Спосіб підвищення резистентності слизових оболонок дихальних шляхів організму до інфікування збудником дифтерії (в експерименті)

Реферат: Спосіб підвищення резистентності слизових оболонок дихальних шляхів організму до інфікування збудником дифтерії шляхом використання вакцини, що містить бактеріальний дифтерійний антиген. Кролям, слизові оболонки яких інфіковані введенням у носові ходи мікробної суспензії C.diphtheriae, роблять щеплення комбінованою вакциною, яка містить дифтерійний анатоксин та бактеріальний дифтерійний антиген, отриманий з використанням електромагнітного випромінення. UA 111081 U (12) UA 111081 U UA 111081 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медичної мікробіології та вакцинопрофілактики і може бути використана при розробці протидифтерійних вакцинних препаратів. Останній епідемічний підйом дифтерії у 90-х роках минулого сторіччя характеризувався великою часткою вакцинованих осіб серед захворілих на дифтерію та супроводжувався майже стовідсотковим охопленням населення первинним щеплювальним комплексом. В структурі захворілих переважали підлітки та дорослі [1]. Виявлення носіїв токсигенних штамів коринебактерій дифтерії зазвичай обмежується вогнищами інфекції та епізодичним обстеженням колективів ризику. Поза увагою профілактичних заходів залишається більшість бактеріоносіїв інфекції, а також хворих на легкі та латентні форми захворювання, котрі забезпечують циркуляцію збудника в людській популяції і є основою епідемічного процесу дифтерії. Вказані особливості свідчать про недостатню ефективність профілактики захворювання за допомогою існуючих вакцинних препаратів на основі дифтерійного анатоксину та вимагають переглянути традиційні підходи до імунопрофілактики цієї інфекції. Відомо, що післявакцинальний гуморальний антитоксичний імунітет не впливає на формування резистентності слизових оболонок дихальних шляхів організму до інфікування збудником дифтерії [2]. Закономірно постає питання про необхідність створення специфічних імунопрофілактичних препаратів, спрямованих на підвищення стійкості організму до колонізації збудником слизових оболонок. Препарати на основі поверхневих бактеріальних антигенів C.diphtheriae, котрі містять патоген-асоційовані молекулярні паттерни, стимулюючі природжений імунітет, мають потенціальну можливість перешкоджати персистенції патогену на слизових оболонках респіраторного тракту. Відомий спосіб підвищення неспецифічної резистентності організму людей і сільськогосподарських тварин, який досягається за рахунок використання в якості вакцин препарату, виготовленого з нетоксигенного штаму C.diphtheriae 5047 [3]. Препарат одержують шляхом культивування вказаного штаму на рідкому живильному напівсинтетичному середовищі з попереднім підрощуванням на маточному культуральному розчині. Вирощену біомасу дезінтегують, очищують шляхом диференційного центрифугування, стерилізують і піддають ліофільному висушуванню. Але вивчення неспецифічної резистентності макроорганізму за імунологічними тестами дослідження крові не дає змоги оцінювати вплив препарату саме на процес звільнення слизових оболонок дихальних шляхів від збудника дифтерії. Відомий також спосіб лікування бактеріоносійства збудника дифтерії, який полягає у комбінації антибіотика та місцевої терапії у вигляді опромінення гелій-неоновим лазером піднебінних мигдаликів та опромінення арсенід-гелієвим лазером підщелепної ділянки - проекції підщелепних лімфовузлів [4]. Призначення комплексної терапії позитивно впливає на динаміку показників імунітету, це проявляється нормалізацією кількості Τ- та В- лімфоцитів, підвищенням показників фагоцитозу та вмісту всіх фракцій імуноглобулінів. Але цей спосіб потребує спеціального високовартісного обладнання, до того ж викликає запитання стійкість отриманого імунологічного ефекту. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб, який полягає у використанні бактерійного дифтерійного антигену, що отримують шляхом дії на вихідний продукт як біомасу штаму C.diphtheriae та дезінтеграцією мікробних клітин ультразвуковими хвилями [5]. Використання даного антигену посилює вплив на формування гуморального антитоксичного імунітету не лише прямим застосуванням дифтерійного анатоксину, але й підсиленням його дії шляхом уведення до складу безпечного, нетоксичного ад'юванту, виготовленого з бактеріальних субклітинних антигенних комплексів епідемічних штамів збудника дифтерії, що забезпечує більш повний контакт вакцини з різними елементами імунної системи макроорганізму. При цьому ступінчаста ультразвукова дезінтеграція мікробної суспензії збудника дифтерії дозволяє суттєво підвищити концентрацію поверхневих антигенів в препараті. Але пошук нових та удосконалення існуючих вакцинних препаратів проти патогенних бактерій залишається актуальною проблемою сучасної медичної науки. Задачею корисної моделі є розробка способу підвищення колонізаційної резистентності слизових оболонок до збудника дифтерії. Поставлена задача вирішується тим, що для підвищення резистентності слизових оболонок дихальних шляхів організму до інфікування збудником дифтерії, кролям, слизові оболонки яких інфіковані введенням у носові ходи мікробної суспензії C.diphtheriae, роблять щеплення комбінованою вакциною, яка містить дифтерійний анатоксин та бактеріальний дифтерійний 9 антиген, при отриманні якого суспензію мікроорганізмів C.diphtheriae концентрацією 10 КУО/мл обробляють електромагнітним випроміненням у режимі: частота 61 ГГц, тривалість 4 години. 1 UA 111081 U 5 10 15 20 25 30 Технічний результат - підвищення опірності організму інфікуванню збудником дифтерії за рахунок застосування комбінованої вакцини, яка посилює резистентність слизових оболонок дихальних шляхів організму. Для реалізації способу пропонується бактеріальний дифтерійний антиген (БДА), одержаний за допомогою фізичного чиннику - електромагнітного випромінення надзвичайно високої частоти (ЕМВ НЗВЧ). Електромагнітні поля є фізичним фактором середовища, який суттєво впливає на живі організми різного рівня організації [6], але механізм його дії досі остаточно не розшифрований. Мішенню для впливу електромагнітного випромінювання є плазматичні і внутрішньоклітинні мембрани, які дуже чутливі до дії самих різних хімічних і фізичних факторів, в тому числі до опромінення. Експериментально встановлено, що механізм дії електромагнітних випромінювань на біологічні об'єкти має резонансно-частотний характер, тобто біологічні ефекти, встановлені для однієї частоти, можуть носити протилежний характер для іншої. На підставі отриманих нами результатів, можна припустити, що під впливом ЕМВ на клітинну стінку коринебактерій відбувається розрив певних хімічних зв'язків з відділенням від клітинної стінки специфічних молекулярних структур. Вони переходять в рідку фазу бактеріальної суспензії і надалі становлять основу бактеріального дифтерійного антигенного препарату. Бактеріальний антигенний препарат з мікробної маси С diphtheriae отримують наступним чином: добову культуру виробничого штаму С.diphtheriae типу gravis tox+, massachussets, вирощену на 10 %-му сироватковому агарі, змивають стерильним фізіологічним розчином (рН 9 7,2) та готують густу суспензію (оптична щільність 26·10 КУО/мл за оптичним стандартом ДІСК ім. Л.О. Тарасевича). З неї готують робочу суспензію мікроорганізмів С. diphtheriae з 9 концентрацією 10 КУО/мл, котру розділяють на 10 пробірок по 6,0 мл в кожній. Пробірки із суспензією мікроорганізмів Сdiphtheriae опромінюють ЕМВ НЗВЧ частотою 61 ГГц впродовж 4 годин на електромагнітному генераторі. Опромінену суспензію піддають центрифугуванню при 6000 об./хв. впродовж 30 хвилин на лабораторній центрифузі ЦЛС-3 і відокремлюють супернатант (СНд). Супернатант інактивують при температурі 56 °C впродовж 1 години в інактиваторі LW-1. Наявність життєздатних коринебактерій в інактивованих суспензіях перевіряють шляхом висіву на 5 % (об'ємна частка) кров'яний агар. Випробування отриманого БДА проводили на кролях середньою вагою близько 3,0 кг. Кролів розподілили на 3 групи за видом імунізації (яку проводили підшкірно у звільнені від шорстки боки із додержанням правил асептики): Група Кількість тварин 1 n=2 2 n=2 3 n=2 Вид імунізації 1,0 мл інактивованого стерильного БДА + 0,5 мл дифтерійного анатоксину (АД) в дозі 20 Lf 1,0 мл інактивованого стерильного БДА + 0,5 мл фізіологічного розчину 0,5 мл АД 20 Lf+1,0 мл фізіологічного розчину 35 40 45 50 В той же день перед забором крові стерильними квачами відбирали матеріал з носових ходів кролів для бактеріологічного посіву на мікрофлору. Посіви здійснювали на кров'янотелуритовий агар (КТА) та у бульйон Лінгуда. Результати подальших бактеріологічних досліджень показали, що в жодного кроля напередодні зараження