Спосіб отримання ліній рису

Реферат: Спосіб отримання лінійного матеріалу в культурі пиляків рису посівного включає отримання гомозиготних ліній методом культури in vitro пиляків. Підвищення регенерації рослин здійснюється за рахунок використання різних джерел вуглецю в індукційному та регенераційному середовищах. UA 108514 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ЛІНІЙ РИСУ UA 108514 U UA 108514 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до селекції сортів рису. В селекційно-генетичній роботі із різними злаковими культурами все більш затребуваним та необхідним є застосування біотехнології, а саме культури ізольованих пиляків. Отримання гаплоїдів через культуру ізольованих пиляків представляє альтернативу традиційним селекційним підходам з поліпшення рису посівного (Oryza spp.). Головною перевагою використання гаплоїдів в селекції є створення гомозиготних ліній в короткий термін [1-3]. Дослідження показали, що індукція андрогенного калюсу та подальша регенерація у рису підвиду Indica виявилася надзвичайно низькою, тоді як сорти рису підвиду Japonica є чутливими до умов in vitro. Високий відсоток диплоїдних регенерантів із калусів у культурі пиляків рису часте явище. Воно є результатом спонтанної диплоїдизації гаплоїдів і відіграє важливу роль у продукції гомозиготних рослин за короткий період. Важливим компонентом середовища є джерело вуглецю, яке, виконує в умовах in vitro дві функції - трофічну та підтримує необхідний осмотичний потенціал в клітинах ізольованих пиляків за їхнього культивування. Частіш всього для цього використовують сахарозу. Вважають, що підвищена її концентрація важлива для всіх злаків на етапі організації багатоклітинних структурних елементів в новоутвореннях - калюсних і ембріоїдних [4-6]. Деякі азіатські дослідники використовують в якості джерела вуглецю у середовищах для культивування пиляків рису інші вуглеводні, а саме мальтозу [7-11]. Найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється, є стаття [G. Trejo-Tapia та інших "The effects of cold-pretreatment, auxins and carbon source on anther culture of rice", - Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 2002. - Vol. 71. - P. 41-46]. У відповідності з даними статті, ефективність способу отримання лінійного матеріалу рису залежить від певної комбінації варіантів культивування: застосування попередньої обробки волотей рису, наявності в індукційному живильному середовищі сахарози або мальтози та певного балансу ауксинових і цитокінінових фітогормонів у середовищі для регенерації. Даний спосіб вибрано як прототип. Недоліки прототипу: 1) ефективність способу залежала від генотипу донорного матеріалу рису; 2) для різних гібридів оптимальне для найбільшого виходу подвоєних гаплоїдів поєднання вмісту ауксинів/цитокінінів та джерела вуглецю у середовищі було різним, що не дозволило вибрати одну універсальну комбінацію умов культивування. Для усунення недоліків даного способу пропонується спосіб отримання ліній рису, оснований на удосконаленні методу культури пиляків in vitro. В основі корисної моделі, що пропонується, є дослідження впливу вуглецевого компоненту та гормональних речовин в середовищі на ефективність андрогенезу in vitro при культивуванні пиляків рису посівного. У зв'язку з цим мета дослідження - вивчення ролі даних сахароз у процесах формування новоутворень та регенерації рослин в культурі пиляків рису української селекції з метою удосконалення етапів біотехнології отримання рослин-регенерантів. Поставлена задача вирішується шляхом застосування різних сахароз на кожному з етапів андрогенезу in vitro при культивуванні пиляків рису посівного. Відмінності корисної моделі, що заявляється, від прототипу: - додавання до індукційного середовища сахарози та одночасно двох ауксинів (2,4-Д та НОК) і цитокініну (кінетин); - додавання до регенераційного середовища мальтози та одночасно двох цитокінінів (БАП та кінетин) і ауксину (НОК). Спосіб забезпечує отримання новоутворень з морфогенних мікроспор пиляків рису та регенерацію з них зелених рослин. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом (отримання ліній від кожного дослідженого генотипу рису) можна пояснити наступним чином. Вибір оптимального джерела вуглецю, що забезпечує рослинні клітини енергією та живильними речовинами залежить від внутрішньоклітинного метаболізму різних тканин даного виду. Проведене порівняльне дослідження впливу вмісту сахарози чи мальтози в живильному середовищі на окремі етапи андрогенезу in vitro (процесу отримання лінійного матеріалу). Показано, що при культивуванні пиляків на штучному живильному середовищі з сахарозою з мікроспор формується достатня кількість новоутворень із високим морфогенним потенціалом. Далі на регенераційному живильному середовищі з мальтозою забезпечується максимально можливий, для даних умов експерименту, рівень регенерації зелених рослин. Спосіб здійснюється таким чином. Як рослинний матеріал застосовуються пиляки рису посівного. Волоті зрізають, коли вакуолізовані мікроспори більшості пиляків знаходяться на середньопізньої стадії розвитку. 1 UA 108514 U 5 10 15 20 25 30 35 Попередню обробку зрізаних волотей проводять у воді за температури 8 °C-10 °C протягом 4-7 діб. Стерилізацію волотей проводять розчином комерційного препарату "Білизна" протягом 5 хв., надалі, зливають його і заливають 0,01 н. розчином НСl (10 хв.) з наступним п'ятиразовим промиванням дистильованою стерильною водою. Пиляки експлантують у чашки Петрі (Ø=60 мм) на тверді живильні середовища та культивують у темряві при 25 °C. Для індукції новоутворень використовують живильне середовище N6 з додаванням НОК - 1 мг/л, 2,4дихлорфенооцтової кислоти (2,4-Д) - 3 мг/л та кінетину 1 мг/л, та 60 г/л сахарози [10]. Для регенерації з новоутворень застосовують живильне середовище MS з додаванням 0,75 мг/л БАП, 0,25 мг/л кінетину та 0,25 мг/л НОК, 30 г/л мальтози [11]. Новоутворення культивують на світлі за температури 26 °C. Для культивування регенерантів використовують безгормональне живильне середовище MS із половинним складом макро- та мікросолей. Приклад 1 Проводили оцінку ефективності запропонованого способу на перших етапах гаплопродукційного процесу. Як дослідний матеріал використовували пиляки рису з рослин гібридів F2: Ariette х Преміум (№ 3); Гарант х Престиж (№ 6); Merle х Престиж (№ 8); Командор х Престиж (№ 14); Fhoi bonne x Престиж (№ 17). Досліджували вплив складу живильного середовища для культивування пиляків на індукцію новоутворень. Застосовували два варіанти живильного середовища N6: 1) з додаванням НОК - 1 мг/л, 2,4-дихлорфенооцтової кислоти (2,4Д) - 3 мг/л та кінетину 1 мг/л; 60 г/л сахарози [10] та 2) з додаванням 2,4-Д - 2 мг/л та кінетину 0,5 мг/л; і 30 г/л мальтози [11]. Показана висока чутливість даних форм до наданих умов in vitro за культивування пиляків. Виявлений достовірний вплив на формування новоутворень складу індукційного середовища (фіг. 1). Приклад 2 Досліджували ефективність гаплопродукції за різних варіантів живильних середовищ для регенерації. Сформовані на кожному з двох індукційних середовищ (приклад 1) новоутворення, пересаджували на два регенераційних середовища [12]: 1) - MS з додаванням 0,75 мг/л БАП, 0,25 мг/л кінетину та 0,25 мг/л НОК, 30 г/л мальтози; 2) - відрізняється від першого варіанта джерелом вуглецю - 30 г/л сахарози. Оскільки первинних середовищ було також два, регенерацію зелених рослин враховували за чотирьох варіантів досліду: варіант 1 - індукційне середовище - із сахарозою / регенераційне - із сахарозою; варіант 2 - сахароза / мальтоза; варіант 3 - мальтоза / сахароза; варіант 4 - мальтоза / мальтоза. Виявили, що здатність до регенерації новоутворень, одержаних на двох дослідних індукційних середовищах, була різною. Більша частина новоутворень усіх досліджених генотипів із середовища з мальтозою була не спроможна регенерувати зелені рослини, тоді як з новоутворень із індукційного середовища з сахарозою - отримано на порядок більше зелених регенерантів від усіх п'яти гібридів рису (фіг. 2). За результатами дослідження виявлено найбільш оптимальну комбінацію між індукційним живильним середовищем та середовищем для регенерації (варіант 2), що за даних умов експерименту дозволяє отримувати достовірно більшу кількість зелених рослинрегенерантів рису від усіх досліджених генотипів (фіг. 3). 