Композиція для біоконтролю у вигляді гранул, що диспергуються у воді

Реферат: Винахід належить до композиції для біоконтролю у вигляді гранули, що диспергується у воді, яка містить: спори нетоксикогенного штаму Aspergillus, аніонна поверхнево-активна речовина та 4-О-бета-D-галактопіранозил-альфа-D-глюкопіранозу у вигляді безводної лактози. Також, винахід належить до способу зниження забруднення афлатоксином сільськогосподарської культури вищезазначеною композицією. UA 114402 C2 (12) UA 114402 C2 UA 114402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь, до якої належить даний винахід [0001] Даний винахід відноситься до гранульованих композицій для біоконтролю, що диспергуються у воді, до їх одержання та до їх застосування. Зокрема, даний винахід відноситься до композицій у вигляді гранул, що диспергуються у воді, які містять гідрофобні спори, котрі мають покращену біологічну стабільність. Передумови даного винаходу [0002] Афлатоксини є токсинами, що продукуються видами Aspergillus, які ростуть на деяких сільськогосподарських культурах, зокрема, арахісі, маїсі або кукурудзі, до та після збору врожаю, а також під час зберігання. Біосинтез афлатоксину включає складний полікетидний шлях, що починається з ацетату та малонату. Однією важливою проміжною сполукою є стеригматоцистин та О-метилстеригматоцистин, які є прямими попередниками афлатоксинів. Важливими продуцентами афлатоксинів є Aspergillus flavus, більшість штамів Aspergillus parasiticus, Aspergillus nomius, Aspergillus bombycis, Aspergillus pseudotamarii, Aspergillus ochraceoroseus, Aspergillus rambelli, Emericella astellata, Emericella venezuelensis, Bipolaris spp., Chaetomium spp., Farrowia spp. та Monocillium spp., зокрема, Aspergillus flavus та Aspergillus parasiticus (Plant Breeding (1999), 118, стор. 1-16). Також відомі додаткові види Aspergillus. Група афлатоксинів складається з більш ніж 20 різних токсинів, зокрема, афлатоксину B1, B2, G1 та G2, циклопіазонової кислоти (CPA). [0003] Захист сільськогосподарських культур від афлатоксинів, які забруднюють зерно сільскогосподарських культур, є проблемою, що постійно виникає в сільському господарстві, садівництві та інших галузях рослинництва. Щоб допомогти подолати цю проблему, було встановлено, що певні ізольовані нетоксикогенні штами Aspergillus, які зустрічаються в природі на сільськогосподарських полях, виявилися ефективними при попередженні забруднення афлатоксином шляхом конкурентного виключення токсигенних штамів. [0004] Для певних сільськогосподарських, садівничих та інших пов'язаних застосувань часто є бажаним складання засобів для біоконтролю у формі сухих гранул для одержання розчинів для розпилення або гранул для розкидного внесення, які вносять із розкидача для внесення гранульованих хімікатів, тоді як для інших схем застосування такі матеріали є відповідним чином складеними у формі змочуваних порошків або гранул, що диспергуються у воді (WDG), які призначені для примішування у великих об'ємах води, як наприклад, бакові суміші, та які в остаточному підсумку застосовують у вигляді суспендованого у воді розчину для розпилення на листя. Завдання, що полягає у доставці біологічно стабільних продуктів, може відрізнятися для цих двох підходів. Патент США №6027724 відноситься до композицій, що містять нетоксикогенні штами Aspergillus, які культивуються як окремі штами на гранулярних джерелах, що є продуктами харчування, таких як, наприклад, рис, жито і т.