389-391), який описує цей спосіб по випробування здатності такого антигензв'язувальвідношенню до гена -лактамази, але спостерігає, ного домену нейтралізувати активність GDF-8. VLщо цей підхід може бути використаний для генерудомен може мати амінокислотну послідовність, яка вання антитіл. по суті представлена тут. Наступною альтернативою є генерування ноМоже бути використаний аналогічний спосіб, в вих VH- або VL-районів, що несуть отримані з CDR якому один або декілька варіантів послідовності послідовності даного винаходу, з використанням VL-домену, описаної тут, об'єднують з одним або безладного (випадкового) мутагенезу одного або декількома VH-доменами. декількох вибраних VH- і/або VL-генів для генеруНаступний аспект даного винаходу відноситьвання мутацій в цілому варіабельному домені. ся до способу отримання антигензв'язувального Такий спосіб описаний Gram et al. (Proc. Natl. Acad. фрагмента, який специфічно взаємодіє з GDF-8. Sci. USA (1992) 89: 3576-3580), які використали Цей спосіб передбачає: схильну до помилок ПЛР. (a) забезпечення вихідного спектра нуклеїноІншим способом, який може бути використавих кислот, що кодують VH-домен, який або вклюний, є спрямування мутагенезу на райони CDR чає в себе CDR3, що повинен бути замінений, або генів VH та VL. Такі способи описані Barbas et al. не містить кодуючого CDR3 району; (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 3809-3813) та (b) об'єднання цього спектра з донорною нукSchier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551-567). леїновою кислотою, що кодує амінокислотну посПодібним чином, один або більше, або всі три лідовність, по суті таку, як представлена тут для CDR можуть бути трансплантовані у спектр VH- і CDR3 VH (тобто H3), таким чином, що ця донорна VL-доменів, які потім піддають скринінгу на специпослідовність вбудовується в район CDR3 в цьому фічний партнер зв'язування або фрагменти зв'язуспектрі таким чином, щоб забезпечити як продукт вання, специфічні по відношенню до GDF-8. спектр нуклеїнових кислот, які кодують VH-домен; Істотна частина варіабельного домену імуног(c) експресію нуклеїнових кислот отриманого лобуліну буде містити щонайменше райони CDR і, спектра; не обов'язково, їх проміжні каркасні райони з scFv(d) відбір специфічного антигензв'язувального фрагментів, як представлено тут. Ця частина буде фрагмента, специфічного по відношенню до GDFтакож включати в себе щонайменше приблизно 8; і 50% будь-якого або обох з FR1 і FR4, причому ці (e) виймання специфічного антигензв'язуваль50% є С-кінцевими 50% FR1 та N-кінцевими 50% ного фрагмента або нуклеїнової кислоти, що кодує FR4. Додаткові залишки на N-кінцевому або Сйого. кінцевому боці істотної частини варіабельного доЗнов може бути використаний аналогічний мену можуть бути залишками, зазвичай асоційоспосіб, в якому CDR3 (тобто L3) VL даного винахованими з районами варіабельних доменів, що зуду об'єднують зі спектром нуклеїнових кислот, що стрічаються природно. Наприклад, конструювання кодують VL-домен, які або включають в себе специфічних антигензв'язувальних фрагментів CDR3, що повинен бути замінений, або не містять даного винаходу, зроблене з використанням спокодуючого CDR3 району. собів рекомбінантних ДНК, може приводити до Кодуюча послідовність CDR даного винаходу введення N-кінцевих або С-кінцевих залишків, що (наприклад, CDR3) може бути введена до спектру кодуються лінкерами, введеними для полегшення варіабельних доменів, що не містять CDR (наприклонування або інших стадій маніпулювання. Інші клад, CDR3) з використанням технології рекомбістадії маніпулювання включають в себе введення нантних ДНК. Наприклад, Marks et al., лінкерів для приєднання варіабельних доменів (Bio/Technology (1992) 10: 779-783) описують споданого винаходу до додаткових білкових послідособи отримання спектрів варіабельних доменів вностей, в тому числі важких ланцюгів імуноглобуантитіл, в яких консенсусні праймери, направлені ліну, інших варіабельних доменів (наприклад, при на 5'-кінець або суміжну з ним послідовність ділянотриманні диантитіл) або білкових міток, як обгоки варіабельного домену, використовують разом з ворюється більш детально нижче. 