Гідрогелевий матеріал для відновлення кісткових тканин та спосіб його отримання

Реферат: Гідрогелевий матеріал для відновлення кісткових тканин та спосіб його отримання належить до медицини, а саме до композитних полімер-неорганічних лікарських форм, призначених до використання в ортопедії та стоматології для заміщення ушкоджених чи видалених ділянок кісткової тканини. Матеріал для відновлення кісткових тканин містить полімер хітозан та кальцій фосфатну сполуку, представлену гідроксіапатитом, при цьому масове співвідношення полімеру хітозану і гідроксіапатиту складає від 2:10 до 2:5, і вміст твердої фракції (гідроксіапатит + полімер хітозан) за масою складає 25-12 мас. % від маси готового продукту, а ступінь вологості готового продукту становить 75-88 %. Окрім цього гідроксіапатит знаходиться у вигляді наночастинок з розміром до 100 нм з характерно високою для таких часток реакційною здатністю. Спосіб отримання гідрогелевого матеріалу для відновлення кісткових тканин включає наступні стадії: 1) утворення хітозанової полімерної матриці в 0,06М водному розчині ортофосфорної кислоти при її змішування з хітозаном в шейкері при температурі + 37 °C; 2) утворення кальцій-фосфатних кристалітів шляхом додавання хітозан-фосфатної суміші, зі стадії 1, до попередньо приготованого 0,1Μ водного розчину хлориду кальцію з рН=12 з наступним прогрівом суміші до +50 °C протягом 10 хвилин; 3) корегування рН суспензії, отриманої на стадії 2, від значення 5,5-6,0 до рН 7,0-7,4; 4) трансформація кальцій-фосфатних кристалітів, отриманих на стадії 3, в гідроксіапатиті протягом не менше 14 діб, утворення наночастинок гідроксіапатиту та іммобілізація їх в поровому просторі хітозанової матриці; 5) промивання суспензії, отриманої на стадії 4, деонізованою водою; 6) відділення твердої фракції, а саме продукту гідрогелевий нанокомпозитний матеріал від рідкої фракції (вода та побічні продукти реакції) шляхом центрифугування; 7) визначення ступеня вологості готового гідрогелевого нанокомпозитного матеріалу, його стерилізація та упаковка. Отриманий матеріал у формі гелю для відновлення кісткових тканин можливо використовувати для нарощування тканини як додаткове джерело іонів кальцію або наносити на металевий імплантат, стимулюючи ріст нативної кістки, зменшуючи ризик післяопераційного відторгнення. UA 110386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до медицини, а саме до композитних полімер-неорганічних лікарських форм, призначених для використання в ортопедії та стоматології для заміщення ушкоджених чи видалених ділянок кісткової тканини. Статистична оцінка хірургії нещасних випадків свідчить, що близько 8 % всіх операцій спрямовано на нарощування кісток. Дефект кістки, викликаний видаленням пухлини, складним переломом, запаленням в навколо протезному просторі після імплантації протезу, повинен заповнюватися кістковим матеріалом для покращення регенерації кісткової тканини, оскільки в противному разі відбувається негативний процес заміщення кісткової тканини з'єднувальною. [Эппле М. Биоматериалы и биоминерализация / Μ. Эппле; [пер. с нем. подред В.Ф. Пичугина и др.//. - Томск: Ветер, 2007. - 165с] Тому пошук універсального матеріалу для відновлення цілісності кісткової чи зубної тканини є однією з найгостріших проблем сучасної медицини. Існує цілий ряд матеріалів для лікування кістки, в тому числі кістковий матеріал тваринного походження, але при цьому є великий ризик інфекцій та імунних реакцій відторгнення. Щоб запобігти вказаним ускладненням, як замінники кісток найчастіше намагаються використовувати метали та синтетичні матеріали. Основними вимогами до таких матеріалів є достатня механічна стабільність, висока біологічна сумісність та пористість для надання кістковій тканині можливості врости в матеріал та забезпечити механічну фіксацію. Кальцій-фосфатні сполуки мають суттєве значення в галузі інженерії кісткової тканини. Це, насамперед, гідроксіапатит (ГА) Са10(РO4)6(ОН)2, що є основним неорганічним компонентом біогенної кісткової тканини та має такі цінні властивості, як біосумісність, біоактивність, остеокондуктивність та відсутність запальних та токсичних ефектів [Demirtas, T. Hydroxyapatite containing superporous hydrogel composites:synthesis and in-vitro characterization // T. Demirtas, A. Karakecili, M.Gumusderelioglu // J. MaterSci: MaterMed. - 2008. V. 19, № 5-P. 729-735]. Останнім часом все більшої популярності набуває використання матеріалів у формі гідрогелів. Композитні матеріали, які моделюють кісткову тканину, складаються з полімерної матриці та неорганічного наповнювача. Структура хімічно або фізично розгалужених полімерних ланцюгів, які утворюють тривимірну сітку, забезпечує гелям можливість іммобілізувати та утримувати достатню кількість води, біологічної рідини або лікарських засобів. Висока гідрофільність та низький міжповерхневий натяг при контакті з біологічними рідинами робить гідрогелі біосумісними та перспективними у використанні [Drury J.L Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications / Drury J.L., Mooney D.J.