Застосування біосумісного гідрогелю як засобу депонування вакцинних препаратів в живому організмі

Застосування замкнути х в сполучнотканинні капсули імплантатів біосумісного гідрогелю як засобу депонування вакцинних препаратів в живому організмі. (19) (21) u200809658 (22) 23.07.2008 (24) 25.12.2008 (46) 25.12.2008, Бюл.№ 24, 2008 р. (72) НІКОЛІН ВОЛОДИМИР ЯРОСЛАВОВИЧ, U A, ГРЕБІНИК МИКОЛА МИКОЛАЙОВИЧ, UA 3 38183 ніння, ущільнення і болючість в місцях щеплень, а іноді приводять до важких алергічних реакцій. Зокрема, в інструкції по вакцинації препаратом «Енджерікс В» прямо сказано, що медперсонал повинен мати в наявності медикаменти, необхідні для надання екстреної допомоги у випадках анафілактичної реакції. Мало того, здатність щепленого організму до синтезу антитіл з часом втрачається і для її відновлення потрібно проводити регулярну ревакцинацію. Зокрема, для вакцин типу АДС-М ревакцинації рекомендовано у вікових категоріях 3 місяці, 4,5 місяці, 6 місяців, 18 місяців, 7 і 14 років у дітей і, в випадках можливості захворювання, в довільні терміни у дорослих людей. Що ж до вакцин на основі пухлиноасоційованих антигенів, то вони дотепер не увійшли до клінічної практики, оскільки їх введення здоровим людям недоцільно, а вірогідність отримання лікувального ефекту у онкологічних хворих відносно невелика. Мало того, існує (і неодноразово виявлялася) небезпека посилення онкологічного процесу і прискорення летального кінця. Другий підхід до рішення проблеми зниження небезпеки вакцинації заснований на мінімізації доз вакцин (звичайно до величин від 0,1 до 0,2мл) і, відповідно, на їх підшкірному (і навіть внутрішньошкірному) введенні. Саме так звичайно вводять вакцину БЦЖ, живу туляремійну вакцину і, до недавнього часу, вводили вакцину проти натуральної віспи. Зрозуміло, що така профілактична техніка особливо показана при введенні живих мікробних вакцин. На жаль, ця техніка лише уповільнює, але не виключає розповсюдження патогенних мікробів по всьому організму реципієнта, що, у випадках не виявленого до щеплення імунодефіциту, може викликати повномасштабні захворювання. Саме тому також не застосовують в клініці живі вакцини для лікування онкологічних захворювань, наприклад, розроблену більше десяти років тому в Max-Delbruck-Centrum fur molekulare Medizin BLANKENSTEIN вакцину на основі живих ракових клітин (див. WO 1996/005866), і не почалося застосування «технічно модифікованих кліток як протипухлинної вакцини» [див. WO 2003/045428; «Use a technically modified cell as a vaccine for treating tumoral disease»]. Підказкою для пошуку ви ходу з описаного тупика могла б служити тимчасова іммобілізація звичайних низькомолекулярних лікарських препаратів по місцю їх введення і, відповідно, уповільнення їх розповсюдження по всьому організму. Як засоби депонування, що утр удняють дифузію лікарських препаратів в міжклітинну рідину, лімфу і кров, на практиці звичайно використовують біологічно інертні сорбенти або в'язкі полімерні матеріали. Саме в цьому аспекті, тобто для створення внутрішньотканинних депо лікарських препаратів пролонгованої дії в заключній частині опису винаходу і [в рефераті UA Patent №10911, RU Patent №2067873, ЕР №0 742 022, US Patent №5,798,096 і інших патентів на основі Міжнародної публікації WO 96/04943 від 22.02.96] було умоглядно запро 4 поновано застосування біосумісного високостабільного поперечно зшитого поліакриламідного гідрогелю. Такий придатний для ін'єкцій гідрогель містить ретельно відмитий від залишків мономера поперечний зшитий поліакриламід (звичайно в кількості від 2,5 до 6,0%, переважно від 3,5 до 5,0%, але не більше 9,0% по масі) і апірогенну дистильовану воду. Клінічне застосування цього гідрогелю офіційно дозволено в Україні, Росії, Європейському Союзі, Китаї і т.