21 91815 22 Хоч варіанти, ілюстровані в прикладах, містять на антитілах є хімічне або ферментативне зв'язу"сумісну" пару VH- та VL-доменів, даний винахід вання глікозидів з амінокислотними залишками включає в себе також зв'язувальні фрагменти, що антитіла. Ці способи описані в WO 87/05330 та в містять єдиний варіабельний домен, що походить Aplin and Wriston (1981) CRC Grit. Rev. Biochem., з послідовностей або VH- ,або VL-доменів, зокре22: 259-306. Видалення будь-яких вуглеводних ма, VH-доменів. У випадку будь-якого з цих специчастин молекул на антитілах може виконуватися фічних відносно єдиного ланцюга зв'язувальних хімічно або ферментативно, як описано доменів, ці домени можуть бути використані для Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., скринінгу на комплементарні домени, що здатні 259: 52; та Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: утворювати специфічний відносно двох доменів 131 та Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: антигензв'язувальний домен, здатний зв'язувати 350. GDF-8. Це може бути досягнуто способами скриніАнтитіла даного винаходу можуть бути також нгу із застосуванням фагового дисплея, що викомічені детектованою або функціональною міткою. ристовують так званий ієрархічний подвійний комДетектовані мітки включають в себе радіоактивні бінаторний підхід, як описано в WO 92/01047, в мітки, такі як 131І або 99Тс, які можуть бути приєдякому окрему колонію, що містить клон або Н-, або нані до антитіл даного винаходу з використанням L-ланцюга, використовують для інфікування повної загальноприйнятих хімічних способів, відомих в бібліотеки клонів, що кодують інший ланцюг (L або даній галузі. Мітки включають в себе також ферН), і отриманий специфічний відносно двох ланцюментні мітки, такі як пероксидаза хріну або лужна гів антигензв'язувальний домен відбирають у відфосфатаза. Далі, мітки включають в себе хімічні повідності до способів фагового дисплея, таких, як частини молекул, такі як біотин, який може бути описані в цьому посиланні. Цей спосіб описаний детектований через зв'язування зі специфічною також в Marks et al., supra. спорідненою детектованою частиною молекули, Антитіла можуть бути кон'юговані хімічними такою як, наприклад, мічений авідин. способами з радіонуклідами, лікарськими засобаАнтитіла, в яких послідовності CDR відрізнями, макромолекулами або іншими агентами або ються лише неістотно від послідовностей, предможуть бути виготовлені у вигляді злитих білків, ставлених в SEQ ID NO.n, де n дорівнює 2, 4, 6, 8, що містять один або декілька CDR даного винахо10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, ду. 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 Злитий білок антитіл містить VH-VL-паy, в якій або 48, включені в межі даного винаходу. Неістотні один з цих ланцюгів (зазвичай VH) та інший білок відмінності включають в себе мінорні зміни аміносинтезовані у вигляді єдиного поліпептидного ланкислот, такі як заміни 1 або 2 з будь-яких 5 аміноцюга. Ці типи продуктів відрізняються від антитіл кислот в послідовності CDR. Зазвичай, амінокистим, що вони зазвичай мають додатковий функцілоту заміняють спорідненою амінокислотою, що ональний елемент; активну частину малої молекумає схожі заряд, гідрофобні або стереохімічні влали або головну молекулярну структурну ознаку цієї стивості. Такі заміни знаходяться в межах звичайкон'югованої або злитої макромолекули. ної кваліфікації фахівця. На відміну від цього в Крім змін амінокислотної послідовності, описаCDR, більш істотні зміни в структурних каркасних них вище, антитіла можуть бути глікозильовані, районах (FR) можуть бути