Злитий протеїн m.tuberculosis

Реферат: Винахід належить до злитого протеїну М. tuberculosis, полінуклеотиду, що його кодує, фармацевтичної композиції, що містить протеїн або полінуклеотид. UA 107788 C2 (12) UA 107788 C2 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід належить до способів запобігання або лікування реактивації інфекції М. tuberculosis у ссавця та до способів вкорочення тривалості курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis. Туберкульоз являє собою інфекційне захворювання, що спричинене інфекцією М. tuberculosis та іншими видами Mycobacterium. Він є основним захворюванням у країнах, що розвиваються, а також являє собою проблему, що росте, у розвинутих областях світу, приблизно з 8 мільйонами нових випадків та 3 мільйонами смертей щорічно. Незважаючи на те, що інфекція може бути безсимптомною протягом значного періоду часу, захворювання найбільш часто проявляється як гостре запалення легень, що приводить до лихоманки та обструктивного кашлю. При відсутності лікування це, звичайно, призводить до ускладнень та смерті. Незважаючи на те, що туберкульоз може в загальному випадку піддаватися лікуванню при застосуванні тривалої антибіотикотерапії, таке лікування не є достатнім для запобігання поширення захворювання. Інфіковані індивідууми можуть бути безсимптомними, але контагіозними, протягом деякого часу. Крім того, незважаючи на те, що дотримання режиму є критичним, поведінку пацієнта важко піддавати спостереженню. Деякі пацієнти не додержуються курсу лікування, що може призводити до неефективного лікування та розвитку стійкості до лікарських засобів. Навіть тоді, коли закінчено повний курс лікування інфекція М. tuberculosis не поширюється від інфікованого індивідуума, але залишається як латентна інфекція, яка може повторно активуватися. Для того, щоб контролювати поширення туберкульозу, є важливими ефективна вакцинація та точний ранній діагноз захворювання . На сьогоднішній день вакцинація живими бактеріями є найбільш ефективним способом для індукції протективного імунітету. Найбільш загальною мікобактерією, що використовується для цієї мети, є Bacillus Кальметта-Герена (BCG), авірулентний штам М. bovis. Проте безпечність та ефективність BCG є джерелом дискусій, а деякі країни, такі, як США, не вакцинують населення цим агентом. Діагностику туберкульозу, звичайно, проводять при використанні шкірного тесту, що передбачає інтрадермальне введення туберкулінової PPD (похідна на основі очищеного білка). Антиген-специфічні відповіді Т-клітин приводять до здатної до вимірювання індурації у місці ін'єкції через 48-72 години після введення, що свідчить про підданий дії мікобактеріальних антигенів. Проте чутливість та специфічність є проблемою у цьому аналізі, крім того, неможливо відрізнити індивідуумів, вакцинованих BCG, від інфікованих індивідуумів. Оскільки макрофаги, як було показано, діють як основні ефектори імунітету до Mycobacterium, Т-клітини є основними індукторами такого імунітету. Суттєва роль Т-клітин у захисті від інфекції Mycobacterium ілюструється частою появою інфекції Mycobacterium у + пацієнтів зі СНІДом, завдяки виснаженню CD4 Т-клітин, асоційованих з інфекцією, що + викликається вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ). Mycobacterium-реактивні CDA Т-клітини були продемонстровані як потужні продуценти у-інтерферону (IFN-γ), який, у свою чергу, був показаний, як такий, що запускає антимікобактеріальні ефекти у мишей. У той час як роль IFN-γ у людей є менш зрозумілою, дослідження показали, що 1,25-дигідрокси-вітамін D3, або самостійно, або у комбінації з IFN-γ або фактором некрозу пухлин альфа, активує макрофаги людини для інгібування інфекції М. tuberculosis. Крім того, є відомим, що IFN-γ стимулює макрофаги людини з утворення 1,25-дигідрокси-вітаміну D3. Подібно до цього інтерлейкін-12 (IL12) був продемонстрований як такий, що грає роль у стимуляції стійкості до інфекції М. tuberculosis. Для огляду імунології інфекції М. tuberculosis, див. Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom ред., 1994), Tuberculosis (2-е вид., Rom and Garay, ред., 2003), та Harrison's Principles of Internal Medicine, розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald та ін., ред., 2005). Все ще існує потреба в ефективних стратегіях лікування для запобігання реактивації інфекцій Mycobacterium tuberculosis, як активної, так і латентної. Даний винахід вирішує цю задачу та інші потреби. Опис приведених послідовностей SEQ ID NO: 1: Mtb72f з N-термінальною 6 His міткою (ДНК) SEQ ID NO: 2: Mtb72f з N-термінальною 6 His міткою (білок) SEQ ID NO: 3: M72 (варіант Mtb72f) з N-термінальною 2 His інсерцією (ДНК) SEQ ID NO: 4: M72 (варіант Mtb72f) з N-термінальною 2-His інсерцією (білок) SEQ ID NO: 5: Mtb72f без N-термінальної His інсерції (ДНК) SEQ ID NO: 6: Mtb72f без N-термінальної His інсерції (білок) Короткий виклад суті винаходу 1 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід забезпечує фармацевтичні композиції, що включають Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, наприклад, разом з одним або більше ад'ювантами, включаючи AS01B та AS02A. Даний винахід частково базується на відкритті винахідниками того факту, що введення Mtb72f злитого білка або його імуногенного фрагменту, наприклад, разом з одним або більше ад'ювантами або нуклеїновою кислотою, що кодує Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент, може запобігати або лікувати реактивацію активної або неактивної інфекції М. tuberculosis. У бажаному втіленні Mtb72f злитий білок або нуклеїнова кислота вводиться з одним або більше хіміотерапевтичними агентами, ефективними проти інфекції М. tuberculosis. В одному аспекті у способах запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи використовуються композиції, при цьому спосіб включає етап введення ссавцю, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи або лікуючи, таким чином, реактивацію туберкульозу. В іншому аспекті у способах запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи використовуються композиції, при цьому спосіб включає етап введення ссавцю, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, де експресований Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи або лікуючи, таким чином, реактивацію туберкульозу. В іншому аспекті у способах зменшення тривалості курсу лікування та хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis використовуються композиції, при цьому спосіб включає етап введення ссавцю, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis, та імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, дозволяючи, таким чином, зменшити тривалість курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis. Завдяки зменшенню тривалості курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis дані способи є також ефективними у поліпшенні прийнятності повного курсу лікування для індивідуума, який піддається лікуванню від інфекції М. tuberculosis. Короткий опис малюнків Фігура 1 графічно представляє модель реактивації М. tuberculosis у Swiss Webster мишей (SWR/J). Фігура показує моменти інфекції, хіміотерапевтичного лікування (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття), імунізацій та підрахунку бактеріального навантаження/колонієутворювальних одиниць (КУО). Фігура 2 показує імунні відповіді lgG1 та lgG2a антитіл у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей залишали без обробки, піддавали хіміотерапії (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) або три рази піддавали хіміотерапії та імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого без ад'юванта. Через 10 днів після останньої імунізації у мишей забирали кров, та сироватку перевіряли на відповідь aHTH-Mtb72f антитіл ізотипів lgG1 (червоний) та lgG2a (чорний) за допомогою ELISA. Фігура 3 показує імунну відповідь lgG1 та lgG2a антитіл у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей залишали без обробки, піддавали хіміотерапії (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) або три рази піддавали хіміотерапії та імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого з ад'ювантом AS01B. Через 10 днів після останньої імунізації у мишей забирали кров, та сироватку перевіряли на відповідь aHTH-Mtb72f антитіл ізотипів lgG1 (червоний) та lgG2a (чорний) за допомогою ELISA Фігура 4 показує відповіді інтерферону-гамма (IFN-γ) у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. З мишей одержували клітини селезінки у різні моменти часу та піддавали стимуляції in vitro протягом трьох днів за допомогою 10 мкг/мл або pMtb72f, або його компонентів (Mtb32 c та Mtb39), як зазначено. Як контролі, культури спленоцитів також стимулювали за допомогою або PPD (3 мкг/мл), або лізату BCG (10 мкг/мл), або соnА (3 мкг/мл), або тільки середовища. Послідовно вимірювали продукцію IFN-γ за допомогою ELISA. 