Спосіб моделювання експериментального гіпотиреозу у лабораторних тварин

Реферат: Спосіб моделювання експериментального гіпотиреозу у лабораторних тварин шляхом щоденного введення тиреостатику мерказолілу тваринам. Крім цього, мерказоліл вводять у вигляді 0,05 % розчину разом з питною водою у вільному доступі протягом 30 днів. UA 109608 U (12) UA 109608 U UA 109608 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до фармації та медицини, зокрема до способів моделювання захворювання щитоподібної залози - гіпотиреозу. Відомо багато способів моделювання експериментальної моделі гіпотиреозу на лабораторних щурах шляхом внутрішньо-шлункового введення тиреостатику мерказолілу, що відрізняються між собою як середньодобовою дозою від 0,3 мг/100 г маси тіла до 50 мг/100 г, так і тривалістю введення - від 14-21 дня до 50-60 днів [2, 3, 4]. Однак, недоліком короткострокового введення мерказолілу протягом 14-21 дня є те, що при зупиненні введення тиреостатику щитоподібна залоза зберігає здатність до спонтанного відновлення її функції і терапевтичний ефект тиреостимулюючих засобів може бути оцінений не достовірно. Довготривале ж введення тиреостатику протягом 50-60 днів викликає в щитоподібній залозі розвиток ознак аутоімунного тиреоїдиту, в результаті чого виникає комбінована форма тиреопатії. До того ж, на запропонованих моделях введення потенційних тиреостимулюючих засобів починається після закінчення терміну прийому мерказолілу, що дає можливість оцінити лише лікувальну дію досліджуваних засобів і не дає можливості провести оцінку профілактичної дії. Існує спосіб моделювання гіпотиреозу шляхом введення мерказолілу протягом 8 тижнів в дозі 5-50 мг/100 г маси тіла тварини, а стимулятори функції щитоподібної залози тварини починають отримувати з 5-го тижня експерименту [1]. Недоліком даного способу є довготривале введення тиреостатику, яке призводить до виникнення гіпотиреозу з ознаками аутоімунного процесу [2], а також розвитком компенсаторних реакцій з боку щитоподібної залози підсиленням її функції, що проявляється у підвищенні продукції тиреоїдних гормонів. Відомий спосіб моделювання гіпотиреозу (пат. UA № 41003, 27.04.2009, бюл. № 8) який включає щоденний вплив тиреостатику мерказолілу у дозі 10 мг/кг. Мерказоліл вводять внутрішньочеревинним шляхом протягом 30 діб, з можливістю підвищення дози на 5 мг/кг через кожні 5 діб. Внутрішньочеревинне введення тиреостатику може призводити до розвитку стресових реакцій, які можуть проявлятися у зміні різних біохімічних показників крові, що будуть нівелювати ознаки гіпотиреозу. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу моделювання експериментального гіпотиреозу, шляхом опрацювання дозового режиму тиреостатику та тривалості введення тиреостатику, що дає можливість оцінити профілактично-лікувальну дію потенційних тиреостимулюючих засобів за більш короткий термін введення тиреостатику мерказолілу. Поставлена задача вирішується тим, що як препарат, що порушує функцію щитоподібної залози, використовується мерказоліл у вигляді 0,05 % розчину разом з питною водою у вільному доступі протягом 30 днів. Згідно з корисною моделлю, потенційні стимулятори функції щитоподібної залози тварини починають отримувати з 13-ої доби прийому тиреостатику тривалістю 21 день. Досліди проводили на щурах масою 160-180 г. Експериментальні тварини були поділені на дві групи по 10 щурів у кожній: 1-а - контрольна, 2-а - експериментальна. Моделювання гіпотиреозу проводили шляхом введенням мерказолілу щурам у вигляді 0,05 % розчину разом з питною водою у вільному доступі протягом 30 днів. Введення потенційних тиреостимуляторів починали з 13 доби прийому тиреостатику тривалістю 21 день. Такий спосіб введення дає змогу по-перше, уникнути розвитку стресових реакцій, а, по-друге - оцінити профілактично-лікувальну дію досліджуваних засобів. Обґрунтування початку лікування саме з 13-ої доби введення мерказолілу проводили за показниками рівня гормонів Т 3 та Т4 у сироватці крові, температури 00 00 00 00 00 00 тіла лабораторних тварин, яку реєстрували о 7 , 11 , 15 , 19 , 23 та 7 та за результатами гістологічного дослідження стану щитоподібної залози у інтактних тварин та в різні терміни введення тиреостатику. Відомо, що гіпотермія розцінюється як діагностична ознака гіпотиреозу. Зниження значень температури тіла на 0,3-1,0 °C у всі фази температурного ритму щурів експериментальної групи в порівнянні з контрольною є діагностичним критерієм розвитку гіпотиреозу [3]. Результати, наведені в таблиці 1 свідчать, що введення мерказолілу протягом 5 та 9 днів не призводить до появи ознак стійкого зниження температури тіла у всі фази вимірювання по відношенню до аналогічних показників контрольної групи. Проте, вже на 13-у добу експерименту температура тіла експериментальних тварин була знижена у всі фази ритму, що дає можливість діагностувати "експериментальний гіпотиреоз". Подальше введення мерказолілу не призводило до ще більшого зниження температури. 