зроблені без шкідливого пегильовані або зв'язані з альбуміном або небілвпливу на зв'язувальні властивості антитіла. Зміни ковим полімером. Наприклад, заявлені тепер анв FR включають в себе, але не обмежуються нититіла можуть бути зв'язані з однією з множини ми, гуманізування отриманої не з людини каркаснебілкових полімерів, наприклад, поліетиленгліконої ділянки або конструювання деяких каркасних лем, поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами, залишків, які є важливими для контакту з антигеспособом, описаним в Патентах США з номерами ном або для стабілізації сайта зв'язування, напри4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або клад, зміною класу або підкласу константної ділян4179337. Ці антитіла хімічно модифікують ковалеки, зміною специфічних амінокислотних залишків, нтною кон'югацією з полімером, наприклад, для які можуть змінювати ефекторну функцію, таку як збільшення їх напівперіоду існування в кровотоці. зв'язування Fc-рецептора (Lund et al. (1991) J. Приклади полімерів і способи їх приєднання до Immun. 147: 2657-2662 та Morgan et al. (1995) пептидів описані також в Патентах США з номераImmunology 86: 319-324), або зміною виду, з якого ми 4766106; 4179337; 4495285 і 4609546. отримують цю константну ділянку. Антитіла моВ інших варіантах антитіло може бути модифіжуть мати мутації в районі СН2 важкого ланцюга, коване таким чином, щоб воно мало змінену карякі зменшують або змінюють ефекторну функцію, тину глікозилювання (тобто змінену в порівнянні з наприклад, зв'язування Fc-рецептора та активацію вихідною або нативною картиною глікозилювання). комплементу. Наприклад, антитіла можуть мати У даному контексті, "змінена" означає наявність мутації, такі як описані в Патентах США з номераделетованих однієї або декількох вуглеводних ми 5624821 і 5648260. У важкому ланцюгу IgG1 або частин молекули і наявність одного або декількох IgG2, наприклад, такі мутації можуть бути отримані сайтів глікозилювання, доданих до вихідного антипри амінокислотих залишках 117 і 120 SEQ ID тіла. Додавання сайтів глікозилювання до заявлеNO:53, яка представляє Fc-частину IgG1 (ці залишних тут антитіл, що виконується зміною амінокиски відповідають амінокислотам 234 та 237 в повлотної послідовності таким чином, що вона містить норозмірній послідовності IgG1 або IgG2). Антитіла консенсусні послідовності сайтів глікозилювання, можуть також мати мутації, які стабілізують дисудобре відоме в даній галузі. Іншим способом збільфідний зв'язок між двома важкими ланцюгами льшення кількостей вуглеводних частин молекул імуноглобуліну, такі як мутації в шарнірній ділянці 23 91815 24 IgG4, описані в Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: Можуть бути вибрані або сконструйовані від105-108. повідні вектори, що містять відповідні регуляторні D. Нуклеїнові кислоти, системи клонування та послідовності, в тому числі промоторні послідовекспресії ності, термінаторні послідовності, послідовності Даний винахід відноситься також до виділеної поліаденілування, енхансерні послідовності, марнуклеїнової кислоти, що кодує антитіла або зв'язукерні гени та інші відповідні послідовності. Вектовальної фрагменти даного винаходу. Нуклеїнова рами можуть бути плазміди або віруси, наприклад, кислота відповідно до даного винаходу може місфаг або фагміда, за мірою необхідності. Відносно тити ДНК або РНК і може бути повністю або частдодаткових подробиць див., наприклад, Molecular ково синтетичною. Посилання на нуклеотидну поCloning: a Laboratory Manual: 2nd ed., Sambrook et слідовність, представлену тут, включає в себе al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Чисмолекулу ДНК з вказаною послідовністю і включає ленні відомі способи та протоколи для маніпулюв себе молекулу РНК з вказаною послідовністю, в вання нуклеїновими кислотами, наприклад, при якій Τ замінений U, якщо в контексті немає іншої отриманні конструкцій нуклеїнових кислот, мутагевказівки. незі, секвенуванні, введенні ДНК в клітини та ексНуклеїнова кислота даного винаходу містить пресії генів і аналізі білків, описані детально в кодуючу послідовність для CDR або VH- або VLCurrent Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., домену даного винаходу, представлену тут. Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. Даний винахід відноситься також до конструкТаким чином, наступний аспект даного винації у формі плазмід, векторів, транскрипційних або ходу відноситься до клітини-хазяїна, що містить експресійних касет, які містять, щонайменше, одну нуклеїнову кислоту, описану тут. Ще один аспект нуклеїнову кислоту даного винаходу, описану вивідноситься до способу, що передбачає введення ще. такої нуклеїнової кислоти до клітини-хазяїна. Це Даний винахід відноситься також до клітинивведення можна виконувати будь-яким доступним хазяїна, яка містить одну або більше конструкцій, способом. Для еукаріотичних клітин відповідні споописаних вище. Нуклеїнова кислота, що кодує соби можуть включати в себе трансфекцію з викобудь-який CDR (H1, Н2, H3, L1, L2 або L3), VH- або ристанням фосфату кальцію, ДЕАЕ-декстрану, VL-домен або специфічний антигензв'язувальний електропорацію, опосередковану ліпосомами трафрагмент, забезпечені тут, утворює аспект даного нсфекцію та трансдукцію з використанням ретровинаходу, як і спосіб отримання продукту, що ковірусу або іншого вірусу, наприклад, вірусу кородується. Цей спосіб включає в себе експресію з в'ячої віспи, або, для клітин комах, бакуловірусу. кодуючої нуклеїнової кислоти. Експресія може доДля бактеріальних клітин придатні способи можуть сягатися культивуванням за придатних умов рековключати в себе трансформацію з використанням мбінантних клітин-хазяїв, що містять дану нуклеїхлориду кальцію, електропорацію і трансфекцію з нову кислоту. Після продукування експресією VHвикористанням бактеріофагу. або VL-домен або специфічний антигензв'язувальВведення може супроводжуватися викликанний фрагмент може бути виділений і/або очищеням або створенням можливості експресії з цієї ний з використанням будь-якого придатного спонуклеїнової кислоти, наприклад, культивуванням собу і потім використаний відповідним чином. клітин-хазяїв в умовах, придатних для експресії Специфічні антигензв'язувальні фрагменти, гена, що розглядається. VH- та/або VL-домени та кодуючі молекули нуклеїЕ. Біологічні депозити нових кислот і вектори відповідно до даного винаКультури Е. coli, індивідуально трансформоходу можуть бути забезпечені у виділеному і/або вані фагмідним вектором pCANTAB6, що кодує очищеному вигляді, наприклад, з їх природного scFv Myo29, Муо28 або Муо22, не модифіковані з оточення в по суті чистій або гомогенній формі отриманням продуктів зародкового типу, були деабо, у випадку нуклеїнової кислоти, в формі, що не поновані 2 жовтня 2002 року в Американській Комістить або по суті не містить нуклеїнової кислоти лекції Культур Тканин (АТТС) під відповідними або генів іншого походження, ніж походження посномерами позначення депозитів РТА-4741, РТАлідовності, що кодує поліпептид з необхідною фу4740 та РТА-4739. Адреса депозитарію: 10801 нкцією. University Blvd, Manassas, VA 20110, U.S.A. Відомі системи для клонування та експресії II. Способи лікування захворювання та інші заполіпептиду у множині різних клітин-хазяїв. Відпостосування відні клітини-хазяї включають в себе бактерії, кліАнтитіла даного винаходу застосовні для затини ссавців і дріжджові та бакуловірусні системи. побігання, діагностики або лікування різних медиЛінії клітин ссавців, доступні в даній галузі для чних порушень в людині або тваринах. Антитіла експресії гетерологічного поліпептиду, включають можуть бути використані для інгібування або змев себе клітини яєчника китайського хом'ячка, кліншення однієї або декількох активностей, асоційотини HeLa, клітини нирки дитинчати