Застосування рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини для запобігання нейтропенії або лейкопенії

Реферат: Винахід стосується застосування рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини у виготовленні лікарського засобу для лікування або запобігання нейтропенії або лейкопенії у суб'єкта людини або для зниження частоти виникнення інфекції, що проявляється фебрильною нейтропенією, у суб'єкта людини з немієлоїдними злоякісними новотворами, яка одержує щонайменше один мієлосупресивний протираковий лікарський засіб, асоційований з клінічно значимою частотою виникнення фебрильної нейтропенії, причому необхідна для застосування кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини становить від приблизно 30 мг до приблизно 60 мг. UA 105201 C2 (12) UA 105201 C2 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Ця заявка заявляє пріоритет згідно з попередньою заявкою на патент США 61/145440, поданою 16 січня 2009 р., і попередньою заявкою на патент США 61/145436, поданою 16 січня 2009 р. Повний вміст попередньої заявки на патент США 61/145440 і попередньої заявки на патент США 61/145436 включено в цей опис за допомогою посилання. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ [0002] Лейкопенія являє собою зниження вмісту циркулюючих лейкоцитів (білих клітин крові), і часто визначається як кількість лейкоцитів < 4000/мл. Основними клітинами, які зачіпає лейкопенія, є нейтрофіли. Однак знижений вміст лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів або базофілів також може сприяти зниженому загальному вмісту лейкоцитів (Merck Manual, 17е видання). [0003] Нейтропенія характеризується зниженням кількості нейтрофілов у крові, яке часто приводить до підвищеної чутливості до бактеріальних і грибкових інфекцій. Нейтропенія класифікується за кількістю нейтрофілів і відносним ризиком розвитку інфекції в такий спосіб: легка (від 1000 до 1500/мл), помірна (3 ступінь, від 500 до 1000/мл) або важка (4 ступінь, < 500/мл). Гостра і важка нейтропенія являє собою загрозливий для життя стан, тому що при ньому пацієнт піддається інфекціям з летальним результатом (Merck Manual, 17е видання), що швидко розвиваються. [0004] Нейтропенія може бути викликана порушеною продукцією нейтрофілів у кістковому мозку або прискореним руйнуванням нейтрофілів. Гостра нейтропенія може виникати протягом декількох днів, коли втрата нейтрофілів відбувається швидко, а їх продукція сильно порушена. Хронічна нейтропенія може тривати багато місяців і часто викликана зниженою продукцією або секвестрацією нейтрофілів у селезінці. Нейтропенію можна класифікувати залежно від того, чи є її виникнення вторинним стосовно факторів, що не відносяться до мієлоїдних клітин кісткового мозку, або внутрішній дефект у мієлоїдних попередниках (Merck Manual, 17е видання). [0005] Нейтропенія та її інфекційні ускладнення належать до числа найпоширеніших і серйозних побічних ефектів цитотоксичної хіміотерапії та інших видів терапії раку, таких як променева терапія, біотерапія, спрямована терапія і трансплантація кісткового мозку. Цитотоксична хіміотерапія, яка діє шляхом руйнування швидкозростаючих клітин, індукує нейтропенію через високу швидкість проліферації попередників нейтрофілів і швидке відновлення нейтрофілів у крові (Merck Manual, 17е видання). Найпоширеніші симптоми нейтропенії у пацієнтів, що зазнають хіміотерапії, включають лихоманку, виразки в ротовій порожнині та вушні інфекції. Пацієнти з важкою нейтропенією часто страждають від гнійних інфекцій, таких як септицемія, шкірний целюліт, абсцеси печінки, фурункульоз, пневмонія, стоматит, гінгівіт, периректальне запалення, коліт, синусит і отит середнього вуха. Може виникати необхідність відкласти хіміотерапію до того моменту, коли організм зможе виробляти більше нейтрофілів, а також іноді доводиться вводити менші дози, що приводить до зниження ефективності лікування. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0006] Згідно з цим винаходом запропоновані способи і композиції для застосування в лікуванні, полегшенні та запобіганні патологічного стану, що характеризується зниженим вмістом лейкоцитів у крові у порівнянні з нормою. Такі патологічні стани включають лейкопенію і нейтропенію, але не обмежуються ними. [0007] Згідно з першим варіантом реалізації винаходу запропонований спосіб лікування або запобігання нейтропенії у суб'єкта, який представляє собою людину, що включає введення суб'єктові, що представляє собою людину, яка страждає нейтропенією або рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що має ризик розвитку нейтропенії, в кількості, ефективній для лікування зазначеного суб'єкта. Згідно з типовим варіантом реалізації винаходу суб'єкт, що представляє собою людину, може мати немієлоїдні злоякісні новотвори і одержувати щонайменше один мієлосупресивний протираковий лікарський засіб, асоційований з клінічно значимою частотою виникнення фебрильної нейтропенії. [0008] Згідно з другим варіантом реалізації винаходу запропонований спосіб лікування або запобігання лейкопенії у суб'єкта, що представляє собою людину, що включає введення суб'єктові, який представляє собою людину, що страждає лейкопенією або рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що має ризик розвитку лейкопенії, в кількості, ефективній для лікування зазначеного суб'єкта. [0009] Згідно з третім варіантом реалізації винаходу запропонований спосіб зниження частоти виникнення інфекції, такий як інфекція, що проявляється фебрильною нейтропенією, у суб'єкта, що представляє собою людину, яка має немієлоїдні злоякісні новотвори, і яка одержує щонайменше один мієлосупресивний протираковий лікарський засіб, асоційований з клінічно 1 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 значимою частотою виникнення фебрильної нейтропенії, що включає введення суб'єктові рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини в кількості, ефективній для лікування зазначеного суб'єкта. [0010] У деяких способах сполуки, описані в цій заявці, можуть застосовуватися для зниження частоти виникнення інфекції, такої як інфекція, що проявляється фебрильною нейтропенією. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу композиції та способи включають гібридний поліпептид, утворений з білка сироваткового альбуміну людини ("HSA") і гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини ("G-CSF"). Довжина гібридного поліпептиду становить 759 амінокислот; 1-585 амінокислоти гібридного поліпептиду відповідають амінокислотам зрілою форми HSA, і 586-759 амінокислоти гібридного поліпептиду відповідають амінокислотам зрілою форми G-CSF людини. Послідовності амінокислот гібридного білка представлені на Фіг. 1. Гібридний поліпептид, що має назву Нейгранін™ ("NEUG"), вводять пацієнтам, що страждають лейкопенією або нейтропенією або, що мають підвищений ризик розвитку лейкопенії або нейтропенії. Наприклад, згідно з деякими варіантами реалізації винаходу способи включають лікування лейкопенії або нейтропенії у суб'єкта, що представляє собою людину, шляхом введення рекомбінантного альбуміну людинигранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини в кількості, ефективній для лікування зазначеного суб'єкта. [0011] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу нейтропенія являє собою первинну нейтропенію, гостру нейтропенію, важку хронічну нейтропенію (ВХН), важку вроджену нейтропенію (синдром Костманна), важкий генетично детермінований агранулоцитоз немовлят, доброякісну нейтропенію, циклічну нейтропенію, хронічну ідіопатичну нейтропенію, вторинну нейтропенію, асоційовану з синдромом нейтропенію або імуно-опосередковану нейтропенію. [0012] Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу нейтропенія є викликаною або пов'язаною з опроміненням, алкоголізмом, лікарськими засобами, алергійними захворюваннями, гіпопластичною анемією, аутоімунним захворюванням, T-γ лімфопроліферативним захворюванням (T-γ ЛПЗ), мієлодисплазією, мієлофіброзом, дисгаммаглобулінемією, нічною пароксизмальною гемоглобінурією, раком, дефіцитом вітаміну B12, дефіцитом фолатів, вірусною інфекцією, бактеріальною інфекцією, ушкодженням селезінки, гемодіалізом, трансплантацією, лейкемією, мієломою, лімфомою, метастатичними солідними пухлинами, які інфільтрують і заміщають кістковий мозок, токсинами, недостатністю кісткового мозку, синдромом Швахмана-Даймонда, хряще-волосяною гіпоплазією, вродженим дискератозом, хворобою нагромадження глікогену IB типу, спленомегалією будь-якої етіології і внутрішніми дефектами мієлоїдних клітин або їх попередників. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу нейтропенія викликана або пов'язана з цитотоксичною хіміотерапією. [0013] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу суб'єкт, що представляє собою людину, страждає від немієлоїдних злоякісних новотворів, наприклад, раку молочної залози, і одержує цитотоксичну хіміотерапію. Наприклад, згідно з деякими варіантами реалізації винаходу пацієнт одержує щонайменше один мієлосупресивний протираковий лікарський засіб, асоційований з клінічно значимою частотою виникнення фебрильної нейтропенії. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу мієлосупресивні протиракові лікарські засоби являють собою доксорубіцин і доцетаксел. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу приблизно 50 2 2 мг/м доксорубіцину і приблизно 75 мг/м доцетакселу вводять послідовно шляхом внутрішньовенної інфузії в той самий день протягом щонайменше одного циклу лікування. 2 Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу приблизно 60 мг/м доксорубіцину і приблизно 2 75 мг/м доцетакселу вводяться послідовно шляхом внутрішньовенної інфузії в той самий день протягом щонайменше одного циклу лікування. [0014] Згідно з іншими варіантами реалізації способи включають спосіб зниження частоти виникнення інфекції, такий як інфекція, що проявляється фебрильною нейтропенією, у суб'єктів, що представляють собою людей. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу суб'єкт, що представляє собою людину, має немієлодні злоякісні новотвори і одержує щонайменше один мієлосупресивний протираковий лікарський засіб, асоційований з клінічно значимою частотою виникнення фебрильної нейтропенії. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини вводять суб'єктові в кількості, ефективній для лікування нейтропенії у зазначеного суб'єкта. [0015] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу у суб'єкта усувають нейтропенію або зменшують тривалість або виразність нейтропенії. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу усувають нейтропенію 3 або 4 ступеня у суб'єкта. В інших варіантах реалізації винаходу зменшують тривалість нейтропенії 3 або 4 ступеня. Наприклад, згідно з деякими варіантами реалізації винаходу тривалість нейтропенії 4 ступеня у суб'єкта становить менше 5 2 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 днів; згідно з деякими варіантами реалізації винаходу, тривалість нейтропенії 4 ступені у суб'єкта становить менше 4 днів, менше 3 днів або менше 2 днів. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу у суб'єкта усувають нейтропенію 3 ступеня, і/або тривалість нейтропенії 3 ступеня у суб'єкта знижується у порівнянні з суб'єктами, що не одержують лікування альбуміном людини-гранулоцитарним колонієстимулюючим фактором людини. [0016] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу введення рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини приводить до підвищення вмісту лейкоцитів ("WBC") або зниження втрати WBC у суб'єкта. Наприклад, у деяких варіантах реалізації винаходу збільшують кількість нейтрофілів у суб'єкта; пригнічують зниження вмісту нейтрофілів у суб'єкта, підвищують мінімальне значення абсолютного числа нейтрофілів ("ANC") у суб'єкта, поліпшують ACN у період відновлення у суб'єкта і/або знижують час відновлення ANC у суб'єкта. [0017] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 40 мкг/кг до приблизно 500 мкг/кг; згідно з іншими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 50 мкг/кг до приблизно 450 мкг/кг. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 50 мкг/кг, приблизно 100 мкг/кг, приблизно 150 мкг/кг, приблизно 200 мкг/кг або приблизно 250 мкг/кг. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 300 мкг/кг, приблизно 350 мкг/кг або приблизно 400 мкг/кг. Згідно з альтернативними варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 450 мкг/кг. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 20 до приблизно 100 мг. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 30 мг до приблизно 60 мг. