Спосіб визначення якісного та кількісного складу фенолкарбонових кислот у воді за допомогою хромато-мас-спектрофотометра

Реферат: Винахід належить до галузі хімічної взаємодії водяних рослин (алелопатії) і призначений для визначення якісного і кількісного складу фенолкарбонових кислот у воді, екзометаболіти вищих водяних рослин яких є регулятором структури альгоугруповань і боротьби з цвітінням води. Заявлено спосіб визначення якісного та кількісного складу фенолкарбонових у воді, в якому пропускають через фільтрувальний папір проби з використанням іонообмінних смол, випарювання і утворення стабільної форми екстракту з подальшою ідентифікацією фенолкарбонових кислот, використовуючи мас-спектрометр та здійснюючи математичні розрахунки. UA 109838 C2 (12) UA 109838 C2 UA 109838 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі хімічної взаємодії водяних рослин (алелопатії) і призначений для визначення якісного і кількісного складу фенолкарбонових кислот у воді, екзометаболіти вищих водяних рослин яких є регулятором структури альгоугруповань і боротьби з цвітінням води. Водорості швидко реагують на зміну екологічних умов, їх продукція визначається трофічним рівнем водойм, а структура і величина характеризує його стан. Одним із важливих моментів у формуванні якісного і кількісного складу фітопланктону є відмінність реакції окремих видів водоростей на певні зміни в компонентному складі фенолкарбонових кислот. Одним із методів визначення кількісного і якісного складу фенолкарбонових кислот з використанням методом високоефективної рідинної хроматографії - мас-спектрометрії з використанням елюенту метанол-вода-фосфорна кислота (40:60:0,5 по об'єму) при швидкості елюювання 0,8 мл/хв. і довжиною хвилі λ = 254 нм (Гаврилин М.В., Попова О.И., Губанова Е.А. Фенольные соединения надземной части шалфея мускатного (Salvia sclarea L.), культивируемого в Ставропольском крае // Химия растительного сырья. - 2010. - № 4. - С. 99104) Недоліком цього способу є його громіздкість, а також постійна перевірка отриманих результатів за допомогою паперової та тонкошарової хроматографії. Метод розроблений для фітомаси рослин, де цих речовин міститься на 1-2 порядки більше, ніж у воді, що суттєво залежить від розгонки на хромато-мас-спектрофотометрі. Крім того, він розроблений більшою мірою під флавоноїди, тому деякі фенолкарбонові кислоти не визначає, а кількісний склад рахується лише по галовій кислоті. При цьому такі умови розгонки екстракту не дають повного спектра отриманих фенольних сполук і продуктів їх руйнування (цис- і транс- ізомерів). Був також запропонований наш метод визначення фенолкарбонових кислот у біомасі вищих водяних рослин (Патент № 103091, Україна. Спосіб визначення якісного складу фенолкарбонових кислот у біомасі вищих водяних рослин за допомогою хромато-масспектрофотометра / Усенко О.М., Коновець І.М., заявник та патентовласник Інститут гідробіології НАН України; опубл. 10.09.2013, Бюл. № 17). Недоліком цього методу є те, що в його основу закладено визначення цих речовин, у першу чергу, в біомасі вищих водяних рослин яких міститься на 1-2 порядки більше ніж у воді, що впливає на умови розгонки. Крім того цей метод дозволяє лише визначення якісного складу фенолкарбонових кислот, а як відомо на структуру альгоугруповань впливає на тільки компонентний, а й кількісний склад, що виділяється в навколишнє середовище, тим самим дозволяючи контролювати "цвітіння" води. Задача, на вирішення якої направлений патент, полягає в розробці способу визначення якісного і кількісного складу повного спектра фенолкарбонових кислот у воді без використання отруйних розчинників, зі зменшенням часових затрат, без втрат цих речовин, з можливістю тривалого зберігання отриманого екстракту, що дозволяє його транспортування в місця знаходження хромато-мас-спектрометра. Суть винаходу полягає у тому, що для визначення