хом'ячка, кліваних з GDF-8 або спорідненим білком. Найбільш тини мишачої меланоми NSO та багато інших. переважно, ці антитіла інгібують або зменшують Звичайним бактерійним хазяїном є Е. coli. Відносодну або декілька активностей GDF-8 відносно но клітин, придатних для отримання антитіл, див. GDF-8, який не зв'язаний антитілом. У деяких ваGene Expression Systems, eds. Fernandez et al., ріантах здійснення активність GDF-8, при зв'язуAcademic Press, 1999. Будь-яка клітина, сумісна з ванні одним або декількома з заявлених тут антиданим винаходом, може бути використана для тіл, інгібується щонайменше на 50%, переважно отримання заявлених тут антитіл. щонайменше на 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 82, 84, 86 або 88%, більш переважне щонай 25 91815 26 менше на 90, 91, 92, 93 або 94% і ще більш перетовується в даному винаході, терапевтично ефекважно щонайменше на 95%-100% відносно зрілого тивна доза може бути визначена спочатку з аналібілка GDF-8, який не зв'язаний одним або декільзів на культурах клітин. У моделях тварин може кома заявленими тут антитілами. Інгібування актибути визначена доза, придатна для досягнення вності GDF-8 може бути виміряне в аналізах з видіапазону концентрації циркуляції в плазмі, який користанням репортерного гена pGL3(CAGA)12 включає в себе ІС50 (тобто концентрацію антитіла, (RGA), як описано в Thies et al. (Growth Factors що тестується, яка дає напівмаксимальне інгібу(2001) 18: 251-259) і як ілюстровано в прикладах 2 вання симптомів), наприклад, високоефективною та 9, або в аналізах з використанням рецептора рідинною хроматографією. Дії будь-якої конкретної ActRIIB, як ілюстровано в прикладах 3 та 6. дози можуть бути піддані моніторингу за допомоМедичним порушенням, яке діагностують, лігою відповідного біоаналізу. Приклади відповідних кують або запобігають описаними тут антитілами, біоаналізів включають в себе аналізи реплікації є м'язове або нервово-м'язове порушення; поруДНК, аналізи на основі транскрипції, аналізи зв'яшення жирової тканини, таке як ожиріння; діабет зування білок GDF-8/рецептор, аналізи креатинкітипу 2; порушена толерантність до глюкози; метанази, аналізи на основі диференціювання преболічні синдроми (наприклад, синдром X); інсуліадипоцитів, аналізи на основі поглинання глюкози норезистентність, індукована травмою, такою як в адипоцитах та імунологічні аналізи. опіки або порушення азотного балансу; або кісткоЗазвичай, ці композиції вводять таким чином, ве дегенеративне захворювання, таке як остеопощо антитіла або їх зв'язувальні фрагменти надароз. ються в дозі 1 мкг/кг - 150 мг/кг, 1 мкг/кг - 100 мг/кг, Іншими медичними порушеннями, які діагнос1 мкг/кг - 50 мг/кг, 1 мкг/кг - 20 мг/кг, 1 мкг/кг - 10 тують, лікують або запобігають описаними тут анмг/кг, 1 мкг/кг - 1 мг/кг, 10 мкг/кг - 1 мг/кг, 10 мкг/кг титілами, є порушення, пов'язані з розрідженням 100 мг/кг, 100 мкг/кг - 1 мг/кг та 500 мкг/кг - 1 мг/кг. кістки, які включають в себе остеопороз, особливо Переважно, ці антитіла надаються у вигляді болюу літніх і/або постклімактеричних жінок, індуковасної дози для максимізації рівнів антитіл в кровоний глюкокортикоїдами остеопороз, остеопенію, тоці протягом найбільшої тривалості після введеностеоартрит і пов'язані з остеопорозом переломи. ня цієї дози. Після болюсної дози може бути також Інші метаболічні кісткові захворювання та порувикористана безперервна інфузія. шення-мішені включають в себе низьку кісткову Способи лікування, діагностики або профілакмасу внаслідок тривалої глюкокортикоїдної терапії, тики медичних станів, зазначених вище, описанипередчасну гонадну недостатність, супресію андми тут антитілами можуть бути також використані рогену, недостатність вітаміну D, повторний гіперна інших білках в надсімействі TGF- . Багато з цих паратиреоз, харчову недостатність і нервовобілків є близькими за їх структурою до GDF-8, тапсихічну анорексію. Ці