Стабільний склад рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини

Реферат: Винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить рекомбінантний альбумін людинигранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини і щонайменше один фармацевтично прийнятний носій, де композиція має рН від 4 до 6,4, а концентрація рекомбінантного гібридного білка становить від 30 до 120 мг/мл. UA 103221 C2 (12) UA 103221 C2 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0001] Ця заявка заявляє пріоритет на підставі попередньої заявки США 61/145440, поданої 16 січня 2009 р., і попередньої заявки США 61/145436, поданої 16 січня 2009 р. Зміст попередньої заявки США 61/145440 і попередньої заявки США 61/145436 тим самим включено в цей опис у всій повноті за допомогою посилання. Рівень техніки [0002] Лейкопенія являє собою зниження кількості циркулюючих лейкоцитів (білих клітин крові) і часто вона відповідає кількості лейкоцитів до < 4000/мл. Основні клітини, з якими зв'язана лейкопенія, являють собою нейтрофіли. Однак знижена кількість лімфоцитів, моноцитів, еозинофілів або базофілів також може сприяти зниженню загальної кількості клітин (Merck Manual, 17 видання). [0003] Нейтропенія характеризується зниженням кількості нейтрофілів у крові, що часто приводить до підвищеної схильності до бактеріальних і грибкових інфекцій. Нейтропенія класифікується за кількістю нейтрофілів і відносному ризику інфекції в такий спосіб: легка (від 1000 до 1500/мл), помірна (3 ступінь, від 500 до 1000/мл) або важка (4 ступінь, < 500/мл). Гостра і важка нейтропенія являє собою загрозливий для життя стан, тому що у випадку нейтропенії пацієнт піддається інфекціям, що швидко розвиваються, з летальним результатом (Merck Manual, 17 видання). [0004] Нейтропенія може бути викликана порушеною продукцією нейтрофілів у кістковому мозку або прискореним руйнуванням нейтрофілів. Гостра нейтропенія може виникати протягом декількох днів, коли споживання нейтрофілів відбувається швидко, а продукція сильно порушена. Хронічна нейтропенія може тривати багато місяців і часто викликана зниженою продукцією або секвестрацією нейтрофілів у селезінці. Нейтропенію можна класифікувати чи є її виникнення вторинним стосовно факторів, що не відносяться до мієлоїдних клітин кісткового мозку, або чи присутній внутрішній дефект у мієлоїдних попередниках (Merck Manual, 17 видання). [0005] Нейтропенія та її інфекційні ускладнення належать до числа найпоширеніших і серйозних побічних ефектів цитотоксичної хіміотерапії та інших видів терапії раку, таких як променева терапія, біотерапія і трансплантація кісткового мозку. Цитотоксична хіміотерапія, яка діє шляхом пошуку і руйнування швидкозростаючих клітин, викликає нейтропенію через високу швидкість проліферації попередників нейтрофілів і швидкого відновлення нейтрофілів у крові (Merck Manual, 17 видання). Найпоширеніші симптоми нейтропенії у пацієнтів, що зазнають хіміотерапії, включають лихоманку, виразки в ротовій порожнині та вушні інфекції. Пацієнти з глибокою нейтропенією часто страждають від гнійних інфекцій, таких як септицемія, шкірний целюліт, абсцеси печінки, фурункульоз, пневмонія, стоматит, гінгівіт, периректальне запалення, коліт, синусит і отит середнього вуха. Може виникати необхідність відкласти хіміотерапію до того моменту доки організм не зможе виробляти більше нейтрофілів й іноді необхідно знижувати дозу введення, що приводить до зниження ефективності лікування. Короткий опис винаходу [0006] Цей винахід відноситься до композицій і способів, що придатні для лікування, попередження або полегшення захворювань і станів, що характеризуються вмістом лейкоцитів нижче норми, таких як лейкопенія та нейтропенія. У деяких варіантах реалізації зазначені композиції та способи включають рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини, показаний на Фіг. 9, або його варіант, або фрагмент. У деяких варіантах реалізації зазначені композиції і способи застосовують для лікування, попередження або полегшення нейтропенії і/або лейкопенії, наприклад, нейтропенію, викликану введенням лікарських засобів, таких як хіміотерапевтичні лікарські засоби, що вводяться для лікування раку, можна лікувати з використанням композицій згідно з цим винаходом. [0007] У деяких варіантах реалізації композиції являють собою фармацевтичні сполуки і містять рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини, показаний на Фіг. 9, або його варіант, або фрагмент. У деяких варіантах реалізації фармацевтична сполука містить щонайменше один фармацевтично прийнятний носій і характеризується pH від приблизно 5 до приблизно 8,0, від приблизно 5 до приблизно 7,5, від приблизно 5 до приблизно 7,2, від приблизно 5 до приблизно 7,0, від приблизно 5 до приблизно 6,8, від приблизно 5 до приблизно 6,6, від приблизно 5 до приблизно 6,4, від приблизно 5 до приблизно 6,2, від приблизно 5 до приблизно 6, від приблизно 6 до приблизно 7,5, від приблизно 6,0 до приблизно 7,2, від приблизно 6 до приблизно 7. В інших варіантах реалізації pH рівний приблизно 4, приблизно 4,2, приблизно 4,4, приблизно 4,5, приблизно 4,6, приблизно 4,8 приблизно 5, приблизно 5,2 приблизно 5,4 приблизно 5,5, приблизно 5,6, приблизно 5,8, приблизно 6,0, приблизно 6,2, приблизно 6,4, приблизно 6,5 приблизно 6,6, приблизно 6,8, 1 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 приблизно 7,0, приблизно 7,2, приблизно 7,4 приблизно 7,5, приблизно 7,6, приблизно 7,8 або приблизно 8,0. [0008] У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини в концентрації, рівній від приблизно 2,5 до приблизно 240 мг/мл, від приблизно 30 до приблизно 120 мг/мл, від приблизно 60 до приблизно 120 мг/мл, приблизно 5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, приблизно 15 мг/мл, приблизно 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 200 мг/мл, приблизно 240 мг/мл або приблизно 250 мг/мл. [0009] У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить щонайменше одну фармацевтично прийнятну сіль. У деяких варіантах реалізації зазначена сіль присутня в композиції у концентрації, рівній від приблизно 5 до приблизно 50 мМ, від приблизно 10 до приблизно 40 мМ, від приблизно 15 до приблизно 30 мМ, від приблизно 20 до приблизно 25 мМ. У деяких варіантах реалізації зазначена сіль присутня в композиції у концентрації, рівній приблизно 5 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 20 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 45 мМ і приблизно 50 мМ. [0010] У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить щонайменше один фармацевтично прийнятний буфер. У деяких варіантах реалізації зазначений буфер присутній у композиції в концентрації, рівній від приблизно 5 до приблизно 50 мМ, від приблизно 10 до приблизно 50 мМ, від приблизно 15 до приблизно 50 мМ, від приблизно 5 до приблизно 10 мМ, від приблизно 10 до приблизно 20 мМ, від приблизно 20 до приблизно 30 мМ, від приблизно 15 до приблизно 25 мМ або приблизно 20 мМ. У деяких варіантах реалізації зазначений буфер присутній у композиції в концентрації, рівній приблизно 5 мМ, приблизно 10 мМ, приблизно 15 мМ, приблизно 20 мМ, приблизно 25 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 35 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 45 мМ, приблизно 50 мМ, приблизно 55 мМ або приблизно 60 мМ. У деяких варіантах реалізації буфер являє собою фосфат, цитрат або комбінацію зазначених з'єднань. У деяких варіантах реалізації буфер включає фосфат натрію, однозаміщений фосфат натрію, дизаміщений фосфат натрію або комбінацію зазначених з'єднань. [0011] У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить стабілізатор для ліофілізації. У деяких варіантах реалізації зазначений стабілізатор для ліофілізації являє собою дигідрат трегалози. У деяких варіантах реалізації концентрація дигідрату трегалози становить від приблизно 20 до приблизно 100 мМ, від приблизно 40 до приблизно 80 мМ, від приблизно 50 до приблизно 70 мМ або приблизно 60 мМ. У деяких варіантах реалізації концентрація зазначеного стабілізатора становить приблизно 20 мМ, приблизно 30 мМ, приблизно 40 мМ, приблизно 50 мМ, приблизно 60 мМ, приблизно 70 мМ, приблизно 80 мМ, приблизно 90 мМ, приблизно 100 мМ, приблизно 110 мМ або приблизно 120 мМ. [0012] У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить наповнювач. У деяких варіантах реалізації зазначений наповнювач являє собою поліол (багатоатомний спирт). У деяких варіантах реалізації зазначений поліол являє собою маніт. У додаткових варіантах реалізації фармацевтична композиція містить фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах реалізації зазначений носій являє собою полісорбат. [0013] Фармацевтичні композиції, розкриті в цьому описі, можуть бути виготовлені у вигляді декількох форм для введення. Наприклад, у деяких варіантах реалізації фармацевтичні композиції одержують для перорального, інгаляційного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, ректального, офтальмологічного введення, введення в товсту кишку, парентерального, інтрацистернального, інтравагінального, інтраперитонеального введення, введення в око, вухо, локального, трансбукального, назального або місцевого введення. Композиції також можуть бути виготовлені для застосування в конкретних лікарських формах. Наприклад, у деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція може бути виготовлена у вигляді рідини, гелю, аерозолю, мазі, крему, ліофілізованої сполуки, порошку, таблетки або капсули. В інших варіантах реалізації фармацевтичну композицію виготовляють у вигляді складу з контрольованим вивільненням, швидкорозчинного складу, складу з відстроченим вивільненням, складу з пролонгованим вивільненням, складу з пульсуючим вивільненням і змішаного складу з негайним вивільненням. У деяких варіантах реалізації запропонована фармацевтична композиція у вигляді рідини. В інших варіантах реалізації запропонована фармацевтична композиція у вигляді ліофілізованого порошку. У ще одних варіантах реалізації фармацевтичну композицію одержують у вигляді ліофілізованої таблетки. 2 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0014] Для фармацевтичної композиції, описаної в цій заявці, можливі різні способи зберігання. У деяких варіантах реалізації фармацевтичну композицію зберігають у флаконі; в інших варіантах реалізації фармацевтичну композицію зберігають у шприці. [0015] У деяких варіантах реалізації фармацевтична композиція містить рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини, щонайменше один буфер і/або регулюючий pH агент і, можливо, щонайменше один додатковий фармацевтично прийнятний носій, при цьому чистота мономерів у розчині рекомбінантного альбуміну людинигранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини зменшується менш ніж на 10 % після витримування при 25ºC протягом 24 годин. У деяких варіантах реалізації буфер є таким же, що й регулюючий pH агент. У деяких варіантах реалізації чистота мономерів у розчині після витримування при 25ºC протягом 24 годин знижується менш ніж приблизно на 1 %, менш ніж приблизно на 5 %, менш ніж приблизно на 15 %, менш ніж приблизно на 20 % або менш ніж приблизно на 25 %. [0016] В інших варіантах реалізації фармацевтична композиція містить рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини, приблизно 20 мM фосфат натрію, приблизно 180 мM маніт, приблизно 60 мM дигідрат трегалози, приблизно 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80 і pH становить приблизно 6,0, при цьому концентрація рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини становить від приблизно 2,5 мг/мл до приблизно 120 мг/мл або від приблизно 30 мг/мл до приблизно 60 мг/мл. У деяких варіантах реалізації концентрація рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини становить приблизно 5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, приблизно 15 мг/мл, приблизно 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 200 мг/мл, приблизно 240 мг/мл або приблизно 250 мг/мл. [0017] В інших варіантах реалізації фармацевтична