// Biomaterials. - 2003. - V. 24. - p. 4337-4351]. Багато розробок та досліджень присвячено використанню різних модифікацій гідрогелів для лікування кісткових та тканинних дефектів в людському організмі [Mann, В.К. Biologic gels in tissue engineering / Mann B.K.// ClinPlast Surg. - 2003. - V. 30. - P. 601-609]. На основі гідрогелів розробляють матеріали біомедичного призначення, сорбційні матеріали та скафолди для культивування клітин. Так, відомий матеріал у формі гелю для регенерації кісткової тканини (патент 2360663 С1, Росія, МПК A61L27/12,A61K6/033/ Десятниченко K.C.(RU). З. 2008118086/15, 08.05.2008. Опубл. 10.07.2009), отриманий змішуванням 20-40 мас. % розчину поліетиленгліколю, 10-50 мас. % суміші ортофосфатів кальцію (гідроксіапатит, фтор, карбонат апатити) з розміром частинок 201000 нм, розчину неколагенових білків, виділених із трубчатих кісток крупної рогатої худоби та домішками лікарських засобів. Основним недоліком даного виходу є значний вміст поліетиленгліколю, щодо якого існує застереження про його можливу токсичність, яка може викликати алергічний та канцерогенний вплив на організм людини, хоча поліетиленгліколь і дозволений до використання як харчова домішка. В патенті US2008063684(A1) (Formable and Settable Polymer Bone Composite and Methods of Production Thereof) описана технологія отримання біокомпозитного матеріалу для протезування кісткової тканини, за якої полімерні гранули крохмал-полікапролактону нагрівались в мікрохвильовій печі до температури 54,4 °C, з них вручну ліпився полімерний матеріал, до складу якого по мірі охолодження додавалася подрібнена кістка тваринного походження в кількості, що становила близько 50 % мас. полімеру. Композит знову нагрівали і надавали йому заданої форми, яка після охолодження мала жорстку конструкцію. Даний винахід має ряд недоліків, а саме: в умовах організму полікапролактон відомий здатністю стимулювати ріст фіброзної тканини, а ксеногенні замінники кістки тваринного походження несуть високий ризик інфекцій і реакцій відторгнення. Відома композиція для кісткової пластики, що створена на основі колагену та гідроксіапатиту (патент № 2274461 С2, Росія, А61К35/32, A61L 27/00 /Литвинов С.Д. (RU). - З. № 2004105528/15. Заявл. 26.02.2004.Опубл. 20.04.2006.), яка наближена за своєю будовою до нативної кісткової тканини. Але хоча біологічний колаген є основною органічною складовою нативної кістки та має 1 UA 110386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ряд безперечно корисних властивостей, в умовах виробництва його добувають з матеріалу тваринного походження, тому він може викликати імунну реакцію відторгнення. Крім того, колаген є поживним середовищем для розмноження мікроорганізмів і не піддається паровій стерилізації внаслідок денатурації при підвищених температурах. Відома також гідрогелева кальцій-фосфатна композиція та спосіб її отримання згідно з патентом CN 101376038 А, опубл. 04.03.2009 року, за якою сполуки фосфору (NaH2PO4, KН2РО4) та кальцію (СаСl2, Ca(NO3)2 в стехіометричному співвідношенні розчиняють в 2 % розчині оцтової кислоти (СН3СООН) і таким чином, як свідчать автори, утворюється попередник гідроксіапатиту (далі ГА). Потім додають 4 % розчин хітозану, причому масове співвідношення хітозану до ГА складає 100:5 та 100:20, тобто основну частку у композиті складає хітозан. Після змішування невелику кількість суспензії наносять на поверхню спеціальної форми, яку поміщують в слабко лужну коагулюючу рідину (NaOH, KОН) для затвердівання. Далі суспензію помішують у прес-форму та витримують в коагулюючій рідині протягом 2-8 годин. Отриманий таким чином гель промивають дистильованою водою при 60-80 °C та висушують протягом 1-2 годин, обов'язково заморожують при -70 °C та висушують в вакуумі. В результаті отримують твердий високопористий матеріал у формі скафолда. Дана композиція та спосіб її отримання є найбільш близькими до заявлюваних технічних рішень, тому й вибрані за прототип. Але при використанні даної композиції, основну частку якої складає хітозан, при такій технології її отримання, мають місце наступні недоліки. Так, суттєве зменшення частки гідроксіапатиту (до 5 %), на наш погляд, знижує якість продукту, оскільки саме гідроксіапатит є основним "конструктивним" матеріалом, додатковим джерелом іонів кальцію при відновленні кісткової тканини та забезпечує механічні властивості імплантату, в той час як хітозан виконує роль матриці для утримування кристалітів ГА та надає матеріалові еластичності. У висушеному матеріалі, який має форму скафолда, кристаліти гідроксіапатиту агломеруються до стану макрочастинок, на відміну від створеного нами гідрофільного матеріалу у вигляді гідрогелю з високим ступенем вологості, де ГА знаходиться у формі наночастинок з високою реакційною здатністю. Крім того, еластичний гідрогелевий матеріал легко заповнює дефекти складної геометрії на відміну від твердої форми матеріалу. В основу запропонованого нами винаходу поставлено задачу створити біосумісний з нативним оточенням гідрогелевий композит для лікування дефектів кісткових тканин, в тому числі складної геометрії, який повинен стимулювати ріст нової кісткової тканини, мати протизапальні властивості, не спричинювати побічних ефектів, не потребувати алергічних тестувань, піддаватися біорезорбції. В основу запропонованого нами винаходу також поставлено задачу удосконалити спосіб одержання матеріалу для відновлення кісткових тканин шляхом отримання просторово зшитих водневими зв'язками матриць на основі природного полімеру - хітозану та ортофосфорної кислоти, утворення та іммобілізації в їх поровому просторі нанорозмірних частинок ГА з отриманням гідрофільного матеріалу, реакційна здатність якого вища, ніж у порошків та гранул. Поставлена задача вирішується тим, що у гідрогелевому матеріалі для відновлення кісткових тканин, який містить природний полімер хітозан та кальцій-фосфатну сполуку, представлену гідроксіапатитом (далі ГА), згідно з винаходом, масове співвідношення полімеру хітозану і ГА складає від 2:10 до 2:5, при цьому вміст твердої фракції (ГА + полімер хітозан) складає 25-12 мас. % від маси готового продукту і ступінь вологості готового продукту становить 75-88 мас. %. Окрім цього, ГА знаходиться у вигляді наночастинок з розміром до 100 нм з характерно високою для таких часток реакційною здатністю. Поставлена задача відносно способу отримання гідрогелевого матеріалу для відновлення кісткових тканин, згідно з винаходом, включає наступні стадії: - утворення хітозанової полімерної матриці в 0,06 Μ водному розчині ортофосфорної кислоти при її змішуванні з хітозаном в шейкері при температурі + 37 °C; - утворення кальцій-фосфатних кристалітів шляхом додавання хітозан-фосфатної суміші, утвореної на стадії 1, до попередньо приготованого 0,1 Μ водного розчину хлориду кальцію (СаСl2) з рН=12 при прогріванні суміші до +50 °C протягом 10 хвилин; - корегування рН суспензії, отриманої на стадії 2, від значення 5,5-6,0 до рН 7,0-7,4; - трансформація кальцій-фосфатних кристалітів зі стадії 3 в кристаліти ГА протягом не менше 14 діб, з подальшим утворенням наночастинок ГА, та іммобілізація їх в поровому просторі хітозанової матриці, одержаної на стадії 1; - промивання суспензії, отриманої на стадії 4, деонізованою водою; - відділення твердої фракції, а саме продукту (гідрогелевий нанокомпозитний матеріал) від рідкої фракції (вода та побічні продукти реакції) шляхом центрифугування; 2 UA 110386 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - визначення ступеня вологості готового гідрогелевого матеріалу, його стерилізація та упаковка. Відомо, що кальцій-фосфатні матеріали широко використовуються при виробництві штучних кісток, заміщенні кісткових дефектів, відновленні кістки, для обробки імплантатів в стоматології та ортопедії. ГА є однією з найбільш стабільних форм кальцій-фосфатів та складає 60-65 % кісткової тканини [Kim, S.K. Bioactive compounds from marine processing by products-A review/Kim, S.K.,E. Mendis //FoodRes. Int. - 2006. - V. 39. - p. 383-393]. Використання хітозану як полімерної складової обумовлене його біосумісністю та здатністю до біодеградації. Хітозан, похідне хітину, є лінійним кристалічним полісахаридом, що складається з мономерів β-(14) N-ацетил-Dглюкозаміну [Z. Modrzejewska Determination of Hydrohel Chitosan Membrane Structure / Z. Modrzejewska, W. Maniukiewich, A. Wojtasz-Pajak // Polish Chitin Society, Monograph XI. - 2006. - p. 113-121]. В фізіологічних умовах розщеплення хітозану до N-ацетил-D-глюкозаміну та Dглюкозаміну відбувається під дією таких ферментів, як хітинази та хітобіази. Загальновідомі протимікробні властивості хітозану. Завдяки наявності в його полімерному ланцюзі аміногруп, 3+ які в водно-кислотних середовищах при значенні рН