антитіла переважно викорикими як ВМР-11. Таким чином, інший варіант здійстовують для профілактики, діагностики або лікуснення забезпечує способи лікування порушень, вання таких медичних порушень у ссавців, зокрезазначених вище, введенням суб'єкту антитіла, ма у людей. здатного інгібувати ВМР-11 або активін, або окреАнтитіла або композиції антитіл даного винамо, або в комбінації з іншими інгібіторами TGF- , ходу вводять в терапевтично ефективних кількостакими як нейтралізуюче антитіло проти GDF-8. тях. Зазвичай терапевтично ефективна кількість Антитіла даного винаходу можуть бути також виможе варіюватися в залежності від віку, стану та користані для лікування захворювання або стану, статі суб'єкта, а також тяжкості медичного стану в пов'язаного з BMP-11 або опосередкованого ВМРцьому суб'єкті. Доза може бути визначена лікарем і 11. Див., наприклад, Патенти США з номерами скоректована, якщо необхідно, для отримання 5639638 та 6437111. ефектів лікування, що спостерігаються. ТоксичАнтитіла даного винаходу можуть бути виконість та терапевтична ефективність таких сполук ристані для виявлення присутності білків, що наможе бути визначена стандартними фармацевтилежать до надсімейства TGF- , таких як BMP-11 чними процедурами в культурах клітин або експета GDF-8, in vivo або in vitro. Кореляцією присутнориментальних тваринах, наприклад, визначенням сті або рівня цих білків з медичним станом фахіLD50 (дози, летальної для 50% популяції) та ED50 вець з кваліфікацією в даній галузі може діагнос(дози, терапевтично ефективної в 50% популяції). тувати асоційований з ними медичний стан. Співвідношення дози між токсичним і терапевтичМедичні стани, які можуть бути діагностовані за ним ефектами є терапевтичним індексом, і він модопомогою описаних тут антитіл, наведені вище. же бути виражений у вигляді відношення Такі способи виявлення добре відомі в даній LD5O/ED50. Переважними є антитіла, які виявляють галузі і включають в себе ELISA, радіоімуноаналіз, високі терапевтичні індекси. імуноблот, Вестерн-блот, імунофлуоресценцію, Дані, отримані з аналізів на клітинних культуімунопреципітацію та інші порівнювані способи. Ці рах і досліджень на тваринах, можуть бути викоантитіла можуть бути додатково забезпечені в ристані у визначенні діапазону дози для застосудіагностичному наборі, який є застосовним для вання у випадку людей. Доза таких сполук лежить одного або декількох способів для детектування переважно в діапазоні концентрацій в кровотоці, білка (наприклад, GDF-8). Такий набір може містиякі включають в себе ED50 з малою токсичністю ти інші компоненти, упаковку, інструкції або інші або з відсутністю токсичності. Ця доза може варіматеріали, що сприяють детектуванню цього білка юватися в межах цього діапазону в залежності від та застосуванню цього набору. дозованої форми і способу введення, що викорисУ випадку, коли ці антитіла призначені для діатовуються. Для будь-якого антитіла, що викорисгностичних цілей, може бути бажаною їх модифі 27 91815 28 кація, наприклад, лігандною групою (такою як біого винаходу і фармацевтично прийнятний ексципітин) або детектованою маркерною групою (такою єнт. У даному контексті фраза "фармацевтично як флуоресцентна група, радіоізотоп або ферприйнятний ексципієнт" включає в себе будь-який мент). Якщо бажано, ці антитіла (поліклональні розчинник і всі розчинники, диспергуючі середоабо моноклональні) можуть бути мічені з викорисвища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові танням загальноприйнятих способів. Відповідні агенти, ізотонічні та затримуючі абсорбцію агенти і мітки включають в себе флуорофори, хромофори, т.