якісного і кількісного складу фенолкарбонових кислот у воді за допомогою хромато-мас-спектрометра використовується запропонований спосіб, який полягає в попередньому пропусканні через фільтрувальний папір 3 проби об'ємом 1-2 дм , з використанням іонообмінних смол, випарюванням й утворенням стабільної форми екстракту, що дозволяє з найменшими втратами ідентифікувати якісні і кількісні показники оксибензойних і оксикоричних (цис- і транс- ізомерів) кислот, запропонованої формули для спрощення в статистичних розрахунках. Відбирають проби у водоймах (в заростях вищих водяних рослин, на чистоводі або місцях 3 необхідних для визначення цих показників) об'ємом 1-2 дм . Потім у випадку знаходження у пробі осаду або мулу пропускаємо через фільтрувальний папір. Отриманий фільтрат об'ємом 13 2 дм пропускаємо через колонку з катіонітом КУ-2. Отриману суміш пропускаємо через аніоніт ЕДЕ-10п. Фільтрат не використовуємо, так як кислоти зв'язуються у колонці з аніонітом. 3 Фенолкарбонові кислоти відбираються 0,2н H2SO4 порціями по 100 см . Перші три порції не беруться, так як використовуються на нейтралізацію NaOH, яким заряджаються колонки з аніонітом. З метою нейтралізації в елюаті H2SO4 в кожну наступну порцію додається 0,1н гідроксиду барію II Ва(ОН)2 до появи білого молочного осаду. Отриманий розчин випарюють на 3 електричній плитці при температурі 70-80 °C, до об'єму 40-60 см . Фільтруємо через фільтрувальний папір і отриману суміш пропускаємо через катіоніт КУ-2-8. Для хроматографії 3 відбираємо у віалу 1,5 см отриманого фільтрату. Для аналізу використовуємо свіжий фільтрат, проте він може зберігатися тривалий час в морозильній камері. Хроматографічний аналіз вмісту фенолкарбонових кислот проводимо методом високоефективної рідинної хроматографії - мас-спектрометрії на приладі Agilent 1200 MSD 6130 3 виробництва Agilent Technologies. Умови розділення такі: об'єм ін'єкції 0,1 см ; колонка Zorbax Eclipse XDB-C18, Narrow-Bore 2,1 × 150 mm, температура колонки 30 °C; швидкість потоку 1 UA 109838 C2 3 мобільної фази 1,0 см /хв, яка складається з суміші вода: ацетонітрил з додаванням 0,1 % мурашиної кислоти у градієнті (табл. 1). Таблиця 1 Градієнт для хроматографічного аналізу вмісту фенолкарбонових кислот Хвилини 0,0 2,5 5,0 7,5 20,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ацетонітрил з 0,1 % мурашиної Вода з 0,1 % кислоти, % об. кислоти, % об. 10 90 10 90 20 80 50 50 50 50 мурашиної Визначення концентрації сполук проводимо на одноквадрупальному мас-детекторі у такому режимі: джерело іонізації електроспрей (ESI); іонізація позитивна; напруга на фрагментаторі 3 70В, потік газу (азот) 12 дм /хв., температура газу 350 °C; напруга на голці розпилення 300 В; детекція в режимі моніторингу окремих йонів (SIM) маса/заряд: 123,1 139,1; 149,1; 155,1; 165,1; 169,1; 171,1; 181,1; 182,1; 195,1; 199,1; 209,1; 225,1. При розробці методик якісного і кількісного визначення фенолкарбонових кислот були використані хроматографічно чисті стандарти речовин: бензойна, n-оксибензойна, саліцилова, галова, протокатехова, ванілінова, сиренева, α-резорцилова, β-резорцилова, корична, nкумарова, кофейна, ферулова, синапова. Якісний і кількісний склад фенолкарбонових кислот визначали по результатах порівняння часу утримання піків, отриманих на хроматограмі досліджуваного розчину, і часу утримання піків розчину стандартних зразків. Приклад конкретного виконання. Приклад 1. Встановлення параметрів градуювального графіку для визначення концентрації фенолкарбонових кислот у воді Стандартні розчини готували наступним чином: біля 10 мг (точна наважка) речовини 3 3 поміщали у мірну колбу ємністю 100 см , додавали 50 см 25 % метилового спирту, речовину 3 розчиняли і доводили об'єм тим же розчинником до мітки; після цього 1 см отриманого розчину 3 поміщали у мірну колбу ємністю 100 см і доводили тим же розчинником до мітки. Отримана 