композиція містить рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини і PMTT20/6,0, при цьому концентрація рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини становить від приблизно 2,5 до приблизно 120 мг/мл або від приблизно 30 мг/мл до приблизно 60 мг/мл. У деяких варіантах реалізації концентрація рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини становить приблизно 5 мг/мл, приблизно 10 мг/мл, приблизно 15 мг/мл, приблизно 20 мг/мл, приблизно 25 мг/мл, приблизно 30 мг/мл, приблизно 35 мг/мл, приблизно 40 мг/мл, приблизно 45 мг/мл, приблизно 50 мг/мл, приблизно 55 мг/мл, приблизно 60 мг/мл, приблизно 70 мг/мл, приблизно 80 мг/мл, приблизно 90 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 120 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 100 мг/мл, приблизно 150 мг/мл, приблизно 200 мг/мл, приблизно 240 мг/мл або приблизно 250 мг/мл. [0018] Як наведений вище загальний опис винаходу, так і наступний короткий опис фігур і докладний опис винаходу наведені для прикладу та пояснення, і призначені для додаткового пояснення заявленого винаходу. Інші цілі, переваги і нові ознаки будуть очевидні фахівцеві в цій галузі техніки з наступного докладного опису цього винаходу. Короткий опис фігур [0019] Фіг. 1 являє собою графік, на якому показано, що підвищення концентрації rHSA-GCSF знижує чистоту мономера. Чистоту мономера зразків rHSA-G-CSF у концентраціях у діапазоні від 2,5 до 240 мг/мл вимірювали шляхом ексклюзивної високоефективної рідинної хроматографії ("Е-ВЕРХ") після витримування в PMTT10/7,2 при 25ºС протягом 24 годин. [0020] Фіг. 2 являє собою графік, на якому показано, що підвищення pH збільшує агрегацію rHSA-G-CSF. Агрегацію rHSA-G-CSF у концентрації, рівній 15 мг/мл або 60 мг/мл, вимірювали шляхом Е-ВЕРХ після витримування при 25ºС протягом 7 днів в PMTT10 при pH, рівному 6,0, 6,8, 7,2 або 8,0. [0021] Фіг. 3 являє собою графік, на якому показано, що підвищення температури збільшує агрегацію rHSA-G-CSF. Агрегацію rHSA-G-CSF у концентрації, рівній 15 мг/мл або 60 мг/мл, вимірювали шляхом Е-ВЕРХ після витримування при 4ºC, 25ºc або 40ºC протягом 24 годин в PMTT10/7,2. [0022] Фіг. 4 являє собою графік, на якому показано, що підвищення pH збільшує агрегацію rHSA-G-CSF. Агрегацію rHSA-G-CSF у концентрації, рівній 48 мг/мл, вимірювали шляхом ЕВЕРХ після витримування при 25ºС протягом до 3 днів в PMTT10 при pH, рівному 5,8, 6,3, 6,4 або 7,0, або в CMTT10 при pH, рівному 6,2. Верхня лінія означає 10 мM PMTT pH 7,0; друга лінія 3 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зверху означає 10 мM PMTT pH 6,4; третя лінія зверху означає 10 мM PMTT pH 6,3; більш темна з нижніх ліній означає 10 мM PMTT pH 5,8; більш світла з нижніх ліній означає 10 мM CMTT pH 6,2. [0023] Фіг. 5 являє собою графік, на якому показано, що підвищення концентрації солі зменшує агрегацію rHSA-G-CSF. Агрегацію rHSA-G-CSF у концентрації, рівній 60 мг/мл, вимірювали шляхом Е-ВЕРХ після витримування протягом 1 дня при 25ºС/60 % ВВ в PMTT10/7,2 і при концентрації хлориду натрію, рівній 5 мM, 10 мМ, 20 мМ або 50 мМ. [0024] Фіг. 6 являє собою графік, на якому показано, що підвищення концентрації фосфату зменшує агрегацію rHSA-G-CSF. Агрегацію rHSA-G-CSF у концентрації, рівній 60 мг/мл, вимірювали шляхом Е-ВЕРХ після витримування протягом 1 дня при 25ºС/60 % відносної вологості ("ВВ") в PMTT/7,2 і при концентрації фосфату, рівній 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 40 мМ або 50 мМ. [0025] Фіг. 7 являє собою графік, на якому показано, що чистота rHSA-G-CSF зберігається при концентраціях до 120 мг/мл у буфері для приготування сполуки PMTT20/6,0. Чистоту мономера зразків rHSA-G-CSF у концентраціях у діапазоні від 2,5 до 120 мг/мл вимірювали шляхом Е-ВЕРХ після витримування в PMTT10/7,2 (старий буфер) або PMTT20/6,0 (новий буфер) при 25ºС протягом 24 годин. [0026] Фіг. 8 являє собою графік, на якому показано, як pH і концентрація фосфату впливають на агрегацію rHSA-G-CSF. Агрегацію rHSA-G-CSF у концентрації 60 мг/мл вимірювали шляхом Е-ВЕРХ після витримування при 4ºC або 25ºC/60 % ВВ протягом максимального періоду часу, що становить 14 днів, в PMTT10/7,2 (старий буфер) або в PMTT20/6,0 (новий буфер). [0027] Фіг. 9А-C. На Фіг. 9А представлена послідовність нуклеїнових кислот і амінокислотна послідовність гібридного поліпептиду rHSA-G-CSF, що називається Нейгранін™ (Neugranin™) ("NEUG"); на Фіг. 9B показана амінокислотна послідовність G-CSF людини; на Фіг. 9С показана амінокислотна послідовність сироваткового альбуміну людини. [0028] Фіг. 10 являє собою таблицю, у якій представлена агрегація, виміряна шляхом ЕВЕРХ rHSA-G-CSF, витриманого при різних значеннях pH у концентрації, рівній 48 мг/мл, і при 25ºC протягом до 3 днів. [0029] Фіг. 11 являє собою таблицю, у якій представлена агрегація rHSA-G-CSF при різному значенні pH, концентрації білка і температурі, виміряну шляхом Е-ВЕРХ. У верхній половині таблиці (перші 3 рядки) наведені дані для 15 мг/мл rHSA-G-CSF. У нижній половині таблиці (останні три рядки) наведені дані для 60 мг/мл rHSA-G-CSF. [0030] Фіг. 12 являє собою таблицю, у якій представлена активність rHSA-G-CSF після витримування при різних значеннях pH, температурі та концентраціях. [0031] Фіг. 13 являє собою схему, що демонструє загальне уявлення про виготовлення NEUG. [0032] На Фіг. 14А и 14В представлені результати Е-ВЕРХ і ОФ-ВЕРХ відповідно, що порівнюють NEUG-1 ("1P") і NEUG-2 ("2P"). [0033] На Фіг. 15А и 15В показане порівняння гетерогенності заряду за даними ІО-ВЕРХ і порівняння ідентичності за даними пептидного картирування відповідно NEUG-1 ("1P") і NEUG-2 ("2P"). [0034] На Фіг. 16 показане порівняння чистоти NEUG-1 і NEUG-2 на гелі SDS-ПААГ (електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію) з фарбуванням Кумассі синім. [0035] На Фіг. 17А и 17В наведені таблиці, у яких представлені загальні результати досліджень трьох різних серій NEUG-1 і п'яти різних серій NEUG-2, отриманих для клінічного застосування у людей. [0036] На Фіг. 18 показаний аналіз SDS-ПААГ (в умовах відновлення) з фарбуванням Кумассі стандартного зразка NEUG-1 серії 2378-R. [0037] На Фіг. 19А и 19В показані хроматограми Е-ВЕРХ і ОФ-ВЕРХ стандартного зразка NEUG-1 серії 2378-R. [0038] На Фіг. 20 представлені загальні результати дослідження, проведеного з використанням типової розроблювальної серії кінцевого лікарського продукту NEUG-2. [0039] На Фіг. 21 показані хроматограми обернено-фазової ("ОФ"), іонообмінної ("ІО") і ексклюзивної ("Е") хроматографії NEUG, на який впливали пероксидом водню і TBO або TBP; дослідження проводили для спостереження окиснення NEUG. Контроль NEUG = середній сірий колір; NEUG, на який діяли пероксидом водню, = ясно-сірий колір; NEUG, на який діяли TBP, = чорний. [0040] Фіг. 22 являє собою таблицю, у якій представлені результати впливу на NEUG 4 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пероксидом водню і TBO або TBP. Дослідження проводили для спостереження окиснення NEUG. [0041] Фіг. 23 являє собою графік, що демонструє середній абсолютний вміст нейтрофілів (АВН) для пацієнтів, що одержують NEUG-1 перед хіміотерапією (0 Цикл) від початку лікування до 14 дня. На 4 день лінії з самої верхньої до самої нижньої являють собою: 300 мкг/кг NEUG, 450 мкг/кг NEUG 150 мкг/кг і 50 мкг/кг NEUG. [0042] Фіг. 24А и 24В являють собою графіки, на яких показані АВН і кількість лейкоцитів ("WBC") для пацієнтів, що одержували NEUG-1 до і через 24 години після Циклів хіміотерапії. Застосовували наступні дози NEUG: 50 мкг/кг; 150 мкг/кг; 300 мкг/кг; або 450 мкг/кг. Скорочення нейтрофілів для нейтропенії 3 і 4 ступеня показаний пунктирними лініями на Фіг. 24А; нормальний діапазон значень нейтрофілів також показаний як на Фіг. 24А, так і на Фіг. 24В. [0043] Фіг. 25 являє собою графік, на якому показаний абсолютний вміст нейтрофілів (АВН) для пацієнтів, що одержували 300 мкг/кг NEUG, 450 мкг/кг NEUG або 6 мг пегфілграстиму (Нейласта®) (pegfilgrastim, Neulasta®) приблизно через 24 години після хіміотерапії в 1 Циклі. [0044] На Фіг. 26 представлені Цикли хіміотерапії для досліджень I Фази. [0045] Фіг. 27 являє собою графік, на якому показана фармакокінетика NEUG у дослідженні I Фази в пацієнтів-людей. Сироваткову концентрацію NEUG, що вводиться підшкірно в зазначених дозах (450 мкг/кг, 300 мкг/кг або 150 мкг/кг), вимірювали у пацієнтів, що страждають раком молочної залози у відсутності хіміотерапії. Квадрати: 450 мкг/кг 0 Цикл; трикутники: 300 мкг/кг 0 Цикл; кола: 150 мкг/кг 0 Цикл. [0046] Фіг. 28 являє собою графік, на якому показаний абсолютний вміст нейтрофілів ("АВН") для пацієнтів в I Фазі. Пацієнти одержували 300 мкг/кг NEUG (n=19), 450 мкг/кг NEUG (n=20) або 6 мг пегфілграстиму (Нейласта®) (n=9) в 1 Циклі після дослідження хіміотерапії. [0047] Фіг. 29 являє собою графік, на якому показана фармакокінетика/фармакодинаміка ("ФК/ФД") NEUG в 1 Циклі хіміотерапії (дослідження I Фази). Пацієнти одержували 450 мкг/кг NEUG через один день після введення доксорубіцину (doxorubicin)/доцетакселу (docetaxel) в 1 Циклі. АВН показане незаштрихованими ромбами; концентрація NEUG показана заштрихованими квадратами. Скорочення для нейтропенії 3 і 4 ступеня показане пунктирними лініями. Мінімальне значення кількісного визначення ("НПКО") для NEUG показане пунктирною точковою лінією при 6 нг/мл. [0048] На Фіг. 30А и 30В показана площа під кривою (ППК) для кожного пацієнта, що одержував лікування в I Фазі, Частина В, виходячи зі значень АВН, отриманих для днів з 0 по 15. Фіг. 30А являє собою графік; дані Фіг. 23А узагальнено в таблиці 30В. Докладний опис [0049] У цій заявці запропоновані композиції та способи лікування, попередження і полегшення станів і захворювань, що характеризуються зниженою кількістю лейкоцитів. Композиції і спосіб, запропоновані в цій заявці, включають гібридний поліпептид, утворений з білка сироваткового альбуміну людину ("HSA") і гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини ("G-CSF"). В одному з варіантів реалізації цього винаходу довжина зазначеного гібридного поліпептиду становить 759 амінокислот; амінокислоти 1-585 зазначеного гібрида відповідають амінокислотам зрілої форми HSA, і амінокислоти 586-759 зазначеного гібрида відповідають амінокислотам зрілої форми G-CSF людини. Амінокислотні послідовності гібридного білка представлені на Фіг. 9А-9С. [0050] Композиції та способи, запропоновані в цій заявці, також включають терапевтичні склади і фармацевтичні композиції, що містять рекомбінантний поліпептид HSA-G-CSF. У деяких варіантах реалізації зазначені склади і композиції формують для введення більш низьких доз поліпептиду, тоді як в інших варіантах реалізації зазначені склади формують для введення більш високих доз поліпептиду. [0051] Цей винахід також включає гібридні білки, що містять варіанти або фрагменти G-CSF, і гібридні білки, що містять альбумін або фрагменти, або варіанти альбуміну. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують терапевтичні гібридні білки альбуміну згідно з цим винаходом, терапевтичні гібридні білки альбуміну, композиції, фармацевтичні композиції, склади і набори. Клітини-хазяї, трансформовані полінуклеотидами, що кодують терапевтичні гібридні білки альбуміну, також включені в цей винахід, як і способи одержання гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом з використанням даних полінуклеотидів і/або клітин-хазяїв. [0052] В одному з варіантів реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом має більш тривалий строк зберігання. [0052] У другому варіанті реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом більш стабільний у порівнянні з відповідною негібридною молекулою G-CSF. [0053] Цей винахід також включає трансгенні організми, модифіковані таким чином, що 5 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазначені організми містять молекули нуклеїнової кислоти згідно з цим винаходом, краще модифіковані таким чином, що зазначені організми експресують гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом. [0054] У цілому, цей винахід відноситься до полінуклеотидів, що кодують гібридні білки альбуміну; гібридних білків альбуміну; і способів лікування, попередження або полегшення захворювань або розладів з використанням гібридних білків альбуміну або полінуклеотидів, що кодують гібридні білки альбуміну. У цьому описі термін "гібридний білок альбуміну" відноситься до білка, утвореного шляхом злиття щонайменше однієї молекули альбуміну (або її фрагмента або варіанта) зі щонайменше однієї молекулою G-CSF (або її фрагментом або варіантом). Гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом містить щонайменше фрагмент або варіант G-CSF і щонайменше фрагмент або варіант сироваткового альбуміну людину, які з'єднано один з одним шляхом генетичного злиття (тобто гібридний білок альбуміну одержують шляхом трансляції нуклеїнової кислоти, у якій полінуклеотид, що кодує весь або частину G-CSF, з'єднують у рамці з полінуклеотидом, що кодує увесь або частину альбуміну). Кожний з G-CSF і білка альбуміну, що є частиною гібридного білка альбуміну може називатися "частиною", "областю" або "фрагментом" гібридного білка альбуміну (наприклад, "частина білка G-CSF" або "частина білка альбуміну"). У найкращому варіанті реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом містить щонайменше одну молекулу G-CSF або її фрагмент, або варіант (включаючи, але не обмежуючись нею, зрілу форму білка G-CSF) і щонайменше одну молекулу альбуміну або її фрагмент, або варіант (включаючи, але не обмежуючись нею, зрілу форму альбуміну). [0055] В іншому кращому варіанті реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом процесується клітиною-хазяїном і секретується в навколишнє культуральне середовище. Процесінг гібридного білка альбуміну, що зароджується, який відбувається в секреторних шляхах хазяїна, що використовується для експресії, може включати, але не обмежується ними, розпад сигнального пептиду; утворення дисульфідних зв'язків; придатний фолдінг; додавання і процесінг вуглеводів (такий як, наприклад, N- і О-зв'язане глікозилювання); конкретне протеолітичне розщеплення; і складання з утворенням мультимерних білків. Гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом краще перебуває в процесованій формі. У найкращому варіанті реалізації термін "процесована форма гібридного білка альбуміну" відноситься до гібридного білкового продукту альбуміну, який піддався розщепленню Nкінцевого сигнального пептиду, у цьому описі, також називається також "зрілим гібридним білком альбуміну". В одному з варіантів реалізації цього винаходу запропонований полінуклеотид, , що кодує гібридний білок альбуміну, який містить або як альтернатива складається з G-CSF і білка сироваткового альбуміну. У додатковому варіанті реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається з білка G-CSF і білка сироваткового альбуміну. В інших варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається з біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента білка G-CSF і білка сироваткового альбуміну. В інших варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається з біологічно активного і/або терапевтично активного варіанта білка G-CSF і білка сироваткового альбуміну. У кращих варіантах реалізації компонент, що представляє собою білок сироваткового альбуміну, гібридного білка альбуміну являє собою зрілу частину сироваткового альбуміну. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують зазначені гібридні білки альбуміну. У додаткових варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається з білка G-CSF і біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента сироваткового альбуміну. У додаткових варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається з білка G-CSF і біологічно активного і/або терапевтично активного варіанта сироваткового альбуміну. У кращих варіантах реалізації частина білка G-CSF гібридного білка альбуміну являє собою зрілу частину білка G-CSF. В іншому кращому варіанті реалізації частина білка G-CSF гібридного білка альбуміну являє собою розчинний позаклітинний домен білка G-CSF. В альтернативному варіанті реалізації частина білка G-CSF гібридного білка альбуміну являє собою активну форму білка G-CSF. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують дані гібридні білки альбуміну. У додаткових варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається з біологічно активного і/або терапевтично активного фрагмента або варіанта білка G-CSF і біологічно активного і/або 6 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 терапевтично активного фрагмента або варіанта сироваткового альбуміну. У кращих варіантах реалізації цього винаходу запропонований гібридний білок альбуміну, що містить або як альтернатива складається зі зрілої частини білка G-CSF і зрілої частини сироваткового альбуміну. Цей винахід також включає полінуклеотиди, що кодують зазначені гібридні білки альбуміну. I. Визначення [0053] У даній заявці цей винахід описано з використанням декількох визначень, наведених нижче і в описі. [0054] Використовуваний у цьому описі термін "полінуклеотид" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує гібридний білок, що містить або як альтернатива складається зі щонайменше однієї молекули альбуміну (або її фрагмента або варіанта), з'єднаної в рамці зі щонайменше однією молекулою гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора (G-CSF) (або її фрагментом або варіантом). Використовуваний у цьому описі термін "гібридна конструкція альбуміну" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що містить або як альтернатива складається з полінуклеотида, що кодує щонайменше одну молекулу альбуміну (або її фрагмент або варіант), з'єднаного в рамці зі щонайменше одним полінуклеотидом, що кодує щонайменше одну молекулу G-CSF (або її фрагмент або варіант); і додатково містить, наприклад, один або більше наступних елементів: (1) функціональний вектор, що саморепліціюється (включаючи, але не обмежуючись ними, човниковий вектор, вектор експресії, інтеграційний вектор і/або систему реплікації), (2) область ініціації транскрипції (наприклад, промоторна область, така як, наприклад, регульований промотор або промотор, що індукується, конститутивний промотор), (3) область термінації транскрипції, (4) лідерну послідовність і (5) маркер, що селектується. Кожний з полінуклеотида, що кодує G-CSF і білка альбуміну, відразу після становлення частиною гібридної конструкції альбуміну, може називатися "частиною", "областю" або "фрагментом" гібридної конструкції альбуміну. [0055] Поліпептид G-CSF, що проявляє "терапевтичну активність", або білок G-CSF, який є "терапевтично активним", означає поліпептид G-CSF, що має один або більше видів відомої біологічної і/або терапевтичної активності, пов'язаної з білком G-CSF. Як необмежуючий приклад, "терапевтичний білок G-CSF" являє собою білок G-CSF, що придатний для лікування, попередження або полегшення захворювання, стану або розладу. Як необмежуючий приклад, "терапевтичний білок G-CSF" може являти собою білок, який специфічно зв'язується з конкретним типом клітин (нормальним (наприклад, лімфоцити) або аномальним (наприклад, ракові клітини)), і, отже, може бути використаний для прицільного впливу сполукою (лікарський засіб або цитотоксичний агент) специфічно на даний тип клітин. [0056] Використовуваний у цьому описі термін "суб'єкт" відноситься до тварини, краще ссавця, ще краще людини. Терміни "суб'єкт" і "пацієнт" можуть бути взаємозамінними. [0057] Термін "фармацевтично прийнятний носій" відноситься до будь-якого носія, який по суті не має тривалого або постійного шкідливого впливу при введенні індивідуумові. Фармацевтично прийнятні носії включають розріджувачі, наповнювачі, солі, дисперсійні середовища, покриття, емульгатори агенти, що змочують, підсолоджувачі або ароматизатори, регулятори тонічності, агенти, що сповільнюють абсорбцію, консерванти, антибактеріальні та протигрибкові агенти, буфери, агент, що регулює рН, антиоксиданти, стабілізатори, солюбілізатори, наповнювачі, кріозахисні агенти, агенти, що інгібують агрегацію, або допоміжна речовина сполуки будь-якого типу. Придатні носії описані в Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 2000, 20th Ed., Lippincott, Williams & Wilkins), включеному в цей опис за допомогою посилання. Кращі приклади зазначених носіїв або розріджувачів включають, але не обмежуються ними, воду, хлорид натрію, маніт, дегідрат трегалози, полісорбат, такий як полісорбат 80, різні фармацевтично прийнятні буфери для регулювання рН (наприклад, фосфатні буфери, цитратні буфери, ацетатні буфери та боратні буфери). [0058] Термін "фармацевтично прийнятні солі" включає солі, утворені аніонами, такими як отримані з соляної, фосфорної, оцтової, щавлевої, винної кислот і т.д., і солі, утворені катіонами, такими як отримані з гідроксидів натрію, калію, амонію, кальцію, заліза, ізопропіламіну, триетиламіну, 2-етиламіноетанолу, гістидину, прокаїну і т.д. Термін "стабілізатор для ліофілізації" відноситься до молекули, яка захищає та зменшує хімічну і/або фізичну нестабільність висушеного за допомогою сублімаційного сушіння речовини. Кращі приклади стабілізаторів для ліофілізації включають, але не обмежуються ними, сахарозу, трегалозу, глутамат натрію, гістидин, бетаїн, сульфат магнію, гліцерин, еритрит, гліцерол, арабіт, ксиліт, сорбіт, маніт, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, плюроніки та комбінації зазначених речовин. Кращий стабілізатор для ліофілізації являти собою цукор, що не 7 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відновлює, такий як дигідрат трегалози або сахароза. [0059] Термін "наповнювач" відноситься до з'єднання, яке надає маси ліофілізованій суміші та сприяє формуванню фізичної структури ліофілізованої таблетки. Типові наповнювачі включають сорбіт, гліцин, маніт і поліетиленгліколь. Термін "PMTT20/6,0" відноситься до композиції, що містить однозаміщений фосфат натрію (2,42 мг/мл, 17,4 мМ), двузаміщений фосфат натрію (0,35 мг/мл, 2,5 мМ), маніт (32,79 мг/мл, 180 мМ), дегідрат трегалози (22,70 мг/мл, 60 мМ), полісорбат 80 (0,1 мг/мл, 0,01 %), кінцевий рН зазначеної композиції рівний 6,0. Композиція також називається "новий буфер", "новий PMTT" або "новий буфер для приготування складу" і також описується як така, що містить 20 мМ фосфат, 180 мМ маніт, 60 мМ дегідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80, рН 6,0. [0060] Термін "PMTT10/7,2" відноситься до композиції, що містить 10 мМ фосфат, 190 мМ маніт, 60 мМ дигідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80, кінцевий рН зазначеної композиції рівний 7,2. Композиція також називається "старий буфер", "старий PMTT" або "старий буфер для приготування сполуки". [0061] Термін "PMTT" відноситься до композиції, що містить фосфат, маніт, дегідрат трегалози і полісорбат. [0062] Термін "CMTT10" відноситься до композиції, що містить 10 мМ цитрат натрію, 190 мМ маніт, 60 мМ дегідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80, буфер при рН, рівному 6,2. II. Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор [0063] Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF) являє собою гематопоетичний фактор росту, що стимулює вироблення нейтрофілів. Введення G-CSF приводить до швидкої індукції нейтрофільного лейкоцитозу. Інша активність G-CSF in vivo, що має важливе значення, являє собою мобілізацію гематопоетичних клітин-попередників у периферичній крові (Duhrsen et al, 1988; Molineux et al, 1999; Roberts et al, 1994). Зазначений ефект включає не тільки лінію диференціювання нейтрофілів, але поширюється й на інші попередники однієї лінії диференціювання та декількох ліній диференціювання, і плюрипотентні гематопоетичні стовбурні клітини (Molineux et al, 1999). G-CSF також збільшує клітинні явища, які є частиною механізму захисту від інфекцій, шляхом примування нейтрофілів, тим самим підвищуючи як їх фагоцитарну, так і антибактеріальну активність у відношенні опсонізованого Золотавого стафілокока. G-CSF також викликає хемотаксис нейтрофілів і моноцитів, і адгезію нейтрофілів (Yuo et al, 1989; Wang et al, 1988). [0064] У цей час схвалені рекомбінантні продукти G-CSF для ряду клінічних показань для стимуляції проліферації та диференціювання нейтрофілів. У клінічних дослідженнях філграстим (рекомбінантний метіоніл G-CSF людини; Нейпоген®, Амген (Amgen), Thousand Oaks, CA) сприяв збільшенню числа периферичних нейтрофілів і тим самим зниженню тривалості нейтропенії після мієлосупресивної хіміотерапії. Філграстим вводять щодня шляхом підшкірної (ПШ) ін'єкції. Пегфілграстим, кон'югований з поліетиленгліколем rG-CSF (Нейласта®), виявився безпечним і ефективним як альтернатива щоденної терапії rG-CSF, яка використовується один раз у Цикл, для зменшення частоти виникнення фебрильної нейтропенії у пацієнтів, що одержують мієлосупресивні протиракові препарати (Holmes, O'Shaughnessy et al, 2002; Green et al, 2003; Neulasta® Smpc 2007). III. Сироватковий альбумін людини Сироватковий альбумін людини (HSA) являє собою найбільш поширений білок крові в системі кровообігу людини, що зустрічається в природі, який вимірюється на рівні приблизно 40 грамів альбуміну/літр, що зберігається в кровообігу протягом більше 20 днів. В HSA відсутня ферментативна або імунологічна функція і він широко розповсюджений in vivo, і відомо, що він є носієм для терапевтичних речовин у крові. Альбумін являє собою білок-носій, що має мінімальну активність у фізіологічних концентраціях. Як HSA, так і рекомбінантний альбумін людини (rHSA) мають однаково тривалий час напівжиття в кровотоці у людини. Дослідження показало, що терапевтичні білки, генетично злиті з альбуміном людини, можуть набувати характеристики часу напівжиття альбуміну в кровотоці (Syed et al, 1997). Наприклад, дослідження на кроликах показало, що час напівжиття CD4, злитого з альбуміном, в 140 разів більше, ніж негібридного CD4 (Yeh et al, 1992). [0065] Сироватковий альбумін людини, білок, що складається з 585 амінокислот, у зрілій формі (як показано на Фіг. 1 патенту США 7592010) відповідальний за значну частину осмотичного тиску сироватки і також виконує функцію носія ендогенних і екзогенних лігандів. У цей час HSA для клінічного застосування одержують шляхом екстракції з крові людини. Одержання рекомбінантного HSA (rHSA) у мікроорганізмах описане в документах ЕР 330451 і EP 361991. IV. Лікування за допомогою G-CSF 8 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0066] Первинна профілактика за допомогою гранулоцитарних колонієстимулюючих факторів (G-CSF) рекомендується для попередження фебрильної нейтропенії у пацієнтів з високим ступенем ризику за віком, історією хвороби, характеристиками захворювання і мієлотоксичністю режиму хіміотерапії. Американське товариство клінічної онкології (ASCO) і Європейська організація по дослідженню та лікуванню раку (EORTC) рекомендує використовувати G-CSF, коли ризик фебрильної нейтропенії становить приблизно 20 %. Національна загальна онкологічна мережа США (NCCN) рекомендує відносне показання для профілактики G-CSF, коли ризик фебрильної нейтропенії становить від 10 % до 20 % і абсолютне показання для профілактики G-CSF, коли ризик фебрильної нейтропенії становить щонайменше 20 % (Smith et al, 2006, Vogel et al 2005, Timmer-Bonte et al 2006, NCCN Guidelines). [0067] Профілактика за допомогою колонієстимулюючих факторів (CSFs) рекомендується для зменшення токсичності певних режимів хіміотерапії. Однак додаткова вартість даних видів лікування являє собою значні труднощі як у США, так і особливо в частинах ЄС і може приводити до низького рівня застосування профілактичного лікування G-CSF, а також може обмежувати відбір пацієнтів для режимів дозоінтенсивної хіміотерапії (Timmer-Bonte et al, 2006; Adams et al, 2006, NCCN Guidelines). V. Фрагменти і варіанти поліпептидів та полінуклеотидів A. Фрагменти [0078] Цей винахід додатково відноситься до фрагментів білка G-CSF, білків альбуміну і/або гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом. Цей винахід також відноситься до полінуклеотидів, що кодують фрагменти білка G-CSF, білків альбуміну і/або гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом. Навіть якщо делеція однієї або більше амінокислот з N-кінця білка приведе до модифікації або втрати однієї або більше біологічних функцій білка G-CSF, білка альбуміну і/або гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, інші види терапевтичної активності і/або функціональної активності (наприклад, біологічна активність, здатність мультимеризуватися, здатність зв'язувати ліганд) як і раніше можуть бути збережені. Наприклад, здатність поліпептидів з N-кінцевими делеціями індукувати і/або зв'язуватися з антитілами, які розпізнають повні або зрілі форми поліпептидів, у цілому буде збережена у випадку, коли з N-кінця видаляють менше більшої частини залишків повного поліпептиду. Чи зберігає конкретний поліпептид, у якому відсутні N-кінцеві залишки повного поліпептиду, зазначені види імунологічної активності можна легко визначити рутинними способами, зазначеними в цьому описі та іншим способом, відомим у даній галузі техніки. Імовірно, мутеїн з більшою кількістю делетованих N-кінцевих залишків амінокислот може зберігати деяку біологічну або імуногенну активність. У дійсності, пептиди, що складаються з лише шести залишків амінокислот, часто можуть викликати імунну відповідь. [0071] Відповідно, фрагменти білка G-CSF, що відповідають частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, включають повнорозмірний білок, а також поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з амінокінця амінокислотної послідовності еталонного поліпептиду (тобто білка G-CSF або частини білка G-CSF гібридного білка альбуміну, який кодується полінуклеотидом або гібридною конструкцією альбуміну). Зокрема, Nкінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до q, де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот в еталонному поліпептиді (наприклад, білку G-CSF або частині білку G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом), і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до q мінус 6. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0072] Крім того, фрагменти поліпептидів сироваткового альбуміну, що відповідають частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, включають повнорозмірний білок, а також поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з амінокінця амінокислотної послідовності еталонного поліпептиду (тобто сироваткового альбуміну або частини сироваткового альбуміну гібридного білка альбуміну). У кращих варіантах реалізації Nкінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до 585, де 585 являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у зрілому сироватковому альбуміні людини, і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до 579. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. У додаткових варіантах реалізації Nкінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до 609, де 609 являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у повнорозмірному сироватковому альбуміні людини, і m визначається як будь-яке ціле число в діапазоні від 2 до 603. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0073] Більше того, фрагменти гібридних білків альбуміну згідно з цим винаходом включають 9 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повнорозмірний гібридний білок альбуміну, а також поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з амінокінця гібридного білка альбуміну, Зокрема, N-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від m до q, де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у гібридному білку альбуміну, і m визначається як будьяке ціле число в діапазоні від 2 до q мінус 6. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0074] Також, як зазначено вище, навіть якщо делеція однієї або більше амінокислот з Nкінця або С-кінця еталонного поліпептиду (наприклад, білка G-CSF; білка сироваткового альбуміну; або гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом) приведе до модифікації або втрати однієї або більше біологічних функцій білка, інші види функціональної активності (наприклад, біологічна активність, здатність мультимеризуватися, здатність зв'язувати ліганд) і/або терапевтичної активності як і раніше можуть бути збережені. Наприклад, здатність поліпептидів з С-кінцевими делеціями індукувати і/або зв'язуватися з антитілами, які розпізнають повні або зрілі форми поліпептиду, у цілому буде збережена, у випадку коли з Скінця видаляють менше більшої частини залишків повного або зрілого поліпептиду. Чи зберігає конкретний поліпептид, у якому відсутні N-кінцеві і/або С-кінцеві залишки еталонного поліпептиду, терапевтичну активність можна легко визначити рутинними способами, запропонованими в цій заявці, і/або іншим способом відомими в цій галузі техніки. [0075] Згідно з цим винаходом також запропоновані поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з карбоксикінця амінокислотної послідовності білка G-CSF, який відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 6 до q мінус 1, і де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот в еталонному поліпептиді (наприклад, білку G-CSF або частині білка GCSF гібридного білка альбуміну, що кодується полінуклеотидом або гібридною конструкцією альбуміну). Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0076] Крім того, сьогодення винаходи запропоновані поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з карбоксикінця амінокислотної послідовності білка альбуміну, який відповідає частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будьяке ціле число в діапазоні від 6 до 584, де 584 являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у зрілому сироватковому альбуміні людини мінус 1. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 6 до 608, де 608 являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у сироватковому альбуміні мінус 1. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0077] Більше того, цього винаходу запропоновані поліпептиди, що містять делецію одного або більше залишків з карбоксикінця гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом. Зокрема, С-кінцеві делеції можуть бути описані загальною формулою від 1 до n, де n являє собою будь-яке ціле число в діапазоні від 6 до q мінус 1, і де q являє собою ціле число, що показує загальну кількість залишків амінокислот у гібридному білку альбуміну згідно з цим винаходом. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0078] Крім того, будь-які з вищеописаних N- або C-кінцевих делецій можуть бути скомбіновані з одержанням N- і C-кінцевого делетованого еталонного поліпептиду. Згідно з цим винаходом також запропоновані поліпептиди, що містять делецію однієї або більше амінокислот як з аміно-, так і з карбоксикінця, які в цілому можуть бути описані як такі, що містять залишки від m до n еталонного поліпептиду (наприклад, білка G-CSF або частини білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, або сироваткового альбуміну, або частини білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, або гібридного білка альбуміну, або гібридного білка альбуміну, що кодується полінуклеотидом або гібридною конструкцією альбуміну згідно з цим винаходом), де n і m являють собою цілі числа, як описано вище. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0079] Ця заявка також відноситься до білків, що містять поліпептиди щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 % ідентичні еталонному поліпептиду G-CSF або еталонному поліпептиду альбуміну, зазначеному в цьому описі, або їх фрагменти. У кращих варіантах реалізації ця заявка відноситься до білків, що містять поліпептиди щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 10 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 % ідентичні еталонним поліпептидам, що містять амінокислотну послідовність N- і C-кінцевих делецій, описаних вище. Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0080] Кращі поліпептидні фрагменти згідно з цим винаходом являють собою фрагменти, що містять або як альтернатива, що складаються з амінокислотної послідовності, яка проявляє терапевтичну активність і/або функціональну активність (наприклад, біологічну активність) поліпептидної послідовності білка G-CSF або білка сироваткового альбуміну, фрагментом якого є дана амінокислотна послідовність. [0081] Інші кращі поліпептидні фрагменти являють собою біологічно активні фрагменти. Біологічно активні фрагменти являють собою фрагменти, що проявляють активність, схожу, але не обов'язково ідентичну активності поліпептиду згідно з цим винаходом. Біологічна активність фрагментів може включати поліпшену бажану активність або знижену небажану активність. В. Варіанти [0082] Термін "варіант" відноситься до полінуклеотиду або нуклеїнової кислоти, що відрізняються від еталонної нуклеїнової кислоти або поліпептиду, але, які зберігають їхні основні властивості. Як правило, варіанти в цілому дуже схожі і у багатьох областях ідентичні еталонній нуклеїновій кислоті або поліпептиду. [0083] У цьому описі термін "варіант" відноситься до частини білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, частини альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом або гібридного білка згідно з цим винаходом, що відрізняються за послідовністю від білка G-CSF, білка альбуміну і/або гібридного білка альбуміну відповідно, але, які зберігають щонайменше одну їх функціональну і/або терапевтичну властивість, як описано в інших місцях цього опису або іншим способом відомо в цій галузі техніки. Як правило, варіанти в цілому дуже схожі і у багатьох областях ідентичні амінокислотній послідовності білка G-CSF, який відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну, білка альбуміну, який відповідає частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну, і/або гібридного білка альбуміну. Нуклеїнові кислоти, що кодують дані варіанти, також включені в цей винахід. [0084] Цей винахід також відноситься до білків, що містять або як альтернатива, що складаються з амінокислотної послідовності, яка щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 %, приблизно 99 % або приблизно 100 % ідентична, наприклад, амінокислотній послідовності білка G-CSF, який відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, білка альбуміну, що відповідає частині білка альбуміну гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом, і/або гібридних білків альбуміну. Також запропоновані фрагменти даних поліпептидів. Додаткові поліпептиди, включені в цей винахід, являють собою поліпептиди, що кодуються полінуклеотидами, які гібридизуються з комплементом молекули нуклеїнової кислоти, що кодує гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом, у жорстких умовах гібридизації (наприклад, гібридизація з фільтр-зв'язаною ДНК в 6x суміші хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45 градусах Цельсія з наступним одним або більше промиваннями в 0,2 х SSC, 0,1 % SDS при приблизно 50-65 градусах Цельсія), у дуже жорстких умовах (наприклад, гібридизація з фільтр-зв'язаною ДНК в 6x суміші хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45 градусах Цельсія з наступним одним або більше промиваннями в 0,1 х SSC, 0,2 % SDS при приблизно 68 градусах Цельсія) або в інших жорстких умовах гібридизації, які відомі фахівцеві в цій галузі техніки (див., наприклад, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, сторінки 6.3.1-6.3.6 і 2.10.3). Полінуклеотиди, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0085] Під поліпептидом, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше, наприклад, на 95 % "ідентичну" запитуваній амінокислотній послідовності, мають на увазі, що зазначена амінокислотна послідовність розглянутого поліпептиду ідентична запитуваній послідовності за винятком того, що розглянута поліпептидна послідовність може містити до п'яти змін амінокислот на кожні 100 амінокислот запитуваної амінокислотної послідовності. Інакше кажучи, для одержання поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 95 % ідентичну запитуваній амінокислотній послідовності, до 5 % залишків амінокислот у розглянутій послідовності можуть бути вбудовані, вилучені або замінені на іншу амінокислоту. Дані зміни еталонної послідовності можуть відбуватися в аміно- і карбоксикінцевих положеннях еталонної амінокислотної послідовності або де-небудь між даними кінцевими положеннями упереміж або 11 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індивідуально серед залишків в еталонній послідовності, або в одній або більше суміжних груп у межах еталонної послідовності. [0086] З практичної точки зору, чи є який-небудь конкретний поліпептид щонайменше на приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 % ідентичний, наприклад, амінокислотній послідовності гібридного білка альбуміну згідно з цим винаходом або його фрагменту (наприклад, частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну або частині альбуміну гібридного білка альбуміну), можна визначити традиційним способом з використанням відомих комп'ютерних програм. Кращий спосіб визначення найбільш повної відповідності між запитуваною послідовністю (послідовністю згідно з цим винаходом) і розглянутою послідовністю, також відомий як глобальне зіставлення послідовностей, може бути визначений з використанням комп'ютерної програми FASTDB на основі алгоритму Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)). При зіставленні послідовностей, запитувана і розглянута послідовності або обидві являють собою нуклеотидні послідовності, або обидві являють собою амінокислотні послідовності. Результат глобального зіставлення послідовностей виражають у відсотках ідентичності. Кращі параметри, що використовуються при зіставленні амінокислот FASTDB, являють собою: Матриця = PAM 0, ktuple=2, Штраф на розбіжність (Mismatch Penalty) = 1, Штраф на з'єднання (Joining Penalty) = 20, Довжина групи рандомізації (Randomization Group Length) = 0, Границя відсікання (Cutoff Score) = 1, Розмір вікна (Window Size) = довжина послідовності, Штраф на делецію (Gap Penalty) = 5, Штраф на розмір делеції (Gap Size Penalty) = 0,05, Розмір вікна (Window Size) = 500 або довжина розглянутої амінокислотної послідовності, залежно від того яка коротше. [0087] Якщо розглянута послідовність коротше запитуваної послідовності внаслідок N- або С-кінцевих делецій, а не внутрішніх делецій, повинна бути проведена ручна корекція результатів. Причина полягає в тому, що програма FASTDB не враховує N- і С-кінцеві усікання розглянутої послідовності при розрахунках відсотка глобальної ідентичності. Для розглянутих послідовностей, усічених на N- і С-кінцях, щодо запитуваної послідовності, відсоток ідентичності коректують шляхом підрахунку числа залишків запитуваної послідовності, які є N- і С-кінцевими розглянутої залишками послідовності, які не збігаються/вирівняні з відповідним розглянутим залишком, у вигляді відсотка від загальних основ запитуваної послідовності. Збігається/чи вирівняний залишок визначають за результатами зіставлення послідовностей FASTDB. Потім даний відсоток віднімають від відсотка ідентичності, розрахованого за допомогою програми FASTDB вище, з використанням зазначених параметрів, з одержанням кінцевої величини відсотка ідентичності. Саме дану скінченну величину відсотка ідентичності використовують для цілей цього винаходу. Тільки залишки на N- і С-кінцях розглянутої послідовності, які не збігаються/вирівняні із запитуваною послідовністю, розглядають для цілей ручного коректування величини відсотка ідентичності. Тобто, тільки запитувані положення залишків за межами найбільш дальніх N- і С-кінцевих залишків розглянутої послідовності. [0088] Наприклад розглянуту послідовність, що складається з 90 залишків амінокислот, зіставляють із запитуваною послідовністю, що складається зі 100 залишків, з визначенням відсотка ідентичності. Делеція відбувається на N-кінці розглянутої послідовності і, отже, зіставлення FASTDB не показує збіг/зіставлення перших 10 залишків на N-кінці. 10 непарних залишків становлять 10 % послідовності (число залишків, що не збігаються на N- і Скінцях/загальне число залишків у запитуваній послідовності), тому 10 % віднімають від величини відсотка ідентичності, розрахованою програмою FASTDB. Якби 90 залишків, що залишилися ідеально збігалися, кінцевий відсоток ідентичності склав би 90 %. В іншому прикладі розглянуту послідовність, що складається з 90 залишків, порівнюють із запитуваною послідовністю, що складається зі 100 залишків. Цього разу делеції являють собою внутрішні делеції, тому немає залишків на N- або С-кінцях розглянутої послідовності, які не збігаються/вирівняні із запитуваною. У цьому випадку відсоток ідентичності, розрахований за допомогою FASTDB, не коректують вручну. Знову вручну коректують тільки положення залишків за межами N- і Скінцевих областей розглянутої послідовності, як показано при зіставленні FASTDB, які не збігаються/вирівняні із запитуваною послідовністю. Ніяких інших ручних коректувань непотрібно виконувати для цілей цього винаходу. [0089] Як правило варіант буде мати щонайменше приблизно 75 % (в інших варіантах реалізації щонайменше приблизно 80 %, приблизно 85 %, приблизно 90 %, приблизно 91 %, приблизно 92 %, приблизно 93 %, приблизно 94 %, приблизно 95 %, приблизно 96 %, приблизно 97 %, приблизно 98 % або приблизно 99 %) ідентичності послідовностей з довжиною нормального білка HA або G-CSF, який має ту же довжину, що і зазначений варіант. Гомологію або ідентичність на рівні нуклеотидної або амінокислотної послідовності визначають шляхом 12 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аналізу BLAST (засіб пошуку основного локального зіставлення) із застосуванням алгоритму, що використовується програмами blastp, blastn, blastx, tblastn і tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) and Altschul, J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993), повністю включений у цей опис за допомогою посилання), спеціально розробленими для пошуку подібності послідовностей. [0090] Підхід, що використовується програмою BLAST, полягає в тому, щоб спочатку розглянути схожі сегменти запитуваної послідовності та послідовності з бази даних, потім оцінити статистичну значимість усіх ідентифікованих збігів і, нарешті, підсумувати тільки ті збіги, які задовольняють попередньо обраному порогу значимості. Для розгляду основних питань по пошуку подібності баз даних послідовностей див. Altschul et al., (Nature Genetics 6: 119-129 (1994)),повністю включений у цей опис за допомогою посилання. Пошукові параметри для гістограми, описів, вирівнювань, очікування (тобто поріг статистичної значимості для повідомлення про збіги щодо послідовностей з бази даних), відсікання, матриці та фільтра є параметрами за замовчуванням. Стандартна матриця замін, що використовується blastp, blastx, tblastn і tblastx являє собою матрицю BLOSUM62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992), повністю включена у цей опис за допомогою посилання). Для blastn матрицю замін встановлюють співвідношеннями від М (тобто "премія" для пари залишків, що збігаються) до N (тобто штраф на залишки, що не збігаються), при цьому значення за замовчуванням для M і N являють собою 5 і -4 відповідно. Чотири параметри blastn можуть бути скоректовані в такий спосіб: Q-10 (штраф на створення делеції (gap creation penalty)); R=10 (штраф на продовження делеції (gap extension penalty)); wink=1 (генерує "влучення" у слова в кожному положенні wink.sup.th протягом запиту); і gapw=16 (встановлює ширину вікна, у якому одержують зіставлення, що містять делеції). Еквівалентні налаштування параметрів Blastp являли собою Q=9; R=2; wink=1; і gapw=32. У порівнянні Bestfit послідовностей, доступному у версії пакета GCG 10,0, використовують параметри ДНК GAP=50 (штраф на створення делеції (gap creation penalty)) і LEN=3 (штраф на продовження делеції (gap extension penalty)) і еквівалентні налаштування при порівняннях білка являють собою GAP=8 і