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, становить від приблизно 30мг, приблизно 40 мг, приблизно 50 мг або приблизно 60 мг. [0018] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу рекомбінантний альбумін людинигранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини вводять після проведення хіміотерапії (наприклад, після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу). Наприклад, згідно з деякими варіантами реалізації винаходу рекомбінантний альбумін людинигранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини вводять під час хіміотерапії або вводиться протягом 2 годин, протягом 4 годин, протягом 6 годин, протягом 12 годин, протягом 18 годин, протягом 24 годин або протягом 48 годин від часу введення хіміотерапевтичного лікарського засобу. [0019] Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу рекомбінантний альбумін людинигранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини можливо вводять після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу. Наприклад, рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини можливо вводять у момент часу, обраний з групи, що включає: (a) щонайменше через 2 години після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; (b) щонайменше через 4 години після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; (c) щонайменше через 6 годин після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; (d) щонайменше через 12 годин після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; (e) щонайменше через 18 годин після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; (f) щонайменше через 24 години після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; (g) щонайменше через 48 годин після введення мієлосупресивного протиракового лікарського засобу; або (h) під час введення, або по суті одночасно з введенням, мієлосупресивного протиракового лікарського засобу. [0020] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу введення рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини під час або після проведення хіміотерапевтичного лікування викликає підвищення числа лейкоцитів і/або викликає підвищення ANC. Наприклад, згідно з деякими варіантами реалізації винаходу ANC і 3 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рівень лейкоцитів повертаються до норми до 10 дня після проведення хіміотерапії. Згідно з іншими варіантами реалізації ANC і рівень лейкоцитів повертаються до норми до 11 дня після проведення хіміотерапії, 12 дня після проведення хіміотерапії, 13 дня після проведення хіміотерапії, 14 дня після проведення хіміотерапії або 15 дня після проведення хіміотерапії. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу на 14 день після введення хіміотерапевтичного лікарського засобу підвищення ANC у пацієнтів, що одержують лікування рекомбінантним альбуміном людини-гранулоцитарним колонієстимулюючим фактором людини, менше, ніж підвищення ANC у пацієнтів, що одержують лікування еквівалентною дозою пегфілграстиму. [0021] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу введення рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини викликає підвищення рівня лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів або базофілів. Наприклад, згідно з деякими варіантами реалізації винаходу підвищується кількість лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів або базофілів у суб'єкта. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу подавляється зниження числа лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів або базофілів у суб'єкта. [0022] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу, що зокрема відносяться до способів лікування або запобігання нейтропенії, результат, що досягається, може бути обраний з групи, що включає: (a) усунення нейтропенії 4 ступеня у суб'єкта; (b) зниження виразності нейтропенії 4 ступеня у суб'єкта; (c) зниження тривалості гострої нейтропенії у суб'єкта; (d) усунення нейтропенії 3 ступеня у суб'єкта; (e) зниження тривалості нейтропенії 3 ступеня у суб'єкта; або (f) будь-яку комбінацію зазначених результатів. [0023] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу, зокрема, що відносяться до способів лікування або запобігання нейтропенії, введення рекомбінантного альбуміну людинигранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини викликає підвищення вмісту лейкоцитів крові. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу, зокрема, що відносяться до способів лікування або запобігання нейтропенії, результат, що досягається, вибирають з групи, що включає (a) підвищення кількості нейтрофілів у суб'єкта; (b) пригнічення зниження вмісту нейтрофілів у суб'єкта; (c) підвищення мінімального значення абсолютного числа нейтрофілів (ANC) у суб'єкта; (d) поліпшення відновлення ANC у суб'єкта; (e) зниження часу відновлення ANC у суб'єкта; або (f) будь-яку комбінацію зазначених результатів. [0024] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу кількість рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини, що вводиться суб'єктові, обрана з групи, що включає: (a) від приблизно 50 мкг/кг до приблизно 450 мкг/кг; (b) приблизно 50 мкг/кг; (c) приблизно 150 мкг/кг; (d) приблизно 300 мкг/кг; (e) приблизно 450 мкг/кг; (f) від приблизно 30 мг до приблизно 60 мг; (g) приблизно 30 мг; (h) приблизно 40 мг; (i) приблизно 50 мг; (j) приблизно 60 мг; або (k) будь-яку комбінацію зазначених кількостей. [0025] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу нейтропенія, піддана лікуванню або запобіганню, обрана з групи, що включає первинну нейтропенію, гостру нейтропенію, важку хронічну нейтропенію (ВХН), важку вроджену нейтропенію (синдром Костманна), важкий генетично детермінований агранулоцитоз немовлят, доброякісну нейтропенію, циклічну нейтропенію, хронічну ідіопатичну нейтропенію, вторинну нейтропенію, асоційовану з синдромом нейтропенію та імуно-опосередковану нейтропенію. Крім того нейтропенія може бути викликана або пов'язана, наприклад, з опроміненням, алкоголізмом, лікарськими засобами, алергійними захворюваннями, гіпопластичною анемією, аутоімунним захворюванням, T-γ лімфопроліферативним захворюванням (T-γ ЛПЗ), мієлодисплазією, мієлофіброзом, дисгаммаглобулінемією, нічною пароксизмальною гемоглобінурією, раком, дефіцитом вітаміну B12, дефіцитом фолатів, вірусною інфекцією, бактеріальною інфекцією, ураженням селезінки, гемодіалізом або трансплантацією, лейкемією, мієломою, лімфомою, метастатичними солідними пухлинами, які інфільтрують і заміщають кістковий мозок, токсинами, недостатністю кісткового мозку, синдромом Швахмана-Даймонда, хрящо-волосяною гіпоплазією, вродженим дискератозом, хворобою нагромадження глікогену IB типу, спленомегалією будь-якої етіології, внутрішніми дефектами мієлоїдних клітин або їх попередників. [0026] Згідно з варіантами реалізації винаходу у суб'єкта, що представляє собою людину, що має немієлоїдні злоякісні новотвори, немієлоїдний злоякісний новотвір може являти собою рак молочної залози. [0027] Згідно з варіантами реалізації винаходу мієлосупресивні протиракові лікарські засоби, 2 що вводяться, можуть являти собою доксорубіцин і доцетаксел. Наприклад, приблизно 50 мг/м 2 доксорубіцину і приблизно 75 мг/м доцетакселу можуть вводитися послідовно шляхом внутрішньовенної інфузії в той самий день протягом щонайменше одного циклу лікування. 2 2 Альтернативно, приблизно 60 мг/м доксорубіцину і приблизно 75 мг/м доцетакселу можуть 4 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вводитися послідовно шляхом внутрішньовенної інфузії в той самий день протягом щонайменше одного циклу лікування. [0028] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу після проведення лікування ANC і рівень лейкоцитів повертаються до норми за період часу, обраний з групи, що включає наступні періоди: (a) через 10 днів після проведення хіміотерапії; (b) через 11 днів після проведення хіміотерапії; (c) через 12 днів після проведення хіміотерапії; (d) через 13 днів після проведення хіміотерапії: (e) через 14 днів після проведення хіміотерапії; або (f) через 15 днів після проведення хіміотерапії. Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу на 14 день після введення хіміотерапевтичного засобу підвищення ANC у пацієнтів, що одержують лікування рекомбінантним альбуміном людини-гранулоцитарним колонієстимулюючим фактором людини, менше, ніж підвищення ANC у пацієнтів, що одержують лікування еквівалентною дозою пегфілграстиму. [0029] Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу введення рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини викликає підвищення рівня лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів, базофілів, або будь-якої комбінації зазначених. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу у суб'єкта підвищується рівень лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів, базофілів або будь-якої комбінації зазначених. Згідно з іншими варіантами реалізації винаходу зниження рівня лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів, або базофілів подавляється у суб'єкта. [0030] Наведений вище загальний опис винаходу і наступний короткий опис фігур, а також докладний опис винаходу, наведені як приклад і пояснення та призначені для більш детального роз'яснення запропонованого винаходу. Інші об'єкти, переваги і нові ознаки будуть очевидні фахівцям у даній галузі техніки з наступного докладного опису цього винаходу. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ [0031] Фіг. 1A-1C: На Фіг. 1A показані послідовність нуклеїнових кислот і послідовність амінокислот гібридного білка рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора ("rHA-G-CSF"), що має назву "Нейгранін™" ("NEUG"); на Фіг. 1B показана послідовність амінокислот G-CSF людини; на Фіг. 1C показана послідовність амінокислот сироваткового альбуміну людину. [0032] На Фіг. 2 представлений графік, що описує абсолютне число нейтрофілів ("ANC") у суб'єктів в I Фазі. Суб'єкти одержували 300 мкг/кг NEUG (n=19), 450 мкг/кг NEUG (n=20) або 6 мг пегфілграстиму (Neulasta®) (n=9) в 1 Циклі після проведення хіміотерапії згідно з дослідженням. [0033] На Фіг. 3 представлений графік, що представляє фармакокінетичні властивості NEUG в I Фазі дослідження у суб'єктів, що представляють собою людей. Концентрацію в сироватці NEUG, що вводиться підшкірно в зазначених дозах (450 мкг/кг, 300 мкг/кг або 150 мкг/кг), вимірювали у суб'єктів, що страждають раком молочної залози, під час відсутності хіміотерапії. Квадрати: 450 мкг/кг, 0 Цикл; трикутники: 300 мкг/кг, 0 Цикл; кружки: 150 мкг/кг, 0 Цикл. [0034] На Фіг. 4 представлений графік, що представляє фармакокінетичні/фармакодинамічні властивості ("PK/PD") NEUG в 1 Циклі хіміотерапії (дослідження I Фази). Пацієнти одержували 450 мкг/кг NEUG через один день після введення доксорубіцину/доцетакселу в 1 Циклі. ANC позначене незафарбованими ромбами; концентрація NEUG позначена зафарбованими квадратами. Граничні значення для поділу нейтропенії 3 і 4 ступеня показані штриховими лініями. Нижня межа кількісного визначення ("LLOQ") для NEUG показана точковою лінією (доза 6 нг/мл). [0035] На Фіг. 5 представлений графік, що показує криву ANC для пацієнтів, які одержували або 30 мг NEUG, або 6 мг пегфілграстиму (Нейласти®) через один день після початку 1 Циклу хіміотерапії (дослідження II Фази). Граничні значення для поділу нейтропенії 3 і 4 ступеня показані штриховими лініями. [0036] На Фіг. 6 показані цикли хіміотерапії для досліджень I Фази. [0037] На Фіг. 7A і 7B представлені графіки, що показують ANC і рівень лейкоцитів крові ("WBC") для суб'єктів у дослідженні I Фази. [0038] На Фіг. 8 представлений графік, що демонструє проліферацію клітин NSF-60 у присутності NEUG (альбуграніну) або Нейпогену®. [0039] На Фіг. 9 представлений графік, що демонструє проліферацію клітин NSF-60 у присутності NEUG або нейласти. + [0040] На Фіг. 10 представлений графік, що демонструє число нейтрофілів (Gr, 1 ) у периферичній крові у мишей BDF-1 після однократного SC введення NEUG (альбуграніну) і + нейпогену (залежно від часу). Загальне число Gr, 1 клітин виражається як середнє групи +/стандартна помилка середнього (SEM). 