д., або включені у екструдовані матриці продуктів харчування, такі як, наприклад, матриці на основі пшеничної клейковини-каоліну. Заявка на патент США №20090060965 відноситься до складу у вигляді гранул, що диспергуються у воді, який містить нетоксикогенні штами Aspergillus; сполучний засіб; засіб, що має осмопротекторні та адгезійні властивості; засіб-носій та джерело поживних речовин. WDG можна диспергувати у воді та вносити у вигляді розпилюваної конідіальної суспензії для попередження забруднення афлатоксином продуктів харчування. [0005] Існує постійна потреба у розробці складу у вигляді гранул, що диспергуються у воді, який містить нетоксикогенні штами Aspergillus, котрі мають поліпшену стабільність під час обробки та при тривалому зберіганні. Короткий опис даного винаходу [0006] Отже, у даному винаході забезпечено стабілізовану композицію для біоконтролю у вигляді гранул, що диспергуються у воді, яка містить щонайменше один нетоксикогенний штам Aspergillus, щонайменше один водорозчинний наповнювач і щонайменше одну аніонну поверхнево-активну речовину. [0007] В іншому аспекті даного винаходу забезпечено спосіб одержання гранули, що диспергується у воді, яка містить щонайменше один нетоксикогенний штам Aspergillus. Придатні способи одержання композицій у вигляді гранул, що диспергуються у воді, за даним винаходом включають (1) розпилення води у обладнанні для грануляції у псевдозрідженому шарі або у чашковому грануляторі, (2) сушіння розпиленням, (3) напівсухе пресування та (4) екструзію зволоженої пасти. В одному варіанті здійснення зволожену пасту одержують шляхом змішування та розмелювання всіх інертних компонентів, окрім спор Aspergillus, перемішування спор Aspergillus із розмеленими інертними компонентами та одержання суміші перемішаних спор-інертних компонентів із водою з утворенням сировини у вигляді вологої пасти, придатної для екструзії гранул відповідного діаметру та довжини. 1 UA 114402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0008] У даному винаході також додатково забезпечено гранулу, що диспергується у воді, яка містить щонайменше один нетоксикогенний штам Aspergillus, одержана за допомогою вищезазначених способів. [0009] У даному винаході також забезпечено спосіб зниження забруднення афлатоксином сільськогосподарських рослин, що включає диспергування композиції для біоконтролю у вигляді гранул, що диспергуються у воді, яка містить щонайменше один нетоксикогенний штам Aspergillus, у прийнятному для сільського господарства водному носії та внесення водної дисперсії на рослини, на ґрунт навколо рослин або на місцезростання рослин. Докладний опис даного винаходу [0010] Як зазначено вище, ізоляти деяких штамів Aspergillus, таких як Aspergillus flavus (A. flavus), Aspergillus parasiticus (А. parasiticus), Aspergillus oryzae (А. oryzae) та Aspergillus sojae (А. sojae) продукують афлатоксин у незначній кількості або не зовсім на продукують його та при цьому є високоагресивними. Наприклад, деякі ізольовані нетоксикогенні штами A. flavus, які зустрічаються в природі на сільськогосподарських полях, виявилися ефективними при попередженні забруднення афлатоксином токсигенними штамами. Дивись, наприклад, ізоляти, описані в патентах США №№5171686, 5294442, 5292661 та 6027724, причому ці патенти включено в даний документ в повному обсязі за допомогою посилання. Ці ізоляти є ефективними засобами для зниження забруднення афлатоксином в культурах корисних рослин, якщо вони складені у вигляді WDG згідно із даним винаходом. [0011] Даний винахід направлений на стабілізовану композицію для біоконтролю у вигляді гранул, що диспергуються у воді (WDG), яка містить щонайменше один нетоксикогенний штам Aspergillus, щонайменше один водорозчинний наповнювач і щонайменше одну аніонну поверхнево-активну речовину; на способи її виготовлення та на її застосування для зниження забруднення афлатоксином у культурних рослин. Більш конкретно, даний винахід відноситься до складу WDG, який містить щонайменше один нетоксикогенний штам Aspergillus, наприклад, A. flavus, і щонайменше один водорозчинний наповнювач, такий як водорозчинний цукор (наприклад, лактозу, сахарозу, глюкозу і т. п.). В одному варіанті здійснення водорозчинним цукром є лактоза. [0012] Дана композиція WDG для біоконтролю додатково містить щонайменше одну аніонну поверхнево-активну речовину. Необов'язково також може бути присутнім піногасник. [0013] Додатково до нетоксикогенних штамів Aspergillus, водорозчинного наповнювача, аніоної поверхнево-активної речовини та необов'язкового піногасника композиції WDG можуть також містити стабілізатори, синергісти, барвники і т.