Стійка, вільна від альбуміну ліофілізована композиція рекомбінантного фактора viii

Даний винахід пов'язаний з фармацевтичними композиціями, і зокрема - з композицією ліофілізованого rFVIll, що стабілізується без альбуміну (безальбумінового). Фактор VIII - це добре відомий білок плазми, який відіграє істотну роль в процесах зсідання крові. Хоч фактор VIII може отримуватися, й зараз отримується з людської плазми, в останні роки вжито значних зусиль для виробництва фактору VIII з рекомбінантних джерел (rFVIll), щоб запобігти забрудненню, пов'язаному з вживанням продуктів крові; крім того, рекомбінантне джерело для фактору VIII забезпечує практично невичерпне постачання коагуляційного фактору, таким чином позбавляючи обмежень, пов'язаних з вживанням плазми донорської крові як вихідного матеріалу. Хоч одною з переваг продукту rFVІІI є те, що він виробляється не з людської плазми, а тому уникає потенціальних забруднень від використання плазми людської крові, одною з цілей виробництва rFVIll є розробка стабільної композиції rFVIll, що описувалася б як цілком вільна від людського джерела сирих матеріалів. Але, на жаль, rFVIll нестабільний білок і тому, як і багато інших терапевтичних білків, він може стати нестабільним під час зберігання. Щоб подолати таку нестабільність, звичайно включають в цей продукт альбумін людської сироватки, як стабілізатор. Альбумін, як з'ясувалося,- гарний стабілізатор для FVIII і використовується в багатьох комерційних продуктах на ринку. Однак, при використанні альбуміну для стабілізування rFVIII одна з головних переваг - перш за все мати рекомбінантний продукт (тобто обійтися без матеріалів на основі людської крові) втрачається. Останнім часом описано декілька безальбумінових композицій фактору VIII, як в середовищі з низькою, так і з високою концентрацією іонів, з вживанням хлориду натрію, хлориду кальцію та гістидину як буферного іону. Крім того, використовувалися основні амінокислоти, такі як лізин, та цукри, такі як манітол, цукроза або мальтоза. Щоб досягти стабільності у безальбуміновій композиції фактору VIII, при цьому забезпечуючи необхідну для терапевтичного вживання ізотонічність, в таких безальбумінових композиціях необхідно ввести приблизно 10% цукру. Дивіться, наприклад патент США 4,877,608 (композиція з низькою концентрацією іонів). Європейський патент О314095 розкриває іншу безальбумінову композицію, що має високу концентрацію іонів, а в якості буферної речовини - гістидин. Патент4,877,608 пов'язаний з рідким розчином, на відміну від ліофілізованого продукту, що повинен витримувати цикли сушіння виморожуванням, які є необхідними для приготуванням цього продукту. Європейський патент 314 095 включає відносно велику кількість хлориду натрію і вживається, головним чином, в рідкій формі (композиції). До інших патентів, що стосуються композицій фактору VIII, можна віднести патент США 5,399,670, що описує вживання аргініну в композиції з виморожуванням, яка містить в собі альбумін. Дивіться також патент WO95/01804, котрий описує композицію, що включає цукрозу і гліцин; та патент США 4,440,679 і патент США 4,623,717 (обидва належать Фернадасу (Fernandas) зі співавторами), в яких показано вживання, принаймі 30% маси, цукрів в комбінації з амінокислотами з метою стабілізування FVIII в рідкому стані в умовах пастеризації (60°С, принаймі 10 годин). Окрім наведених композицій фактору VIII, є ще декілька патентів, пов'язаних з рафінуванням та/або зі стабілізуванням фактору VIII. До них належать: патент США 5,288,853, в якому описано багатоопераційний процес виробництва, включно з вживанням колонки зв'язаного гепарину, за якими іде додавання гліцину, щоб зформувати рафінований продукт фактору VIII. Патент США 