5 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0041] На Фіг. 11 представлений графік, що демонструє вміст гематопоетичних клітин+ попередників (c-kit ) у периферичній крові після однократного підшкірного (SC) введення NEUG + (альбуграніну) і нейпогену (залежно від часу). Загальне число c-kit клітин виражається як середнє групи +/- SEM (стандартна помилка середнього). + [0042] На Фіг. 12 A і 12 B представлені графіки, що демонструють вміст гранулоцитів (Gr, 1 ) периферичної крові після однократного підшкірного ("SC") введення NEUG (альбуграніну) або нейласти (Neulasta®) мишам BDF-1. На Фіг. 12A показана залежність відповіді від часу після введення однократної дози нейласти або NEUG, і на Фіг. 12B показана відносна активність NEUG або нейласти. [0043] Фіг. 13 являє собою таблицю, у якій наведена композиція лікарського продукту NEUG, використовуваного в I Фазі. [0044] Фіг. 14 являє собою таблицю, у якій наведена композиція лікарського продукту NEUG, що використовується в II Фазі. [0045] На Фіг. 15 представлений графік, що демонструє вміст гематопоетичних клітин+ попередників (c-kit ) у периферичній крові після однократного підшкірного введення NEUG + (альбуграніну) або Нейласти® (залежно від часу). Загальне число c-kit клітин виражене як середнє і стандартна помилка середнього, розрахована для кожної групи. Відмінності між лікувальними групами аналізували за допомогою t-критерію Стьюдента із залежною дисперсією. [0046] На Фіг. 16 представлений графік, що демонструє число нейтрофілів периферичної + крові (Gr, 1 ) після однократного підшкірного введення NEUG (альбуграніну) або нейласти через 1 день після внутрішньочеревинного (IP) введення 5-фторурацилу (5-FU) у дозі 150 мкг/кг. + Загальне число GR, 1 клітин, підраховуваних щодня, виражається як середнє і стандартна помилка середнього, розрахована для кожної групи. Відмінності серед лікувальних груп оцінювали за допомогою двовибіркового t-критерію Стьюдента з неоднаковою дисперсією. Лікування будь-яким агентом при всіх дозах приводило до статистично значимого підвищення вмісту нейтрофілів у порівнянні з контролем плацебо. [0047] На Фіг. 17 представлений графік, що демонструє ефект NEUG (альбуграніну) на відносне число нейтрофілів у периферичній крові. Відносне число нейтрофілів на кожний день дослідження представлене як середнє групи +/- SEM. Дані на 8 і 9 день для дози NEUG 100 мкг/кг, Q7, представлені як дані для 9 і 10 дня, відповідно, для можливості порівняння з іншими групами. Контролем був фізіологічний розчин (плацебо), що вводиться SC кожні 4 дні  4, або Нейпоген®, що вводиться SC щодня  14. Період проведення лікування розглядається як період з 1 по 14 день, і період відновлення - з 15 по 28 день. [0048] На Фіг. 18 представлений графік, що показує порівняння багаторазових доз NEUG (альбуграніну) при підшкірному (SC) введенні, NEUG при внутрішньовенному (IV) введенні або Нейласти® при підшкірному (SC) введенні на мобілізацію нейтрофілів у мавп. Кількість нейтрофілів (тисяч клітин/мкл) на кожний день дослідження до 22 дня представлене як середнє групи +/- SEM. Стрілки позначають введення дози. NEUG вводили підшкірно, SC, (n=6) або внутрішньовенно, IV, (n=6) у концентрації 1,0 мг/кг/доза, і нейласту вводили підшкірно, SC, (n=6) у концентрації 0,22 мг/кг/доза (доза, еквімолярна 1,0 мг/кг NEUG). Контроль плацебо для NEUG вводили підшкірно, SC, (n=2). [0049] Фіг. 19A і 19B являють собою таблиці, що показують сумарні дані досліджень фармакокінетичних властивостей in vivo. [0050] Фіг. 20 являє собою таблицю, що показує сумарні дані доклінічних досліджень in vivo, які забезпечують дані по безпеці. [0051] Фіг. 21 являє собою схему типового процесу ферментації і очищення NEUG. [0052] Фіг. 22 являє собою графік, що показує медіанне абсолютне число нейтрофілів (ANC) для суб'єктів в I Фазі, Частині A (0 Цикл, або до проведення хіміотерапії) від початку лікування до 14 дня. На 4 день криві (зверху вниз) відповідають дозам: 300 мкг/кг, 450 мкг/кг, 150 мкг/кг і 50 мкг/кг. [0053] Фіг. 23A і 23 B показують площу під кривою (AUC) ANC, побудованою на основі значень ANC для кожного суб'єкта, що одержує лікування в I Фазі, Частині B, отриманих на 0 15 день. Фігура 23A являє собою графік; дані, представлені на Фігурі 23A підсумовано в таблиці 23B. [0054] На Фіг. 24 представлений графік, що показує площу під кривою (AUC) ANC, побудованою на основі значень ANC для суб'єктів, що одержують лікування в II Фазі, отриманих на 0-15 день 1 Циклу (групи, що одержують фіксовані дози). Для всіх суб'єктів в II Фазі розраховували AUCANC (0-15 день). Діапазон доз для пацієнтів, що одержують лікування нейграніном, становив від 0,3 до 1 мг/кг (розраховано на основі дози, діленої на вихідну масу). Розрахований з урахуванням маси тіла діапазон доз ділили на квартили і наноcили на графік 6 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відносно AUCANC (ліва панель). Для всіх суб'єктів, що одержують лікування пегфілграстимом (N=112), 30 мг (N=10), 40 мг (N=105) або 50 мг (N=105) нейграніну, також розраховували і порівнювали AUCANC. Дані показані як середнє ± SEM. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0055] Згідно з цим винаходом запропоновані композиції і способи лікування, попередження та полегшення станів і захворювань, що характеризуються зниженим вмістом лейкоцитів. Способи і композиції, запропоновані в цьому описі, включають гібридний поліпептид, утворений білком сироваткового альбуміну людину ("HSA") і гранулоцитарним колонієстимулюючим фактором людини ("G-CSF"). Згідно з кращим варіантом реалізації цього винаходу довжина зазначеного гібридного поліпептиду становить приблизно 759 амінокислот; 1-585 амінокислоти зазначеного гібридного білка відповідають амінокислотам зрілою форми HSA і 586-759 амінокислоти зазначеного гібридного білка відповідають амінокислотам зрілою форми G-CSF людини. Амінокислотна послідовність гібридного білка представлена на Фіг. 1. [0056] Цей винахід також включає гібридні білки, що містять варіанти або фрагменти G-CSF, і гібридні білки, що містять альбумін або його фрагменти або варіанти. Цей винахід також включає полінуклеотиди, терапевтичні гібридні білки альбуміну, що кодують, згідно з цим винаходом, терапевтичні гібридні білки альбуміну, композиції, фармацевтичні композиції, склади і набори. Клітини-хазяї, трансформовані полінуклеотидами, що кодують терапевтичні гібридні білки альбуміну, також включені в цей винахід, як і способи одержання гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом з використанням зазначених полінуклеотидов і/або клітинхазяїв. [0057] Відповідно до одного варіанту реалізації винаходу гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом має тривалий строк зберігання. [0058] Згідно з другим варіантом реалізації винаходу гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом більш стабільний, ніж відповідна негібридна молекула G-CSF. [0059] Цей винахід також включає трансгенні організми, модифіковані таким чином, що вони містять молекули нуклеїнової кислоти згідно з цим винаходом, краще модифіковані таким чином, що вони експресують гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом. [0060] У цілому, цей винахід відноситься до полінуклеотидів, що кодують гібридні білки альбуміну; гібридних білків альбуміну і способів лікування, попередження або полегшення захворювань або розладів із застосуванням гібридних білків альбуміну або полінуклеотидів, що кодують гібридні білки альбуміну. У цьому описі термін "гібридний білок альбуміну" відноситься до білка, утвореного шляхом злиття щонайменше однієї молекули альбуміну (або її фрагмента або варіанта) зі щонайменше однією молекулою G-CSF (або її фрагментом або варіантом). Гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом містить щонайменше фрагмент або варіант G-CSF і щонайменше фрагмент або варіант сироваткового альбуміну людини, які з'єднано один з одним шляхом генетичного злиття (тобто гібридний білок альбуміну одержують шляхом трансляції нуклеїнової кислоти, у якій полінуклеотид, що кодує весь або частину G-CSF, з'єднують у рамці з полінуклеотидом, що кодує увесь або частину альбуміну). G-CSF і білок альбумін як частина гібридного білка альбуміну можуть називатися "частиною", "областю" або "фрагментом" гібридного білка альбуміну (наприклад, "G-CSF-частина білка" або "альбумінова"). У найкращому варіанті реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом містить щонайменше одну молекулу G-CSF або її фрагмент, або варіант (включаючи, але не обмежуючись нею, зрілу форму білка G-CSF) і щонайменше одну молекулу альбуміну або її фрагмент, або варіант (включаючи зрілу форму альбуміну, але не обмежуючись нею). [0061] Відповідно до іншого кращого варіанту реалізації винаходу гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом процесується клітиною-хазяїном і секретується в навколишнє культурне середовище. Процесінг гібридного білка альбуміну, що утворюється, який відбувається в секреторних шляхах хазяїна, що використовується для експресії, може включати, але не обмежується ними, розпад сигнального пептиду, утворення дисульфідних зв'язків, відповідний фолдінг, додавання і процесінг вуглеводів (наприклад, N- і О-зв'язане глікозилювання), конкретне протеолітичне розщеплення, і складання з утворенням мультимерних білків. Гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом краще перебуває в процесованій формі. У найкращому варіанті реалізації термін "процесована форма гібридного білка альбуміну" відноситься до гібридного білкового продукту альбуміну, який піддався відщіпленню N-кінцевого сигнального пептиду, що у цьому описі називається також "зрілим гібридним білком альбуміну". [0062] В одному з варіантів реалізації згідно з цим винаходом запропонований полінуклеотид, що кодує гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з G-CSF і білка сироваткового альбуміну. В іншому варіанті реалізації згідно з цим 7 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з білка G-CSF і білка сироваткового альбуміну. В інших варіантах реалізації згідно з цим винаходом запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента білка G-CSF і білка сироваткового альбуміну. В інших варіантах реалізації згідно з цим винаходом запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з біологічно активного і/або терапевтично активного варіанта білка G-CSF і білка сироваткового альбуміну. У кращих варіантах реалізації компонент, що представляє собою білок сироваткового альбуміну, гібридного білка альбуміну являє собою зрілу частину сироваткового альбуміну. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують дані гібридні білки альбуміну. [0063] В інших варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з білка G-CSF і біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента сироваткового альбуміну. В інших варіантах реалізації згідно з цим винаходом запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з білка G-CSF і біологічно активного і/або терапевтично активного варіанта сироваткового альбуміну. У кращих варіантах реалізації частина білка GCSF гібридного білка альбуміну являє собою зрілу частину білка G-CSF. В іншому кращому варіанті реалізації частина білка G-CSF гібридного білка альбуміну являє собою розчинний позаклітинний домен білка G-CSF. В альтернативному варіанті реалізації частина білка G-CSF гібридного білка альбуміну являє собою активну форму білка G-CSF. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують дані гібридні білки альбуміну. [0064] В інших варіантах реалізації згідно з цим винаходом запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається з біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента або варіанта білка G-CSF і біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента або варіанта сироваткового альбуміну. У кращих варіантах реалізації згідно з цим винаходом запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або, як альтернатива, що складається зі зрілою частини білка G-CSF і зрілою частини сироваткового альбуміну. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують дані гібридні білки альбуміну. I. Визначення [0065] У цьому описі термін "полінуклеотид" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеотидів, яка кодує гібридний білок, що містить або як альтернатива, що складається зі щонайменше однієї молекули альбуміну (або її фрагмента або варіанта), з'єднаної в рамці зі щонайменше однією молекулою гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора (G-CSF) (або її фрагментом або варіантом). [0066] У цьому описі термін "гібридна конструкція альбуміну" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що містить або, як альтернатива, що складається з полінуклеотида, який кодує щонайменше одну молекулу альбуміну (або її фрагмент або варіант), з'єднаного в рамці зі щонайменше одним полінуклеотидом, що кодує щонайменше одну молекулу G-CSF (або її фрагмент або варіант); і, що додатково містить, наприклад, один або більше наступних елементів: (1) функціональний вектор (включаючи, але не обмежуючись ними, човниковий вектор, вектор експресії, інтеграційний вектор і/або систему реплікації), що саморепліціюється (2) область ініціації транскрипції (наприклад, промоторна область, така як, наприклад, регульований або індукований промотор, конститутивний промотор), (3) область термінації транскрипції, (4) лідерну послідовність і (5) маркер, що селектується. Полінуклеотид, що кодує G-CSF і білок альбумін як частина гібридної конструкції альбуміну, кожний може називатися "частиною", "областю" або "фрагментом" гібридної конструкції альбуміну. [0067] Поліпептид G-CSF, що проявляє "терапевтичну активність", або білок G-CSF, який є "терапевтично активним", означає поліпептид G-CSF, що має одну або більше видів відомої біологічної і/або терапевтичної активності, пов'язаної з білком G-CSF. Як не обмежуючий приклад, "терапевтичний білок G-CSF" являє собою білок G-CSF, що придатний для лікування, попередження або полегшення захворювання, стану або розладу. Як не обмежуючий приклад, "терапевтичний білок G-CSF" може являти собою білок, який специфічно зв'язується з конкретним типом клітин (нормальним (наприклад, лімфоцити) або аномальним (наприклад, ракові клітини)), і, отже, може бути використаний для спрямованого специфічного впливу сполукою (лікарський засіб або цитотоксичний агент) на даний тип клітин. II. Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор [0068] Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF) являє собою гематопоетичний фактор росту, що стимулює вироблення нейтрофілів. Введення G-CSF 8 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приводить до швидкої індукції нейтрофільного лейкоцитозу, якщо є доступні для стимуляції клітини-попередники. Іншою важливою активністю G-CSF in vivo є стимуляція мобілізації гематопоетичних клітин-попередників у периферичній крові (Duhrsen et al., 1988; Molineux et al., 1999; Roberts et al., 1994). Даний ефект торкається не тільки лінії диференціювання нейтрофілів, але поширюється і на інші попередники однієї лінії диференціювання та декількох ліній диференціювання, і плюрипотентні гематопоетичні стовбурні клітини (Molineux et al., 1999). G-CSF також підсилює клітинні явища, які є частиною механізму захисту від інфекцій, шляхом праймування нейтрофілів, тим самим підвищуючи як їх фагоцитарну, так і антибактеріальну активність у відношенні опсонізованого золотавого стафілокока. G-CSF також індукує хемотаксис нейтрофілів і моноцитів, і адгезію нейтрофілів (Yuo et al., 1989; Wang et al., 1988). [0069] У цей час рекомбінантні продукти G-CSF схвалені для ряду клінічних показань для стимуляції проліферації і диференціювання нейтрофілів. У клінічних дослідженнях філграстим (рекомбінантний метіоніл G-CSF людини; Нейпоген®, Амген (Amgen), Thousand Oaks, CA) збільшував число периферичних нейтрофілів і тим самим знижував тривалість нейтропенії після мієлосупресивної хіміотерапії. Рекомбінантний G-CSF (філграстим) вводять щодня шляхом підшкірної (SC) ін'єкції. [0070] Інша рекомбінантна форма G-CSF являє собою пегфілграстим, кон'югований з поліетиленгліколем, rG-CSF (Нейласту®), який, як встановлено, є безпечним і ефективним при застосуванні як альтернатива щоденної терапії rG-CSF при введенні раз у цикл для зменшення частоти виникнення фебрильної нейтропенії у пацієнтів, що одержують мієлосупресивні протиракові препарати (Holmes, O'Shaughnessy et al., 2002; Green et al., 2003; Neulasta® Smpc 2007). [0071] Первинна профілактика G-CSF рекомендується для запобігання фебрильної нейтропенії у пацієнтів, які відносяться до групи підвищеного ризику розвитку фебрильної нейтропенії на підставі віку, історії хвороби, характеристик захворювання і мієлотоксичності схеми хіміотерапевтичного лікування. Американське суспільство клінічної онкології і Європейська організація по дослідженню й лікуванню раку рекомендують застосування G-CSF у випадках, коли ризик розвитку фебрильної нейтропенії становить приблизно 20 %. Національна мережа багатопрофільних онкологічних установ США рекомендує факультативне призначення профілактики G-CSF у випадках, коли ризик розвитку фебрильної нейтропенії становить від 10 % до 20 %, і обов'язкове призначення профілактики G-CSF у випадках, коли ризик розвитку фебрильної нейтропенії становить щонайменше 20 %. (Smith et al., 2006, Vogel et al., 2005, Timmer-Bonte et al., 2006, NCCN Guidelines). [0072] Профілактика колонієстимулюючими факторами рекомендується для полегшення токсичності певних схем хіміотерапевтичного лікування. Однак висока вартість даних способів лікування є істотною проблемою в США і, особливо, у деяких частинах Європи, яка може приводити до недостатнього використання профілактичного лікування G-CSF і може також обмежувати можливість відбору пацієнта для проведення схеми хіміотерапевтичного лікування інтенсивними дозами (Timmer-Bonte et al., 2006; Adams et al., 2006, NCCN Guidelines). [0073] Білок G-CSF може кодуватися полінуклеотидною послідовністю дикого типу (наприклад, або повнорозмірною, або зрілою), або, у деяких прикладах, послідовність може являти собою варіант полінуклеотидної послідовності дикого типу (наприклад, полінуклеотид, який кодує білок G-CSF дикого типу, причому послідовність ДНК полінуклеотиду оптимізована, наприклад, для експресії в певних видах; або полінуклеотид, який кодує варіант білка G-CSF дикого типу (тобто, сайтспрямований мутант; алельний варіант)). III. Сироватковий альбумін людини [0074] Сироватковий альбумін людини (HSA або HA) являє собою білок, що найчастіше зустрічається в природі, крові в системі кровообігу людини, рівень якого оцінюється як приблизно 40 грам альбуміну/літр і який зберігається в кровообігу протягом більше 20 днів. Альбумін являє собою білок-носій з мінімальною активністю при фізіологічних концентраціях. Навіть незважаючи на те, що в HSA відсутня ферментативна або імунологічна функція, він широко розповсюджений in vivo, і відомо, що він є носієм для різних речовин у крові (наприклад, горманів, жирних кислот, незв'язаного білірубіну і т.д. (Yeh et al., 1992)). Як HSA, так і рекомбінантний HA (rHA) мають однаково довгий циркулюючий час напівжиття у людей. [0075] Дослідження показало, що терапевтичні білки, генетично гібридизовані з альбуміном людини, можуть набувати властивість часу напівжиття альбуміну в циркулюючій крові (Syed et al., 1997). Наприклад, у кроликів час напівжиття CD4, гібридизованого з альбуміном, в 140 разів більше, ніж негібридного CD4 (Yeh et al., 1992). [0076] Сироватковий альбумін людини, білок, що складається з 585 амінокислот, у зрілій формі (як показано на Фіг. 1 патенту США 7592010) відповідальний за значну частину 9 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 осмотичного тиску сироватки і також виконує функцію носія ендогенних і екзогенних лігандів. У цей час HA для клінічного застосування одержують шляхом екстракції з крові людини. Одержання рекомбінантного HA (rHA) у мікроорганізмах описане в ЕР 330451 і EP 361991. IV. Фрагменти і варіанти поліпептидів та полінуклеотидів A. Фрагменти [0077] Цей винахід також відноситься до фрагментів білка G-CSF, білків альбуміну і/або гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом. Цей винахід також відноситься до полінуклеотидів, що кодують фрагменти білка G-CSF, білків альбуміну і/або гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом. Навіть якщо делеція однієї або більше амінокислот з N-кінця білка приведе до модифікації або втрати однієї або більше біологічних функцій білка G-CSF, білка альбуміну і/або гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, інші види терапевтичної активності і/або функціональної активності (наприклад, біологічна активність, здатність мультимеризуватися, здатність зв'язувати ліганд) можуть бути збережені. Наприклад, здатність поліпептидів з N-кінцевими делеціями індукувати і/або зв'язуватися з антитілами, які розпізнають повні або зрілі форми поліпептидів, у цілому звичайно зберігається при видаленні менше більшості залишків повного поліпептиду з N-кінця. Чи зберігає конкретний поліпептид, у якому відсутні N-кінцеві залишки повного поліпептиду, зазначені види імунологічної активності, можна легко визначити рутинними способами, зазначеними в цьому описі та іншими способами, відомими в даній галузі техніки. Можливо, мутантний білок з делетуванням великої кількості Nкінцевих амінокислотних залишків може зберігати деяку біологічну або імуногенну активність. У дійсності, пептиди, що складаються з лише шести амінокислотних залишків, часто можуть викликати імунну відповідь. [0078] Відповідно, фрагменти білка G-CSF, що відповідають частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, включають повнорозмірний білок, а також поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з амінокінця амінокислотної послідовності еталонного поліпептиду (тобто білка G-CSF або частини білка G-CSF гібридного білка альбуміну, що кодується полінуклеотидом або гібридною конструкцією альбуміну). Зокрема, Nкінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до q, де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість амінокислотних залишків в еталонному поліпептиді (наприклад, білку G-CSF або частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом), і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до q мінус 6. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0079] Крім того, фрагменти поліпептидів сироваткового альбуміну, що відповідають частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, включають повнорозмірний білок, а також поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з амінокінця амінокислотної послідовності еталонного поліпептиду (тобто сироваткового альбуміну або частини сироваткового альбуміну гібридного білка альбуміну). У кращих варіантах реалізації Nкінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до 585, де 585 являє собою ціле число, що показує загальну кількість амінокислотних залишків у зрілому сироватковому альбуміні людини, і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до 579. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. У додаткових варіантах реалізації N-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до 609, де 609 являє собою ціле число, що показує загальну кількість амінокислотних залишків у повнорозмірному сироватковому альбуміні людини, і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до 603. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0080] Більше того, фрагменти гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом включають повнорозмірний гібридний білок альбуміну, а також поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з амінокінця гібридного білка альбуміну, Зокрема, N-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до q, де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість амінокислотних залишків у гібридному білку альбуміну, і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до q мінус 6. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0081] Також, як зазначено вище, навіть якщо делеція однієї або більше амінокислот з Nкінця або С-кінця еталонного поліпептиду (наприклад, білка G-CSF; білка сироваткового альбуміну; або гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом) приведе до модифікації або втрати однієї або більше біологічних функцій білка, інші види функціональної активності (наприклад, біологічна активність, здатність мультимеризуватися, здатність зв'язувати ліганд) і/або терапевтичної активності як і раніше можуть зберігатися. Наприклад, здатність поліпептидів з С-кінцевими делеціями індукувати і/або зв'язуватися з антитілами, які 10 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розпізнають повні або зрілі форми поліпептиду, звичайно зберігається при видаленні менше більшості залишків повного або зрілого поліпептиду з С-кінця. Чи зберігає конкретний поліпептид, у якому відсутні N-кінцеві і/або С-кінцеві залишки еталонного поліпептиду, терапевтичну активність, можна легко визначити рутинними способами, зазначеними в цьому описі і/або іншими способами, відомими в даній галузі техніки. [0082] Згідно з цим винаходом також запропоновані поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з карбокси-кінця амінокислотної послідовності білка G-CSF, що відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 6 до q мінус 1, і де q являє собою ціле число, що показує загальна кількість амінокислотних залишків в еталонному поліпептиді (наприклад, у білку G-CSF або частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну, що кодується полінуклеотидом або гібридною конструкцією альбуміну). Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0083] Крім того, згідно з цим винаходом запропоновані поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з карбоксикінця амінокислотної послідовності білка альбуміну, що відповідає частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будьяке ціле число в діапазоні від 6 до 584, де 584 являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у зрілому сироватковому альбуміні людини мінус 1. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 6 до 608, де 608 являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у сироватковому альбуміні мінус 1. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0084] Більше того, згідно з цим винаходом запропоновані поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з карбоксикінця гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 6 до q мінус 1, і де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у гібридному білку альбуміну згідно з цим винаходом. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0085] Крім того, будь-які з вищеописаних N- або C-кінцевих делецій можуть бути скомбіновані з одержанням N- і C-кінцевого делетованого еталонного поліпептиду. Згідно з цим винаходом також запропоновані поліпептиди, що містять делецію однієї або більше амінокислот як з аміно-, так і з карбокси-кінця, які в цілому можуть бути описані як такі, що містять залишки від m до n еталонного поліпептиду (наприклад, білка G-CSF або частини білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, або сироваткового альбуміну, або частини білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, або гібридного білка альбуміну, або гібридного білка альбуміну, що кодується полінуклеотидом або гібридною конструкцією альбуміну згідно з цим винаходом), де n і m являють собою цілі числа, як описано вище. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0086] Ця заявка також відноситься до білків, що містять поліпептиди щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 % ідентичні еталонному поліпептиду G-CSF або еталонному поліпептиду альбуміну, зазначеному в цьому описі, або їх фрагментам. У кращих варіантах реалізації ця заявка відноситься до білків, що містять поліпептиди щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 % ідентичні еталонним поліпептидам, що містять амінокислотну послідовність, яка відповідає N- і C-кінцевим делеціям, описаним вище. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0087] Кращі поліпептидні фрагменти згідно з цим винаходом являють собою фрагменти, що містять або, як альтернатива, що складаються з амінокислотної послідовності, що проявляє терапевтичну активність і/або функціональну активність (наприклад, біологічну активність) поліпептидної послідовності білка G-CSF або білка сироваткового альбуміну, фрагментом якого є дана амінокислотна послідовність. [0088] Інші кращі поліпептидні фрагменти являють собою біологічно активні фрагменти. Біологічно активні фрагменти являють собою фрагменти, що проявляють активність, схожу, але не обов'язково ідентичну активності поліпептиду згідно з цим винаходом. Біологічна активність фрагментів може включати поліпшену бажану активність або знижену небажану активність. 11 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В. Варіанти [0089] Термін "варіант" відноситься до полінуклеотиду або нуклеїнової кислоти, що відрізняються від еталонної нуклеїнової кислоти або поліпептиду, але, які зберігають їхні основні властивості. Як правило, варіанти в цілому дуже схожі і у багатьох областях ідентичні еталонній нуклеїновій кислоті або поліпептиду. [0090] У цьому описі термін "варіант" відноситься до частини білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, частині альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом або гібридного білка згідно з цим винаходом, що відрізняються за послідовністю від білка G-CSF, білка альбуміну і/або гібридного білка альбуміну відповідно, але, які зберігають щонайменше одну їх функціональну і/або терапевтичну властивість, як описано в інших розділах цього опису або іншим способом відомо в даній галузі техніки. Як правило, варіанти в цілому дуже схожі і у багатьох областях ідентичні амінокислотній послідовності білка G-CSF, що відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну, білка альбуміну, що відповідає частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну, і/або гібридного білка альбуміну. Нуклеїнові кислоти, що кодують дані варіанти, також включені в цей винахід. [0091] Цей винахід також відноситься до білків, що містять або, як альтернатива, що складаються з амінокислотної послідовності, яка щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 %, приблизно 99 % або приблизно 100 % ідентична, наприклад, амінокислотній послідовності білка G-CSF, що відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, білків альбуміну, що відповідають частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, і/або гібридних білків альбуміну. Також запропоновані фрагменти даних поліпептидів. Додаткові поліпептиди, включені в цей винахід, являють собою поліпептиди, що кодуються полінуклеотидами, які гібридизуються з комплементом молекули нуклеїнової кислоти, що кодує гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом, у жорстких умовах гібридизації (наприклад, гібридизація з фільтр-зв'язаною ДНК в 6x суміші хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45 градусах Цельсія з наступним одним або більше промиваннями в 0,2  SSC, 0,1 % додецилсульфату натрію при приблизно 50-65 градусах Цельсія), у дуже жорстких умовах (наприклад, гібридизація з фільтр-зв'язаною ДНК в 6x суміші хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45 градусах Цельсія з наступним одним або більше промиваннями в 0,1  SSC, 0,2 % додецилсульфату натрію при приблизно 68 градусах Цельсія) або в інших жорстких умовах гібридизації, які відомі фахівцеві в даній галузі техніки (див., наприклад, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., і John Wiley & Sons Inc., New York, сторінки 6.3.1-6,3,6 і 2.10.3). Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0303] Під поліпептидом, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше, наприклад, 95 % - "ідентичну" запитуваній амінокислотній послідовності, мають на увазі, що зазначена амінокислотна послідовність розглянутого поліпептиду ідентична запитуваній послідовності за винятком того, що розглянута поліпептидна послідовність може містити до п'яти змін амінокислот на кожні 100 амінокислот запитуваної амінокислотної послідовності. Інакше кажучи, для одержання поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 % ідентичну запитуваній амінокислотній послідовності, до 5 % залишків амінокислот у розглянутій послідовності можуть бути вбудовані, вилучені або замінені на іншу амінокислоту. Дані зміни еталонної послідовності можуть відбуватися в аміно- і карбоксикінцевих положеннях еталонної амінокислотної послідовності або де-небудь між даними кінцевими положеннями упереміж або окремо серед залишків в еталонній послідовності, або в одній або більше суміжних груп у межах еталонної послідовності. [0304] З практичної точки зору, чи є який-небудь конкретний поліпептид щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 % ідентичним, наприклад, амінокислотній послідовності гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом або його фрагменту (наприклад, частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну або частині альбуміну гібридного білка альбуміну), може бути визначено традиційним методом з використанням відомих комп'ютерних програм. Кращий спосіб визначення найбільш повної відповідності між запитуваною послідовністю (послідовністю згідно з цим винаходом) і розглянутою послідовністю, також відомий як глобальне зіставлення послідовностей, може бути визначений з використанням комп'ютерної програми FASTDB на основі алгоритму Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). При зіставленні послідовностей запитувана і розглянута послідовності або обидві являють собою нуклеотидні 12 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, або обидві являють собою амінокислотні послідовності. Результат глобального зіставлення послідовностей виражають у відсотках ідентичності. Кращі параметри, що використовуються при вирівнюванні амінокислот FASTDB, являють собою: Матриця = PAM 0, ktuple=2, Штраф на розбіжність (Mismatch Penalty) = 1, Штраф на з'єднання (Joining Penalty) = 20, Довжина групи рандомізації (Randomization Group Length) = 0, Границя відсікання (Cutoff Score) = 1, Розмір вікна (Window Size) = довжина послідовності, Штраф на пробіл (Gap Penalty) = 5, Штраф на розмір пробілу (Gap Size Penalty) = 0,05, Розмір вікна (Window Size) = 500 або довжина розглянутої амінокислотної послідовності, залежно від того, яка коротше. [0305] Якщо розглянута послідовність коротше запитуваної послідовності внаслідок N- або С-кінцевих делецій, а не внутрішніх делецій, повинна бути проведена ручна корекція результатів. Причина полягає в тому, що програма FASTDB не враховує N- і С-кінцеві усікання розглянутої послідовності при розрахунках відсотка глобальної ідентичності. Для розглянутих послідовностей, усічених на N- і С-кінцях, стосовно запитуваної послідовності, відсоток ідентичності коректують шляхом підрахунку числа залишків запитуваної послідовності, які є N- і С-кінцевими розглянутої послідовності, які не збігаються/не зіставлені з відповідним розглянутим залишком, у вигляді відсотка від загальних основ запитуваної послідовності. Чи збігається/зіставлений залишок визначають за результатами зіставлення послідовностей FASTDB. Потім даний відсоток віднімають від відсотка ідентичності, розрахованого за допомогою програми FASTDB вище, з використанням зазначених параметрів, з одержанням кінцевої величини відсотка ідентичності. Саме дану кінцеву величину відсотка ідентичності використовують для цілей цього винаходу. Тільки залишки на N- і С-кінцях розглянутої послідовності, які не збігаються/зіставлені із запитуваною послідовністю, розглядають для цілей ручного коректування величини відсотка ідентичності. Тобто тільки запитувані положення залишків за межами самих далеких N- і С-кінцевих залишків розглянутої послідовності. [0306] Наприклад розглянуту послідовність, що складається з 90 залишків амінокислот, зіставляють із запитуваною послідовністю, що складається зі 100 залишків, з визначенням відсотка ідентичності. Делеція відбувається на N-кінці розглянутої послідовності і, отже, зіставлення FASTDB не показує збіг/зіставлення перших 10 залишків на N-кінці. 10 непарних залишків становлять 10 % послідовності (число залишків на N- і С-кінцях, що не збігаються/загальне число залишків у запитуваній послідовності), тому 10 % віднімають від величини відсотка ідентичності, розрахованого програмою FASTDB. Якби 90 залишків, що залишилися ідеально збігалися, кінцевий відсоток ідентичності склав би 90 %. В іншому прикладі розглянуту послідовність, що складається з 90 залишків, порівнюють із запитуваною послідовністю, що складається з 100 залишків. У цьому прикладі делеції являють собою внутрішні делеції, тому немає залишків на N- або С-кінцях розглянутої послідовності, які не збігаються/вирівняні із запитуваною. У цьому випадку відсоток ідентичності, розрахований за допомогою FASTDB, не коректують вручну. Знову вручну коректують тільки положення залишків за межами N- і С-кінцевих областей розглянутої послідовності, як показано при вирівнюванні FASTDB, які не збігаються/зіставлені із запитуваною послідовністю. Ніяких інших ручних коректувань для цілей цього винаходу виконувати не потрібно. [0092] Як правило, варіант буде мати щонайменше приблизно 75 % (в інших варіантах реалізації щонайменше приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 %) ідентичності послідовностей з довжиною нормального білка HA або G-CSF, який має ту ж довжину, що й зазначений варіант. Гомологію або ідентичність на рівні нуклеотидної або амінокислотної послідовності визначають шляхом аналізу BLAST (засіб пошуку основного локального зіставлення) із застосуванням алгоритму, що використовується програмами blastp, blastn, blastx, tblastn і tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) і Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993), повністю включений у цей опис за допомогою посилання), спеціально розробленими для пошуку подібності послідовностей. [0307] Підхід, що використовується програмою BLAST, полягає в тому, щоб спочатку розглянути схожі сегменти запитуваної послідовності та послідовності з бази даних, потім оцінити статистичну значимість усіх ідентифікованих збігів і, нарешті, підсумувати тільки ті збіги, які задовольняють попередньо обраному порогу значимості. Для розгляду основних питань по пошукові подібності баз даних послідовностей див. Altschul et al., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994)), повністю включений у цей опис за допомогою посилання. Пошукові параметри для гістограми, описів, вирівнювань, очікування (тобто поріг статистичної значимості для повідомлення про збіги щодо послідовностей з бази даних), відсікання, матриці та фільтру є параметрами за замовчуванням. Стандартна матриця замін, що використовується blastp, blastx, 13 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tblastn і tblastx являє собою матрицю BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992), повністю включений у цей опис за допомогою посилання). Для blastn матрицю замін встановлюють співвідношеннями від М (тобто "премія" для пари залишків, що збігаються) до N (тобто штраф на залишків, що не збігаються), при цьому значення за замовчуванням для M і N являють собою 5 і -4 відповідно. Чотири параметри blastn можуть бути скоректовані в такий спосіб: Q-10 (штраф на створення делеції (gap creation penalty)); R=10 (штраф на продовження делеції (gap extension penalty)); wink=1 (генерує "влучення" у слова в кожному положенні wink.sup.th протягом запиту); і gapw=16 (встановлює ширину вікна, у якому одержують зіставлення, що містять делеції). Еквівалентні установки параметрів Blastp являли собою Q=9; R=2; wink=1; і gapw=32. У порівнянні Bestfit послідовностей, доступному у версії пакета GCG 10,0, використовують параметри ДНК GAP=50 (штраф на створення делеції (gap creation penalty)) і LEN=3 (штраф на продовження делеції (gap extension penalty)) і еквівалентні установки при порівняннях білка являють собою GAP=8 і LEN=2. [0093] Варіанти полінуклеотидів згідно з цим винаходом можуть містити зміни в областях, що кодують, областях, що не кодують, або обох областях. Найкращими є варіанти полінуклеотидів, що містять зміни, які утворюють мовчазні заміни, додавання або делеції, але не змінюють властивості або види активності поліпептиду, що кодується. Кращі варіанти нуклеотидів, утворені мовчазними замінами через виродженості генетичного коду. Більше того, кращими також є варіанти поліпептидів, у яких менше 50, менше 40, менше 30, менше 20, менше 10 або 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 або 1-2 амінокислоти замінені, вилучені або додані в будьякій комбінації. Варіанти полінуклеотидів можуть бути отримані по різних причинах, наприклад, для оптимізації експресії кодоном для