2 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 5 показує відповіді IFN-γ у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. З мишей одержували клітини селезінки у різні моменти часу та піддавали стимуляції in vitro протягом трьох днів за допомогою 10 мкг/мл або pMtb72f, або його компонентів (Mtb32c та Mtb39), як зазначено. Як контролі, культури спленоцитів також стимулювали за допомогою або PPD (3 мкг/мл), або лізату BCG (10 мкг/мл), або соnА (3 мкг/мл), або тільки середовища. Послідовно вимірювали продукцію IFN-Γ за допомогою ELISA. Фігура 6 показує відповіді CD4+ Т-клітин та IFN-γ цитокіну у SWR/J мишей, інфікованих М. tuberculosis, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. З мишей одержували клітини селезінки у різні моменти часу та піддавали стимуляції in vitro протягом ночі за допомогою 10 мкг/мл pMtb72f. Ці клітини потім забарвлювали для виявлення CD4 та IFN-γ. Як контроль, культури спленоцитів також стимулювали тільки за допомогою середовища. Продукцію специфічного для CD4+ Т-клітин IFN-γ+ вимірювали після цього шляхом забарвлювання внутрішньоклітинного цитокіну (ICS). Фігура 7 показує табличне підсумовування значень продукції специфічного для CD4+ та CD8+ Т-клітин IFN-γ+ через 120 днів після інфекції Mtb. Клітини селезінки одержували з групи мишей, яких не піддавали обробці, піддавали обробці протягом 30, 60 або 90 днів шляхом комбінаційної терапії, або піддавали обробці при використанні комбінаційної терапії як допоміжного заходу до вакцинації Mtb72f. Спленоцити стимулювали протягом ночі за допомогою 10 мкг/мл pMtb72f. Потім клітини забарвлювали для виявлення CD4, CD8 або IFN-γ. Як контроль, культури спленоцитів також стимулювали тільки за допомогою середовища. Продукцію специфічного для CD4+ та CD8+ Т-клітин IFN-γ+ вимірювали після цього шляхом забарвлювання внутрішньоклітинного цитокіну. Фігура 8 показує виживання інфікованих М. tuberculosis SWR/J мишей, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей інфікували за допомогою аерозолю, що містить 50-100 КУО MtbH37Rv, а хіміотерапію (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) розпочинали у підмножині мишей через 30 днів. Хіміотерапію продовжували протягом 60 днів. Половину тих мишей, що одержували хіміотерапію, тричі піддавали імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого з ад'ювантом AS01B. Фігура 9 виживання інфікованих М. tuberculosis SWR/J мишей, яких піддавали хіміотерапії, а потім імунізували за допомогою Mtb72f. Мишей інфікували за допомогою аерозолю, що містить 50-100 КУО MtbH37Rv, а хіміотерапію (50 мг рифампіну/85 мг ізоніазиду на літр води для пиття) розпочинали у підмножині мишей через 30 днів. Хіміотерапію продовжували протягом 30, 60 або 90 днів у різних підмножині мишей. Половину тих мишей, що одержували хіміотерапію, тричі піддавали імунізації внутрішньом'язово за допомогою 8 мкг на дозу Mtb72f, рецептованого з ад'ювантом AS01B. Детальний опис специфічних втілень Даний винахід належить до композицій, що включають нуклеїнові кислоти Mtb72f або злиті білки та ад'ювант, корисних для лікування, запобігання або відстрочення реакцтивації активної або неактивної (тобто латентної) інфекції Mycobacterium, та способів їх застосування. Зокрема, композиції згідно з даним винаходом включають Mtb72f злиті поліпептиди або їх імуногенні фрагменти або нуклеїнові кислоти, що кодують Mtb72f злиті поліпептиди або їх імуногенні фрагменти, які містять компоненти з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, наприклад, видів, таких, як М. tuberculosis, М. bovis або М. africanum, або видів Mycobacterium, що є присутніми у навколишньому середовищі або є опортуністичними, та таких, що викликають опортуністичні інфекції, такі, як інфекції легень у хазяїв з порушеним імунітетом (наприклад, у пацієнтів зі СНІДом), наприклад, BCG, М. avium, M. intracellular, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, М. fortuitum та М. scrofulaceum (див., наприклад, Harrison's Principles of Internal Medicine, Розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald, та ін., ред., 2005). Винахідники згідно з даним винаходом несподівано виявили, що композиції, які включають Mtb72f злиті поліпептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують Mtb72f злиті поліпептиди, або їх імуногенні фрагменти, є корисними у лікуванні, запобіганні та відстроченні реактивації інфекції М. tuberulosis. У бажаному втіленні Mtb72f злитий поліпептид або нуклеїнова кислота вводяться з одним або більше хіміотерапевтичними агентами. Такі композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти, що їх кодують, є, таким чином, корисними для того, щоб викликати імунну відповідь у ссавців, що захищає проти реактивації симптомів захворювання. Mtb72f нуклеїнові кислоти та злиті поліпептиди даного винаходу можуть також включати інші компоненти, призначені для підсилення їх антигенності або для поліпшення цих антигенів в 3 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інших аспектах. Наприклад, поліпшена ізоляція злитих поліпептидних антигенів може бути удосконалена шляхом додання подовжувальних залишків гістидину до одного кінця антигену. Композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть включати додаткові копії антигенів або додаткові гетерологічні поліпептиди з Mycobacterium sp., такі, як MTB8.4 антиген, МТВ9.8 антиген, МТВ9.9 антиген, МТВ40 антиген, МТВ41 антиген, ESAT-6 антиген, МТВ85 комплексний антиген, а-кристалічний антиген або NS1 антиген. Альтернативно або додатково, композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть включати додаткові копії інших антигенів з Mycobacterium sp., такі, як Аg85В або МТСС#2. Композиції, поліпептиди та нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть також включати додаткові поліпептиди з інших джерел. Наприклад, композиції та злиті білки згідно з винаходом можуть включати поліпептиди або нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди, де поліпептид сприяє експресії антигену, наприклад, NS1, білок вірусу грипу (див., наприклад, WO99/40188 та WO93/04175). Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть бути одержані на основі переважних кодонів у вибраних видів, наприклад, людей. Композиції на основі Mtb72f злитого білка, звичайно, включають один або більше ад'ювантів, наприклад, AS01B (монофосфорил ліпід A (MPL) та QS21 у складі ліпосом; див., патентна публікація США № 2003/0143240); AS02A (3D-MPL та QS21 та емульсію масло-у-воді; див., Bojang, та ін., Lancet (2001) 358:1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; сапоніни, включаючи Quil А та його компоненти, наприклад, QS21, та міметики сапоніну; CWS; TDM; AGP; імуностимуляторні олігонуклеотиди, наприклад, CPG; Leif; та їх похідні. У бажаному втіленні Mtb72f злитий поліпептид вводиться разом з одним або більше ад'ювантами, вибраними з групи, що включає 3D-MPL та QS21 у складі ліпосом, наприклад, AS01 В, MPL та QS21, а також у формі емульсії масло-у-воді (наприклад, AS02A). Ад'юванти AS01B та AS02A є також описаними у Pichyangkul, та ін., Vaccine (2004) 22:383140. При доставці Mtb72f антигену у вигляді нуклеїнової кислоти, він може доставлятися, наприклад, у вірусному векторі (наприклад, у складі аденовірусного вектора), або у мутантній хазяйській бактеріальній клітині (тобто, мутантній, авірулентній Mycobacterium, Lactobacillus або Bacillus хазяйській клітині, включаючи Bacillus Кальметта-Герена (BCG) та Lactococcus lactis). В одному аспекті композиції використовуються в способах для запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи, при цьому спосіб включає етап введення ссавцеві, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи, таким чином, реактивації туберкульозу. При використанні способів згідно з даним винаходом, реактивація інфекції М. tuberculosis може бути відстрочена (наприклад, на період кілька місяців, років або на невизначений період). В одному аспекті композиції використовуються у способах для запобігання або лікування реактивації туберкульозу в особи, при цьому спосіб включає етап введення ссавцеві, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає нуклеїнову кислоту, яка кодує Mtb72f злитий білок або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу, де Mtb72f злитий білок індукує імунну відповідь проти М. tuberculosis, запобігаючи, таким чином, реактивації туберкульозу. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму з активною інфекцією М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нукле їнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму з неактивною або латентною інфекцією М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму, інфікованому мультирезистентним штамом М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться індивідууму, якого раніше було імунізовано за допомогою Bacillus Кальметта-Герена (BCG). В деяких втіленнях Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться з одним або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis. Приклади таких хіміотерапевтичних агентів включають, але не обмежуються, амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреоміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитроміцин, азитроміцин та флуорохінолони. Така хіміотерапія визначається висновком практикуючого лікаря при використанні бажаних комбінацій лікарських засобів. Хіміотерапевтичні агенти «першої черги», що використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, що не є мультирезистентною, включають ізоніазид, рифампін, етанбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти «другої черги», що використовуються 4 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 для лікування інфекції М. tuberculosis, яка демонструє стійкість до одного або більше лікарських засобів «першої черги» включають офлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин канаміцин та капреоміцин. Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок можуть вводитися перед, одночасно або після введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis. В одному втіленні Mtb72f нуклеїнова кислота або злитий білок вводиться приблизно через 2 тижні після початку введення одного або більше хіміотерапевтичних агентів. Один або більше хіміотерапевтичних агентів в загальному випадку вводяться протягом періоду часу, наприклад, приблизно 1, 2, 3 або 4 тижні, 2, 3, 4, 5, 6 або 8 місяців, 1 рік або довше. В окремих втіленнях ефект Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого білка посилюється шляхом введення Bacillus Кальметта-Герена (BCG). У деяких втіленнях після примування або першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше "бустерних" введень або подальше введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду (спосіб "примування (сенсибілізації) та бустеризації (стимулювання)"). Наприклад, після першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше введень Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого білка. В одному втіленні після першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше введень Mtb72f злитого поліпептиду. В одному втіленні після першого введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду проводять одне або більше введень Mtb72f нуклеїнової кислоти. Звичайно, перше або "примувальне" введення та друге або "бустерне" введення має інтервал 2-12 тижнів, або інтервал до 4-6 місяців. Подальші "бустерні" введення проводять з інтервалом приблизно 6 місяців або з інтервалом 1, 2, 3, 4 або 5 років. Традиційна бустерна обробка (наприклад, коли після примувального введення білка здійснюють бустерне введення) є також корисною у запобіганні або лікуванні реактивації М. tuberculosis. В іншому аспекті композиції використовуються у способах зниження або вкорочення курсу хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis, при цьому спосіб включає етап введення ссавцеві, вже інфікованому Mycobacterium tuberculosis, одного або більше хіміотерапевтичних агентів, ефективних проти інфекції М. tuberculosis та імунологічно ефективної кількості фармацевтичної композиції, що включає Mtb72f злитий поліпептид або його імуногенний фрагмент з видів Mycobacterium комплексу туберкульозу та ад'ювант, де вказаний Mtb72f злитий поліпептид індукує імунну відповідь на М. tuberculosis, дозволяючи, таким чином, знизити або вкоротити курс хіміотерапії проти інфекції М. tuberculosis. Звичайно, введення Mtb72f нуклеїнової кислоти або злитого поліпептиду буде дозволяти проводити ефективне хіміотерапевтичне лікування інфекції М. tuberculosis протягом періоду 6 місяців, 5 місяців, 4 місяців, 3 місяців або менше. Композиції Mtb72f, звичайно, вводяться людям, але є ефективними для інших ссавців, включаючи домашніх ссавців (тобто, собак, котів, кролів, пацюків, мишей, морських свинок, хом'яків, шиншил) та сільськогосподарських ссавців (тобто, корів, свиней, овець, кіз, коней). У своїх загальних аспектах Mtb72f злитий білок згідно з винаходом являє собою білок, який включає принаймні імуногенний фрагмент кожного з трьох антигенів Ra12-TbH9-Ra35. Згідно з цією заявкою Ra35 належить до N-термінального кінця Mtb32A (Ra35FL), що включає принаймні приблизно перші 205 амінокислот Mtb32A з М. tuberculosis, нуклеотидна та амінокислотна послідовність якого розкрита на Фігурі 4 у патентній заявці США № 09/597,796, або відповідну ділянку інших видів Mycobacterium. Найбільш типово, Ra35 належить до частини послідовності SEQ ID NO: 2, розкритій у даній заявці, що відповідає залишкам 535-729. Альтернативно, це поняття належить до варіанту Ra35, в якому амінокислота Ser, що відповідає положенню 710 у SEQ ID NO: 2, замінена на Ala. Ra12 належить до С-термінального кінця Mtb32A (Ra35FL), що включає принаймні приблизно 132 амінокислоти з МТВ32А з М. tuberculosis, послідовність яких розкрита як SEQ ID NO: 4 (ДНК) та SEQ ID NO: 66 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентній заявці США № 09/072,967, або відповідну ділянку інших видів Mycobacterium. Найбільш типово, Ra12 належить до частини послідовності SEQ ID NO: 2, розкритій у даній заявці, що відповідає залишкам 8-139. Mtb39 (TbH9) належить до послідовності, що є суттєво такою, як розкрито у SEQ ID NO: 106 (кДНК повної довжини) та у SEQ ID NO: 107 (білкова послідовність повної довжини) у патентних заявках США № 08/658,800, № 08/659,683, № 08/818,112 та № 08/818,111 та в заявках WO97/09428 та WO97/09429. Послідовність є також розкритою як SEQ ID NO: 33 (ДНК) та SEQ ID NO: 91 (амінокислотна послідовність) у патентній заявці США № 09/056,559. Найбільш типово, ТЬН9 належить до частини послідовності SEQ ID NO: 2, розкритій у даній заявці, що відповідає залишкам 143-532. 