5,399,670 охоплює процес підготовки виробництва ліофілізованого фактору VIII з покращеною розчинністю, який перед ліофілізацією потребує додавання в фактор VIII аргініну. Патент США 5,259,951 охоплює багатоопераційний метод рафінування фактору VIII з плазми, використовуючи іонообмінні колонки. Патент США 4,758,657 охоплює багатоопераційний процес виділення фактору VIII:C з плазми, в якому принаймі одна з операцій вимагає поглинання фактору Vlll:C гідрофобною інтерактивною матрицею. Крім названих патентів останнім часом з'явилося дуже багато композицій фактору IX (FIX), що з'явилися подібно до даної композиції rFVIII. Дивіться Реферат 244 Л.Буш зі співавторами, Гемофілія, том 2, Додаток 1, сторінка 64 (червень 1996) [Abstract 244 by L. Bush et al., Hemophilia. Vol. 2. Supplement 1, p.64 (June, 1996)]. FIX - це профермент (проензим), перетворений на активний протеолітичний фермент. З другого боку FVIII послуговується, разом з іншими коагуляційними компонентами, як кофактор стимулювання коагуляції крові . Молекулярна маса FVIII становить біля 340.000 Дальтонів (Dalton), в той час як маса FIX становить від 56000 до 57000. FVIII дуже чутливий до протеолітичної обробки, реагуючи консомітантним зменшенням коагуляційної активності. Добре відомо, що фактор VIII значно менш стабільний, порівняно з FIX, а вживання в кожному з цих факторів висушеного виморожуванням концентрату призводить до помітної різниці в стабільності при зберіганні при різних значеннях температури. На відміну від FVIII до FIX входить унікальна речовина залишки гамма-карбоксилювання 12N-термінальної глутамінової кислоти, таким чином вносячи можливу причину різниці в стабільності. Таким чином, композиція для FIX не обов'язково передбачає композицію й для FVIII. У виданні Pharmaceutical Research (Фармацевтичні дослідження), том 12, №6, стор.831-837, 1995 також наведено композицію стабілізованого рекомбінантного антагоніста рецептора інтерлейкін-1 людини, подібну до викладеного нижче. Незважаючи на минулі й останні зусилля розробити стабільний препарат rFVIII, який можна було б успішно ліофілізувати, а пізніше швидко реконституювати в воді, на сьогодні важко розробити композицію, в якій не тільки б не вживались людські продукти, такі як альбумін, а й щоб вона відповідала вимогам відповідної ліофілізації, швидкого реконституювання та ізотонії, в той же час забезпечуючи отримання rFVIII, що має тривалу стабільність та фармацевтичне прийнятний термін зберігання. На здивування з’ясувалося, що отримати такий препарат тепер можливо. Під час розробки даної композиції виявлено, що гістидин, котрий вивчався й використовувався раніше як буферна речовина, насправді має дестабілізуючий вплив на ліофілізовані безальбумінні композиції. Однак, нами з'ясовано, що ці дестабілізуючі ефекти гістидину можуть бути ефективно подолані новими композиціями з солей, гліцину та цукрози, комбінація котрих, як з’ясувалося, підвищує стабільність rFVIII. Ця суміш також захищає rFVIII під час багаторазових циклів замороження - відтанення в ході ліофілізації; вона також забезпечує швидке реконституювання ліофілізованого продукту водою. Дана композиція включає в себе як кристалічні, так і аморфні компоненти, на відміну від більшості раніше вживаних композицій, котрі в основному є аморфними. Композиція цього винаходу залишається стабільною в рідкому стані протягом принаймі 24 годин при кімнатній температурі. Детальний склад даної композиції та її вживання описано ниже. Короткий опис винаходу Дана покращена композиція rFVIIІ - це фармацевтичне прийнятний безальбуміновий ліофілізований продукт, котрий може бути швидко реконституйований в воді (протягом З0 секунд) і придатний для лікування гемофілії. Цей ліофілізований