3 концентрація маточного розчину відповідає 1 мкг/см . Для побудови градуювального графіку готують серію розчинів з вмістом стандартних 3 речовин 0; 0,01; 0,03; 0,08; 0,20; 0,51; 1,28; 3,2; 8,0 і 20,0 мкг/дм . Отриману суміш пропускаємо через катіоніт КУ-2, потім аніоніт ЕДЕ-10п. Фільтрат не використовуємо, так як кислоти зв'язуються у колонці з аніонітом. Фенолкарбонові кислоти 3 відбираються 0,2 н H2SO4 порціями по 100 см . Перші 3 порції не беруться, так як використовуються на нейтралізацію NaOH, яким заряджаються колонки з аніонітом. З метою нейтралізації в елюаті H2SO4 в кожну наступну порцію додається 0,1 н гідроксиду барію II Ва(ОН)2 до появи білого молочного осаду. Отриманий розчин випарюють на електричній плитці 3 при температурі 70-80 °C, до об'єму 40-60 см і стабільної форми рН 0,5-1,0. Фільтруємо через фільтрувальний папір і отриману суміш пропускаємо через катіоніт КУ-2-8. Для хроматографії 3 відбираємо у віалу 1,5 см отриманого фільтрату. Хроматографічний аналіз виконуємо відповідно до методу, описаного вище. 3 Будуємо градуювальний графік у координатах "концентрація ФКК (у мкг/дм ) - площа піку мас-детектора при конкретній величині m/z (x, кількість імпульсів). Встановлено, що в даному діапазоні концентрацій спостерігається лінійний зв'язок. Рівняння градуювального графіку наведено у табл. 2. Приклад 2. Визначення концентрації фенолкарбонових кислот у воді заростей вищої водяної рослини Ceratophyllum demersum. А) Воду відбираємо у водоймі (в заростях вищої водяної рослини Ceratophyllum demersum) 3 об'ємом 2 дм . Потім у випадку знаходження у пробі осаду або мулу пропускаємо через 3 фільтрувальний папір. Отриманий фільтрат об'ємом 2 дм пропускаємо через колонку з катіонітом КУ-2. Отриману суміш пропускаємо через аніоніт ЕДЕ-10п. Фільтрат не використовуємо, так як кислоти зв'язуються у колонці з аніонітом. Фенолкарбонові кислоти 3 відбираються 0,2 н H2SO4 порціями по 100 см . Перші 3 порції не беруться, так як використовуються на нейтралізацію NaOH, яким заряджаються колонки з аніонітом. З метою 2 UA 109838 C2 5 10 15 нейтралізації в елюаті H2SO4 в кожну наступну порцію додається 0,1 н гідроксиду барію II Ва(ОН)2 до появи білого молочного осаду. Отриманий розчин випарюють на електричній плитці 3 при температурі 70-80 °C, до об'єму 50 см і стабільної форми рН 0,5-1,0. Фільтруємо через фільтрувальний папір і отриману суміш пропускаємо через катіоніт КУ-2-8. Для хроматографії 3 відбираємо у віалу 1,5 см отриманого фільтрату. Для аналізу використовуємо свіжий фільтрат, проте він може зберігатися тривалий час в морозильній камері. 3 Б) Паралельно готуємо розчин стандартів об'ємом 2 дм з концентрацією речовин 1,28 3 мкг/дм (порівняльний розчин). Обробку цієї проби проводимо аналогічно вищеописаному методу. В складі фенолкарбонових кислот в заростях вищої водяної рослини Ceratophyllum demersum було ідентифіковано і встановлено концентрації (табл. 3). Підтвердженням отриманих результатів є хроматографічні профілі Ceratophyllum demersum зі спектрами отриманих фенолкарбонових кислот (фіг.) Фіг. Хроматографічні профілі комплексу фенолкарбонових кислот Ceratophyllum demersum: 1 - галова, 2 - протокатехова, 3 - α-резорцилова; 4-n-оксібензойна, 5 - ванілінова; 6 - βрезорцилова; 7 - бузкова; 8 - кумарова; 9 - синапова; 10 - транс-ферулова; 11 - цис-ферулова; 12 - бензойна; 13 - саліцилова; 14 - корична. Концентрацію ФКК у зразках води розраховували за наступною формулою: C 20 S  CCP SCP , де S - площа піку речовини у розчині, що досліджується; S CP - площа піку речовини у стандартному розчині; C CP - концентрація стандартної речовини у порівняльному розчині. 