5 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зазначене нижче забезпечує послідовності деяких індивідуальних антигенів, що використовуються у композиції та злитих білках згідно з винаходом: Mtb32A (TbRa35FL або Ra35FL), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 17 (кДНК) та SEQ ID NO: 79 (білок) у патентних заявках США № 08/523,436, № 08/523,435, № 08/658,800, № 08/659,683, № 08/818,112, № 09/056,556 та № 08/818,111 та у заявках WO97/09428 та WO97/09429, див. також Skeiky та ін., Infection and Immunity 67:3998-4007 (1999). Зазначене нижче забезпечує послідовності деяких злитих білків згідно з винаходом: TbH9Ra35 (Mtb59F), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 23 (кДНК) та SEQ ID NO: 24 (білок) у патентній заявці США № 09/287,849 та заявці PCT/US99/07717; Ra12-TbH9-Ra35 (Mtb72f), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 5 (ДНК) та SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 6 (білок) у даній заявці, а також у патентній заявці США № 09/223,040 та у PCT/US99/07717. Послідовність SEQ ID NO: 1 та SEQ ID NO: 2 включає His мітку 6 залишків His. М72, що являє собою мутант Mtb72f, в якому залишок серину в амінокислотному положенні 710 у послідовності SEQ ID NO: 2 є зміненим на Ala, (а також 4 залишки His є видаленими з Hisмітки на N термінальному кінці), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: З (ДНК) та SEQ ID NO: 4 (білок) у даній заявці. Варіант цих послідовностей, в яких білок має His мітку 6 залишків His, є розкритим у патентній заявці США № 09/597,796 та в PCT/USO1/19959. Шляхом заміни Ser710 на Ala, M72 стає більш резистентним до аутолізу, ніж Mtb72f. Зазначене нижче забезпечує послідовності деяких додаткових антигенів, що використовуються у композиції та злитих білках згідно з винаходом: Мtb8.4 (DPV), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 101 (кДНК) та SEQ ID NO: 102 (білок) у патентних заявках США № 08/658,800, № 08/659,683, № 08/818,112 та № 08/818,111, а також у заявках WO97/09428 та WO97/09429; Mtb9.8 (MSL), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 12 (ДНК), SEQ ID NO: 109 (передбачена амінокислотна послідовність) та від SEQ ID NO: 110 до 124 (пептиди) у патентних заявках США № 08/859,381, № 08/858,998, № 09/073,009 та № 09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514; Mtb9.9A (МТІ, що також є відомим як МТІ-А), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 3 та SEQ ID NO: 4 (ДНК) та SEQ ID NO: 29 та від SEQ ID NO: 51 до 66 (ORF пептид для МТІ) у патентних заявках США № 08/859,381, № 08/858,998, № 09/073,009 та v09/073,010, a також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514. Існують два інші варіанти МТІ, що називаються МТІ-В та МТІ-С; Mtb40 (НТСС#1), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 137 (кДНК) та 138 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентних заявках США № 09/073,009 та № 09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514; Mtb41 (МТСС#2), послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 140 (кДНК) та SEQ ID NO: 142 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентних заявках США № 09/073,009 та № 09/073,010, а також у заявках PCT/US98/10407 та PCT/US98/10514; ESAT-6, послідовність якого розкрита як SEQ ID NO: 103 (ДНК) та SEQ ID NO: 104 (передбачена амінокислотна послідовність) у патентній заявці США № 09/072,967. Послідовність ESAT-6 є також розкритою у патенті США № 5,955,077; α-кристалічний антиген, послідовність якого розкрита у Verbon та ін., J. Bad. 174:13521359(1992); 85 комплексний антиген, послідовність якого розкрита у Content та ін., Infect. & Immunol. 59:3205-3212 (1991). Кожна із зазначених послідовностей є розкритою у Cole та ін. Nature 393:537 (1998) та може бути знайдена, наприклад, за адресою http://www.sanger.ac.uk та http:/www.pasteur.fr/mycdb/. Кожна із зазначених вище послідовностей є розкритою у патентних заявках США № № 08/523,435, 08/523,436, 08/658,800, 08/659,683, 08/818,111, 08/818,112, 08/942,341, 08/942,578, 08/858,998, 08/859,381, 09/056,556, 09/072,596, 09/072,967, 09/073,009, 09/073,010, 09/223,040, 09/287,849, а також у заявках РСТ PCT/US98/10407, PCT/US98/10514, PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, WO97/09428 та WO97/09429, WO98/16645, WO98/16646, кожна з яких введена в дану заявку як посилання. Антигени, описані в даній заявці, включають поліморфні варіанти та консервативно модифіковані варіації, а також проміжні штами та міжвидові гомологи Mycobactehum. Крім того, антигени, описані в даній заявці, включають підпослідовності або вкорочені послідовності. Злиті білки можуть також містити додаткові поліпептиди, необов'язково гетерологічні пептиди з Mycobacterium або інших джерел. Ці антигени можуть бути модифіковані, наприклад, шляхом, 6 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 додання лінкерних пептидних послідовностей, як описано нижче. Ці лінкерні пептиди можуть бути вбудовані між одним або більше компонентами, які складають кожний зі злитих білків. Визначення Термін "реактивація туберкульозу" належить до більш пізнього виявлення симптомів захворювання у індивідууму, який виявляється як позитивний у туберкуліновій пробі, проте не має явних симптомів захворювання. Індивідуум є інфікованим М. tuberculosis та може мати або може не мати симптомів активного захворювання, які виявлялися раніше, та який в достатній мірі піддавався лікування для переведення туберкульозу у неактивний або латентний стан. Проте способи для запобігання або лікування реактивації туберкульозу можуть бути розпочаті також у індивідуума, який виявляє активні симптоми захворювання. "Первинний туберкульоз" належить до клінічного захворювання (прояв симптомів захворювання), що безпосередньо йде за інфекцією М. tuberculosis. Див., Harrison's Principles of Internal Medicine, Розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald, та ін., ред., 2005). "Вторинний туберкульоз" або "постпервинний туберкульоз" належить до реактивації прихованої, неактивної або латентної інфекції М. tuberculosis. Див., Harrison's Principles of Internal Medicine, вище. "Активна інфекція М. tuberculosis" належить до інфекції М. tuberculosis з вираженими симптомами захворювання. "Прихована, неактивна або латентна інфекція М. tuberculosis" належить до інфекції М. tuberculosis без виражених симптомів захворювання. "Резистентна до лікарських засобів" інфекція М. tuberculosis належить до інфекції М. tuberculosis, в якій інфекційний штам не підтримується у статичному стані або не вбивається (є резистентним) одним або більше так званих хіміотерапевтичних агентів «першої черги», ефективних у лікуванні інфекції М. tuberculosis (наприклад, ізоніазидом, рифампіном, етамбутолом, стрептоміцином та піразинамідом). "Мультирезистентна" інфекції М. tuberculosis належить до інфекції М. tuberculosis, де інфекційний штам є стійким до двох або більше хіміотерапевтичних агентів «першої черги», ефективних у лікуванні інфекції М. tuberculosis . "Хіміотерапевтичний агент, ефективний у лікуванні інфекції М. tuberculosis" належить до фармакологічних агентів, що є відомими та використовуються в області техніки для лікування інфекцій М. tuberculosis. Приклади фармакологічних агентів, що використовуються для лікування інфекцій М. tuberculosis, включають, але без обмеження, амікацин, аміносаліцилову кислоту, капреоміцин, циклосерин, етамбутол, етіонамід, ізоніазид, канаміцин, піразинамід, рифаміцини (тобто, рифампін, рифапентин та рифабутин), стрептоміцин, офлоксацин, ципрофлоксацин, кларитроміцин, азитроміцин та флуорохінолони. Хіміотерапевтичні агенти «першої черги», що використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, що не є резистентною до лікарських засобів, включають ізоніазид, рифампін, етанбутол, стрептоміцин та піразинамід. Хіміотерапевтичні агенти «другої черги», що використовуються для лікування інфекції М. tuberculosis, яка демонструє стійкість до одного або більше лікарських засобів «першої черги», включають офлоксацин, ципрофлоксацин, етіонамід, аміносаліцилову кислоту, циклосерин, амікацин канаміцин та капреоміцин. Такі фармакологічні агенти розглядаються у розділі 48 Goodman та Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman та Limbird ред., 2001. Скорочення "FL" належить до повної довжини, тобто поліпептиду, який має ту саму довжину, що й поліпептид дикого типу. "His мітка" належить до ланцюга His залишків, типово 6 залишків, що є вбудованими на Nтермінальному кінці, звичайно, безпосередньо після Met залишку ініціації або також на Стермінальному кінці. Вони звичайно є гетерологічними для нативної послідовності, але вбудовані тому, що вони сприяють ізоляції шляхом поліпшення зв'язування білка з іммобілізованими смолами металоафінної хроматографії (ІМАС). Взагалі, присутність або відсутність His мітки не є важливою з точки зору індукції корисної імунної відповіді на антигенний білок. У випадку, коли виникає шкідлива імунна реакція на His мітку як таку, вважається кращим мінімізувати довжину His мітки, наприклад, до 4 або менше залишків, зокрема, до 2 залишків. Термін "його імуногенний фрагмент" належить до поліпептиду, який включає епітоп, який упізнається цитотоксичними Т-лімфоцитами, хелперними Т-лімфоцитами або В-клітинами. Типово, імуногенний фрагмент Mtb72f буде являти собою поліпептид, який містить 500 або більше амінокислот, наприклад, 600 або більше амінокислот, наприклад, 700 або більше амінокислот. Винахід також охоплює множину фрагментів, наприклад, фрагменти, які перекривають, що разом покривають усю або суттєво усю (наприклад, 500 або більше 7 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислот, наприклад, 600 або більше амінокислот, наприклад, 700 або більше амінокислот) послідовність Mtb72F злитого білка. Термін "види Mycobacterium комплексу туберкульозу" включає ті види, які традиційно вважаються такими, що викликають захворювання на туберкульоз, а також види Mycobacterium навколишнього середовища та опортуністичні види, що викликають туберкульоз та захворювання легень у пацієнтів з порушеним імунітетом, таких, як пацієнти зі СНІДом, наприклад, М. tuberculosis, М. bovis, або М. africanum, BCG, М. avium, M. intracellular, M. celatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaccae, M. fortuitum та М. scrofulaceum (див., наприклад, Harrison's Principles of Internal Medicine, розділ 150, стор. 953-966 (16-е вид., Braunwald, та ін., ред., 2005). Ад'ювант належить до компонентів у вакцині або терапевтичній композиції, що підвищують специфічну імунну відповідь на антиген (див., наприклад, Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411 (1992)). Ад'юванти індукують імунні відповіді Th1 типу та Th2 типу. Цитокіни Th1 типів (наприклад, IFN-γ, IL-2 та IL-12) мають тенденцію до індукції опосередкованої клітинами імунної відповіді на введений антиген, у той час, як цитокіни Тп2 типу (наприклад, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 та TNF-3) мають тенденцію до індукції гуморальної імунної відповіді. Ад'юванти, здатні до переважної стимуляції опосередкованої Th1 клітинами імунної відповіді є описаними в WO 94/00153 та WO 95/17209. "Нуклеїнової кислоти" належить до дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів та їх полімерів або в одноланцюговій, або у дволанцюговій формі. Термін охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі аналоги нуклеотидів або модифіковані залишки скелету або зв'язків, які є синтетичними, існуючі у природі або такі, що не існують у природі, які мають однакові зв'язувальні властивості зі стандартною нуклеїновою кислотою, та ті, що метаболізуються подібним до стандартних нуклеотидів чином. Приклади таких аналогів включають, але без обмеження, фосфортіоати, фосфорамідати, метилфосфонати, хіральні метилфосфонати, 2-Ометил рибонуклеотиди, пептид-нуклеїнові кислоти (PNA). Якщо не вказано інше, то специфічна послідовність нуклеїнової кислоти також охоплює її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміни на основі вироджених кодонів) та комплементарні послідовності, а також послідовність, яка детально приведена. Зокрема, заміни на основі вироджених кодонів можуть бути здійснені за допомогою вироджених послідовностей, в яких третє положення одного або більше вибраних (або усіх) кодонів є заміщеним залишком змішаного типу та/або дезоксиінозиновим залишком (Batzer та ін., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka та ін., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini та ін., Мої. Cell. Probes 8:9198 (1994)). Термін нуклеїнова кислота використовується почергово з терміном ген, кДНК, мРНК, олігонуклеотид та полінуклеотид. Терміни "поліпептид", "пептид" та "білок" в даній заявці використовуються почергово і відносяться до полімерів амінокислотних залишків. Терміни застосовуються до амінокислотних полімерів, в яких один або більше амінокислотних залишків являють собою штучні хімічні міметики відповідної існуючої у природі амінокислоти, а також до існуючих у природі амінокислотних полімерів та до неіснуючих у природі амінокислотних полімерів. Термін "амінокислота" належить до існуючих в природі та синтетичних амінокислот, а також до аналогів амінокислот та міметиків амінокислот, що функціонують подібним до існуючих у природі амінокислот чином. Існуючі у природі амінокислоти є такими, що кодуються генетичним кодом, а також ті амінокислоти, які є модифікованими після цього, наприклад, гідроксипролін, γкарбоксиглутамат та О-фосфосерин. Аналоги амінокислот відносяться до сполук, що мають однакову основну структуру з існуючими в природі амінокислотами, тобто а вуглець, що є зв'язаним з воднем, карбоксильну групу, аміногрупу та R групу, наприклад, гомосерин, норлейцин, метіонін сульфоксид, метіонін метилсульфоній. Такі аналоги мають модифіковані R групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні скелети, але залишаються при цьому тими ж основними структурами, що й існуючі в природі амінокислоти. Амінокислотні міметики відносяться до хімічних сполук, які мають структуру, яка відрізняється від загальної хімічної структури амінокислот, але такі, що функціонують подібним до існуючих в природі амінокислот чином. Амінокислоти можуть позначатися в даній заявці або за допомогою трибуквеного символу, або однобуквеного символами, як рекомендовано IUPAC-IUB Комісією з біохімічної номенклатури. Нуклеотиди можуть позначатися за допомогою їх загальноприйнятого однобуквеного коду. Термін "консервативно модифіковані варіанти" застосовується як для амінокислотних послідовностей, так і для послідовностей нуклеїнових кислот. Стосовно певних послідовностей нуклеїнової кислоти термін "консервативно модифіковані варіанти" належить до таких 8 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або суттєво ідентичні амінокислотні послідовності, або де нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, до суттєво ідентичних послідовностей. Завдяки виродженості генетичного коду будь-який даний білок кодує велика кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG та GCU усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, де аланін позначається кодоном, цей кодон може бути змінений на будь-який з відповідних описаних кодонів без зміни кодованого поліпептиду. Такі варіації нуклеїнової кислоти являють собою "мовчазні варіації", які є одним з видів варіацій на основі консервативної модифікації. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти в даній заявці, яка кодує поліпептид, також описує кожну можливу мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти. Будь-який спеціаліст в даній області техніки може визнати, що кожний кодон в нуклеїновій кислоті (за винятком AUG, який звичайно є єдиним кодоном для метіоніну, та TGG, який звичайно є єдиним кодоном для триптофану) може бути модифікований з одержанням функціонально ідентичної молекули. Згідно з цим кожна мовчазна мутація нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, мається на увазі для кожної описаної послідовності. Що стосується амінокислотних послідовностей, то спеціаліст в даній області має визнати, що індивідуальні заміни, делеції або доповнення до послідовності нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, що замінюють, додають або видаляють одну амінокислоту або невеликий процент амінокислот у кодованій послідовності, являють собою "консервативно модифікований варіант", в якому зміна приводить до заміни амінокислоти хімічно подібною амінокислотою. Таблиці консервативних замін, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, є добре відомим в області техніки. Такі консервативно модифіковані варіанти являють собою доповнення та не виключають поліморфних варіантів, міжвидових гомологів та алелей згідно з винаходом. Кожна з наведених нижче груп містить амінокислоти, які є консервативними замінами одна для одної: 1) Аланін (А), Гліцин (G); 2) Аспарагінова кислота (D), глутамінова кислота (Е); 3) Аспарагін (N), Глутамін (Q); 4) Аргінін (R), Лізин (К); 5) Ізолейцин (І), Лейцин (L), Метіонін (М), Валін (V); 6) Фенілаланін (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); 7) Серин (S), Треонін (Т);та 8) Цистеїн (С), Метіонін (М) (див., наприклад, Creighton, Proteins (1984)). Термін "гетерологічний", коли використовується для позначення частин нуклеїнової кислоти, означає, що нуклеїнова кислота включає дві або більше субпослідовності, які не виявлено у такому зв'язку одна з одною у природі. Наприклад, нуклеїнова кислота, що є типово одержаною рекомбінантним шляхом, містить дві або більше послідовності з неспоріднених генів, що поєднані з утворенням нової функціональної нуклеїнової кислоти, наприклад, промотор, одержаний з одного джерела, та кодуюча ділянка з іншого джерела. Подібно до цього, гетерологічний білок означає, що білок включає дві або більше субпослідовності, що не виявлені у такому зв'язку одна з одною у природі, (наприклад, злитий білок). "Злитий поліпептид" або "злитий білок" належить до білка, що має принаймні два гетерологічні поліпептиди Mycobacterium sp., зв'язані ковалентно, або безпосередньо, або за допомогою амінокислотного лінкера. Поліпептиди, що утворюють злитий білок, є типово зв'язаними С-термінальним кінцем з N-термінальним кінцем, проте вони також можуть бути зв'язаними С-термінальним кінцем з С-термінальним кінцем, N-термінальним кінцем з Nтермінальним кінцем, або N-термінальним кінцем з С-термінальним кінцем. Поліпептиди злитого білка можуть розміщуватися у будь-якому порядку. Цей термін також належить до консервативно модифікованих варіантів, поліморфних варіантів, алелей, мутантів, субпослідовностей та міжвидових гомологів антигенів, що утворюють злитий білок. Антигени Mycobacterium tuberculosis описані у Cole та ін., Nature 393:537 (1998), де розкрито цільний геном Mycobacterium tuberculosis. Повна послідовність Mycobacterium tuberculosis може бути також знайдена на http://www.sanger.ac.uk та на http://www.pasteur.fr/mycdb/ (MycDB). Антигени з інших видів Mycobacterium, що відповідають антигенум М. tuberculosis, можуть бути ідентифіковані, наприклад, при використанні алгоритмів порівняння послідовностей, як описано в даній заявці, або за допомогою інших способів, відомих кваліфікованому спеціалісту в даній області, наприклад, шляхом гібридизаційних аналізів та аналізів зв'язування антитіла. Типові Mtb72f злиті білки для використання у даному винаході включають: 9 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Білки, що містять залишки 8-729 послідовності SEQ ID NO: 2; Білки, що включають або складаються з послідовності SEQ ID NO: 2 (=Mtb72f), необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини; Злиті білки, що включають послідовність SEQ ID NO: 2, необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини (наприклад, білок, який включає залишки 8-729 послідовності SEQ ID NO: 2) разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Білки, що включають залишки 4-725 послідовності SEQ ID NO: 4 (=М72); Білки, що включають або складаються з послідовності SEQ ID NO: 4 (=М72), необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини; та Злиті білки, що включають послідовність SEQ ID NO: 4, необов'язково без His мітки, утвореної залишками 2-7 вказаної послідовності, або з His міткою різної довжини; (наприклад білок, що включає залишки 4-725 послідовності SEQ ID NO: 4) разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Типові імуногенні фрагменти Mtb72f злитого білка, що використовується у даному винаході, включають: Білки що включають послідовність або складаються з послідовності TbH9-Ra35 (Mtb59F); або ТЬН9; або Ra35; або Ra12; та Злиті білки, що включають вказані послідовності разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Додаткові типові імуногенні фрагменти Mtb72f злитих білків для застосування згідно з даним винаходом включають: Білки, що включають послідовність або складаються з послідовності TbH9-Ra35 (Mtb59F) або Ra35, в яких положення, що відповідає Ser710 в SEQ ID NO: 2, є зміненим на Ala; та Злиті білки, які включають вказані послідовності разом з одним або більше антигенуми М. tuberculosis, наприклад, одним або більше білками, приведеними вище в абзацах від [0045] до [0052], або імуногенним фрагментом будь-якого з них; Зокрема, Mtb72f являє собою: поліпептид, що включає залишки 8-729 SEQ ID NO: 2; або поліпептид, що складається з залишків 1 та 8-729 SEQ ID NO: 2, необов'язково з His міткою, вбудованою після початкового залишку Met; або поліпептид SEQ ID NO: 2; або поліпептид, що включає залишки 4-725 SEQ ID NO: 4; або поліпептид, що складається з залишків 1 та 4-725 SEQ ID NO: 4, необов'язково з His міткою, вбудованою після початкового залишку Met; або поліпептид SEQ ID NO: 4; або поліпептид SEQ ID NO: 6. Додаткові типові Mtb72f злиті білки та їх імуногенні фрагменти включають білки, згадані вище, в яких N- та/або С-термінальні кінці є вкороченими, наприклад, на 5 або 4 або 3 або 2 або 1 амінокислотний залишок. Додаткові типові Mtb72f злиті білки та їх імуногенні фрагменти включають білки, згадані вище, в яких до 10 % амінокислот, наприклад, до 5 % амінокислот (наприклад, до 10, наприклад, до 5), є заміненими консервативними замінами, як визначено в даній заявці. Типові Mtb72f нуклеїнові кислоти для застосування згідно з даним винаходом включають нуклеїнові кислоти (наприклад, молекули ДНК), що кодують згадані вище типові Mtb72f злиті білки та їх імуногенні фрагменти. Один набір специфічних молекул ДНК, що можуть бути згадані, включає нуклеотиди 63-2228 SEQ ID NO: 1. Інший набір специфічних молекул ДНК, що можуть бути згадані, включає нуклеотиди 10-2175 SEQ ID NO: 3. Специфічні молекул ДНК, що можуть бути згадані, включають або складаються з SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 5. Термін "злитий" належить до ковалентного зв'язку між двома поліпептидами у злитому білку. Поліпептиди типово зв'язуються за допомогою пептидного зв'язку, або безпосередньо один з одним, або через амінокислотний лінкер. Необов'язково, пептиди можуть з'єднуватися за допомогою непептидних ковалентних зв'язків, що є відомими спеціалісту в даній області. 