д. для ін'єкційного ендопротезування в пластичній хірургії, включаючи мамопластику, фалопластику і контурну пластику обличчя і інших частин тіла людини. Проте на практиці ніхто не займався депонуванням будь-яких ліків за допомогою описаного гідрогелю, бо він сам по собі складається переважно з води і не може ефективно утримувати навіть слабо-розчинні у водовмісних біологічних середовища х лікарські препарати. Тому в основу корисної моделі покладена задача шляхом зміни умов застосування перетворити біосумісний гідрогель в ефективний засіб блокування розповсюдження вакцинних антигенів і антигенних комплексів в живому (переважно людському) організмі і тим самим істотно понизити ризик ускладнень після вакцинації. Ця задача вирішена застосуванням замкнути х в сполучно-тканинні капсули імплантатів біосумісного гідрогелю як засобу депонування вакцинних препаратів в живому організмі. Здатність людського або тваринного організму відносно швидко (звичайно протягом одного-двох місяців) формувати навколо імплантованих порцій гідрогелю сполучно-тканинні капсули була відзначена у вказаних вище патентах-аналогах. Але ні в цих патентах, ні в інших відомих нам публікаціях по темі ендопротезування із застосуванням відомого біосумісного гідрогелю (та його нині численних аналогів), не була розкрита здатність сполучно-тканинних капсул служити такими мембранами, які виключають дифузію в організми реципієнтів навіть очищених антигенів, що мають середню молекулярну масу порядку одного або декількох кДа (килодальтон), але не перешкоджають обміну інформацією між вакцинними антигенами або атенуйованими вакцинними вірусами, мікробами або раковими клітинами, які депонують в капсульованих гідрогелевих імплантатах, і імунокомпетентними лімфоцитами вакцинованого організму. Наше відкриття згаданої здатності і покладене в основу цієї корисної моделі. Далі суть корисної моделі пояснюється: коротким описом способу виготовлення поперечно зшитого придатного для ін'єкційної імплантації поліакриламідного гідрогелю; описом процедури формування в організмі людини перед вакцинацією гідрогелевих депо; прикладами і результатами вакцинації із застосуванням відомих вакцин, які були введені підшкірно (реципієнтам контрольної групи) і в гідрогелеві депо, оточені сполучно-тканинними капсулами (реципієнтам дослідної групи). 5 38183 Для синтезу вказаного гідрогелю в асептичному приміщенні в стерильну скляну судину вносять розрахункові кількості акриламіду і розбавлених водних розчинів зшиваючою агента (звичайно метилен-біс-акриламіду) і ініціаторів полімеризації (як правило, персульфату амонію і тетраметилетилендиаміну). Ці реагенти при кімнатній температурі ретельно перемішують, розбавляють водою, фільтрують суміш і витримують фільтрат до отримання текучого гідрогелю поперечний зшитого поліакриламиду, який відмивають від залишків мономера і інших реагентів. Готовий продукт містить (звичайно в концентрації від 2,5 до 6,0%, а переважно від 3,5 до 5,0% по масі) високо-очищений поперечнозшитий нерозчинний у воді і рідких середовищах на її основі і хімічно та механічно стабільний поліакриламід і апірогенну дистильовану воду (до 100%). Замкнуті в сполучно-тканинні капсули імплантати біосумісного гідрогелю формують у реципієнтів вакцин завчасно (не менше, ніж за місяць до депонування вакцинних препаратів). При цьому імунний статус можна не враховувати , бо тривале застосування вказаного гідрогелю навіть для масивного ендопротезування (коли об'єм гелю сягає 300-500мл) показало практично повну відсутність алергічних і інших негативних реакцій пацієнтів. Слід проявляти особливу обережність лише при ін'єкціях гідрогелю особам з гострими гнійними запальними захворюваннями. Гідрогель ін'єктують щонайменше в одне вибране місце, як правило, підшкірно для полегшення подальшого виявлення імплантатів оглядом або пальпацією і забезпечення точності ін'єкцій вакцин всередину цих імплантатів. Зокрема, такі місця обирають в зоні передпліччя ззовні, або переважно у верхній третині стегна спереду або збоку, або під шкірою живота переважно зліва і праворуч від серединної лінії нижче пупка. Можливі й інші зони формування гідрогелевих імплантатів. Бажано лише, щоб вони розташовувалися за течією лімфи від периферії до центру і, за можливістю, поблизу лімфовузлів, локалізація яких добре відома будьякому лікарю. Об'єм одного гідрогелевого імплантату звичайно вибирають з урахуванням віку і розмірів тіла майбутнього реципієнта вакцин в межах від 1,0 до 2,5мл (і лише іноді 3,0мл або більш, але переважно