25 30 35 Таким чином нами було вперше встановлено якісний і кількісний склад 14 фенолкарбонових кислот (серед яких 9 оксибензойних і 5 оксикоричні (одна серед яких з цис- і транс- ізомерами) з 3 домінуванням бензойної кислоти (8,65 мкг/дм ). Спосіб дозволяє визначати якісний і кількісний склад фенолкарбонових кислот у воді, так як в залежності від гідробіонтів виділяється різна кількість і компонентний склад цих речовин в навколишнє середовище, що впливає на життєдіяльність альгоугруповань, а особливо на види, що визивають "цвітіння" води, тим самим дозволяючи регулювання цих процесів. Запропонований спосіб призводить до скорочення часу отримання екстракту без використання отруйних розчинників і втрат досліджуваної проби води з ідентифікацією повного спектру і концентрації фенолкарбонових кислот (включаючи цис- і транс- ізомери) за допомогою хроматомас-спектрофотометра. Запропонована формула спрощує процеси підрахунку результатів. Отримана стабільна форма екстракту дозволяє тривале зберігання проб без втрат, з можливістю накопичувати різну кількість проб для аналізу з подальшим транспортуванням в місця знаходження хромато-мас-спектрометру. 3 UA 109838 C2 Таблиця 2 Параметри градуювального графіку для визначення концентрації фенолкарбонових кислот у воді 3 (у=а+b·с, нг/дм ) m/z 123 139 139 149 155 155 155 165 169 171 195 195 199 225 Назва ФКК Бензойна n-Оксибензойна Саліцилова Корична Протокатехова α-Резорцилова β-Резорцилова Кумарова Ванілінова Галова транс-Ферулова цис-Ферулова Бузкова Синапова Час хв виходу, Коефіцієнти рівняння а 15,87 12,19 16,49 19,52 7,78 12,02 13,32 14,35 13,32 3,74 14,62 14,96 13,67 14,60 R b 0,305 0,231 0,323 0,207 0,087 0,326 0,533 0,138 0,175 0,295 0,228 0,081 0,337 0,099 0,0018 0,0020 0,0018 0,0006 0,0004 0,0008 0,0006 0,0005 0,0006 0,0024 0,0011 0,0004 0,0012 0,0005 0,92 0,89 0,91 0,89 0,87 0,92 0,90 0,95 0,88 0,90 0,96 0,86 0,92 0,93 Межа виявлення, 3 нг/дм 45,4 6,4 9,6 3,0 4,8 18,4 11,0 5,4 2,9 51,2 6,5 5,2 7,6 9,1 Таблиця 3 Концентрація ідентифікованих фенолкарбових кислот у воді заростей вищої водяної рослини 3 Ceratophyllum demersum, мкг/дм m/z Назва ФКК 123 Бензойна 139 n-Оксибензойна 139 Саліцилова 149 Корична 155 Протокатехова 155 α-Резорцилова 155 β-Резорцилова 165 Кумарова 169 Ванілінова 171 Галова 195 транс-Ферулова 195 цис-Ферулова 199 Бузкова 225 Синапова Загальна сума 5 10 15 Час виходу, хв 15,87 12,19 16,49 19,52 7,78 12,02 13,32 14,35 13,32 3,74 14,62 14,96 13,67 14,60 Площа піку 19155 5356 6359 9935 421 978 453 568 14344 9148 498 499 4220 571 25,438 Концентрація, мкг/дм 8,650 2,749 2,951 1,309 0,034 0,224 0,153 0,079 2,169 5,518 0,157 0,052 1,299 0,094 3 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб визначення якісного та кількісного складу фенолкарбонових кислот у воді, який 3 відрізняється тим, що виділяють із води пробу об′ємом 1-2 дм , попередньо фільтрують її через фільтрувальний папір, пропускають через іонообмінні смоли КУ-2 і ЕДЕ-10п, причому відбирають фенолкарбонові кислоти 0,2 н H2SO4 з додаванням 0,1 н Ba(OH)2 та подальшим 3 випарюванням одержаного розчину при температурі 70-80 °С, доводячи до об’єму 40-60 см в стабільній формі рН 0,5-1,0, фільтрують та пропускають отриманий розчин через катіоніт КУ-2-8 та ідентифікують цис- і транс- ізомери оксибензойних та оксикоричних фенолкарбонових кислот за допомогою хромато-мас-спектрофотометра, використовуючи елюент: вода з 0,1 % мурашиною кислотою - ацетонітрил з 0,1 % мурашиною кислотою, при швидкості подачі 3 елюента 1,0 см /хв., а детектування здійснюють при різних довжинах хвиль: 215, 240, 254, 270 4 UA 109838 C2 5 та 320 нм, при напрузі на дифрагментаторі для позитивних іонів 70 В та режиму моніторингу іонів: 123, 139, 149, 155, 165, 169, 171, 181, 182, 195, 199, 209 та 225 а. о. м., при цьому концентрацію фенолкарбонових кислот розраховують за наступною формулою: C=S*CCP/SCP, де S - площа піку речовини у розчині, що досліджують, SCP - площа піку речовини у стандартному розчині, CCP - концентрація стандартної речовини у порівняльному розчині. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5