Трансплантат на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю

Реферат: Трансплантат на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю містить біосумісний поліакриламідний гідрогель, що містить поліакриламід та 0,9 % розчин натрію хлориду, при цьому як поліакриламід використовують співполімер акриламіду та N,N'-метилен-біс-акриламід, додатково містить персульфат амонію та N,N,N',N'- тетраметилетилендіамід, та суміш ембріональних стовбурових клітин 4-14-тижневої гестації людини. Трансплантат має 5 7 концентрацію суміші ембріональних стовбурових клітин від 1,5*10 до 2,7*10 клітин/мл у співвідношенні гідрогель:суміш ембріональних стовбурових клітин складає 1:(1-4), 0,9 % розчин натрію хлориду виготовляють на основі структурованої (талої) води при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: акриламід 1,9-9,0 N,N'-метилен-біс-акриламід 0,006-0,1 N,N,N',N'тетраметилетилендіамід 0,004-0,5 персульфат амонію 0,02-0,2 натрію хлорид, розчин 0,9 % решта. UA 101518 U (12) UA 101518 U UA 101518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до реконструктивно-відновлювальної, пластичної хірургії, та стосуються отримання біосумісного поліакріламідного гідро гелю, який може бути використаний в медичних та/або біологічних цілях, а також як трансплантат та як носій клітин. З рівня техніки відомий патент України "Біосумісний поліакриламідний гідрогель" (UA64849, дата публікації 15.03.2004, бюл. № 3), що містить поліакриламід, зшитий ІЧ, М'-метилен-бісакриламідом, як ізотонічний розчин (який використовують як дисперсійне середовище) використовують 0,85 % розчин натрію хлориду, 0,5 % розчин глюкози, розчин Рингера-Лока, розчин Ерла, розчин Хенкса, боратний або фосфатний буфери та додатково використовують пластифікатор, за який використовують поліоксіетилен, метилцелюлозу, желатин, полівінілпіролідон, полівініловий спирт. Головним недоліком зазначеного гідрогелю є використання метилцелюлози та желатину, що сприяє розвитку та розростанню патогенної мікрофлори. Наявність у поліакриламідному гідрогелі патогенної мікрофлори збільшує вірогідність післяопераційних ускладнень та інших небажаних реакцій, зокрема в умовах організму з температурою 36,6 °C. Також з рівня техніки відомий патент RU 2067873 (дата публікації 20.10.1996) "Біосумісний гідрогель", що містить від 3,5 до 9,0 мас. % поперечно-зшитого співполімеру акриламіду зі зшиваючим агентом - метилен-біс-акриламідом та 96,5-99,0 мас. % води. Гідрогель отримують реакцією співполімеризації акриламіду з метилен-біс-акриламідом в водному середовищі у присутності пероксидних ініціаторів полімеризації з витримкою суміші при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Процес полімеризації провадять в одну стадію, при цьому як пероксидні ініціатори використовують персульфат амонію і тетраметилетилендіамін. Отриманий гель має недостатній ступінь зшивки, що обумовлено низьким температурним режимом проведення процесу співполімеризації та використання лише однієї стадії полімеризації та не забезпечує об'ємну стабільність. Найближчим аналогом є патент RU 2236872 "Поліфункціональний біосумісний гідрогель та спосіб його одержання" (дата публікації відомостей 27.09.2004). Гідрогель містить поліакриламід та воду, поліакриламід у свою чергу містить співполімер акриламіду, метакриламід, 2-гідроксіетилметакрилат і N,N'-метилен-біс-акриламід. Співполімеризацію провадять у три стадії, перша стадія - при температурі 20-30 °C, протягом 12-24 годин. Друга стадія γ-опромінення в дозі 0,4-1,0 мегарад та третя стадія при температурі 100-130 °C і тиску 01,2 атм. Протягом 20-40 хвилин. Гідрогель після першої стадії промивають у воді, що має температуру 70-110 °C, протягом не менш 3-х годин при співвідношенні гідрогелю та води 1:810, тиск 0-1,2 атм. Як ініціатор співполімеризації беруть перекис водню та/або персульфат амонію. Як водне середовище використовують бідистильовану апірогенну воду. Недоліком вищезазначеного гелю є низька стійкість гідрогелю до резорбції під впливом внутрішнього середовища організму. В основу корисної моделі поставлена задача створення трансплантату на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю, що усуває дефекти та має функції біологічної тканини