40 2 UA 108514 U Таблиця Аналіз прототипу та запропонованого способу отримання ліній рису Ознаки та технічні результати Культура Прототип Запропонований спосіб Oryza sativa L. Андрогенез в культурі пиляків Об'єкт дослідження рису Ефективність способу отримання лінійного матеріалу залежить від генотипу рису. Від кожного генотипу максимальну кількість ліній одержують за Спосіб отримання ліній культивування пиляків на різних рису варіантах живильного середовища N6 із певною комбінацією фітогормонів та сахарози (30 г/л) або мальтози (30 г/л). Ефективність способу 5 10 15 20 25 30 Відсоток новоутворень -0-13 %; відсоток регенерації - 0-1 % від числа висаджених пиляків. Oryza sativa L. Андрогенез в культурі пиляків рису За культивування пиляків на середовищі N6 з додаванням НОК - 1 мг/л, 2,4-Д - 3 мг/л та кінетину 1 мг/л; 60 г/л сахарози з наступним культивуванням новоутворень на середовищі MS здодаванням 0,75 мг/л БАП, 0,25 мг/л кінетину та 0,25 мг/л НОК, 30 г/л мальтози) усі досліджені генотипи показали максимальний рівень регенерації зелених рослин. Дібрано оптимальний варіант індукційного та регенераційного середовищ, який забезпечує ефективний процес формування новоутворень і сприяє виходу зелених рослин-регенерантів. Відсоток новоутворень - 10-42 %; відсоток регенерації - до 3 % від числа висаджених пиляків. Джерела інформації: 1. Sripichitt P. Improved method for anther culture of an indica rice cultivar of Thailland / P. Sripichitt, T. Ozawa, M. Otani, T. Shimada // Plant Prod. Sci. - 2000. - Vol. 3. - P. 254-256. 2. Tran Th. Th. Xa. Rice breeding for high grain quality through anther culture / Tran Thi Thanh Xa, Nguyen Thi Lang // Omonrice. - 2011. - Vol. 18. - P. 68-72. 3. Chen Q.F. Anther culture in connection with induced mutations for rice improvement / Q.F. Chen, С.L. Wang, Y. M. Lu, M. Shen, R. Afza, M. V. Duren, H. Brunner // Euphytica. - 2001, Vol. 120 (3). - P. 401-408. 4. Mkuya M.S. Effect of 137Cs gamma rays to panicles on rice anther culture / M.S. Mkuya, S. I Hua-min, LIU Wen-zhen, SUN Zong-xiu // Rice Science. - 2005, Vol. 12(4). - P. 299-302. 5. Martнnez A. L. Characterization of storage proteins and anther culture for the development of high nutritional quality rice genotypes /A. L. Martнnez, E. Ventura, U. Maldonado, M. M S6nchez, Cr. Bazaldúa, A. A. del Villar // Biotechnologia Aplicada. - 2005, Vol. 22. - P. 41-44. 6. Bagheri N. Evaluation of effective factors in anther culture of iranian rice (Oryza sativa L.) Cultivars / N. Bagheri, N. Babaeian-Jelodar and Ali Ghanbari // Biharean Biologist. - 2009. - Vol. 3, No.2. - P. 119-124. 7. Trejo-Tapia G. The effects of cold-pretreatment, auxins and carbon source on anther culture of rice / G. Trejo-Tapia, U. M. Amaya, G. S. Morales, A. Jimenez-Aparicio // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 2002. - Vol. 71. - P. 41-46. 8. Замбріборщ І.С. Особливості андрогенезу in vitro міжсортових гібридів Oryza sativa L. української селекції / I.C. Замбріборщ, О.Л. Шестопал, Г.О. Доброва, Д.В. Шпак // VIII Міжнар. наук, конфер. "Фактори експериментальної еволюції організмів". - Алушта, 2013. - Т. 12. - С. 224-228. 9. Шестопал О.Л. Вплив попередньої обробки волотей Oryza sativa L. на морфогенез в культурі пиляків in vitro / О.Л. Шестопал, І.С. Замбріборщ, C.O. Ігнатова, Д.В. Шпак // Зб. наук, праць "Фактори експериментальної еволюції організмів". - К., 2014. - Т. 15. - С. 144-148 10. Herath H.M.I. Effect of culture media for another culture of Indica rice varieties and hybrids of Indica and Japonica / H.M.I. Herath, D.C. Bandara, P.K. Samarajeewa // Tropical Agricultural Research & Extension. - 2007. - V. 10. - P. 17-22. 3 UA 108514 U 5 11. Rukmini M. Effect of cold pretreatment and phytohormones on anther culture efficiency of two Indica rice (Oryza sativa L.) hybrids-Ajay and Rajalaxmi / M. Rukmini, G. J. N. Rao and R. N. Rao // Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. – 2013. - Vol. 1(2). - P. 69-76. 12. Шестопал О.Л., Замбріборщ І.С., Шпак Д.В. Вплив вуглецевого компоненту живильного середовища на ефективність андрогенезу in vitro Oryza sativa L. / О.Л. Шестопал, І.С. Замбріборщ, Д.В. Шпак // Фактори експериментальної еволюції організмів: зб. наук. пр. / НАН України, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. МЛ. Вавилова; редкол. / В.А. Кунах (голов, ред.) [та ін.]. -К.: Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова, 2015, - Т. 17. - С. 160-163. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб отримання лінійного матеріалу в культурі пиляків рису посівного, що включає отримання гомозиготних ліній методом культури in vitro пиляків, який відрізняється тим, що підвищення регенерації рослин здійснюється за рахунок використання різних джерел вуглецю в індукційному та регенераційному середовищах. 4 UA 108514 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5