менше 5,0мл). Кількість імплантатів і їх сумарний об'єм залежать, як правило, від максимального об'єму разової дози вибраної вакцини і від кількості очікуваних ревакцинацій. Зрозуміло, що за потреби у формуванні декількох депо для часток (близько 0,2-0,5мл) однієї порівняно великої разової дози вакцини (або для одночасного введення декількох вакцин) всі початкові імплантати біосумісного гідрогелю слід формувати за один сеанс. Далі вказані імплантати витримують в організмі майбутнього реципієнта вакцини не менше одного місяця (але звичайно не більше двох місяців) до формування навколо них суцільних сполучнотканинних капсул. Досвідчений пластичний хірург здатний - з урахуванням зменшення рухливості гідрогелю - оцінити зрілість кожної такої капсули 6 шляхом пальпації. Природно, що таке вміння може виробити навіть у середнього медперсоналу, який виконує масові щеплення. Капсульовані імплантати не перешкоджають роботі м'язів і інших органів і можуть зберігатися у людей довічно. Мало того, завдяки біологічній і хімічній інертності гідрогель на основі поперечнозшитого поліакриламіду при безпосередньому і тривалому (в експериментах - до 180 днів) контакті з різними вакцинами не виявляє будь-якого модифікуючого впливу ні на їх склад, ні на імуногенну активність. Відповідно, термін дії вакцин, що депоновані всередині вказаних капсул, зростає, а потреба в періодичних ревакцинаціях скорочується (іноді - до нуля). Природно, що кожний окремий імплантат біосумісного гідрогелю навіть через багато років можна застосувати для ревакцинації (якщо вона буде необхідна за показниками титрів антитіл), або для подальшого введення різних вакцин, бо низькомолекулярні не-антигенні компоненти вакцин будуть вільно дифундувати крізь сполучно-тканинні капсули імплантатів, звільняючи місце для чергових ін'єкцій очищених вакцинних антигенів або живих вакцин. Примітка. Стосовно використання протипухлинних вакцин слід мати на увазі наступне. Нині широко відомо, що злоякісні пухлини є безпосередніми причинами смерті лише в тих окремих випадках, коли вони глибоко уразили нервову систему (особливо головний мозок), систему кровотворення, печінку, нирки і інші життєво важливі системи або органи і практично повністю подавили їх функціонування. В більшості ж випадків загибель пацієнтів є наслідком кахексії, тобто білкового голодування життєво важливих органів і тканин, яке (навіть при звичайному посиленому харчуванні) є наслідком інтенсивного відбору амінокислот на розмноження і підтримку життєдіяльності пухлинних клітин. Тому при використанні запропонованої корисної моделі для вакцинації ракових хворих на час, що необхідний для формування сполучнотканинних капсул навколо гідрогелевих імплантатів, доцільно застосовувати методику аліментарного життєзабезпечення і активізації імунної системи, запропоновану Інститутом здоров'я нації® (Київ, Україна), яка відома під знаками WORLD GRINIZATION SYSТЕМ® і ГРІНІЗАЦІЇ® (ГРІНІЗАЦИЯ®, GRINIZATION ®), і спеціально створені харчові продукти, доступні на ринку під знаками ГРІН ПРО® (GRIN PROТМ) і ГРІН МІКС® (GRIN MixТМ). Це дозволяє підтримати ракових хворих (причому деяких з них - навіть в термінальній стадії) до моменту, коли навкруги гідрогелевих імплантатів сформуються сполучно-тканинні капсули і стане можливою вакцинація із застосуванням вакцин на основі пухлиноасоційованих антигенів і навіть на основі культур (не обов'язково атенуйованих, але обов'язково диспергованих) живих ракових клітин. Для експериментальної перевірки запропонованого засобу і супутнього способу вакцинації були проведені дослідження двох однакових груп реципієнтів. В кожній групі було 40 дорослих людей різної статі у віці від 20 до 30 років з задовіль 7 38183 ним початковим імунним статусом. Кожному реципієнту в разовій дозі 0,5мл була введена жива вірусна вакцина для профілактики кору, паротиту і краснухи M-M-RII® фірми MERCK & Co., Inc. (Whitehouse Station, N.J., USA). В контрольній групі вакцину вводили підшкірно в праве передпліччя відповідно до інструкції виробника з використанням звичайних стерильних одноразових шприців. В дослідній групі вакцину вприскували в сформовані