конкретного хазяїна (зміна кодонів у мРНК людини на кодони, кращі для бактеріального хазяїна, такого як дріжджі або E. coli). [0094] У кращому варіанті реалізації полінуклеотид згідно з цим винаходом, що кодує частину альбуміну гібридного білка альбуміну, оптимізують для експресії в клітинах дріжджів або ссавців. В іншому кращому варіанті реалізації полінуклеотид згідно з цим винаходом, що кодує частину білка G-CSF гібридного білка альбуміну, оптимізують для експресії в клітинах дріжджів або ссавців. У ще одному кращому варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом, оптимізують для експресії в клітинах дріжджів або ссавців. [0100] В альтернативному варіанті реалізації полінуклеотид з оптимізованими кодонами, що кодує частину білка G-CSF гібридного білка альбуміну, не гібридизується з полінуклеотидом дикого типу, що кодує білок G-CSF, у жорстких умовах гібридизації, як описано в цьому описі. В іншому варіанті реалізації полінуклеотид з оптимізованими кодонами, що кодує частину альбуміну гібридного білка альбуміну, не гібридизується з полінуклеотидом дикого типу, що кодує білок альбуміну, у жорстких умовах гібридизації, як описано в цьому описі. В іншому варіанті реалізації полінуклеотид з оптимізованими кодонами, що кодує гібридний білок альбуміну, не гібридизується з полінуклеотидом дикого типу, що кодує частину білка G-CSF або частину білка альбуміну, у жорстких умовах гібридизації, як описано в цьому описі. [0101] У додатковому варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує частину білка G-CSF гібридного білка альбуміну, не містить або, як альтернатива, не складається з послідовності даного білка G-CSF, що зустрічається в природі. В іншому варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує частину білка альбуміну гібридного білка альбуміну, не містить або, як альтернатива, не складається з послідовності білка альбуміну, що зустрічається в природі. В альтернативному варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує гібридний білок альбуміну, не містить або, як альтернатива, не складається з послідовності частини білка G-CSF, що зустрічається в природі, або частини білка альбуміну. [0102] З використанням відомих способів білкової інженерії та технології рекомбінантних ДНК можуть бути отримані варіанти для поліпшення або зміни характеристик поліпептидів згідно з цим винаходом. Наприклад, одна або більше амінокислот можуть бути вилучені з Nкінця або С-кінця поліпептиду згідно з цим винаходом по суті без втрати біологічної функції. [0103] У кращих варіантах реалізації варіанти згідно з цим винаходом містять консервативні заміни. Під терміном "консервативні заміни" мають на увазі заміни всередині груп, такі як заміна аліфатичних або гідрофобних амінокислот Ala, Val, Leu і Ile; заміна гідроксильних залишків Ser і Tar; заміна кислих залишків Asp і Glu; заміна амідних залишків Asn і Gln, заміна основних залишків Lys, Arg і His; заміна ароматичних залишків Phe, Tyr і Trp і заміна амінокислот малого розміру Ala, Ser, Thr, Met і Gly. [0104] Посібник з одержання фенотипово мовчазних замін амінокислот наведено, наприклад, в Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid 14 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990), у якому автори відзначають, що існує дві основні стратегії для дослідження "толерантності" амінокислотної послідовності до зміни. [0105] У першій стратегії використовується "толерантність" до замін амінокислот з боку природного добору в процесі еволюції. Шляхом порівняння амінокислотних послідовностей у різних видів, можуть бути ідентифіковані консервативні амінокислоти. Дані консервативні амінокислоти, імовірно, мають важливе значення для функції білка. На відміну від цього, положення амінокислот, де заміни були допущені природним добором, імовірно, не мають критичного значення для функції білка. Таким чином, положення, у яких допускається заміна амінокислот, можуть бути модифіковані, при цьому біологічна активність білка зберігається. [0106] У другій стратегії для введення змін амінокислот у конкретних положеннях клонованого гена для ідентифікації областей, що мають критичне значення для функції білка використовується генна інженерія. Наприклад, може бути використаний сайт-спрямований мутагенез або мутагенез, що сканує аланіном (введення одиничних мутацій аланіну в кожному залишку в молекулі). Див. Cunningham і Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Отримані мутантні молекули потім можуть бути протестовані на біологічну активність. [0107] Як стверджують автори, дані дві стратегії показали, що білки незвичайно "толерантні" до замін амінокислот. Автори також показують, які зміни амінокислот, імовірно, будуть дозволені в певних положеннях амінокислот у білку. Наприклад, для більшості схованих (у межах третинної структури білка) залишків амінокислот необхідні неполярні бічні ланцюги, тоді як деякі особливості поверхневих бічних ланцюгів, як правило, зберігаються. Більше того, припустимі консервативні заміни амінокислот включають заміну аліфатичних або гідрофобних амінокислот Ala, Val, Leu і Ile; заміну гідроксильних залишків Ser і Thr; заміну кислих залишків Asp і Glu; заміну амідних залишків Asn і Gln, заміну основних залишків Lys, Arg і His; заміну ароматичних залишків Phe, Tyr і Trp, і заміну амінокислот малого розміру Ala, Ser, Thr, Met і Gly. Крім консервативної заміни амінокислот, варіанти згідно з цим винаходом включають (i) поліпептиди, що містять заміни одного або більше неконсервативних залишків амінокислот, при цьому замінені амінокислотні залишки можуть бути або можуть не кодуватися генетичним кодом, або (ii) поліпептиди, що містять заміни одного або більше залишків амінокислот, що містять групу, яка заміняє, або (iii) поліпептиди, які були злиті або хімічно сполучені з іншою сполукою, такою як сполуки для збільшення стабільності і/або розчинності поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь), (iv) поліпептид, що містить додаткові амінокислоти, такий як, наприклад, пептид з гібридною областю Fc IgG. Передбачається, що зазначені варіантні поліпептиди перебувають у рамках компетенції фахівця в даній галузі техніки виходячи з ідей цього опису. [0108] Наприклад, варіанти поліпептидів, що містять заміни заряджених амінокислот на інші заряджені або нейтральні амінокислоти, можуть приводити до утворення білків з поліпшеними характеристиками, такими як знижена агрегація. Агрегація фармацевтичних складів одночасно знижує активність і підвищує кліренс внаслідок імуногенної активності агрегату. Див. Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993). [0109] У конкретних варіантах реалізації поліпептиди згідно з цим винаходом містять або, як альтернатива, складаються з фрагментів або варіантів амінокислотної послідовності гібридного білка альбуміну, амінокислотної послідовності білка G-CSF і/або сироваткового альбуміну людини, при цьому зазначені фрагменти або варіанти містять 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 і 50150 приєднань, замін і/або делецій залишків амінокислот у порівнянні з еталонною амінокислотною послідовністю. У кращих варіантах реалізації заміни амінокислот є консервативними. Нуклеїнові кислоти, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0110] Поліпептид згідно з цим винаходом може складатися з амінокислот, з'єднаних одна з одною пептидними зв'язками або модифікованими пептидними зв'язками, тобто пептидні ізостери, і можуть містити амінокислоти, відмінні від 20 амінокислот, що генетично кодуються. Поліпептиди можуть бути модифіковані або природними шляхами, такими як посттрансляційний процесінг, або відповідно до технологій хімічної модифікації, які добре відомі в даній галузі техніки. Зазначені модифікації добре описані в базових підручниках і в більш докладних монографіях, а також у численній дослідницькій літературі. Модифікації можуть відбуватися в будь-якому місці поліпептиду, включаючи пептидний кістяк, бічні ланцюги амінокислот і аміноабо карбоксикінці. Очевидно, що той самий тип модифікації може бути присутнім в однаковій або різній степені в декількох ділянках у даному поліпептиді. Крім того, конкретний поліпептид може містити багато типів модифікацій. Поліпептиди можуть бути розгалуженими, наприклад, у результаті убіквітинілювання і вони можуть бути циклічними з розгалуженням або без нього. Циклічні, розгалужені та розгалужені циклічні поліпептиди можуть бути продуктом 15 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 посттрансляційних природних процесів або можуть бути отримані синтетичними способами. Модифікації включають ацетилування, ацилювання, АДФ-рибозилювання, амідування, ковалентне приєднання флавіну, ковалентне приєднання фрагмента гема, ковалентне приєднання нуклеотиду або похідного нуклеотиду, ковалентне приєднання ліпіду або похідного ліпіду, ковалентне приєднання фосфатидилінозиту, зшивання, Циклізацію, утворення дисульфідних зв'язків, деметилювання, утворення ковалентних перехресних зв'язків, утворення цистеїну, утворення піроглутамату, формілювання, гамма-карбоксилювання, глікозилювання, утворення GPI-«якоря", гідроксилювання, йодування, метилювання, міристилювання, окиснення, пегілювання, протеолітичний процесінг, фосфорилювання, пренілювання, рацемізацію, селеноїлювання, сульфатуцію, опосередковуване транспортною РНК додавання амінокислот до білків, таке як аргінілювання та убіквітинілювання. (Див., наприклад, PROTEINS-STRUCTURE і MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman і Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:4862 (1992)). С. Функціональна активність [0111] Термін "поліпептид, що має функціональну активність" відноситься до поліпептиду, здатного проявляти один або більше видів відомої функціональної активності, асоційованої з повнорозмірним білком, про-білком і/або зрілою формою білка G-CSF. Зазначені види функціональної активності включають, але не обмежуються перерахованими: біологічну активність, антигенність [здатність зв'язуватися (або конкурувати з поліпептидом за зв'язування) з антитілом до поліпептиду], імуногенність (здатність викликати утворення антитіла, яке зв'язується з конкретнимполіпептидом згідно з цим винаходом), здатність утворювати мультимери з поліпептидами згідно з цим винаходом і здатність зв'язуватися з рецептором або лігандом поліпептиду. [0112] Термін "поліпептид, що має біологічну активність" відноситься до поліпептиду, що проявляє активність, близьку до, але не обов'язково ідентичну активності білка G-CSF згідно з цим винаходом, включаючи зрілі форми, яка вимірюється в конкретному біологічному аналізі із залежністю від доз або без неї. [0113] У кращих варіантах реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом має щонайменше однин вид біологічної і/або терапевтичної активності, пов'язаної з частиною білка G-CSF (або його фрагментом або варіантом), не гібридизованого з альбуміном. [0114] Гібридні білки альбуміну згідно з цим винаходом можуть бути досліджені на функціональну активність (наприклад, біологічну активність) з використанням тестів, відомих у даній галузі техніки, або їх рутинних модифікацій, а також тестів, зазначених у цьому описі. Крім того, фахівець у даній галузі техніки може рутинним способом досліджувати фрагменти білка GCSF, що відповідають частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну. Крім того, фахівець у даній галузі техніки може рутинним способом досліджувати фрагменти білка альбуміну, що відповідають частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну, на активність з використанням тестів, відомих у даній галузі техніки, і/або як описано в розділі Приклади нижче. [0115] Наприклад, в одному з варіантів реалізації, у якому аналізують здатність гібридного білка альбуміну зв'язувати або конкурувати з білком G-CSF за зв'язування з антитілом до поліпептиду G-CSF і/або антитілом до альбуміну, можуть бути використані різні імуноаналізи, відомі в даній галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: системи конкурентного і безконкурентного аналізу з використанням таких технологій, як радіоімуноаналізи, ІФА (твердофазний імуноферментний аналіз), імуноаналізи типу "сендвіч", імунорадіометричні аналізи, гель-дифузійні реакції осадження, імунодифузійні аналізи, імуноаналізи in situ (з використанням колоїдного золота, ферменту або радіоізотопних міток, наприклад), вестерн-блоттінг, реакції осадження, реакції аглютинації (наприклад, реакції аглютинації в гелі, реакції гемагглютинації), реакції зв'язування комплементу, імунофлуоресцентні аналізи, тести з білком білка А і дослідження методом імуноелектрофорезу і т.