п., які є сумісними з фармацевтичним введенрадіоактивні атоми, електронно-щільні реагенти, ням. Застосування таких середовищ і агентів для ферменти та ліганди, що мають специфічних парфармацевтично активних речовин добре відоме в тнерів зв'язування. Ферменти зазвичай детектують даній галузі. Ці композиції можуть також містити за їх активністю. Наприклад, пероксидаза хріну інші активні сполуки, що забезпечують додаткові, може бути детектована за її здатністю перетворюдодаткові або посилені терапевтичні функції. Ці вати тетраметилбензидин (ТМВ) у синій пігмент, фармацевтичні композиції можуть бути включені який може бути визначений кількісно за допомогою до контейнеру, упаковки або розподільного приспектрофотометра. Інші придатні мітки можуть строю разом з інструкціями для введення. включати в себе біотин і авідин або стрептавідин, Фармацевтичну композицію даного винаходу IgG та білок А і численні пари рецептор-ліганд, готують таким чином, що вона є сумісною з передвідомі в даній галузі. Інші перестановки та можлибачуваним способом введення. Способи виконанвості будуть цілком очевидними фахівцям зі звиня введення відомі фахівцям зі звичайною квалічайною кваліфікацією в даній галузі та розглядафікацією в даній галузі. Можна також отримувати ються як еквіваленти в обсязі даного винаходу. композиції, які можуть вводитися місцево або пеЩе один аспект даного винаходу відноситься рорально або які можуть бути здатні пройти крізь до способу ідентифікації терапевтичних агентів, слизові оболонки. Введення може бути, напризастосовних у лікуванні м'язових і кісткових поруклад, внутрішньовенним, внутрішньочеревинним, шень. У даній галузі відомі відповідні аналізивнутрішньом'язовим, внутрішньопорожнинним, скринінги. У такому аналізі-скринінгу першу зв'язупідшкірним або черезшкірним. вальну молекулу утворюють об'єднанням антитіла Розчини або суспензії, що використовуються даного винаходу та ліганду, наприклад, GDF-8, для внутрішньошкірного або підшкірного введення, ВМР-11, активіну; і вимірюють кількість зв'язуванзазвичай включають в себе один або декілька з ня між цим лігандом і цим антитілом в першій сунаступних компонентів: стерильний розріджувач, міші для зв'язування (М0). Другу суміш для зв'язутакий як вода для ін'єкцій, сольовий розчин, нелевання також утворюють об'єднанням антитіла, ткі масла, поліетиленгліколі, гліцерин, поліпропіліганду та сполуки, що підлягає скринінгу, або агеленгліколь або інші синтетичні розчинники; антинта, і кількість зв'язування між лігандом і антитілом бактерійні агенти, такі як бензиловий спирт або вимірюють в цій другій суміші для зв'язування (М1). метилпарабени; антиоксиданти, такі як аскорбіноПотім кількості зв'язувань в першій і другій сумішах ва кислота або бісульфіт натрію; хелатоутворювадля зв'язування порівнюють, наприклад, шляхом чі, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота; буферозрахунку відношення М1/М0. Вважається, що ця ри, такі як ацетати, цитрати або фосфати; і агенти сполука або агент здатний інгібувати активність для корекції тонічності, такі як хлорид натрію або GDF-8, якщо спостерігають зменшення зв'язувандекстроза. рН може доводитися кислотами або ня у другій суміші для зв'язування в порівнянні з основами, такими як хлористоводнева кислота або першою сумішшю для зв'язування. Утворення і гідроксид натрію. Такі препарати можуть бути вміоптимізація сумішей для зв'язування знаходяться щені в ампули, одноразові шприці або флакони з в рамках кваліфікації в даній галузі, і такі суміші множинними дозами зі скла або пластика. для зв'язування можуть також містити буфери та Фармацевтичні композиції, придатні для ін'єксолі, необхідні для посилення або оптимізації зв'яції, включають в себе стерильні водні розчини або зування, і додаткові контрольні аналізи можуть дисперсії та стерильні порошки для незаплановабути включені до аналізу-скринінгу даного винахоного приготування ін'єкційних розчинів або диспеду. рсії. Для внутрішньовенного введення придатні Сполуки, що зменшують зв'язування антитілоносії включають в себе фізіологічний сольовий ліганд щонайменше на приблизно 10% (тобто розчин, бактеріостатичну воду, Cremophor EL М1/М0