д. [0014] В одному варіанті здійснення щонайменше один нетоксикогенний штам A. flavus є вибраним із NRRL 21882, NRRL 30797, NRRL 18543 та їх сумішей. Придатний водорозчинний наповнювач є вибраним із лактози, 4-O-бета-D-галактопіранозил-альфа-D-глюкопіранози у вигляді безводної лактози і т. п. В одному варіанті здійснення аніонна поверхнево-активна речовина є вибраною з натрію N-метил-N-олеїлтаурату, натрію алкілнафталінсульфонату, натрію нафталінсульфонату, кальцію лігносульфонату, натрію лігносульфонату, амонію лігносульфонату та їх сумішей. В одному варіанті здійснення композиція також містить піногасник, вибраний із метильованих силіконів і поліорганосилоксанів. В одному варіанті здійснення аніонна поверхнево-активна речовина присутня в композиції в кількості 0-35 % за вагою, зокрема 0,5-15 % за вагою композиції WDG для біоконтролю. [0015] В іншому варіанті здійснення забезпечено композицію для біоконтролю у вигляді гранули, що диспергується у воді, яка містить: (А) 1-75 % за вагою, більш переважно 5-75 % за вагою спор щонайменше нетоксикогенного штаму Aspergillus; (B) 25-95 % за вагою, більш переважно 30-60 % за вагою водорозчинного цукру, такого як лактоза; (C) 0-25 % за вагою, більш переважно 2-10 % за натрію вагою N-метил-N-олеїлтаурату; (D) 0-10 % за вагою, більш переважно 0,5-5 % за вагою натрію алкілнафталінсульфонату; та (E) 0-3 % за вагою, більш переважно 0,1-3 % за вагою поліорганосилоксану. [0016] Сума відносних частин різних компонентів (А)-(Е) становить не більше 100 % за вагою, та точні концентрації компонентів можуть змінюватися залежно від присутності води або домішок, наприклад. [0017] Гранули, що диспергуються у воді (гранули, які легко диспергуються у воді), за даним винаходом мають склад, який є значною мірою близьким до такого в змочуваних порошків. Їх можна одержати за допомогою гранулювання або вологим способом (приведення у контакт тонкоподрібнених спор з інертним наповнювачем і невеликою кількістю води, наприклад 1-30 відсотків за вагою, або з водним розчином засобу для диспергування або сполучного засобу з 2 UA 114402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наступним сушінням та просіюванням) або сухим способом (пресування з наступним розмелюванням і просіюванням). [0018] Придатні гранули можуть мати практично будь-яку бажану форму, наприклад, сфери, циліндри, еліпси, стрижні, конуси, диски, голки та неправильні форми. В одному варіанті здійснення гранули мають практично циліндричну форму. Як правило, гранули мають розмір частинок: - екструдовані WDG ~ від 0,5 мм до 2,5 мм; - гранульовані в чашковому грануляторі WDG ~ від 0,25 мм до 2,8 мм; - висушені розпиленням WDG ~ від 0,1 мм до 1,5 мм. [0019] Можна використовувати розміри за межами цього діапазону, якщо це необхідно або доречно. [0020] При вологому способі грануляції перший етап у способі являє собою сухе перемішування інертних компонентів, що не включають спори, із наступним розмелюванням, за яким йде перемішування спор А. flavus із сумішшю розмелених інертних компонентів. Суміш спор/інертних компонентів потім повільно перемішують при введенні відповідної кількості води за вагою (наприклад, 25-35 % за вагою) з одержанням вологої пасти або вологої маси (сировини). [0021] Сировину потім піддають екструзії та сушать екструдат, наприклад, у сушарці із псевдозрідженим шаром для видалення надлишкової води. Цільова кількість води у висушених гранулах становить 1-12 %, більш переважно менше 10 % та найбільш переважно менше 5 %. Висушені гранули можна просіяти із видаленням дрібних частинок. [0022] В одному варіанті здійснення придатні норми та терміни внесення для нетоксикогенних штамів Aspergillus, які використовували у композиціях за дійсним винаходом, є порівнянними з існуючими нормами і термінами, наведеними на етикетках представлених у цей час продуктів, що містять такі штами. Наприклад, NRRL 21882 Aspergillus flavus марки aflaguard® являє собою гранули для одержання розчинів для розпилення, які містять 0,0094 % 8 активного інгредієнта з мінімум 1,2 × 10 КУО/фунт, яку можна вносити у нормі від 10-20 фунтів/акр. В одному варіанті здійснення склади WDG за дійсним винаходом суспендують у воді та вносять у вигляді розчину для розпилення на листя у 20 гал./акр, причому норма КУО на акр є аналогічною afla-guard®. [0023] Композиції згідно з даним винаходом є придатними для зниження забруднення афлатоксином шляхом витіснення грибків, що продукують афлатоксин, в культурах корисних рослин. Придатні культури корисних рослин включають арахіс, кукурудзу, бавовник і плоди горіхових дерев. Компоненти, що використовуються в композиції за даним винаходом можна вносити рядом способів, відомих фахівцям у даній галузі техніки, в різних концентраціях. Норма, у якій вносять композиції, буде залежати від конкретного типу афлатоксинів, що підлягає контролю, потрібного ступеня контролю, а також терміну та способу внесення. [0024] В одному варіанті здійснення WDG за даним винаходом розчиняють у воді та вносять у нормі від 10 до 100 г активного інгредієнта (спор) на гектар, конкретніше від 20 до 50 г а.і./га. Норми внесення 24 та 49 г а.і./га є особливо придатними. [0025] В іншому варіанті здійснення застосування за будь-яким з V5, V10 або VT є придатними, якщо WDG за даним винаходом розводять водою та вносять на кукурудзу для зниження забруднення афлатоксином зерна зібраної культури. [0026] Слід розуміти, що сільськогосподарські культури також включають такі культури, яким було надано додана витривалість до гербіцидів або класів гербіцидів (наприклад, інгібіторів ALS, GS, EPSPS, PPO, ацетил-КоА та HPPD) за допомогою традиційних способів селекції або за допомогою генної інженерії. Приклади сільськогосподарських культур, яким було надано витривалість до гербіцидів за допомогою способів генної інженерії, включають, наприклад, стійкі до гліфосату та глюфозинату сорти маїсу, комерційно доступні під торговими назвами RoundupReady® та LibertyLink®. [0027] Слід розуміти, що сільськогосподарські культури являють собою такі, яким було надано стійкість до комах-шкідників за допомогою способів генної інженерії, наприклад, Bt-маїс (стійкість до кукурудзяного метелика), Bt-бавовна (стійкість до бавовняного довгоносика), а також VIP-бавовник (стійкість до трав'яної совки та малої совки). Прикладами Bt-маїсу є гібриди маїсу Bt-176 NK® (Syngenta Seeds). Bt-токсин являє собою білок, який утворюється у природних умовах ґрунтовими бактеріями Bacillus thuringiensis. Приклади токсинів або трансгенних рослин, що здатні синтезувати такі токсини, описано в EP-A-451 878, EP-A-374 753, WO 93/07278, WO 95/34656, WO 03/052073 та ЕР-А-427 529. Приклади трансгенних рослин, що містять один або декілька генів, які кодують стійкість до комах та експресують один або декілька токсинів, являють собою KnockOut (маїс), Yield Gard (маїс), NuCOTIN33B (бавовник), Bollgard 3 UA 114402 C2 5 10 15 20 25 30 (бавовник), AgrisureViptera™ 3111 (кукурудза). Рослини культури або їх насіннєвий матеріал можуть бути як стійкими