в правому передпліччі збоку за 1,5 місяці до щеплення імплантати біосумісного гідрогелю на основі поперечно-зшитого поліакриламіду з початковим об'ємом близько 2,5мл, що знаходилися усередині суцільних сполучнотканинних капсул. Для вакцинації використовували одноразові стерильні шприци з тонкими "інсуліновими" голками. Реципієнтів обох гр уп обстежували для оцінки їх стану перед імунізацією і для виявлення побічних реакцій після імунізації, тобто таких небажаних явищ, які - за визначенням ВОЗ - викликані вакциною, процесом імунізації або за часом пов'язані з імунізацією. Для цього реципієнтів піддавали регулярному опитуванню, огляду і фізикальному дослідженню. Крім того, до імунізації (день «0»), а потім на 7-у, 14-у, і 35-у добу після імунізації у реципієнтів брали проби крові, в яких загальноприйнятими методами визначали: ЦІК (сироватковий Циркулюючий Імунний Комплекс, що складається з антигена, антитіл і пов'язаних з ними С3, С4 і Clq компонентів комплементу), імуноглобуліни типів IgM, IgA і IgG, 8 вихідні величини і приріст концентрації імунокомпетентних клітин CD3, CD4, CD8 і CD20, і зміни співвідношення CD 16/56 і Т-хелперного (CD4+)/T-cyпpecopнoгo(CD8+) індексу. Дані індивідуальних вимірів на кожний день контролю в кожній контрольній групі усереднювали, фіксуючи максимальнівідхилення від середніх величин (див. відповідно таблиці 1 і 2). Дисперсія у всіх випадках була не гірше р≤0,05. Порівняльні обстеження і аналізи дали наступні результати. В більшій частині контрольної групи після вакцинації були відзначені несприятливі побічні реакції, у тому числі: слабо виражені - у 30%, середньої тяжкості - у 22,5% і важкі - у 12,5% реципієнтів. Практично всі реципієнти після імунізації скаржилися на неприємні відчуття (сверблячку і локальні болі різної інтенсивності) в зоні ін'єкції, загальну слабкість і уповільнення реакції на зовнішні подразники. З позицій нозологічної діагностики найзначніші ускладнення в цій групі були представлені гіпертермічним синдромом, інтеркурентними інфекціями, загостренням латентних процесів і хронічних осередків інфекції, судорожними і невралгічними синдромами, явищами транзитного імунодефіциту, алергічними реакціями, простим (не гнійним) лімфаденітом, гарячковими коливаннями температури тіла і двома випадками стертого паротиту (внаслідок залишкової патогенності або індивідуальної реверсії відповідного вакцинного штаму). Вплив стандартної вакцинації на імунологічні показники крові у реципієнтів контрольної групи показаний в таблиці 1. 9 38183 10 Як видно з цієї таблиці 1, стандартна вакцинація викликає різке підвищення величини ЦІК, яка далека від початкового значення навіть на 35-у добу, і помітну розбалансованість основних чинників гуморального і клітинного імунітету. В дослідній групі обстеження шкіри і підшкірних тканин в місцях розташування гідрогелевих імплантатів після ін'єкцій вакцини показало відсутність місцевого запального процесу у всі х реципієнтів. Легке нездужання і субфебрильна температура спостерігалися протягом 1-3 днів. Трьом пацієнтам (7,5%) дослідної групи в період спостереження (35 діб) були рекомендовані антибактеріальні засоби, не пов'язані з процедурою імунізації. їх вживання практично не вплинуло на перебіг експерименту. Вплив вакцинації з використанням капсульованих гідрогелевих депо на імунологічні показники крові у реципієнтів дослідної групи показаний в таблиці 2. Як видно із таблиці 2, імунізація з використанням капсульованих гідрогелевих імплантатів як депо для вакцини сприяє, по-перше, збереженню фізіологічно виправданих рівнів ефекторів гуморального імунітету (рецепторів для антигенів) IgA, IgM, IgG і сироваткового ЦІК і, по-друге, оптимізації співвідношень популяцій імунокомпетентних клітин CD3+; CD4+; CD8+; CD20+; CD23+; CD16+; CD56+ і Т-хелперного (CD4+)/T-cyпpecopнoгo(CD8+) індексу. Застосування замкнутих в сполучно-тканинні капсули імплантатів біосумісного гідрогеля як засобів депонування вакцин в живому організмі істотно знижує ризик поствакцинальних ускладнень і потребу в багатократній ревакцинації. Комп’ютерна в ерстка Н. Лисенко Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601