д. В одному з варіантів реалізації зв'язування антитіла виявляють шляхом детектування мітки на первинному антитілі. В іншому варіанті реалізації первинне антитіло виявляють шляхом детектування зв'язування вторинного антитіла або реагенту з первинним антитілом. В іншому варіанті реалізації вторинне антитіло мітять. У даній галузі техніки відомо багато способів детектування зв'язування в імуноаналізі і вони входять в обсяг цього винаходу. [0116] У кращому варіанті реалізації, у якому ідентифікують партнера по зв'язуванню (наприклад, рецептор або ліганд) білка G-CSF, можна аналізувати зв'язування з даним партнером по зв'язуванню за допомогою гібридного білка альбуміну, який містить даний білок G-CSF як частину білка G-CSF зазначеного гібриду, наприклад, спосіб, добре відомий у даній 16 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 галузі техніки, такими як, наприклад, відновлювальна і невідновлювальна гель-хроматографія, афінна хроматографія білків і афінний блоттінг. Див., у цілому, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). В іншому варіанті реалізації здатність фізіологічних корелятів гібридного білка альбуміну зв'язуватися з рецептором (рецепторами) поліпептиду G-CSF, що відповідає частині білка G-CSF зазначеного гібрида, можна рутинним способом аналізувати з використанням технологій, відомих у даній галузі техніки. [0117] В альтернативному варіанті реалізації, у якому оцінюють здатність гібридного білка альбуміну мультимеризуватися, можна аналізувати зв'язування з іншими компонентами мультимера, наприклад, методами, добре відомими у даній галузі техніки, такими як, наприклад, відновлювальна та невідновлювальна гель-хроматографія, афінна хроматографія білків і афінний блоттінг. Див., у цілому, Phizicky et al., вище. [0118] Імуноаналізи, які можуть бути використані для аналізу білкового зв'язування, перехресної реактивності, або ідентичності, включають, але не обмежуються перерахованими: системи конкурентного і безконкурентного аналізу з використанням технологій, таких як вестерн-блоттінг, радіоімуноаналізи, ІФА (твердофазний імуноферментний аналіз), імуноаналізи "сендвіч"-типу, реакції імуноосадження, реакції осадження, гель-дифузійні реакції осадження, імунодифузійні аналізи, реакції аглютинації, реакції зв'язування комплементу, імунорадіометричні аналізи, флуоресцентні імуноаналізи та аналізи білка А, та інші. Зазначені аналізи є рутинними і добре відомі в даній галузі техніки (див., наприклад, Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, повністю включений у цей опис за допомогою посилання). [0119] Антитіла, які зв'язують білок G-CSF, що відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну, також можуть бути описані або охарактеризовані в термінах їх афінності до зв'язування відносно даного білка або антигену, краще антигену, який вони специфічно зв'язують. Кращі значення афінності зв'язування включають значення з константою дисоціації -2 -2 -3 -3 -4 -4 або Kd менше 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M. Більш кращі значення -5 афінності зв'язування включають значення з константою дисоціації або Kd менше 5 × 10 M, -5 -6 -6 -7 -7 -8 -8 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M або 10 M. Ще більш кращі значення -9 афінності до зв'язування включають значення з константою дисоціації або Kd менше 5 × 10 M, -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 M, -14 -15 -15 10 M, 5 × 10 M або 10 M. Крім того, тести, зазначені в цьому описі або інші, відомі в даній галузі техніки, можна рутинно використовувати для вимірювання здатності гібридних білків альбуміну і їх фрагментів, варіантів і похідних, викликати біологічну активність і/або активність G-CSF (або in vitro, або in vivo), зв'язану або з частиною білка G-CSF і/або частиною альбуміну гібридного білка альбуміну. Інші способи відомі фахівцеві в даній галузі техніки і входять в обсяг цього винаходу. V. Гібридні білки G-CSF і HSA [0120] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини (rHA-G-CSF) являє собою аналог G-CSF. Приклади rHA-G-CSF описані в патенті США № 5665863 і в патенті США No. 7041478, обидва з яких включені в цю заявку за допомогою посилання. [0121] Інший приклад rHA-G-CSF являє собою Нейгранін™ ("NEUG"), розроблений компанією Teva Biopharmaceuticals USA LTD. NEUG являє собою гібридний поліпептид з молекулярною масою приблизно 85 кДа. NEUG являє собою одноланцюговий поліпептид з 759 амінокислот, де залишки 1-585 відповідають зрілій формі HSA, і залишки 586-759 відповідають зрілій формі G-CSF людини. Послідовність амінокислот гібридного білка NEUG показана на Фіг. 1. VI. Одержання гібридного білка [0122] Приклади способів синтетичних процесів виробництва rHA-G-CSF описані в заявці на патент США 11/929828, повний вміст якої включено в цей опис за допомогою посилання. У деяких варіантах реалізації NEUG одержують з використанням хазяйської системи на основі дріжджів (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), створеної методами генної інженерії для експресії гібридного білка NEUG. NEUG збирають з середовища дріжджової культури, що зброджується, і очищають з використанням методів, добре відомих у даній галузі техніки (наприклад, шляхом серії етапів хроматографії та фільтрації, таких як афінна хроматографія та іонообмінна хроматографія). [0123] В одному з необмежуючих прикладів гібридну конструкцію NEUG одержували в такий спосіб. Повнорозмірну кДНК альбуміну виділяли з бібліотеки кДНК людини в лабораторії Д-ра. F.E. Baralle в Оксфордському університеті, Великобританія. Даний клон відправляли в Delta Biotechnology Limited, Ноттінгем, Великобританія, у вигляді плазміди pat153ALB. Крім того, 17 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 модифікували пропептид HSA (RGVFRR), що складається з 6 амінокислот, для забезпечення більш ефективного процесінгу в дріжджах (RSLDKR). [0124] Плазміда для одержання NEUG, модифікований вектор експресії, заснований на pSAC35, заснована на 2-мкм плазміді, виявленій в Saccharomyces cerevisiae дикого типу. Вектор експресії на основі PSAC35 (див., наприклад, патенти EP 286424 B, патент США 5637504) містить ген LEU2 з Saccharomyces cerevisiae як маркера, що селектується, який доповнює дефіцит лейцину хазяїна S. cerevisiae для одержання. Дана плазміда для одержання також містить сильний дріжджовий промотор, PRB1, і послідовності плазміди pUC9, що забезпечують клонування і відтворення в E. coli. Крім того, зазначена плазміда усуває послідовності з pUC9, необхідні для відтворення в E. coli, відразу після трансформації в дріжджі. Це досягається шляхом фланкування мішеней (FRT), що розпізнають FLP, і експресії рекомбінази FLP дріжджів з плазміди після потрапляння в дріжджі. Таким чином, в організмі, що використовується для одержання NEUG, не присутня бактеріальна ДНК. Це підтверджене шляхом виділення і секвенування 2 мкм плазміди з дріжджів після одержання головного банку клітин. [0125] Як описано вище, плазміду для одержання NEUG, що називається CID1643 (pSAC35:HSA.GCSF(T31-P204)), одержували з вектора експресії на основі pSAC35. Область, що відповідає T31-P204 G-CSF людини, ампліфіціювали шляхом ПЦР при додаванні придатних 5' і 3' сайтів рестрикції із забезпеченням гладкого злиття з 3'-кінцем відкритої рамки зчитування HSA. [0126] Флакони із запалом NEUG використовували для одержання головного банку клітин сGMP в Human Genome Sciences, Inc., у Роквіллі, Меріленд. Тестування і дослідження основного банку клітин NEUG виконували в Charles River Laboratories (Малверн, Пенсільванія, США) і Lark Technologies (Х'юстон, Техас, США) згідно з керівництвом ICH Q5D (Виділення та характеристика клітинних субстратів, що використовуються для виробництва біотехнологічних/біологічних продуктів). [0127] Потім одержували робочий банк клітин сGMP, отриманий з основного банку клітин, і тестували його в Charles River Laboratories (Малверн, Пенсільванія, США). [0128] Усі компоненти середовищ, що застосовуються у виробництві банків ліній клітин NEUG, були синтетичними, біосинтетичними або рослинного походження. У ході одержання лінії клітин або банку клітин не використовували компоненти тваринного або людського походження. [0129] Банки клітин зберігають при температурі ніж 20 % ризиком). При використанні деяких схем хіміотерапії частота виникнення фебрильної нейтропенії під час відсутності лікування G-CSF становить приблизно 40 % (наприклад, схема хіміотерапії, що включає внутрішньовенне введення доксорубіцину та доцетакселу). Необмежуючі приклади різних ракових захворювань і схем лікування, пов'язаних з ризиком розвитку фебрильної нейтропенії, наведені нижче в Таблиці 1. Згідно з деякими варіантами реалізації винаходу гібридний білок HSA-G-CSF, показаний на Фіг. 1, вводиться пацієнтові для запобігання, лікування або полегшення нейтропенії, пов'язаної з введенням зазначених лікарських препаратів. Таблиця 1 Типові ракові захворювання і схеми лікування, пов'язані з розвитком фебрильної нейтропенії Рак Терапія MVAC (метотрексат, вінбластин, доксорубіцин, цисплатин) Рак сечового міхура (неоад'ювантна, ад'ювантна, протиметастатична) Доцетаксел + трастузумаб (протиметастатична або замісна) Щільнодозоватерапія AC-T (доксорубіцин, Циклофосфамід, паклітаксел) (ад'ювантна) Рак молочної залози AT (доксорубіцин, паклітаксел) (протиметастатична або замісна) AT (доксорубіцин, доцетаксел) (протиметастатична або замісна) TAC (доцетаксел, доксорубіцин, Циклофосфамід) (ад'ювантна) Рак стравоходу і Доцетаксел/цисплатин/фторурацил шлунку ICE (ізосфамід, карбоплатин, етопозид) (дифузійна B-крупноклітинна лімфома, периферичні T-клітинні лімфоми, терапія другої лінії, резервна терапія) RICE (ритуксимаб, ізосфамід, карбоплатин, етопозид) CHOP-14 (Циклофосфамід, доксорубіцин, вінкристин, преднізон) MINE (месна, ізосфамід, новантрон і етопозид) (дифузійна Bкрупноклітинна лімфома, периферичні T-клітинні лімфоми, терапія другої лінії, рефрактерна терапія) Неходжкінська DHAP (дексаметазон, цисплатин, цитарабін) (дифузійна B-крупноклітинна лімфома лімфома, периферичні T-клітинні лімфоми, терапія другої лінії) ESHAP (етопозид, метилпреднізолон, цисплатин, цитарабін) (дифузійна Bкрупноклітинна лімфома, периферична T-клітинна лімфома, рецидивуюче ракове захворювання, терапія другої лінії) BEACOPP (блеоміцин, етопозид, доксорубіцин, Циклофосфамід, вінкристин, прокарбазин, преднізон) ГіперCVAD + Ритуксимаб (Циклофосфамід, вінкристин, доксорубіцин, дексаметазон + ритуксимаб) (лімфома Беркітта) Комбінація, що включає дакарбазин (дакарбазин, цисплатин, вінбластин) (прогресуюче, метастазуюче або рецидивуюче ракове захворювання) Меланома Комбінація, що включає дакарбазин і IL-2, інтерферон-альфа (дакарбазин, цисплатин, вінбластин, IL-2, інтерферон-альфа) (прогресуюче, метастазуюче або рецидивуюче ракове захворювання) Мієлодиспластичний Децитабін синдром Топотекан Рак яєчників Паклітаксел Доцетаксел Рак селезінки Гемцитабін/доцетаксел MAID (месна, доксорубіцин, ізосфамід, дакарбазин) Саркома Доксорубіцин Дрібноклітинний рак Топотекан легенів 19 UA 105201 C2 Таблиця 1 Типові ракові захворювання і схеми лікування, пов'язані з розвитком фебрильної нейтропенії Рак Рак яєчок 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Терапія VeIP (вінбластин, ізосфамід, цисплатин) VIP (етопозид, ізосфамід, цисплатин) BEP (блеоміцин, етопозид, цисплатин) TIP (паклітаксел, ізосфамід, цисплатин) [0134] Схеми цитотоксичного лікування дрібноклітинного раку легенів, наприклад, цисплатин + етопозид, також як і CAE, теж пов'язані з розвитком фебрильної нейтропенії. [0135] Відомі різні види нейтропенії, і згідно з деякими варіантами реалізації винаходу гібридний білок HSA-G-CSF, показаний на Фіг. 1, застосовується для запобігання, лікування або полегшення одного або більше видів нейтропенії, включаючи (але не обмежуючись зазначеними) викликану хіміотерапією нейтропенію, первинну нейтропенію, гостру нейтропенію, важку хронічну нейтропенію (ВХН), важку вроджену нейтропенію (синдром Костманна), важкий генетично детермінований агранулоцитоз немовлят, доброякісну нейтропенію, Циклічну нейтропенію, хронічну ідіопатичну нейтропенію, вторинну нейтропенію, асоційовану з синдромом нейтропенію або імуно-опосередковану нейтропенію. VIII. Експериментальні приклади [0136] Наступні приклади наведені з метою ілюстрації цього винаходу. Однак слід розуміти, що цей винахід не обмежується конкретними умовами або деталями, описаними в наведених прикладах. Вміст усіх загальнодоступних документів, посилання на які наведені в цьому описі, включаючи (але не обмежуючись зазначеними) патенти США, включено в цей опис за допомогою посилання. [0137] У наступних необмежуючих прикладах Нейгранін™ ("NEUG") тестували на клітинних лініях, на мишах і мавпах, і також використовувався для запобігання, лікування і полегшення нейтропенії і/або лейкопенії, викликаної лікарською терапією (наприклад, хіміотерапією), у суб'єктів, що представляють собою людей, для лікування раку молочної залози. [0138] NEUG являє собою аналог G-CSF, у якого швидкість плазматичного кліренсу знижена завдяки злиттю активної сполуки G-CSF з сироватковим альбуміном людини. Отриманий у результаті повнорозмірний рекомбінантний білок зберігає фармакологічну активність G-CSF in vivo, тобто стимулює мобілізацію нейтрофілів і гематопоетичних стовбурних клітин з кісткового мозку в периферичний кровотік. Оцінювали активність зазначеного білка в мишей і мавп (див. Експериментальні приклади, нижче). Спостережуване підвищення рівня нейтрофілів і гематопоетичних клітин-попередників відбувалося швидко і зберігалося протягом декількох днів після однократного введення. Ефекти були дозозалежними, при цьому більш високим дозам відповідала більш інтенсивна і тривала відповідь на введення NEUG у порівнянні з відповіддю на більш низькі дози. Кліренс NEUG був повільніше, ніж кліренс Нейпогену® (філграстиму). Кінетика нейтрофілії крові після однократного і багаторазового введення NEUG була майже такою ж, як у тварин, що одержують лікування Нейластою® (пегфілграстимом). Тому що NEUG в 4,5 разів більше Нейласти® (пегфілграстиму) (по масі), для досягнення подібного ефекту in vivo може застосовуватися більша (по масі), але еквімолярна доза NEUG. У мавп еквімолярна доза NEUG виявляла еквівалентний пегфілграстиму ефект, а в мишей було показано, що доза NEUG, що перевищує в 1,5 рази дозу пегфілграстиму, приводила до досягнення еквівалентної AUCANC. У зазначених дослідженнях 1 мг Нейласти® (пегфілграстиму) був еквівалентним за ефектом 4,5-7,7 мг NEUG. При цьому максимальна доза, що не приводить до розвитку спостережуваних небажаних явищ ("NOAEL"), для NEUG у мавп становила більше 1 мг/кг/тиждень. Доза 1 мг/кг виявляла в ~12 разів більший вплив (Cmax і AUC) у мавп, ніж у людей, що одержують 0,45 мг/кг NEUG. Таким чином, NOAEL, показана для мавп, перевищує діапазон доз, що використовується для клінічної оцінки NEUG (див. нижче). [0139] У сукупності дані досліджень показують, що еквімолярні дози NEUG забезпечують фармакологічний ефект, близький до ефекту Нейласти® (пегфілграстиму) і виявляють такі ж ефекти на популяцію гранулоцитів у людини. A. In vitro та in vivo дослідження NEUG [0140] Далі йде огляд результатів досліджень NEUG in vitro та in vivo, які докладно описані в Експериментальних прикладах, нижче. [0141] In vitro фармакологічні дослідження показали наступне: 1. NEUG викликає проліферацію клітин лінії NFS-60 в дозозалежний спосіб. 