шляхом підбору такої сукупності його компонентів, що забезпечує максимальний лікувальний ефект. А також отримання біосумісного поліакриламідного гідро гелю, що використовується як трансплантат, як носій суміші ембріональних стовбурових клітин, що трансплантується людині; забезпечує пролонговану дію медпрепаратів з постійною швидкістю впродовж тривалого часу; отримання гідрогелю, що забезпечує збільшення тривалості активної життєдіяльності суміші ембріональних стовбурових клітин. Також до задач належить отримання гідро гелю, що створює оболонку навколо колоній клітин, для стримування розчинних факторів росту і елементів позаклітинного матриксу. Технічним результатом корисної моделі є створення біосумісного поліакриламідного гідрогелю стабільної структури для використання його як трансплантату, що усуває дефекти та має функції біологічної тканини, та як носія суміші ембріональних стовбурових клітин, що трансплантуються пацієнту. На теперішній час відомо, що живі ембріональні стовбурові клітини, які введені до організму людини, здатні приживатись, проліферуватись (поширюватися поділом), спеціалізуватися та компенсувати функціональну недостатність або забезпечувати репарацію власних органів пацієнтів. Трансплантація таких клітин отримала назву "клітинна терапія". Як відомо, введення на ранньому етапі (навіть у внутрішньоутробному періоді) дітям пулу генетично здорових стовбурових гемопоетичних клітин дозволяє компенсувати імунні дефекти. Терапевтичний ефект трансплантації суміші ембріональних стовбурових клітин до організму дорослої людини характеризується відносно коротким терміном, приблизно 3-6 місяців. Ця 1 UA 101518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 обставина пов'язана з тим, що ембріональні стовбурові клітини мають власний генотип, який проявляється в міру диференціації клітин, що й приводить до відторгнення введених суміші ембріональних стовбурових клітин. Запобігти відторгненню суміші ембріональних стовбурових клітин можливо або шляхом постійної обробки реципієнта імунодепресантами або включенням трансформованих клітин в різні оболонки з поліакриламідного гідрофільного гелю, що запобігає розпізнанню клітин імунною системою реципієнта. Виходячи з результатів експериментальної трансплантології стовбурових клітин, для отримання клінічного ефекту необхідна направлена доставка суміші ембріональних стовбурових клітин до зони ушкодження, фіксація в цій зоні, захист від дії, що ушкоджує, факторів запалення та відтворення потрібного клітинного мікрооточення. Для ефективного використання суміші ембріональних стовбурових клітин у відновлювальній медицині таку трансплантацію необхідно проводити в складі так званої "стовбурової одиниці", що являє собою стовбурову клітину з її сферою, що заповнена біосумісним поліакриламідним гідрогелем, який в свою чергу буде сприяти більш ефективному виживанню та адекватному функціонуванню стовбурових клітин, після їх трансплантації до ураженого органу або тканини організму пацієнта. Суть корисної моделі полягає в тому, що був підібраний якісний і кількісний склад біосумісного поліакриламідного гідрогелю, а також умови проведення співполімеризації, що дозволяють збільшити тривалості активної життєдіяльності трансплантованих до організму пацієнта суміші ембріональних стовбурових клітин. При цьому біологічно-активні властивості біосумісного поліакриламідного гідрогелю в значній мірі залежить від структури сітчастого полімеру. Структура сітчастого полімеру, в свою чергу, залежить від умов синтезу, а саме від якісного та кількісного складу вихідних реагентів, в тому числі від зшиваючого агента, ініціатора полімеризації, а також умов та режиму проведення полімеризації. Поставлена задача вирішується наступним, біосумісний поліакриламідний гідрогель містить у своєму складі поліакриламід та 0,9 % розчин хлориду натрію. Як поліакриламід використовують співполімер акриламіду з N,N'-метилен-біс-акриламідом. Реакція полімеризації протікає по вільнорадикальному механізму і вимагає наявності вільних радикалів акриламіду. Як ініціатори реакції полімеризації використовують речовини, що руйнуються з утворенням вільних радикалів, які потім взаємодіють з молекулами акриламіду і запускають (ініціюють) полімеризацію. Найбільш широко як ініціатор процесу полімеризації використовують персульфат амонію. Оскільки реакція полімеризації акриламіду - повільний процес, то для прискорення процесу полімеризації як каталізатор використовують N,N,N',N' тетраметилетилендіамід. При цьому біосумісний поліакриламідний гідрогель містить наступне співвідношення компонентів, мас. % акриламід 1,9-9,0 N,N'- метилен-біс-акриламід 0,006-0,1 N,N,N',N'0,004-0,5 тетраметилетилендіамід персульфат амонію 0,02-0,2 хлорид натрію, розчин 0,9 % решта. Для забезпечення біосумісному поліакриламідному гідрогелю структурно-об'ємну стабільність, а також для надання гідрогелю більшу біологічну сумісність з тканинами організму людини, 0,9 % розчин хлориду натрію виготовляють на основі структурованої (талої) води. Спосіб одержання біосумісного поліакриламідного гідрогелю, включає проведення співполімеризації акриламіду з N,N'-метилен-біс-акриламідом в дисперсійному середовищі, з персульфатом амонію та N,N,N',N'-тетраметилетилендіамідом, потім відмивання утвореного гелю 0,9 % розчином хлориду натрію, виготовленого на структурованій (талій) воді, витримуванням його для набухання до рівноважного стану, гомогенізацію та стерилізацію. Як дисперсійне середовище використовують 0,9 % розчин хлориду натрію, виготовлений на основі структурованої (талої) води. При наступному співвідношенні компонентів, мас. % акриламід 1,9-9,0 N,N'-метилен-біс-акриламід 0,006-0,1 N,N,N',N'0,004-0,5 тетраметилетилендіамід персульфат амонію 0,02-0,2 хлорид натрію, розчин 0,9 % решта. Біосумісний поліакриламідний гідрогель отримують наступним чином. Спочатку співполімеризацію здійснюють при температурі 20-28 °C, протягом 30-60 хвилин. Отриманий гель відмивають, для відмивання використовують 0,9 % розчин хлориду натрію, 2 UA 101518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 отриманий на основі структурованої (талої) води. Відмивання здійснюють протягом 3 годин в 6 етапів, при цьому на кожному етапі здійснюють заміну 0,9 % розчину хлориду натрію. Потім витримують для набухання 18 годин при температурі 20-30 °C, коефіцієнт набухання 1,63-1,73, здійснюють гомогенізацію протягом 5-15 хвилин. Потім здійснюють стерилізацію при температурі 80-90 °C протягом 5-10 хвилин. Витримують дві години, а потім стерилізують вдруге при температурі 118-135 °C, тиску 1,5-2,5 Бар та протягом від 15-45 хвилин. Використання 0,9 % розчину хлориду натрію, виготовленого на основі структурованої (талої) води, забезпечує біосумісному поліакриламідному гідрогелю структурно-об'ємну стабільність, а також надає гідрогелю більшу біологічну сумісність з тканинами організму людини. Зазначений спосіб отримання біосумісного поліакриламідного гідрогелю дозволяє зменшити кількість незв'язаних аміногруп, вільних NH2 радикалів та неграничних подвійних зв'язків. Також збільшується ступінь зшивки гідрогелю. Це дозволяє зменшити тканинну реакцію організму пацієнта на трансплантацію біосумісного поліакриламідного гідрогелю, забезпечити високу формостійкість при імплантації за рахунок зменшення ступеня резорбції та збігання в організмі пацієнта, знизити можливість заселення його мікроорганізмами у тому числі з організму реципієнта та їх розмноження. Для отримання трансплантату на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю, до отриманого гідрогелю додають екстракт ембріональних стовбурових клітин. Трансплантат на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю, що усуває дефекти та відновлює функції біологічних тканин, містить біосумісний поліакриламідний гідрогель та суміші ембріональних стовбурових клітин 4-14-тижневої гестації людини. Отриманий трансплантат має 5 7 концентрацію суміші ембріональних стовбурових клітин від 1,5*10 до 2,7*10 клітин/мл при співвідношенні гідрогель:суміш клітин, що складає 1:(1-4), причому біосумісний поліакриламідний гідрогель має комплекс властивостей, що визначають його біосумісність з сумішшю ембріональних стовбурових клітин. До того ж біосумісний поліакриламідний гідрогель утворює капсули в тканинах пацієнтів, навколо колоній клітин, для стримування розчинних факторів росту і елементів позаклітинного матриксу. Для вивчення можливості трансплантації ізольованих