10 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фраза "селективно (або специфічно) гібридизується з" належить до зв'язування, утворення дуплексів або гібридизації молекули тільки з певною нуклеотидною послідовністю при жорстких умовах гібридизації, коли ця послідовність є присутньою у складній суміші (наприклад, загальна клітинна або бібліотечна ДНК або РНК). Фраза "жорсткі умови гібридизації" належить до умов, при яких зразок буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю, типово, у складній суміші нуклеїнової кислоти, але не з іншими послідовностями. Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися за різних обставин. Більш довгі послідовності специфічно гібридизуються при більш високих температурах. Детальне керівництво з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти у Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization та the strategy of nucleic acid assays" (1993). В загальному випадку жорсткі умови вибирають з таких, що є приблизно на 5-10 °С нижчими, ніж точка плавлення (Т m) для специфічної послідовності при визначеній іонній силі рН. Т т являє собою температуру (при визначеній іонній силі, рН, та концентрації нуклеїнової кислоти), при якій 50 % зразків, комплементарних до цільової послідовності, гібридизується з цільовою послідовністю при рівноважному стані (оскільки цільові послідовності є присутніми у надлишку при Т m, то 50 % зразків при рівноважному стані є зайнятими). Жорсткі умови будуть такими, в яких концентрація солі є меншою, ніж приблизно 1,0 М іона натрію, типово приблизно від 0,01 до 1,0 М концентрації іона натрію (або інших солей) при значенні рН від 7,0 до 8,3, а температура складає принаймні приблизно 30 °С для коротких зразків (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) та принаймні приблизно 60 °С для довгих зразків (наприклад, таких, що мають довжину, більшу, ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також бути досягненні при доданні дестабілізувальних агентів, таких, як формамід. Для селективної або специфічної гібридизації позитивний сигнал складає принаймні двократний сигнал фону, необов'язково, десятикратний сигнал фону гібридизації. Типові умови жорсткої гібридизації можуть бути наступними: 50 % формаміду, 5 × SSC, та 1 % SDS, інкубація при 42 °С, або 5 × SSC, 1 % SDS, інкубація при 65 °С, з промиванням у 0,2 × SSC та 0,1 % SDS при 65 °С. Нуклеїнові кислоти, що не гібридизуються одна з одною при жорстких умовах, все ще залишаються суттєво ідентичними, якщо поліпептиди, які вони кодують, є суттєво ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли копію нуклеїнової кислоти створюють при використанні максимальної виродженості кодонів, що дозволяється генетичним кодом. У таких випадках нуклеїнові кислоти типово гібридизуються при помірно жорстких умовах гібридизації. Приклад "помірно жорстких умов гібридизації" включає гібридизацію у буфері 40 % формаміду, 1 М NaCl, 1 % SDS при 37°, та промивання у 1Х SSC при 45 °С. Позитивна гібридизація складає принаймні двократний фон. Спеціаліст у даній області техніки добре знає, що альтернативна гібридизація та умови промивання можуть використовуватися для забезпечення умов подібної жорсткості. "Антитіло" належить до поліпептиду, який кодується ділянкою рамки зчитування гена імуноглобуліну або його фрагмента, що зв'язується та впізнає антиген. Відомі гени імуноглобулінів включають гени каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, епсілон та мю константних ділянок, а також міріади генів варіабельної ділянки імуноглобуліну. Легкі ланцюги класифікуються або як каппа, або лямбда. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, дельта або епсілон, що, у свою чергу, визначають класи імуноглобулінів IgG, IgM, IgA, IgD та IgE, відповідно. Структурна одиниця типового імуноглобуліну (антитіла) включає тетрамер. Кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один легкий (приблизно 25 кДа) та один важкий ланцюг (приблизно 50-70 кДа). N-термінальний кінець кожного ланцюга визначає варіабельну ділянку довжиною приблизно від 100 до 110 або більше амінокислот, що головним чином відповідає за впізнання антигену. Терміни варіабельний легкий ланцюг (VL) та варіабельний важкий ланцюг (VH) відносяться до цих легких та важких ланцюгів, відповідно. Антитіла існують, наприклад, як інтактні імуноглобуліни або як ряд добре охарактеризованих фрагментів, що одержані шляхом перетравлювання за допомогою різних пептидаз. Таким чином, наприклад, пепсин перетравлює антитіло нижче дисульфідних зв'язків у шарнірній ділянці з одержанням F(ab)'2, димера Fab, який сам по собі являє собою легкий ланцюг, з'єднаний з VH-CH1 дисульфідним зв'язком. F(ab)'2 може розкладатися при м'яких умовах з розривом дисульфідного зв'язку у шарнірній ділянці, перетворюючи, таким чином, F(ab)'2 димер на Fab' мономер. Fab' мономер являє собою суттєво Fab з частиною шарнірної ділянки (див. Fundamental Immunology (Paul ред., 3-є вид. 1993). Оскільки різні фрагменти антитіла визначаються у зв'язку з перетравлюванням інтактного антитіла, то спеціаліст в даній області 11 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буде знати, що такі фрагменти можуть бути синтезовані de novo або хімічним шляхом, або при використанні методики рекомбінантної ДНК. Таким чином, термін антитіло, як використовується в даній заявці, також включає фрагменти антитіла, одержані або шляхом модифікації цільних антитіл, або синтезовані de novo при використанні методики рекомбінантної ДНК (наприклад, один ланцюг Fv), або ті, що ідентифіковані за допомогою фагових бібліотек (див., наприклад, McCafferty та ін., Nature 348:552-554(1990)). Для одержання моноклональних або поліклональних антитіл можна використовувати будьяку методику, відому з рівні техніки (див., наприклад, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor та ін., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole та ін., стор. 77-96 в Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Методики для одержання одноланцюгових антитіл (патент США № 4,946,778) можуть бути адаптовані для одержання антитіл до поліпептидів згідно з даним винаходом. Крім того, трансгенні миші або інші організми, такі, як ссавці, можуть використовуватися для експресії гуманізованих антитіл. Альтернативно, бібліотеки фагового дисплею можна використовувати для ідентифікації антитіл та гетеромерних Fab фрагментів, що специфічно зв'язуються з вибраними антигенами (див., наприклад, McCafferty та ін., Nature 348:552-554 (1990); Marks та ін., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Фраза "специфічно (або селективно) зв'язується" з антитілом або "є сцецифічно (або селективно) імунореактивним з", коли стосується білка або пептиду, належить до реакції зв'язування, що є визначальною для присутності білка в гетерологічній популяції білків та інших біологічних речовин. Таким чином, при визначених умовах імуноаналізу значення зв'язування специфічних антитіл з конкретним білком складає принаймні двократне значення фону, та ці антитіла суттєво не зв'язуються у значній кількості з іншими білками, що є присутніми у зразку. Специфічне зв'язування з антитілом при таких умовах може вимагати наявності антитіла, що є вибраним за його специфічністю до певного білка. Наприклад, поліклональні антитіла, утворення яких індуковане злитими білками, можуть бути вибраними для одержання тільки тих поліклональних антитіл, які є специфічно імунореактивними зі злитим білком, але не з індивідуальними компонентами злитих білків. Така селекція