1 UA 109608 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аналіз результатів, наведених в таблиці 2, показав, що 5-денний термін введення мерказолілу не призводив до вірогідного зниження рівня Т 3 у сироватці крові (на 8,5 %). Після 9денного введення тиреостатику рівень трийодтироніну знижувався на 45,6 %, а після 13денного введення - на 48,4 % порівняно з групою контролю. Збільшення терміну введення мерказолілу не призводило до подальшого значного зниження рівня Т 3 Рівень тироксину у сироватці крові щурів зменшувався на 35 % на 5-ий день введення тиреостатику та 61,4 % - на 9-ий день. Показники рівня Т4 у сироватці крові на 13-й та 17-й дні статистично не відрізнялися від такого, що був отриманий на 5-й день. Таким чином, отримані результати свідчать про розвиток експериментального гіпотиреозу вже на 9-й день введення тиреостатику мерказолілу. Проте, ці дані не співпадають з показниками 6-разового вимірювання температури тіла тварин. За даними температурного ритму експериментальний гіпотиреоз можна констатувати не раніше 13 дня введення мерказолілу. З метою встановлення остаточного діагнозу "експериментальний гіпотиреоз" була проведена гістологічна оцінка стану щитоподібної залози. Морфологічний аналіз показав, що щитоподібна залоза тварин контрольної групи мала типову фолікулярну будову. Часточки тканини відокремлені одна від одної тонкими сполучнотканинними перегородками. Тиреоїдні фолікули різних розмірів, округлої - злегка овальної форми, з чіткими контурами. Фолікулярні тироцити розміщені на базальній мембрані виключно у один ряд (див. фіг. 1 "б"). Ядра клітин щільні, округлі, центрально розташовані, висота клітин становить 5,42±0,10мкм (таблиця 3). Щільність розташування тиреоїдних фолікулів звичайна. Перифолікулярна капілярна сітка нормального кровонаповнення (див. фіг. 1 "а"). Наведена вище морфологічна будова щитоподібної залози відповідає стану нормальної, життєздатної, помірно активної тканини. Через 9 днів після введення мерказолілу у 80 % щурів спостерігали виразне різноманіття розмірів фолікулів, яке візуально ще підсилювалося за рахунок дрібновогнищевої проліферації екстрафолікулярного епітелію та перифолікулярної капілярної гіперемії, особливо у центральних зонах часточок. Часто форма фолікулів ставала більш витягнутою, іноді кутастою. Колоїд у порожнині більшості фолікулів відсутній, або видно залишки його. При цьому мінялася "фактура" колоїду - в ньому з'являлися дрібні брили. Фолікулярні тироцити збільшувалися у висоту порівняно з контролем на 35,1 % (таблиця 3). В цитоплазмі клітин визначалася вакуолізація, помітним був анізонуклеоз. В деяких фолікулах порушено чітке упорядкування тироцитів у ряді (див. фіг.2 "а" та "б"). Через 13 днів введення мерказолілу структурні зміни щитоподібної залози поглиблювалися і були виявлені у 100 % щурів. Зовнішній діаметр фолікулів візуально збільшений. У значній кількості фолікулів епітеліальні клітини гіпертрофовані, виразно вакуолізовані. Вогнищево або по всьому периметру стінки фолікула спостерігається збільшення чисельності тироцитів. Порушувалась чіткість розташування тироцитів у ряді, іноді клітини розміщувалися у декілька рядів. Внаслідок цього внутрішній діаметр фолікулів часто зменшений, типовий рисунок тканини змінений. Проліферація тироцитів призводила до створення у частині фолікулів різних за розміром та гіллястістю сосочкових епітеліальних виростів. Зберігалися перифолікулярна капілярна гіперемія, вогнищева проліферація екстрафолікулярного епітелію, відсутність колоїду у порожнині фолікулів - типова картина йодної недостатності з гіперпластичними проліферативними проявами (див. фіг. 3). Морфометричні заміри підтвердили морфологічні ознаки йодної недостатності. Так, висота фолікулярних тироцитів збільшилася на 63,5 % порівняно з інтактним контролем, а відносно попереднього строку споживання - відповідно на 21,3 % (таблиця 3). Збільшення строку споживання мерказолілу до 17 днів не призводило до подальшого виразного погіршення мікроскопічної картини. Відмічається лише деяке візуальне збільшення фолікулів з