LEN=2. [0091] Варіанти полінуклеотидів згідно з цим винаходом можуть містити зміни у областях, що кодують, областях, що не кодують або обох областях. Найкращими є варіанти полінуклеотидів, що містять зміни, які утворюють мовчазні заміни, додавання або делеції, але не змінюють властивості або види активності поліпептиду, що кодується. Кращі варіанти нуклеотидів, утворені мовчазними замінами через виродженості генетичного коду. Більше того, кращими також є варіанти поліпептидів, у яких менше 50, менше 40, менше 30, менше 20, менше 10 або 5-50, 5-25, 5-10, 1-5 або 1-2 амінокислоти замінені, вилучені або додані в будьякій комбінації. Варіанти полінуклеотидів можуть бути отримані з різних причин, наприклад, для оптимізації експресії кодоном для конкретного хазяїна (зміна кодонів у мРНК людини на кодони, кращі для бактеріального хазяїна, такого як дріжджі або E. coli). [0092] У кращому варіанті реалізації полінуклеотид згідно з цим винаходом, що кодує частину альбуміну гібридного білка альбуміну, оптимізують для експресії в клітинах дріжджів або ссавців. В іншому кращому варіанті реалізації полінуклеотид згідно з цим винаходом, що кодує частину білка G-CSF гібридного білка альбуміну, оптимізують для експресії в клітинах дріжджів або ссавців. У ще одному кращому варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом, оптимізують для експресії в клітинах дріжджів або ссавців. [0093] В альтернативному варіанті реалізації кодон-оптимізований полінуклеотид, що кодує частину білка G-CSF гібридного білка альбуміну, не гібридизується з полінуклеотидом дикого типу, що кодує білок G-CSF, у жорстких умовах гібридизації, як згідно з цим описом. В іншому варіанті реалізації кодон-оптимізований полінуклеотид, що кодує частину альбуміну гібридного білка альбуміну, не гібридизується з полінуклеотидом дикого типу, що кодуює білок альбуміну, у жорстких умовах гібридизації, згідно з цим описом. В іншому варіанті реалізації кодоноптимізований полінуклеотид, що кодує гібридний білок альбуміну, не гібридизується з полінуклеотидом дикого типу, що кодує частину білка G-CSF або частину білка альбуміну, у жорстких умовах гібридизації, згідно з цим описом. [0094] У додатковому варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує частину білка G-CSF гібридного білка альбуміну, не містить або як альтернатива не складається з послідовності даного білка G-CSF, що зустрічається в природі. В іншому варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує частину білка альбуміну гібридного білка альбуміну, не містить або як альтернатива не складається з послідовності білка альбуміну, що зустрічається в природі. В альтернативному варіанті реалізації полінуклеотид, що кодує гібридний білок альбуміну, не містить або як 13 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альтернатива не складається з послідовності частини білка G-CSF, що зустрічається в природі, або частини білка альбуміну. [0095] З використанням відомих способів білкової інженерії та технології рекомбінантних ДНК можуть бути отримані варіанти для поліпшення або зміни характеристик поліпептидів згідно з цим винаходом. Наприклад, одна або більше амінокислот можуть бути вилучені з Nкінця або С-кінця поліпептиду згідно з цим винаходом по суті без втрати біологічної функції. [0096] У кращих варіантах реалізації варіанти згідно з цим винаходом містять консервативні заміни. Під терміном "консервативні заміни" мають на увазі заміни всередині груп, такі як заміна аліфатичних або гідрофобних амінокислот Ala, Val, Leu і Ile; заміна гідроксильних залишків Ser і Tar; заміна кислих залишків Asp і Glu; заміна амідних залишків Asn і Gln, заміна основних залишків Lys, Arg і His; заміна ароматичних залишків Phe, Tyr і Trp і заміна амінокислот малого розміру Ala, Ser, Thr, Met і Gly. [0097] Керівництво відносного того як одержувати фенотипово мовчазні заміни амінокислот наведено, наприклад, в Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990), у якому автори відзначають, що існує дві основні стратегії для дослідження "толерантності" амінокислотної послідовності до зміни. [0098] У першій стратегії використовується "толерантність" замін амінокислот шляхом природного добору в процесі еволюції. Шляхом порівняння амінокислотних послідовностей у різних видів, можуть бути ідентифіковані консервативні амінокислоти. Дані консервативні амінокислоти, імовірно, мають важливе значення для функції білка. На відміну від цього, положення амінокислот, де заміни були допущені шляхом природного добору, означають, що дані положення не мають критичного значення для функції білка. Таким чином, положення, що допускають заміну амінокислот, можуть бути модифіковані, при цьому як і раніше зберігаючи біологічну активність білка. [0099] У другій стратегії використовується генна інженерія для введення змін амінокислот у конкретних положеннях клонованого гена для ідентифікації областей, що мають критичне значення для функції білка. Наприклад, може бути використаний сайт-спрямований мутагенез або мутагенез, що сканується аланіном (введення одиничних мутацій аланіну в кожному залишку в молекулі). Див. Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989). Отримані мутантні молекули потім можуть бути досліджені на предмет біологічної активності. [0100] Як стверджують автори, дані дві стратегії показали, що білки дивно "толерантні" до замін амінокислот. Автори також показують, які зміни амінокислот, імовірно, будуть дозволені в певних положеннях амінокислот у білку. Наприклад, для більшості прихованих (у межах третинної структури білка) залишків амінокислот необхідні неполярні бічні ланцюги, тоді як деякі особливості поверхневих бічних ланцюгів, як правило, зберігаються. Більше того, припустимі консервативні заміни амінокислот включають заміну аліфатичних або гідрофобних амінокислот Ala, Val, Leu і Be; заміну гідроксильних залишків Ser і Thr; заміну кислих залишків Asp і Glu; заміну амідних залишків Asn і Gln, заміну основних залишків Lys, Arg і His; заміну ароматичних залишків Phe, Tyr і Trp, і заміну амінокислот малого розміру Ala, Ser, Thr, Met і Gly. Крім консервативної заміни амінокислот, варіанти згідно з цим винаходом включають (i) поліпептиди, що містять заміни одного або більше неконсервативних залишків амінокислот, при цьому замінені залишки амінокислот можуть бути або можуть не бути кодовані генетичним кодом, або (ii) поліпептиди, що містять заміни одного або більше залишків амінокислот, що містять групу, яка замінює, або (iii) поліпептиди, які були злиті або хімічно сполучені з іншим з'єднанням, таким як з'єднання для збільшення стабільності і/або розчинності поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь), (iv) поліпептид, що містить додаткові амінокислоти, такий як, наприклад, пептид з гібридною областю Fc IgG. Вважається, що зазначені варіантні поліпептиди перебувають у рамках компетенції фахівця в цій галузі техніки виходячи з цього опису. [0101] Наприклад, варіанти поліпептидів, що містять заміни заряджених амінокислот на інші заряджені або нейтральні амінокислоти, можуть утворювати білки з поліпшеними характеристиками, такими як менша агрегація. Агрегація фармацевтичних сполук як знижує активність, так і підвищує кліренс внаслідок імуногенної активності агрегату. Див. Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993). [0102] У конкретних варіантах реалізації поліпептиди згідно з цим винаходом містять або як альтернатива складаються з фрагментів або варіантів амінокислотної послідовності гібридного білка альбуміну, амінокислотної послідовності білка G-CSF і/або сироваткового альбуміну людини, при цьому зазначені фрагменти або варіанти містять 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 і 50150 додавань, замін і/або делецій залишків амінокислот у порівнянні з еталонною амінокислотною послідовністю. У кращих варіантах реалізації заміни амінокислот є 14 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 консервативними. Нуклеїнові кислоти, що кодують дані поліпептиди, також включені в цей винахід. [0103] Поліпептид згідно з цим винаходом може складатися з амінокислот, з'єднаних одна з одною пептидними зв'язками або модифікованими пептидними зв'язками, тобто пептидні ізостери, і можуть містити амінокислоти, відмінні від 20 амінокислот, що кодуються геном. Поліпептиди можуть бути модифіковані або природними способами, такими як посттрансляційний процесінг, або технологіями хімічної модифікації, які добре відомі в цій галузі техніки. Зазначені модифікації добре описані в основних підручниках і в більш докладних монографіях, а також у багатотомній дослідницькій літературі. Модифікації можуть відбуватися в будь-якому місці поліпептиду, включаючи пептидний кістяк, бічні ланцюги амінокислот і аміноабо карбоксикінці. Очевидно, що той самий тип модифікації може бути присутнім у тій же або іншій степені в декількох ділянках у даному поліпептиді. Крім того, даний поліпептид може містити багато типів модифікацій. Поліпептиди можуть бути розгалуженими, наприклад, у результаті убіквітинілювання і вони можуть бути Циклічними з розгалуженням або без нього. Циклічні, розгалужені й розгалужені Циклічні поліпептиди можуть бути результатом посттрансляційних природних процесів або можуть бути отримані синтетичними способами. Модифікації включають ацетилування, ацилювання, АДФ-рибозилювання, амідування, ковалентне приєднання флавіну, ковалентне приєднання фрагмента гему, ковалентне приєднання нуклеотиду або похідного нуклеотиду, ковалентне приєднання ліпіду або похідного ліпіду, ковалентне приєднання фосфатидилінозиту, зшивання, Циклізацію, утворення дисульфідних зв'язків, деметилювання, утворення ковалентних перехресних зв'язків, утворення цистеїну, утворення піроглутамату, формілювання, гамма-карбоксилювання, глікозилювання, утворення GPI-«якоря", гідроксилювання, йодування, метилювання, міристилювання, окиснення, пегілювання, протеолітичний процесінг, фосфорилювання, пренілювання, рацемізацію, селеноілювання, сульфатуцію, опосередковуване транспортною РНК додавання амінокислот до білків, таке як аргінілювання та убіквітинілювання. (Див., наприклад, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, пгs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:4862 (1992)). С. Функціональна активність [0104] Термін "поліпептид, що має функціональну активність" відноситься до поліпептиду, здатного проявляти один або більше видів відомої функціональної активності, пов'язаної з повнорозмірним, про-протеїном і/або зрілою формою білка G-CSF. Зазначені види функціональної активності включають, але не обмежуються ними, біологічну активність, антигенність [здатність зв'язуватися (або конкурувати з поліпептидом за зв'язування) з антитілом до поліпептиду], імуногенність (здатність утворювати антитіло, яке зв'язується з конкретним поліпептидом згідно з цим винаходом), здатність утворювати мультимери з поліпептидами згідно з цим винаходом і здатність зв'язуватися з рецептором або лігандом поліпептиду. [0105] Термін "поліпептид, що має біологічну активність" відноситься до поліпептиду, що проявляє активність, схожу, але не обов'язково ідентичну активності білка G-CSF згідно з цим винаходом, включаючи зрілі форми, яка вимірюється в конкретному біологічному аналізі із залежністю від доз або без неї. [0106] У кращих варіантах реалізації гібридний білок альбуміну згідно з цим винаходом має щонайменше одну біологічну і/або терапевтичну активність, пов'язану з частиною білка G-CSF (або його фрагментом або варіантом), коли він не злитий з альбуміном. [0107] Гібридні білки альбуміну згідно з цим винаходом можуть бути досліджені на предмет функціональної активності (наприклад, біологічної активності) з використанням або рутинною модифікацією аналізів, відомих у цій галузі техніки, а також аналізів, запропонованих у цій заявці. Крім того, фахівець у цій галузі техніки може рутинним способом аналізувати фрагменти білка G-CSF, що відповідають частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну. Крім того, фахівець у цій галузі техніки може рутинним способом аналізувати фрагменти білка альбуміну, відповідні частини білка альбуміну гібридного білка альбуміну, на предмет активності з використанням аналізів, відомих у цій галузі техніки, і/або як описано в розділі Приклади нижче. [0108]Наприклад, в одному з варіантів реалізації, у якому аналізують здатність гібридного білка альбуміну зв'язувати або конкурувати з білком G-CSF за зв'язування з антитілом до поліпептиду G-CSF і/або антитілом до альбуміну, можуть бути використані різні імуноаналізи, відомі в цій галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись ними, системи конкурентного та безконкурентного аналізу з використанням технологій, таких як радіоімуноаналізи, ІФА 15 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (твердофазний імуноферментний аналіз), імуноаналізи "сендвіч»-типу, імунорадіометричні аналізи, гель-дифузійні реакції осадження, імунодифузійні аналізи, імуноаналізи in situ (з використанням колоїдного золота, ферменту або радіоізотопних міток, наприклад), вестернблоттінг, реакції осадження, реакції аглютинації (наприклад, реакції аглютинації в гелі, реакції гемаглютинації), реакції зв'язування комплементу, імунофлуоресцентні аналізи, аналізи білка А та аналізи методом імуноелектрофорезу і т.