може бути досягнута шляхом видалення антитіл, які перехресно реагують з цими індивідуальними антигенами. Різноманітні методики імуноаналізу можуть використовуватися для відбору антитіл, які є специфічно імунореактивними з певним білком. Наприклад, твердофазні ELISA імуноаналізи, звичайно, використовуються для відбору антитіл, які є специфічно імунореактивними з білком (див., наприклад, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) and Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), для опису методик імуноаналізу та умов, які можуть використовуватися для визначення специфічної імунореактивності). Типово, специфічна або селективна реакція буде мати принаймні двократний сигнал фону або шумів та більш типово буде мати сигнал у 10-100 разів більший за фон. Полінуклеотиди можуть включати нативну послідовність (тобто ендогенну послідовність, що кодує індивідуальний антиген або його частину) або можуть включати варіант такої послідовності. Полінуклеотидні варіанти можуть містити одну або більше замін, доповнень, делецій та/або інсерцій, таких, що біологічна активність кодованого злитого поліпептиду не знижується у порівнянні зі злитим поліпептидом, що включає нативні антигени. Варіанти переважно демонструють приблизно 70 % ідентичності, більш переважно, принаймні приблизно 80 % ідентичності та найбільш бажано, принаймні приблизно 90 % ідентичності до полінуклеотидної послідовності, що кодує нативний поліпептид або його частину. Терміни "ідентичний" або процент "ідентичності" у контексті двох або більше нуклеїнових кислот або поліпептидних послідовностей, належать до двох або більше послідовностей або субпослідовностей, що є однаковими або мають вказаний процент амінокислотних залишків або нуклеотидів, які є однаковими (тобто 70 % ідентичності, необов'язково 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 % ідентичності на вказаній ділянці) при порівнянні та вирівнюванні для максимальної відповідності у межах вікна порівняння або вказаної ділянки, як вимірюють при використанні одного з приведених алгоритмів порівняння послідовностей або ручного вирівнювання та візуальної перевірки. Такі послідовності потім називаються "суттєво ідентичними". Таке визначення також належить до комплементу досліджуваної послідовності. Необов'язково, ідентичність існує у межах ділянки, що складається принаймні з приблизно 25 - приблизно 50 амінокислот або нуклеотидів у довжину, або необов'язково у межах ділянки, що містить 75-100 амінокислот або нуклеотидів у довжину. Для порівняння послідовностей, типово, коли одна послідовність виконує роль стандарту для порівняння, з якою досліджувані послідовності порівнюються. Коли використовують алгоритм порівняння послідовностей, то досліджувана послідовність та послідовність, яка є стандартом для порівняння, вводять у комп'ютер, встановлюють координати субпослідовності, 12 UA 107788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 якщо це необхідно, та задають параметри для програми алгоритму порівняння послідовностей. Алгоритм порівняння послідовностей підраховує процент ідентичності послідовностей для досліджуваних послідовностей стосовно стандартної послідовності на основі програмних параметрів. "Вікно порівняння", як використовується в даній заявці, включає посилання на сегмент будьякого одного з ряду суміжних положень, вибраних з групи, яка складається з 25-500, звичайно, від приблизно 50 до приблизно 200, більш часто від приблизно 100 до приблизно 150, де послідовність може порівнюватися зі стандартною послідовністю з тим самим числом суміжних положень після того, як дві послідовності є оптимально вирівняні. Способи вирівнювання послідовностей для порівняння є добре відомими в області техніки. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, при використанні алгоритму локальної гомології Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритму гомологічного вирівнювання Needleman & Wunsch, J. Моl. Biol. 48:443 (1970), методу пошуку на подібність Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), за допомогою комп'ютеризованих втілень цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA у Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), або шляхом ручного вирівнювання та візуальної перевірки (див., наприклад, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel та ін., ред.. 1995 додаток)). Один приклад корисного алгоритму являє собою PILEUP. PILEUP створює множинне вирівнювання послідовностей з групи споріднених послідовностей при використанні прогресивних, попарних вирівнювань для демонстрації спорідненості та проценту ідентичності послідовностей. Це також забезпечує одержання дерева або дендрограми, що показує розділені на кластери взаємні зв'язки, які використовуються для проведення вирівнювання. PILEUP використовує ампліфікацію способу прогресивного вирівнювання Feng & Doolittle, J. Моl. Evol. 35:351-360 (1987). Використовуваний при цьому спосіб є подібним до способу, описаного Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). Програма може порівняти до 300 послідовностей, кожна з яких має максимальну довжину 5000 нуклеотидів або амінокислот. Процедуру множинного вирівнювання починають з попарного вирівнювання двох найбільш подібних послідовностей, одержуючи, таким чином, кластер вирівняних послідовностей. Цей кластер потім порівнюють з наступною, найбільш близькою послідовністю або кластером вирівняних послідовностей. Два кластери послідовностей вирівнюють шляхом простого подовження попарного вирівнювання двох індивідуальних послідовностей. Заключне вирівнювання проводять при використанні серії прогресивних попарних вирівнювань. Програму виконують шляхом задання специфічних послідовностей та їх амінокислотних або нуклеотидних координат для ділянок послідовності порівняння та шляхом задання параметрів програми. При використанні PILEUP стандартна послідовність порівнюється з іншими досліджуваними послідовностями для визначення проценту ідентичності послідовностей при використанні наступних параметрів: значення пробілу по умовчанню (3,00), значення довжини пробілу по умовчанню (0,10) та значення кінців пробілів. PILEUP може бути одержаний з GCG програмного забезпечення аналізу послідовності, наприклад, версії 7.0 (DevereauxTa ін., Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984). Інший приклад алгоритму, що є прийнятним для визначення проценту ідентичності послідовностей та подібності послідовностей, являє собою алгоритми BLAST та BLAST 2.0, які є описаними у Altschul та ін., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) та Altschul та ін., J. Моl. Віоl. 215:403-410 (1990), відповідно. Програмне забезпечення для аналізів BLAST є доступним через Національний центр біотехнологічної інформації (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Цей алгоритм втягує першу ідентифікацію пар послідовності, які мають високий рахунок (HSP), шляхом ідентифікації коротких слів, які мають довжину W у послідовності запиту, що є або відповідним, або задовольняє певний позитивний показник порогового значення Т, коли порівнюється зі словом тієї самої довжини у базі даних послідовностей. Т розглядається як сусідній пороговий показник (Altschul та ін., вище). Ці вихідні сусідні співпадання слова виступають як відправні точки для ініціації пошуків для знаходження більш довгих HSP, що містять їх. Співпадання слова подовжуються в обох напрямках вздовж кожної послідовності для того, щоб кумулятивний показник вирівнювання міг бути підвищений. Кумулятивні показники підраховують, використовуючи для нуклеотидних послідовностей параметри М (коефіцієнт винагороди для пари зі співпадаючими залишками; завжди >0) та N (штрафний коефіцієнт для залишків, що не співпадають; завжди