ембріональних клітин, що включені до біосумісного поліакриламідного гідро гелю, провели експерименти по трансплантації ембріональних клітин печінки людини з гідрогелем лабораторним щурам з гострим токсичним ураженням печінки. У попередніх експериментах було проведено порівняльне вивчення впливу різних концентрацій поліакриламіду на життєздатність клітин ембріональної печінки та можливості маніпулювання суміші гідрогелю з клітинами. Встановлено, що концентрація поліакриламіду в межах 2,5 % не впливає на життєздатність клітин та дозволяє найбільш ефективно змішувати суміш ембріональних стовбурових клітин з гідрогелем, кріоконсервувати та вводити лабораторним тваринам. Найбільш відтворені результати були отримані при введені до 6 гідрогелю до 5*10 життєздатних ембріональних клітин. Значна частина введених та деконсервованих ембріональних клітин печінки у суміші з гідрогелем являє собою суспензію поодиноких клітин, що зберігають життєздатність. На четверту добу клітини почали утворювати колонії по 2-7 клітин. На сьому добу колонії нараховували 100 і більше клітин. Протягом десяти днів після введення тваринам гідрогель з суміш клітин ембріональної печінки спостерігалось поява нових клітин та ріст старих. Проведені експерименти дали можливість з'ясувати, що гідрогель для ембріональних клітин може бути напівтвердим середовищем інкубації, в якому клітини можуть достатньо проліферуватись. Приклад здійснення корисної моделі. Для отримання біосумісного поліакриламідного гідрогелю беремо: акриламід 62,7 г N,N'-метилен-біс-акриламід 0,9 г N,N,N',N'0,68 г тетраметилетилендіамід персульфат амонію 3,0 г хлорид натрію, розчин 0,9 % 1580,72 г. Отримують гідрогель у спосіб, що представлений у способі отримання біосумісного поліакриламідного гідрогелю. Спочатку здійснюють співполімеризацію акриламіду з N,N'-метилен-біс-акриламідом. Отриманий гель відмивають, для відмивання використовують 0,9 % розчин хлориду натрію, отриманий на основі структурованої (талої) води. Відмивання здійснюють протягом 3 годин в 6 етапів, при цьому на кожному етапі здійснюють заміну 0,9 % розчину хлориду натрію. Потім витримують для набухання 18 годин при температурі 20-30 °C. Здійснюють гомогенізацію 3 UA 101518 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 5-15 хвилин. Етап стерилізації проходить наступним чином, здійснюють первинну стерилізацію при температурі 80-90 °C протягом 5-10 хвилин, витримують дві години, а потім стерилізують. Отриманий біосумісний поліакриламідний гідрогель з'єднують з сумішшю ембріональних стовбурових клітин 6-14 тижнів гестації. Суміш ембріональних стовбурових клітин отримують наступним чином, здрібнені тканини гомогенізують в скляному гомогенізаторі у співвідношенні тканина-сольове середовище =1:1. Далі здійснюють центрифугування протягом 30 хвилин у рефрижераторній центрифузі при 10000 об/хв. Отриманий екстракт стерилізують фільтруванням за допомогою фільтра з діаметром пор 0,22 мкм, потім суміш ембріональних стовбурових клітин фасується у кріоконтейнери по 1 мл. та зберігаються у низькотемпературному банку. Суміш ембріональних стовбурових клітин перевіряють на стерильність та бактеріальне забруднення. Спосіб застосування: внутрішньом'язове, підшкірне введення. Показання до застосування: - стимуляція імунної системи; - хвороби печінки; - хвороби нервової системи; - хвороби серцево-судинної системи. Під наглядом знаходилось 70 пацієнтів зі стенокардією, що обумовлена стенозуючим атеросклерозом коронарних артерій (строк нагляду 2,5-3 роки). Діагноз ішемічної хвороби серця у переважної кількості був встановлений на коронаграфічному досліджені. Протокол спостереження містить оцінку важкості стенокардії, що визначалась по толерантності до фізичних навантажень за допомогою велоергометричної проби. Ліпідний спектр сироватки крові досліджували ензиматичним методом з використанням стандартних реактивів. 