коринебактерії не висівалися, в усіх тварин на слизових оболонках носу переважала кокова мікрофлора. На другий день після контролю мікрофлори слизових оболонок носу тварин заражали шляхом уведення у носові ходи квачів, змочених у мікробній суспензії C.diphtheriae. Для виготовлення суспензії добову агарову культуру C.diphtheriae змивали стерильним 9 фізіологічним розчином (рН 7,2) та готували мікробну завись з оптичною щільністю 14×10 КУО/мл. Надалі проводили щоденні бактеріологічні обстеження кролів на наявність C.diphtheriae на слизових оболонках носу з посівами на КТА та бульйон Лінгуда і відмічали зростання коринебактерій. Сумарні дані за два тижні наведені у таблиці 1. Якщо в жодного кроля напередодні зараження культурою C.diphtheriae коринебактерії не висівалися, то після зараження впродовж двох тижнів в піддослідних інфікованих тварин було виділено 28 культур коринебактерій дифтерії (типові грампозитивні палички, з кінцевими стовщеннями, розташовані парами у вигляді "V", "войлоку" тощо). У кролів групи 3 було виділено (80±10,7) % від культур коринебактерій, виділених з прямих посівів, та (69,2±13,3) % - з бульйонів Лінгуда. Імунізація монопрепаратом бактеріального антигену (група 2) була у 3,5 рази ефективніша у порівнянні з групою 3. Але найефективнішим було щеплення комбінованою 2 UA 111081 U вакциною БДА + АД (група 1), в кролів, які одержали вказану вакцину, культура C.diphtheriae виділялася лише один раз впродовж двох тижнів спостереження. Таблиця 1 Результати бактеріологічних досліджень кролів, щеплених експериментальним бактеріальним дифтерійним препаратом Група Введені вакцинні препарати Кількість досліджень 1 2 3 5 10 15 БДА + АД БДА + фіз. розчин АД + фіз. розчин 32 32 32 Кількість виділених культур C.diphtheriae всього в т.ч. при прямому посіві абс.ч. (М±m), % абс.ч. 1 3,1±3,1 1 6 18,8±6,9 2 21 65,6±8,4 12 На 14-й день після зараження в жодного кроля коринебактерії вже не висівалися, і знову спостерігалася лише кокова мікрофлора, як і напередодні зараження. Таким чином, результати бактеріологічних досліджень свідчать про те, що імунізація БДА, одержаним за допомогою ЕМВ НЗВЧ, запобігає колонізації слизових оболонок дослідних тварин C.diphtheriae. Слід зауважити, що протидифтерійна антиколонізаційна активність щеплення виявляється сильнішою у поєднанні БДА з очищеним АД, тобто виявляється синергічна дія щодо попередження колонізації C.diphtheriae. Для вивчення ад'ювантної дії БДА на формування гуморального антитоксичного імунітету, на третьому тижні після щеплення (коли титри антитоксичних протидифтерійних антитіл є максимальними) в кролів, імунізованих БДА, що містив 0,18 мг/мл білка, проводили забір крові для серологічних досліджень в реакції пасивної гемаглютинації (РПГА). Отримані результати представлені у таблиці 2. Таблиця 2 Результати серологічних досліджень в РПГА на третьому тижні після щеплення БДА Група 1 2 3 20 25 30 Введені вакцинні препарати БДА + АД БДА + фіз.розчин АД + фіз. розчин Титри антитіл, МО/мл 0,63 0 0,03 Результати РПГА показали, що на третьому тижні після щеплення захисний рівень антитіл виявися у кролів групи 1, котрі одержали щеплення комбінованою вакциною БДА + АД. В інших тварин титри антитіл були нульовими або не досягали захисного рівня - 1:20. Визначення адгезивних властивостей тест-штаму проводили за відомим способом [7]. Для цього в піддослідних тварин брали кров з вушної вени, відбирали сироватки, інактивували їх, розводили 1:5 фізіологічним розчином (рН 7,2), додавали до них 0,05 мл зависі нормальних еритроцитів барана та витримували суміш у побутовому холодильнику при температурі +(6-8)°С впродовж 18 годин. Сироватки крові кролів в об'ємі 0,5 мл додавали до 0,5 мл зависі формалінізованих нормальних еритроцитів людини 0(1) групи крові, витримували у термостаті при температурі 37 °C впродовж 30 хвилин, надалі додавали 0,5 мл суспензії тест-штаму C.diphtheriae, вдруге витримували у термостаті при аналогічних умовах. Робили 2 серії мазків на ретельно знежирених скельцях, висушували та забарвлювали по Романовському-Гімза. Враховували результат окремо по двом серіям мазків-препаратів та потім обчислювали середні показники окремо для групи кролів, щеплених ДБА, та контрольних тварин; результати розрахунків представлені в таблиці 3. 