сосочковими епітеліальними виростами та кутастою формою (див. фіг.4). Крім цього, у частини щурів місцями видно невелике розширення сполучнотканинних міжчасточкових прошарків. Висота фолікулярного епітелію вірогідно не змінилася порівняно з попереднім строком (таблиця 3). Через 30 днів введення мерказолілу морфологічна картина щитоподібної залози свідчила про розвиток у щурів виразної стадії гіпотиреозу, ускладненого гіперпластичними проліферативними проявами. В залежності від зони часточок спостерігали коливання фолікулів за формою і розміром. Втім у значній частині фолікулів епітеліальні клітини гіпертрофовані, форма їх ставала високою кубічною та навіть циліндричною. Часто спостерігалися "змикання" верхнього краю фолікулярного епітелію з протилежним його шаром, порожнина фолікула не видна або мала вигляд вузької щілини, у зв'язку з чим залоза на цій ділянці повністю втрачала свою звичайну будову. Виразна проліферація фолікулярних тироцитів у вигляді сосочкових епітеліальних виростів, "багаторядність" розташування клітин. Крім цього, у стінці деяких 2 UA 109608 U 5 10 15 20 25 30 фолікулів простежено появу так званих фолікулярних подушок Сандерсона, з вторинними фолікулами. Мали місце дистрофія тироцитів, підвищення мітозу, вогнищева проліферація екстрафолікулярного епітелію, повнокровність капілярної сітки міжфолікулярно. Колоїд у порожнині фолікулів відсутній (див. фіг. 5). Морфологічні прояви гіпофункції підтверджені виразними морфометричними змінами. Так, висота фолікулярних тироцитів ставала більшою порівняно з 17 днями споживання мерказолілу ще на 18,4 %, а відносно інтактних щурів вона збільшилася у 1,96 рази (таблиця 3). Таким чином, на підставі отриманих морфологічних даних можна зробити висновок про те, що на 9-й день введення мерказолілу за поданою вище схемою, у мікроскопічній картині щітоподібної залози щурів починали проявлятися ознаки її гіпофункції. На 13-й день споживання мерказолілу стан залозистої тканини вже повністю відповідав критеріям гіпотиреоїдного стану, який поглиблювався протягом наступних двох тижнів. Отже, за результатами показників температури тіла, рівнем тиреоїдних гормонів у сироватці крові та даними морфологічного дослідження остаточно констатувати розвиток повноцінного гіпотиреоїдного стану у лабораторних тварин можна лише на 13-й день введення тиреостатику. Тому, для оцінки лікувально-профілактичної дії потенційних тиреостимулюючих засобів їх введення слід починати з 13-го дня споживання мерказолілу. Джерела інформації: 1. Доклінічні дослідження лікарських засобів: Методичні рекомендації / За ред. чл.-кор. АМН України О.В.Стефанова - К.: Авіцена, 2001. - 528 с. 2. Методические рекомендации по доклиническому изучению тиреостатических и тиреостимулирующих средств / Е.С. Ром-Богуславская, И.В. Комарова, А.А. Кириченко, Т.С.Божко, Ю.И.Легонькова. - Киев: Фармакологический комитет МЗ Украины, 1995. - 16 с. 3. Патент на изобретение РФ № 2290859, А61В5/01. Способ диагностики экспериментального гипотиреоза у лабораторных животных / В.Н. Козлов, А.Н. Мамцев, И.А. Бондарева. Заявл. 19.05.2005; Опубл. 10.01.2007 // Бюл. - 2007. - № 1. 4. Патент на изобретение РФ № 1522275, G09B23/28. Способ моделирования аутоиммунного тиреоидита / К.О. Блох, В.В. Натарова, О.И. Бриндак, Е.В. Ладогубец, В.В. Полторак. Заявл. 22.01.1986; Опубл. 15.11.1989. 5. Патент на корисну модель Украйни № 41003, МПК: G09B 23/00, G09B19/10, А61P43/00. Спосіб моделювання гіпотиреозу / О.Г. Родинський, В.М. Бєлоконь, П.О. Неруш (Україна). - № u200815151; Заявл. 29.12.2008; Опубл. 27.04.2009, Бюл. № 8-3 с. Таблиця 1 Температура тіла щурів в різні строки введення мерказолілу в дозі 10 мг/100 г Група 00 7 37,7±0,11 Контроль Мерказоліл, 5-ий 37,4±0,12 день Мерказоліл, 9-й 36,4±0,18 день Мерказоліл, 13-ий 36,5±0,25 день Мерказоліл, 17-ий 36,4±0,22 день 11 37,8±0,06 Температура тіла, °C 00 00 15 19 37,5±0,16 36,8±0,17 23 37,0±0,27 7 36,8±0,19 37,3±0,16 36,5±0,17 36,7±0,30 37,3±0,16 36,6±0,23 36,6±0,23 36,9±0,17 36,9±0,29 36,3±0,22 36,0±0,17 36,7±0,18 36,4±0,20 36,4±0,17 36,5±0,11 36,1±0,25 36,7±0,18 36,3±0,20 36,3±0,12 36,4±0,11 36,1±0,25 00 00 00 Таблиця 2 Рівень гормонів Т3 та Т4 в сироватці щурів в різні строки введення мерказолілу в дозі 10 мг/100 г Рівень гормонів, нмоль/л Контроль 5-ий 9-ий 13-ий 17-ий 2,17±0,39 61,92±2,85 Т3 Т4 35 День вимірювання 2,00±0,20 40,20±3,81* 1,18±0,07* 23,93±1,33* 1,12±0,08* 24,38±1,87* 1,10±0,10* 22,83±1,24* Примітки: 3 UA 109608 U * - відмінності статистично значущі відносно групи контролю, р