6 Отриманий матеріал являє собою суміш ембріональних стовбурових клітин (від 1,0*10 до 7 1,0*10 клітин/мл) та біосумісного поліакриламідного гідрогелю у співвідношенні 1:4 (1 мл суміші клітин 4 мл. гідрогелю). Матеріал вводили підшкірно одноразовим шприцом в передню стінку черевної порожнини, в 4-5 точок з дотриманням усіх правил асептики та антисептики. Пацієнти, що отримали першу дозу препарату, були розподілені на 3 групи. До першої групи увійшло 14 осіб, у яких після трансплантації позитивний ефект зберігався протягом 9-12 місяців, після спливу цього періоду у пацієнтів збільшувалось кількість приступів стенокардії в добу, відповідно збільшувався об'єм медикаментозних препаратів, погіршувалась наслідки фізичних навантажень. У хворих другої групи (34 особи) погіршення самопочуття наступило в період 12-18 місяців після трансплантації. В третю групу потрапили 22 пацієнти, у яких до 36 місяців стан здоров'я залишався стабільним, погіршення не спостерігалось. Летальних результатів в перебігу трьох років серед 70 пацієнтів не спостерігалося. Спостереження протягом трьох років показали наступне: Клінічний ефект суміші ембріональних стовбурових клітин з біосумісним поліакриламідним гідрогелем утримувався в середньому до 20 місяців та залежить від тяжкості вихідного стану пацієнтів, після спливу цього строку приблизно у половини хворих виникає необхідність у повторній трансплантації; Суміш ембріональних стовбурових клітин з біосумісним поліакриламідним гідрогелем сприяє зниженню інтенсивності симптомів стенокардії та нормалізує вплив на ліпідну формулу крові. Повторна трансплантація повністю повторює результати першої трансплантації та може служити альтернативою лікувальному комплексу, що містить гіпохолестеринемічні та антиангінальні препарати. Інший спосіб використання трансплантатів на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю розглянемо на прикладі опікового центру. Використовуємо отриманий біосумісний поліакриламідний гідрогель з сумішшю ембріональних стовбурових клітин у співвідношенні гідрогелю до суміші клітин 1:2, 1:3. Для проведення дослідження відібрано 22 людини в дослідну та контрольну групи. Віковий склад наступний 8 дітей у віці від 1 до 12 років з опіками 2-3 аб ступеня, площею опіку від 1,5 до 25 % та 14 осіб у віці від 16 до 67 років з опіками 3 аб ступеня та площею опіку від 1,5-25 %. Підшкірне введення біосумісного поліакриламідного гідрогелю з сумішшю ембріональних стовбурових клітин навколо опікового місця 2-3 аб ступеня від 2-3 мл трансплантата в перші три дні показав, що здійснилося переведення від відкритої рани до закритої, що сприяло зменшенню втрати електролітів та білків, що в свою чергу є важливим при лікуванні хворих у ранній період гострої опікової травми. У контрольній групі таке переведення було на 11-12 день. Однією з особливостей використання біосумісного поліакриламідного гідрогелю з сумішшю 4 UA 101518 U 5 ембріональних стовбурових клітин є виключення механічного ушкодження грануляцій, висихання пораненої поверхні та утворення вторинних некрозів. Також відзначаємо значне зниження строків епітелізації ушкоджених поверхонь. Таким чином, використання біосумісного поліакриламідного гідрогелю з сумішшю ембріональних стовбурових клітин відкриває нові можливості для створення нових матеріалів, які можуть застосовуватись для відновлення хрящової та кісткової тканини, в протиопіковій терапії для загоєння ран та стимуляції регенерації тканини. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Трансплантат на основі біосумісного поліакриламідного гідрогелю, що усуває дефекти та відновлює функції біологічних тканин, який містить біосумісний поліакриламідний гідрогель, що містить поліакриламід та 0,9 % розчин натрію хлориду, при цьому як поліакриламід використовують співполімер акриламіду та N,N'-метилен-біс-акриламід, додатково містить персульфат амонію та N,N,N',N'-тетраметилетилендіамід, та суміш ембріональних стовбурових клітин 4-14-тижневої гестації людини, який відрізняється тим, що трансплантат має 5 7 концентрацію суміші ембріональних стовбурових клітин від 1,5*10 до 2,7*10 клітин/мл у співвідношенні гідрогель:суміш ембріональних стовбурових клітин складає 1:(1-4), 0,9 % розчин натрію хлориду виготовляють на основі структурованої (талої) води при наступному співвідношенні компонентів, мас. %: акриламід 1,9-9,0 N,N'-метилен-біс-акриламід 0,006-0,1 N,N,N',N'0,004-0,5 тетраметилетилендіамід персульфат амонію 0,02-0,2 натрію хлорид, розчин 0,9 % решта. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5