3 UA 111081 U Таблиця 3 Середні показники адгезії по двом серіям мазків-препаратів Лабораторні тварини Щеплені ДБА Контрольні Показники адгезії СПА КА ІАМ 2,4±0,07 69,4±1,3 3,4±0,06 3,0±0,05 75,4±1,8 4,0±0,05 Статистична достовірність різниці показників Р=95,5 %, t>2 Примітки: 1) середній показник адгезії (СПА) - середня кількість мікробів, які прикріпилися до одного еритроциту; 2) коефіцієнт адгезії (КА) - відсоток еритроцитів, що мали на своїй поверхні адгезовані мікроорганізми; 3) індекс адгезивності мікроорганізмів (ІАМ) - відношення СПА до КА помножене на 100. 5 10 15 20 25 30 35 40 Вивчення адгезивних властивостей тест-штаму C.diphtheriae до формалінізованих еритроцитів людини показало, що експозиція їх із сироваткою піддослідних тварин, щеплених дифтерійним бактеріальним антигеном, призвела до зменшення показників адгезії у порівнянні з контролем, відповідно: СПА - на 20, 0 %, КА - на 8,0 %, ІАМ - на 15 відсотків. Причому, різниця показників виявилася статистично достовірною: при Р=95,5 % t > 2 для усіх трьох показників. Це може вказувати на присутність у сироватці щеплених кролів протидифтерійних антиадгезивних антитіл та ефективність імунізації тварин досліджуваним бактеріальним антигенним препаратом. Таким чином, експериментальна комбінована вакцина, що містить АД та дифтерійний антигенний бактеріальний препарат, одержаний при опроміненні мікробних клітин C.diphtheriae електромагнітним випроміненням надзвичайно високої частоти, ефективно сприяє очищенню імунізованого організму від збудника дифтерії, підвищує специфічний гуморальний протидифтерійний імунітет та антиадгезивну активність сироваток крові тварин, щеплених проти C.diphtheriae. Джерела інформації: 1. Чудная, Л.М. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии на Украине [Текст] /Л.М.Чудная, В.Г. Оксиюк, Л.С. Красюк [и др.] // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - № 1. - С. 10-12. - Библ. с. 12 (1 назв.). - ISSN 1560-9529. Держатели документа: ОмГМА. 2. Харсеева, Г.Г. Показатели антитоксического и антибактериального иммунного ответа у детей, больных дифтерией /Г.Г. Харсеева, Е.П. Москаленко, О.И. // Журн. Микробиол. - 2005. № 4. - С. 58-61. 3. Пат. 2019181 RU, МПК 7 G01N 33/53, G01N 33/569. Способ оценки антибактериального иммунитета к дифтерии [Електронний ресурс] /Немов В.В., Дегтева Г.К., Ивашкина С.Г. [та ін.] (RU); заявник і патентовласник ФГУ науки и здравоохранения "Нижегородский научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной" (RU). № 2001100242/14; заявл. 03.01.2001; опубл. 27.01.2003. - Режим доступу: www.flps.ru 4. Пат. 54710 UA, МПК 7 А61В 10/00, А61К 38/00, A61N 5/00. Спосіб лікування бактеріоносійства збудника дифтерії [Електронний ресурс] /Михайлова А.М., Савчук А.І. (UA); заявник і патентовласник Одеський державний медичний університет (UA). - № 2002010688; заявл. 28.01.2002; опубл. 17.03.2003, Бюл № 3. - Режим доступу: www.uipv.org 5. Пат. 86891 UA, МПК (2013.01) А61К 35/66 (2006.01), А61К 35/00. Спосіб отримання бактерійного дифтерійного антигену [Електронний ресурс] /Бабич Є.М., Єлисєєва І.В., Білозерський В.І. [та ін.] (UA); заявник і патентовласник ДУ "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова НАМИ України" (UA). - № u 2013 09779; заявл. 06.08.2013; опубл. 10.01.2014, Бюл. № 1. - Режим доступу: www.uipv.org 6. Бецкий О.В., Кислов В.В. // Волны и клетки. - Серия: Физика. - Изд-во: Знание, 1990. - 64 с. 7. Предтеченский, В.С. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям [Текст] /В.С. Предтеченский, Е.А. Кост, Л.Г. Смирнова // М.: Медицина, 1964. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 1. Спосіб підвищення резистентності слизових оболонок дихальних шляхів організму до інфікування збудником дифтерії шляхом використання вакцини, що містить бактеріальний дифтерійний антиген, який відрізняється тим, що кролям, слизові оболонки яких інфіковані 4 UA 111081 U 5 введенням у носові ходи мікробної суспензії C.diphtheriae, роблять щеплення комбінованою вакциною, яка містить дифтерійний анатоксин та бактеріальний дифтерійний антиген, отриманий з використанням електромагнітного випромінення. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що при отриманні бактеріального дифтерійного 9 антигену суспензію мікроорганізмів C.diphtheriae концентрацією 10 КУО/мл обробляють електромагнітним випроміненням у режимі: частота 61 ГГц, тривалість 4 години. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5