20 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2. NEUG є в ~ 3 рази менш активним, ніж Нейпоген® (філграстим) in vitro. 3. NEUG еквівалентний Нейласті® (пегфілграстиму) при оцінці на основі молярних кількостей (1 мг Нейласти® (пегфілграстиму) еквівалентний за ефектом 4,5 мг NEUG). [0142] На основі in vivo фармакологічних досліджень були визначені наступні властивості NEUG: 1. NEUG добре переноситься мишами і яванськими макаками. 2. У мишей однократне введення NEUG викликає дозозалежне швидке і тривале збільшення вмісту нейтрофілів і гематопоетичних клітин-попередників у периферичній крові. При порівнянні з наявними на ринку продуктами G-CSF було показано, що підвищення вмісту нейтрофілів і клітин-попередників при використанні NEUG було більш тривалим, ніж при використанні еквімолярної дози Нейпогену® (філграстиму), та ідентичним використанню еквімолярної дози Нейласти® (пегфілграстиму) за тривалістю та інтенсивністю. 3. У мишей еквівалентні ефект і AUCANC досягалися при дозі NEUG, що в 7,7 разів перевищує дозу Нейласти® (пегфілграстиму). 4. У мишей з індукованою 5-FU нейтропенією однократні ін'єкції еквімолярних доз NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) приводили до ефективного прискорення відновлення нейтрофілів з ідентичною кінетикою і виразністю ефекту. 5. Однократні та багаторазові (один раз на тиждень) дози NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) викликають однакове збільшення вмісту периферичних нейтрофілів у мавп. При еквімолярних дозах як інтенсивність, так і тривалість підвищення вмісту нейтрофілів у мавп були однаковими для тварин, що одержують лікування Нейластою® (пегфілграстимом), і тварин, що одержують лікування NEUG. 6. Як у мишей, так і мавп, NEUG має більш повільний кліренс, більш довгий кінцевий період напіввиведення та більший середній час утримання, ніж Нейпоген® (філграстим) при IV або SC введенні. 7. У яванських макак кінцевий період напіввиведення NEUG (12,6 годин) приблизно на 33 % довше, ніж у Нейласти® (пегфілграстиму) (9,49 годин) після SC ін'єкції, і кліренс стосовно біодоступності ("CL/F") для NEUG становить приблизно половину значення CL/F для Нейласти® (пегфілграстиму). 8. Кліренс NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) повільніше в мишей з 5-FU-індукованою цитопенією, ніж в нормальних мишей, що вказує на те, що у виведення обох білків вносить вклад рецептор-опосередкований кліренс. 9. Ниркове виведення (показане на пацюках) вносить значний вклад у кліренс Нейпогену® (філграстиму), вносить незначний вклад у кліренс Нейласти® (пегфілграстиму) і не вносить значного внеску в кліренс NEUG. 10. NEUG, білок людини, утворений з сироваткового альбуміну людини та колонієстимулюючого фактора людини, є імуногенним у мишей і яванських макак. Нейласта® (пегфілграстим) викликала таку ж захворюваність і титр антитіл у мавп. Антитіла деяких мавп, що одержують лікування NEUG і Нейластою® (пегфілграстимом), були нейтралізуючими in vitro, при цьому як у випадку NEUG, так і у випадку Нейласти® (пегфілграстиму), відповідь нейтрофілів знижувалася при повторному впливі, при цьому у тварин, позитивних на присутність антитіл, вихідний рівень нейтрофілів був таким же, як рівень нейтрофілів у тварин, негативних по присутності антитіл, протягом періоду відновлення. [0143] Взяті разом, дані по фармакологічних властивостях NEUG in vitro і in vivo дають підстави вважати, що NEUG діє аналогічним Нейпогену® (філграстиму) і Нейласті® (пегфілграстиму) способом у забезпеченні мобілізації нейтрофілів і гематопоетичних клітин у кровотік. Необмежуючі експериментальні приклади in vitro та in vivo описані нижче. Приклад 1: Проліферація клітин NFS-60 [0144] NSF-60 являє собою клітинну лінію, що звичайно використовується в біологічних тестах для вимірювання активності G-CSF. Швидкість проліферації зазначеної клітинної лінії підвищується у відповідь на введення G-CSF. Порівнювали відносну активність рекомбінантого C-CSF (Нейпогену®, філграстиму) і NEUG. [0145] Для вимірювання ефективності NEUG і Нейпогену® (філграстиму) відносно 3 стимуляції проліферації клітин NFS-60 вимірювали включення H-тімідину через 24 години після впливу ряду концентрацій зазначених аналогів. Одержували значення EC 50, які виражали в одиницях маси (нг/мл). 5 [0146] Коротко, 1 × 10 клітин NFS-60 на лунку висівали на 96-ямкові планшети в кінцевому об'ємі 200 мкл повного середовища, що включає зазначену кількість NEUG (що також називається альбуграніном) або Нейпогену® (філграстиму). Усі зразки тестували тричі. Клітини інкубували при температурі 30 °C протягом 24 годин і вводили протягом останніх 4 годин 0,5 21 UA 105201 C2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мкКі H-тімідину на лунку. Включення тімідину використовували для вимірювання проліферації (Фіг. 8). [0147] NEUG і Нейпоген® (філграстим) стимулювали проліферацію в дозо залежний спосіб. У цьому аналізі Нейпоген® (філграстим) був в 15 разів більш активним, ніж NEUG при порівнянні на основі маси. NEUG в ~4,5 рази більше (по масі) Нейпогену® (філграстиму), таким чином, при розрахунках на основі молярних кількостей у цьому аналізі NEUG був в ~ 3 рази менш активним, ніж Нейпоген® (філграстим) in vitro. [0148] Нейласту® (пегфілграстим) аліквотирували на основі маси рекомбінантного G-CSF, масу модифікованого поліетиленгліколя не включали в розрахунки дозування. NEUG в 4,5 рази більше рекомбінантного G-CSF через внесок маси HSA, і, таким чином, для порівняння здатності NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) стимулювати проліферацію клітин NFS-60 використовували титри еквімолярних доз NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) і значення EC50 5 виражали як молярні концентрації. Коротко, 1 × 10 NFS-60 клітин/лунку висівали на 96-ямкові планшети в кінцевому об'ємі 200 мкл повного середовища, що містить зазначену кількість NEUG (альбуграніну) або Нейласти® (пегфілграстиму). Усі зразки тестували тричі. Клітини інкубували 3 при температурі 37 °C протягом 20 годин і вводили протягом останніх 4 годин 0,5 мкКі Hтімідину на лунку. Включення тімідину використовували для вимірювання проліферації. Результати показані на Фіг. 9. Приклад 2: Порівняння NEUG і Нейпогену® (філграстиму) у мишей BDF-1 [0149] Метою цього дослідження була оцінка ефекту однократних доз NEUG при його підшкірному введенні на нейтрофіли і гематопоетичні стовбурні клітини периферичної крові в мишей BDF-1. Мишей BDF-1 ін'єціювали підшкірно ("SC") однократною дозою NEUG при 3 рівнях дози (0,25 мг/кг, 1,25 мг/кг або 5,0 мг/кг) або Нейпогеном® (філграстимом) при 2 рівнях + + дози (0,25 мг/кг і 1,25 мг/кг). Гранулоцити (Gr, 1 ) і гематопоетичні клітини-попередники (c-kit ) периферичної крові оцінювали кількісно за допомогою проточної цитометрії щодня з 1 дня до 5 дня і порівнювали з даними для тварин, що одержують плацебо (середовище без сполуки, що тестується). [0150] Як NEUG, так і Нейпоген® (філграстим) викликали підвищення вмісту нейтрофілів у периферичній крові у порівнянні з тваринами, що одержують плацебо, але кінетика та інтенсивність відповіді різнилися (Фіг. 10). У групах, що одержують Нейпоген® (пегфілграстим), максимальне 3-кратне збільшення вмісту нейтрофілів відбувалося на 1 день, і число нейтрофілів верталося до нормального рівня до 2 дня. Хоча однократне введення NEUG приводило до такого ж підвищення вмісту нейтрофілів, що і введення порівнянних доз Нейпогену® (філграстиму), число нейтрофілів, навпаки, продовжувало збільшуватися в групах, що одержують NEUG, причому вихід на максимум кінетики і величини був дозозалежний. Дози NEUG 0,25, 1,25 і 5,0 мг/кг приводили до максимального вмісту нейтрофілів в 5,4, 10 і 24 разів вище, ніж у тварин, що одержують лікування середовищем. Більш низькі дві дози викликали максимальне підвищення вмісту нейтрофілів на 2 день, тоді як найвища доза, що тестується, приводила до максимального вмісту на 4 день. Число нейтрофілів верталося до нормального рівня на 3, 4 і 5 день для при введенні доз NEUG 0,25, 1,25 і 5,0 мг/кг, відповідно (Фіг. 10). Як показано на Фіг. 10, збільшення вмісту нейтрофілів у периферичній крові, викликане введенням NEUG, було більш вираженим і більш тривалим, ніж викликане введенням Нейпогену® (філграстиму). [0151] Вплив лікування NEUG і Нейпогеном® (філграстимом) на вміст периферичних + гематопоетичних (c-kit ) стовбурних клітин у цьому дослідженні були аналогічні результатам, отриманим для нейтрофілів периферичної крові (Фіг. 11). Ефект NEUG був дозозалежний і близький до ефекту порівнянних доз Нейпогену® (філграстиму) на 1 день, але продовжував підсилюватися на 2-4 день у всіх лікувальних групах, вертаючись до базової лінії до 5 дня, яка задається контролем, що одержує середовище. Як показано на Фіг. 11, викликане NEUG + збільшення вмісту клітин c-kit було більш вираженим і тривалим, ніж викликане введенням Нейпогену® (філграстиму). Приклад 3: Порівняння NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) у мишей BDF-1 [0152] Метою цього дослідження було порівняння ефекту однократних підшкірних (SC) ін'єкцій NEUG і Нейласти® (пегфілграстиму) на нейтрофіли та гематопоетичні клітинипопередники в периферичній крові в мишей BDF-1. Оцінку проводили шляхом ін'єціювання мишам BDF-1 (n=5) однократних доз NEUG 5 або 10 мг/кг. Ефект NEUG порівнювали з ефектом еквімолярних доз пегфілграстиму (Нейласти®) (1,12 мг/кг і 2,24 мг/кг) при однократному введенні. Дві зазначені дози Нейласти® (пегфілграстиму) і NEUG є приблизно еквімолярними. [0153] Результати показано на Фігурі 12. Однократне введення NEUG (5 і 10 мг/кг) або Нейласти® (1,12 мг/кг і 2,24 мг/кг) приводило до ефективного збільшення кількості гранулоцитів 22 UA 105201 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 і гематопоетичних клітин-попередників у периферичній крові в мишей BDF-1. У зазначеному експерименті максимальна мобілізація периферичних гранулоцитів відбувалася на 3 день (у випадку використання NEUG у дозі 5 мг/кг) і на 4 день (у випадку використання NEUG у дозі 10 мг/кг). Вміст гранулоцитів вертався до нормального рівня на 6 день після проведення лікування NEUG. У мишей, яким вводили однократну дозу Нейласти® (пегфілграстиму), максимальна мобілізація гранулоцитів відбувалася на 4 день. У мишей, що одержують Нейласту® (пегфілграстим) у дозі 2,25 мг/кг, на 6 день після введення лікарського засобу значення ANC було усе ще значно (p=0,036) вище, ніж вихідне, а абсолютне число нейтрофілів (ANC) у мишей, що одержують дозу 1,12 мг/кг, верталося до норми на 6 день (Фіг. 12A). [0154] Для оцінки відносної активності в мишей розраховували площі під фармакодинамічними (PD) кривими (AUC ANC) залежно від молярної еквівалентної дози (нмоль/кг) (Фіг. 12B). Лінії відповіді на дозу були паралельні, що вказує на те, що AUC АНС є прийнятним об'єктом порівняння в зазначеній моделі. AUC ANC, очевидно, були дозозалежними для обох аналогів G-CSF. У зазначеному експерименті відносна активність нейласти стосовно NEUG на основі маси становила 7,7. Тобто, 1 мг Нейласти® (пегфілграстиму) (при дозуванні в клініці на основі маси rhG-CSF) еквівалентний за ефектом 7,7 мг NEUG, що в ~1,5 рази перевищує різницю по молекулярній масі між NEUG і Нейластою® (пегфілграстимом), що складає 4,5 рази. [0155] Однократне введення NEUG або Нейласти® (пегфілграстиму) приводило до значного (p