д. В одному з варіантів реалізації зв'язування антитіла виявляють шляхом детектування мітки на первинному антитілі. В іншому варіанті реалізації первинне антитіло виявляють шляхом детектування зв'язування вторинного антитіла або реагенту з первинним антитілом. В іншому варіанті реалізації вторинне антитіло мітять. У цій галузі техніки відомо багато способів детектування зв'язування в імуноаналізі та зазначені способи включені в обсяг цього винаходу. [0109] У кращому варіанті реалізації, у якому ідентифікують партнера по зв'язуванню (наприклад, рецептор або ліганд) білка G-CSF, можна аналізувати зв'язування з даним партнером по зв'язуванню за допомогою гібридного білка альбуміну, який містить даний білок G-CSF як частину білка G-CSF зазначеного гібриду, наприклад, способами, добре відомими у даній галузі техніки, такими як, наприклад, відновлювальна та не відновлювальна гельхроматографія, афінна хроматографія білків і афінний блоттінг. Див., у цілому, Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). В іншому варіанті реалізації здатність фізіологічних корелятів гібридного білка альбуміну зв'язуватися з рецептором (рецепторами) поліпептиду G-CSF, який відповідає частині білка G-CSF зазначеного гібрида, можна рутинним способом аналізувати з використанням технологій, відомих у цій галузі техніки. [0110] В альтернативному варіанті реалізації, у якому оцінюють здатність гібридного білка альбумін мультимеризуватися, можна аналізувати зв'язування з іншими компонентами мультимера, наприклад, спосіб, добре відомий у цій галузі техніки, такими як, наприклад, відновлювальна і невідновлювальна гель-хроматографія, афінна хроматографія білків і афінний блоттінг. Див., у цілому, Phizicky et al., вище. [0111] Імуноаналізи, які можуть бути використані для аналізу зв'язування і перехресної реактивності, та підтвердження ідентичності гібрида HAS-G-CSF, включають, але не обмежуються ними, системи конкурентного та безконкурентного аналізу з використанням технологій, таких як вестерн-блоттінг, радіоімуноаналізи, ІФА (твердофазний імуноферментний аналіз), імуноаналізи "сендвіч»-типу, реакції імуноосадження, реакції осадження, гель-дифузійні реакції осадження, імунодифузійні аналізи, реакції аглютинації, реакції зв'язування комплементу, імунорадіометричні аналізи, флуоресцентні імуноаналізи і аналізи білка А, та інші. Зазначені аналізи є рутинними і добре відомі в цій галузі техніки (див., наприклад, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, повністю включений у цей опис за допомогою посилання). [0112] Антитіла, які зв'язують білок G-CSF, що відповідає частині білка G-CSF гібридного білка альбуміну, також можуть бути описані або зазначені на основі їх афінності до зв'язування відносно даного білка або антигену, краще антигену, який вони специфічно зв'язують. Кращі значення афінності до зв'язування включають значення з константою дисоціації або Kd менше -2 -2 -3 -3 -4 -4 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M. Ще кращі значення афінності до зв'язування -5 -5 -6 -6 включають значення з константою дисоціації або Kd менше 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M, -7 -7 -8 -8 5×10 M, 10 M, 5×10 M або 10 M. Ще більш кращі значення афінності до зв'язування -9 -9 -10 -10 включають значення з константою дисоціації або Kd менше 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M, -11 -11 -12 -12 -13 -13 -14 -14 -15 -15 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M, 5×10 M, 10 M, 5×10 M або 10 M. Крім того, аналізи, зазначені в цьому описі та іншим способом відомі в цій галузі техніки, можна рутинним способом використовувати для вимірювання здатності гібридних білків альбуміну та їх фрагментів, варіантів і похідних, викликати біологічну активність і/або активність G-CSF (або in vitro, або in vivo), зв'язану або з частиною білка G-CSF і/або частиною альбуміну гібридного білка альбуміну. Інші способи відомі фахівцеві в цій галузі техніки і включені в обсяг цього винаходу. VI. Гібридний білок HSA-G-CSF [0113] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини (rHSA-G-CSF) являє собою аналог G-CSF. Приклади rHSA-G-CSFs описані в патенті США 5665863 і в патенті США 7041478, включених у цей опис за допомогою посилання. [0114] Інший приклад rHSA-G-CSF являє собою Нейгранін™, що розроблюється Teva Biopharmaceuticals USA LTD. Нейгранін™ ("NEUG") являє собою гібридний поліпептид, що складається з 759 амінокислот, з молекулярною масою, рівною приблизно 85 кДа, з'єднаний в один ланцюг. Залишки 1-585 відповідає зрілій формі HSA, і залишки 586-759 відповідають зрілій формі G-CSF людини. Гібридний поліпептид Нейгранін™ представлений на Фіг. 9. 16 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 VII. Одержання гібридного білка [0115] Приклади синтетичного способу одержання rHSA-G-CSF описані в заявці на патент США 11/929828, зміст якої повністю включено в цей опис за допомогою посилання. У деяких варіантах реалізації NEUG одержують з використанням дріжджової системи-хазяїна (Saccharomyces cerevisiae), створеної методами генної інженерії для експресії гібридного білка NEUG. NEUG відбирають з середовища дріжджової культури, що зброджується, і очищають з використанням способів, добре відомих у цій галузі техніки (наприклад, шляхом серії етапів хроматографії та фільтрації, таких як афінна хроматографія та іонообмінна хроматографія). [0116] В одному з необмежуючих прикладів гібридну конструкцію NEUG одержували в такий спосіб. Повнорозмірну кДНК альбуміну виділяли з бібліотеки кДНК людини в лабораторії Д-р. F.E. Baralle в Оксфордському університеті, Великобританія. Даний клон відправляли в Delta Biotechnology Limited, Нотінгем, Великобританія, у вигляді плазміди pAT153ALB. Крім того, модифікували пропептид HSA (RGVFRR), що складається з 6 амінокислот, для сприяння більш ефективному процесінгу в дріжджах (RSLDKR). [0117] Плазміда для одержання Нейграніну заснована на 2-мкм плазміді, виявленій в Saccharomyces cerevisiae дикого типу. Вектор експресії на основі PSAC35 (патенти EP 286424 B, US 5637504) містить ген LEU2 з Saccharomyces cerevisiae як маркер, що селектується, який доповнює дефіцит лейцину хазяїна для одержання. Дана плазміда для одержання також містить сильний дріжджовий промотор, PRB1, і послідовності плазміди pUC9, що забезпечують клонування та відтворення в E. coli. Крім того, зазначена плазміда проявляє унікальну властивість, згідно з якою вона усуває отримані з pUC9 послідовності, необхідні для відтворення в E. Coli, відразу після трансформації в дріжджі. Це досягається шляхом фланкування мішеней, що розпізнають FLP, і експресії рекомбінази FLP дріжджів з плазміди відразу після влучення в дріжджі. Таким чином, в організмі, що використовується для одержання NEUG, не присутня бактеріальна ДНК. Це підтверджено шляхом порятунку та секвенування 2 мкм плазміди з дріжджів після одержання головного банку клітин. [0118] Як описано вище, плазміду для одержання NEUG, що називають CID1643 (pSAC35:HSA.GCSF(T31-P204)), одержували з вектора експресії на основі pSAC35. Область, що відповідає T31-P204 G-CSF людини, ампліфіціювали шляхом ПЦР при додаванні придатних 5' і 3' сайтів рестрикції із забезпеченням гладкого злиття з 3'-кінцем відкритої рамки зчитування HSA. [0119] Флакони із запалом NEUG використовували для одержання головного банку клітин сGMP (MCB) в Human Genome Sciences, Inc., (HGS) у Роквіллі, Меріленд. Дослідження та одержання характеристик MCB NEUG виконували в Charles River Laboratories (Малверн, Пенсільванія, США) і Lark Technologies (Х'юстон, Техас, США) згідно з керівництвом ICH Q5D (Виділення та характеристика клітинних субстратів, що використовуються для виробництва біотехнологічних/біологічних продуктів). [0120] Потім робочий банк клітин сGMP (WCB), отриманий з даного MCB, одержували і досліджували в Charles River Laboratories (Малверн, Пенсільванія, США). [0121] Усі компоненти середовищ, що застосовуються у виробництві банків ліній клітин NEUG, були синтетичними, біосинтетичними або рослинного походження. Під час одержання лінії клітин або банку клітин не використовували компоненти тваринного або людського походження. [0122] Банки клітин зберігають при 1 мг/кг/тиждень, який був в ~ 12 разів вище, ніж спостережуваний після введення дози, що становить 0,45 мг/кг у людей. Тварини, що виліковуються, також демонстрували збільшення АВН і WBC. (Дані не наведені). Приклад 2: одержання терапевтичного NEUG-1 [0132] NEUG-1 одержували для клінічних досліджень у людей. Зазначений склад містив NEUG у кількості 15,0 мг/мл в PMMT10/7,2 (10 мM фосфат натрію, 200 мM маніт, 60 мM дегідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат-80, при pH 7,2). [0133] Композиція NEUG-1 наведена в Таблиці 1 нижче 45 Таблиця 1 Композиція лікарського продукту NEUG-1 Компонент Концентрація Нейгранін Однозаміщений фосфат натрію Дизаміщений фосфат натрію 15,0 мг/мл 0,44 мг/мл (3 мM) 0,97 мг/мл (7 мM) 36,4 мг/мл (200 мM) Маніт Кількість, що доставляється на Ступінь чистоти а флакон 15,0 мг USP, кілька 2,42 мг фармакопей USP, кілька 0,35 мг фармакопей USP, кілька 32,79 мг фармакопей 18 Призначення API Буферизуючий агент Буферизуючий агент Буферизуючий агент UA 103221 C2 Продовження таблиці 1 Компонент Концентрація 22,70 мг/мл (60 мM) 0,1 мг/мл Полісорбат 80 (0,01 %) Стерильна вода для Відновлення 1,0 ін'єкцій мл Дигідрат трегалози Кількість, що доставляється на Ступінь чистоти а флакон 22,7 мг Призначення Висока чистота Кріозахисний агент 0,1 мг USP, кілька фармакопей Інгібування агрегації 1,0 мол USP Розріджувач aa 0,16 мл надлишок міститься в кожному флаконі для забезпечення об'єму 1,0 мл, що доставляється. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [0134] Один типовий спосіб виготовлення нерозфасованого лікарського засобу (BDS) для NEUG-1 показаний необмежуючими етапами способу на Фіг. 13. Потім BDS зберігають при приблизно -80ºC (номінальне значення, прийнятний діапазон температури зберігання становить приблизно -65ºC). [0135] Для підвищення стійкості складу до транспортування і зберігання на клінічних базах, а також для одержання стабільного продукту з очікуваним тривалим строком зберігання, була розроблена ліофілізована форма NEUG-1. Способи сублімаційного сушіння добре відомі в цій галузі техніки і один з типових способів, який дозволяє одержувати ліофілізовані таблетки, що мають відмінні якості здійснювали, як описано в наступних етапах. Етап 1: розморожування та розведення нерозфасованого лікарського засобу [0136] Контейнери з нерозфасованим лікарським засобом NEUG розморожували при 1530ºC. Нерозфасований лікарський засіб поєднували (за необхідності), змішували і концентрацію білка визначали за поглинанням при 280 нм. Концентрацію нерозфасованого лікарського засобу використовували для розрахунків необхідної кількості буфера для розведення. Також вимірювали щільність і рН. Буфер для приготування сполуки використовували для розведення нерозфасованого лікарського засобу до необхідної кінцевої концентрації. Етап 2: стерильна фільтрація [0137] Розведений розчин переносили з області одержання в стерильну прийомну посудину за допомогою стерильних фільтрів, які були досліджені на предмет цілісності. Фільтраційний ряд складається з двох 0,2 мкм фільтрів ПВДФ у серії. Усі фільтри раніше не використовувалися та протестовані на предмет цілісності, і їх утилізують після одержання продукту. Етап 3: заповнення і часткове закупорювання [0138] Нейгранін поміщали в апірогенні 3 мл скляні флакони USP типу I, частково закупорювали і поміщали на бездонні піддони для ліофілізації. Виконували перевірки маси протягом усієї процедури заповнення для контролю об'єму заповнення. Етап 4: ліофілізація [0139] Цикл ліофілізації контролювали за тиском в камері і температурі полиць. Температуру продукту контролювали за допомогою термопар продукту, встановлених по всій камері ліофілізації. Частково закупорені флакони завантажували на попередньо охолоджені полиці і заморожували з контрольованою швидкістю. Етап відпалювання здійснювали зі сприянням кристалізації маніту (наповнювача). Потім здійснювали первинне сушіння і його контролювали шляхом моніторингу термопар. Вторинне сушіння здійснювали з досягненням необхідного вмісту вологи. Наприкінці вторинного сушіння вивільняли вакуум у камері ліофілізації шляхом випускання 0,2 мкм стерильного фільтрованого азоту в зазначену камеру. Етап 5: герметизація та закупорювання [0140] Пробки встановлювали на флакони під частковим вакуумом (приблизно 11-12 фунтів на кв. дюйм). Вивантажували піддони з продуктом і флакони закупорювали. [0141] Вихідна ліофілізована клінічна речовина (NEUG-1) виявилася досить стабільною з поточним терміном зберігання 2 року (при зберіганні при 2-8 °C), який, імовірно, буде додатково продовжений після розгляду даних досліджень стабільності, що тривають. Приклад 3: загальні властивості стандартного зразка NEUG-1, серія 2378-R [0142] Було розроблено безліч способів для дослідження фізико-хімічних і біологічних характеристик NEUG. Одна серія NEUG, що називається серія 2378-R стандартного зразка, 19 UA 103221 C2 5 містить 21,3 мг/мл NEUG і її одержували в 10 мМ фосфаті натрію, 200 мМ маніті, 60 мМ дегідраті трегалози і 0,01 % (мас./об.) полісорбаті 80 при рН 7,2 (PMTT10/7,2). Одержання фізико-хімічних характеристик здійснювали з використанням серії стандартного зразка і досліджувані властивості, аналітичні методи та узагальнення результатів наведено в Таблиці 2 нижче. Таблиця 2 Одержання характеристик NEUG-1, серія 2378-R Властивість Зовнішній вигляд pH Концентрація білка Осмоляльність Чистота Чистота Чистота Гетерогенність заряду Чистота мікрофлора Ендотоксин Аналітичний метод Серія 2378-R (NEUG-1) Візуальний огляд блідо-жовтий pH-електрод 7,3 A280 21,3 мг/мл Температура замерзання 313 мосмоль/кг SDS-ПААГ (за умов відновлення Умови відновлення: 99 % та не відновлення, фарбування Умови не відновлення 98 %: Кумассі синім) Е-ВЕРХ 97,4 % ОФ-ВЕРХ 83,9 % ІО-ВЕРХ 84,8 % Встановлений як стандартний SDS-ПААГ (фарбування зразок (Немає смуг при >1 % сріблом) основної смуги) Фільтрація через мембрану 0 КОЕ/10 мол Кінетичний турбідиметричний 0,293 ЄЕ/мг метод Граничний метод 96 % послідовності покрито) Пептидна карта (відновлення) Білок дріжджової клітиниІФА хазяїна Активність 10 15 20 >95 % DAHKS 49 нг/мг EC50=197,6  41,6 пг/мл Біоаналіз (проліферація клітин (встановлений як стандартний NFS60) зразок) [0143] Аналіз SDS-ПААГ NEUG-1 серії 2378-R з фарбуванням Кумассі синім приводить до одержання однієї смуги (Фіг. 19). Репрезентативна хроматограма Е-ВЕРХ і ОФ-ВЕРХ NEUG-1 серії 2378-r також показана на Фіг. 19А і 19В відповідно. Приклад 4: дослідження сполук NEUG-0 і NEUG-1 1. Вплив концентрації білка на чистоту мономера rHSA-G-CSF [0144] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини (rHSA-G-CSF) у концентраціях у діапазоні від 2,5 до 240 мг/мл інкубували в PMTT10/7,2 (10 мM фосфат, 190 мM маніт, 60 мM дигідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80, pH 7,2) при 25ºС протягом 24 годин. Після інкубації вимірювали чистоту мономера шляхом Е-ВЕРХ. [0145] Результати (Фіг. 1) показують, що агрегація збільшувалася з підвищенням концентрації rHSA-G-CSF. 2. Вплив pH на агрегацію rHSA-G-CSF [0146] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини в концентрації, рівній 15 мг/мл і 60 мг/мл, інкубували при 25ºС протягом 7 днів в PMTT10 (10 мM фосфат, 190 мM маніт, 60 мM дигідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80) при pH, рівному 6,0, 6,8, 7,2 і 8,0. Після інкубації вимірювали чистоту мономера rHA-G-CSF шляхом Е-ВЕРХ. 20 UA 103221 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0147] Результати (Фіг. 2) показують, що агрегація збільшувалася зі збільшенням pH і прискорювалася з підвищенням концентрації білка. 3. Вплив температури на агрегацію rHSA-G-CSF [0148] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини в концентрації, рівній 60 мг/мл, витримували в буфері PMTT10/7,2 при 4ºC, 25ºC або 40ºC протягом 24 годин. Після витримування вимірювали чистоту мономера rHA-G-CSF шляхом Е-ВЕРХ. [0149] Результати (Фіг. 3) показують, що агрегація прискорювалася з підвищенням температури. 4. Вплив pH на агрегацію rHSA-G-CSF [0150] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини в концентрації, рівній 48 мг/мл, витримували при 25ºС протягом 3 днів в PMTT10 (10 мM фосфат, 190 мM маніт, 60 мм дигідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80) при pH, рівному 5,8, 6,3, 6,4 або 7,0, або в буфері CMTT10 (10 мM цитрат натрію, 190 мM маніт, 60 мM дигідрат трегалози, 0,01 % (мас./об.) полісорбат 80) при pH, рівному 6,2. Чистоту мономера рекомбінантного альбуміну людини-гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора людини вимірювали шляхом Е-ВЕРХ в 0, 1, 2 і 3 день після витримування. [0151] Результати (Фіг. 4 і Фіг. 10) показують, що найбільше агрегація відбувалася в перший день після інкубації і що швидкість агрегації збільшувалася внаслідок збільшення pH. 5. Вплив pH на агрегацію rHSA-G-CSF [0152] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини в концентрації, рівній 15 мг/мл і 60 мг/мл, витримували при 4ºC, 25ºc або 40ºC протягом до 10 днів в PMTT10 при pH, рівному 6,0, 6,8, 7,2 або 8,0. Чистоту мономера вимірювали шляхом Е-ВЕРХ в 0, 1, 7 і 10 день після витримування. [0153] Результати (Фіг. 11) показують, що агрегація збільшувалася зі збільшенням pH і прискорювалася з підвищенням температури і концентрації білка. 6. Вплив pH на біоактивність rHSA-G-CSF [0154] Рекомбінантний альбумін людини-гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор людини в концентрації, рівній 15 мг/мл або 60 мг/мл, витримували при 4ºC, 25ºc або 40ºC протягом до 10 днів в PMTT10 при pH, рівному 6,0, 6,8, 7,2 або 8,0. Біоактивність вимірювали шляхом біоаналізу в 0 і або 7, або 10 день після витримування. [0155] Коротко, клітини NFS-60 проліферують у відповідь як на G-CSF, так і на NEUG. У даному аналізі 10000 клітин на лунку висівали в 96-ямковий мікропланшет і обробляли білками NEUG протягом 20 годин при 37ºC. Після витримування протягом 20 годин клітини NFS-60 піддавали імпульсному міченню 0,5 мкКі/лунка [3H]-Тімідину протягом 4 годин і визначали рівень синтезу ДНК, вимірюваний шляхом введення [3H]-Тімідину. Для статистичного аналізу вимірювання введення [3H]-Тімідину залежно від концентрації NEUG моделювали з використанням логістичної моделі з чотирма параметрами і визначали значення EC50 (пг/мл). Результати для досліджуваних білків представляли у вигляді значення відносної активності (ВА%), отриманого шляхом порівняння значення EC50 стандартного зразка з EC50 досліджуваного зразка, проаналізованого в рамках того ж аналізу [ВА% = (EC50 стандарту/EC50 зразка)*100]. [0156] Результати (Фіг. 12) показують, що активність rHSA-G-CSF краще зберігалася при витримуванні при низькому pH. 7. Вплив концентрації солі на агрегацію rHSA-G-CSF [0157] Іонну силу розчинів 60 мг/мл rHA-G-CSF контролювали шляхом зміни кількості хлориду натрію в розчині. Буфер для приготування складу являв собою PMTT10/7,2. Зразки витримували протягом 1 дня при 25 °C/ОВ 60 % при концентрації хлориду натрію, що становить 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ або 50 мМ, а потім аналізували шляхом Е-ВЕРХ. [0158] Результати показують, що підвищення концентрації солі зменшувало агрегацію rHSAG-CSF (Фіг. 5). 8. Вплив концентрації фосфату на агрегацію rHSA-G-CSF [0159] Іонну силу розчинів rHSA-60мг/мл G-CSF контролювали шляхом зміни кількості фосфату в розчині. Буфер для приготування сполуки являв собою PMTT pH 7,2. Зразки витримували протягом 1 дня при 25 °C/ОВ 60 % при концентрації фосфату, що становить 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 40 мМ або 50 мМ, а потім аналізували шляхом Е-ВЕРХ. [0160] Результати показують, що підвищення концентрації фосфату зменшувало агрегацію rHSA-G-CSF (Фіг. 6). Приклад 5: одержання терапевтичного NEUG-2 21 UA 103221 C2 5 10 15 [0161] NEUG-2 одержували для клінічних досліджень для застосування і введення в більш високих концентраціях. Зазначений склад містив NEUG у кількості 50,0 мг/мл в PMMT20/6,0 (20 мM фосфат натрію, 180 мM маніт, 60 мм трегалоза, 0,01 % полісорбат-80). [0162] По суті, дотримувалися того ж способу ферментації і очищення, показаного для NEUG-1 (див., наприклад, Фіг. 13). [0163] NEUG-2 одержували як у формі рідини, так і в ліофілізованій формі. Ліофілізовану форму одержували для підвищення стійкості сполуки до транспортування і зберігання на клінічних базах, а також для одержання стабільного продукту з очікуваним тривалим терміном зберігання. NEUG-2 сушили методом сублімаційного сушіння з використанням Циклу сублімаційного сушіння, ідентичного описаному для NEUG-1. Сполука NEUG-2 також утворювала правильні таблетки, що мають відмінні фармацевтичні якості. Приклад 6: порівняння сполук NEUG-0, NEUG-1 і NEUG-2 [0164] У Таблиці 3 показана фізико-хімічна порівнянність NEUG-0, стандартної серії NEUG-1 (стандартний зразок 2378-R) і трьох різних серій NEUG-2. У зазначеній таблиці "СР" означає прозорий, блідо-жовтий. "НВ" означає не визначено. Таблиця 3 Фізико-хімічна порівнянність NEUG-0, NEUG-1 і NEUG-2 NEUG-0 Токсикологія Властивість Аналітич. метод (серія 2579092) Зовнішній вигляд pH Концентраці я білка Візуальний огляд pH-електрод A280 Зниження Осмоляльніс температури ть замерзання SDS-ПААГ (в умовах відновлення та Чистота не відновлення, фарбування Кумассі синім) Чистота Е-ВЕРХ Чистота ОФ-ВЕРХ Гетерогенніс ІО-ВЕРХ ть заряду SDS-ПААГ Чистота (фарбування сріблом) Інтактна маса ІЕР/МС (очікувана 85086) Ідентичність N-кінцеве (очікувана: секвенування DAHKS) Пептидна карта Ідентичність (відновлення) Білок дріжджової ІФА (нг yHCP/мг клітинибілка) хазяїна CP NEUG-1 Поточний станд. зразок (2378-R) CP NEUG-2 Клінічна серія 071008005 CP NEUG-2 Клінічна серія 071025001 CP NEUG-2 Клінічна серія 071026004 CP 6,5 7,3 6,0 6,0 6,0 4,7 мг/мл 21,3 мг/мл 64,5 61,4 62,0 316 мосмоль/кг 313 мосмоль/кг 305 мосмоль/кг 310 мосмоль/кг 313 мосмоль/кг Відновлюв.: 97 % Невідновлю в.: 92 % Відновлюв.: 100 % Невідновлю в.: 95 % Відновлюв.: 100 % Невідновлю в.: 100 % Відновлюв.: 100 % Невідновлю в.: 100 % Відновлюв.: 100 % Невідновлю в.: 100 % 97,5 % 73,0 % 97,5 % 82,5 % 98,9 % 86,3 % 99,4 % 88,5 % 98,1 % 87,5 % 52,8 % 80,5 % 89,5 % 88,0 % 89,5 % Порівняна Порівнянна Порівнянна Порівнянна Порівнянна 85091 Да 85087 Да 92 % DAHKS, 3 % TYGEM >95 % DAHKS НВ >95 % DAHKS НВ >95 % DAHKS НВ >95 % DAHKS Порівнянна Порівнянна Порівнянна Порівнянна Порівнянна 198 ppm 49 ppm 22 39 ppm 19 ppm 20 ppm UA 103221 C2 Продовження таблиці 3 Активність Ендотоксин Залишкова ДНК 5 Біоаналіз проліферації клітин NFS60 80,9 % (% відносна активність) Кінетичний турбідиметричн 1,67 ЄЕ/мг ий метод Граничний