препарат містить в собі нову суміш солей, амінокислот і цукрози. Продукт стабільний при кімнатній температурі й, на відміну від відомих композицій, має відносно низький рівень цукру. Дана композиція після реконституювання водою містить в собі такі інгредієнти: гліцин гістидин від 65 до 400мМ, краще 290мМ, до 50мМ, краще від 1мМ до 50мМ, найкраще 20мМ цукроза від 15 до 60мМ, краще З0мМ, NaCI до 50мМ, краще від 1мМ до 50мМ, найкраще З0мМ СаСІ2 до 5мМ, краще від 0.1мМ до 5мМ, найкраще 2.5мМ rFVIII від 50 до 1500МО/мл ((міжнародних одиниць (МО/мл) В кращій ліофілізованій композиції залишкова кількість води має бути біля 1-3%вar. краще - біля 1%ваг. Короткий опис малюнка На малюнку зображено графік порівняльної залежності активності (potency) від часу зберігання при температурі 40°С для композиції даного винаходу, яка має відносно низький вміст цукру (нижня крива), та для композиції попередніх досліджень, яка має відносно високий вміст цукру (нижня крива). Детальний опис винаходу До даного винаходу привели пошуки безальбумінової композиції, яка забезпечувала б стабільність rFVIII (мінімальну, або меншу 20%, втрату активності) в різних операціях процесу, таких як: ультрафільтрація/діафільтрація, зберігання заморожених об'ємів, замороження - відтанення, та ліофілізація. Крім того, було б бажано мати швидкорозчинний продукт, стабільний в реконституйованому рідкому стані. Також бажано було б отримати фармацевтичне прийнятний ліофілізований продукт з достатнім терміном зберігання, який можна було б ліофілізувати при короткому циклі заморожування сушіння. Білки не кристалізуються в процесі ліофілізації. Метою даного процесу сушіння має бути перетворення водного розчину білка в аморфну фазу, щоб захистити білки від хімічної та/або конформаційної нестабільності, причиною якої є кристалічне середовище (або загальна нестача води). Щоб забезпечити отримання аморфної фази (компонента), необхідної для стабілізації білків, традиційно включають значну кількість альбуміну (до 1%). Для виконання цих завдань було розроблено композицію як з кристалічним компонентом - щоб забезпечити швидку ліофілізацію, так і з аморфним компонентом - щоб стабілізувати отриманий rFVIII. В даному контексті вираз "кристалічний з аморфним компонентом" означає, що дана композиція містить в собі дві або більше різних фаз, принаймі одна з яких кристалічна і одна - аморфна. Тверді речовини можуть існувати в кристалічній або в аморфній формі. Кристалічні матеріали характеризуються як такі, що мають визначену структуру, стехіометричний склад і точку плавлення. На відміну від них, аморфні матеріали не мають чітко визначеної молекулярної структури і можуть бути визначеними як можливі переохолоджені рідини з надзвичайно високою в'язкістю, такі як в'язкоеластична "гума" чи більш жорстке крихке скло. Вважається, що для формування аморфного компонента можуть включатися інші цукри, такі як мальтоза, трегалоза та мальтотріоза. Для формування кристалічного компонента до композиції може бути включений манітол. Стратегія пошуку фармацевтично прийнятної безальбумінової композиції rFVIII була такою: (а) Вихідним матеріалом був ретельно рафінований rFVIII, очищений за допомогою ортогональної хроматографії. Вона визначається як хроматографічні процеси, що працюють в різних режимах, на певних принципах, і звичайно використовуються послідовно. В результаті з’ясувалося, що білок можна швидко очистити, вживаючи різні більш ефективні методи очищення. Було отримано фактор VIII, що мав ступінь очистки принаймі 90% (електрофорезом гелю) при активності більшій 2000МО на мг білка. Теоретичне значення ступіні очистки rFVIII є предметом дискусії, і, на нашу думку, складає 3500-5000М0/на мг білка; (б) Білок (протеїн) був уведений в композицію методом ультрафільтраці /діафільтраці (УФ/ДФ) і досліджувався на відновлення шляхом УФ/ДФ, вразливість при заморожуванні - відтаненні, та стабільність рідини при різних значеннях температури інкубації; (в) Можливі композиції далі характеризувалися за їх тепловими показниками, визначеними методом диференційної сканувальної калориметрії (КДС). Було визначено температуру склування, (Тg'), температуру розсклування (Td') та евтектичну температуру плавлення (Те'). Цю інформацію було використано для ототожнювання композицій, що можуть бути швидко ліофілізованими; саме їх було відібрано для подальших досліджень; (г) Перші композиції було ліофілізовано за допомогою циклу сушіння методом швидкого виморожування, потім зробили аналіз стабільності при стандартних та підвищених значеннях температури зберігання; (д) Стабільні композиції просто визначалися за зразками, що зберігалися різний час при температурі 40°С. При аналізуванні результатів численних досліджень, що привели до даної композиції, застосовували стратегію експериментального проекту з багатьма змінними чинниками і було використано програму виведення на екран списку конкретних інгредієнтів, що входять до складу сумішей з амінокислот, солей і цукрів. Щоб знайти результати взаємодії між інгредієнтами, отримані результати було проаналізовано із застосуванням складної програми, і розроблено методику багаточинникового аналізу даних поверхневої чутливості. На здивування, з'ясувалося, що гістидин (традиційно вживаний в попередній практиці) насправді має дестабілізуючий ефект на композиції rFVIII. Це змусило критично дослідити критерії різних інгредієнтів композиції, яку остаточно визнали прийнятною. ПРИКЛАД 1 Вплив на стабільність ліофілізованого rFVIII було досліджено титруванням різної кількості гістидину в суміші rFVIII, що містить в собі: 150мМ NaCI, 2.5мМ CaCI; and 165мМ манітолу. Результати дослідження наведено нижче. Таблиця Процент від вихідної активності через два тижні зберігання при температурі 40°С при наявності в композиції гістидину. Гістидин (мМ) 20 55 75 100 % від вихідної активності через два тижні зберігання при температурі 40°С 5.9% 6.3% 2.5% 1.9% Як видно з наведених даних, збільшення кількості гістидину призводить до зменшення активності реконституйованого ліофілізованого rFVIII, в залежності від дози. Ці результати свідчать, що гістидин не є стабілізатором rFVIII в ліофілізованому стані. ПРИКЛАД 2 Стабільність rFVIII в композиціях з великим і малим вмістом цукру. Рекомбінантний фактор VIII було приготовано в двох композиціях. Нестабільність було досліджено при підвищеній до 40°С температурі зберігання. Композиція з високим вмістом цукру, подібно до традиційно вживаної, була аморфною композицією, до складу якої, після реконституювання водою, входило: 50мМ хлориду натрію, 2.5мМ хлориду кальцію, 5мМ гістидину і 10% ваг. мальтози. Композиція цього винаходу з низьким вмістом цукру була кристалічною з одним аморфним компонентом - 1% цукрози (ЗОмМ цукрози), призначено стабілізувати білок. До складу цієї композиції, після реконституювання її за допомогою безводного інгредієнта (WFI), входило: ЗОмМ хлориду натрію, 2.5мМ хлориду кальцію, 20мМ гістидину, 290мМ гліцину і приблизно 200МО/мл rFVIII. Дана композиція порівнювалась з традиційною композицією, як на наведеному малюнку, з якого видно, що rFVIII з малим вмістом цукру значно більш стабільний в часі, порівняно з традиційно вживаним стабілізованим продуктом з великим вмістом цукру. Щодо даного винаходу, можливо фахівцями будуть запропоновані його чисельні варіації. Тому наведені приклади треба тлумачити тільки як ілюстративні, а рамки даного винаходу обмежуються лише наступною формулою винаходу. Фіг.