до гербіцидів, так і, в той же час, стійкими до поїдання комахамишкідниками (трансгенні об'єкти з "пакетованими генами"). Наприклад, насіння може мати здатність експресувати інсектицидний білок Cry3 та/або VIP, та при цьому мати витривалість до гліфосату. [0028] Також слід розуміти, що культури включають такі, які є одержаними за допомогою традиційних способів селекції або генної інженерії та містять так звані ознаки, що впливають на продуктивність, (наприклад, підвищену стабільність при зберіганні, підвищену поживну цінність і покращений смак). Приклади [0029] Наступні приклади додатково ілюструють деякі аспекти даного винаходу, але не призначені для обмеження його обсягу. Якщо інше не визначено у даному описі та формулі винаходу, відсотки являють собою відсотки за вагою (% ваг/ваг). Приклад 1 [0030] Партію з 210 г гранул (50 WG), що диспергуються у воді, одержували з композиції наступним чином. [0031] Інгредієнти, які використовували: спори ізоляту Aspergillus flavus NRRL 21882 50 %; поліорганосилоксан (Rhodorsil EP 6703) 0,10 %; натрію алкілнафталінсульфонат (Agnique ANS3DNPW) 2 %; натрію N-метил-N-олеїлтаурат натрію (Geropon Т-77) 8 %; безводна лактоза (решта). А. Першим етапом у способі було одержання сухої суміші інертних компонентів, що не включала спори, з наступним розмелюванням. Суміш розмелених інертних компонентів потім перемішували зі спорами A. flavus у гомогенізаторі Уоринга. Одержану таким чином суміш спор/інертних компонентів завантажували у змішувач Hobart і повільно перемішували при введенні ~ 30 % води за вагою з одержанням вологої маси (сировини). В. Сировину потім переносили в екструдер, виконаний із 0,8 мм сіткою. Екструдат сушили у сушарці з псевдозрідженим шаром з метою видалення надлишкової води та переносили гранули в обладнання для просіювання, щоб видалити частинки, розмір яких знаходиться поза межами встановленого діапазону: діаметр 0,8 мм і довжина 2-5 мм. Приклади 2-5 [0032] Результати розведень та посіву для підрахунку кількості колонієутворюючих одиниць a на грам (КУО/г) Aspergillus flavus NRRL 21882 Склад # 2 3 4 WDG з прикладу 1 Чисті спори ізоляту NRRL 21882 Сировина з прикладу 1 (A.) WDG з прикладу 1, які зберігали при 38 °C протягом чотирьох тижнів 5 35 40 45 50 a Середнє КУО/г 9 7,03 × 10 10 1,17 × 10 9 6,73 × 10 9 2,84 × 10 b c RSD (%) 10,4 19,0 14,9 13,5 Приблизно 0,1 г досліджуваного виробу суспендували в 9,9 мл фосфатного буферу + 0,2 % -5 -6 Tween 80 при розведенні 10 (# 7) і 10 (всі інші) і 0,1 мл з трьох найбільших розведень розподіляли у двох повторностях на плашки DRBC агару. Колонії підраховували після двох днів інкубування при 30 °C. b КУО/г=(сума підрахованих значень для плашок у двох повторностях/ 0,2 мл) X коефіцієнт розведення X 10 мл суспензії/вага частини зразка. Під середнім КУО/г мають на увазі середнє значення для п'яти частин зразка. c Відносне стандартне відхилення = (стандартне відхилення/ середнє КУО/г) X 100 % Приклад 6 [0033] Партія з 500 г гранул (50 WG), що диспергуються у воді, одержували з композиції наступним чином. A. Першим етапом в способі було одержання сухої суміші інертних компонентів, що не включала спори, з наступним розмелюванням. Суміш подрібнених інертних компонентів перемішували зі спорами A. flavus у гомогенізаторі Уоринга. Одержану таким чином суміш спор/інертних компонентів завантажували у змішувач Hobart і повільно перемішували при введенні ~ 30 % води за вагою з одержанням вологої маси (сировини). B. Сировину потім переносили в екструдер, обладнаний 0,8 мм сіткою. Екструдат сушили у сушарці з псевдозрідженим шаром з метою видалення надлишкової води та переносили гранули в обладнання для просіювання, щоб видалити частинки, розмір яких знаходився поза межами встановленого діапазону: діаметр 0,8 мм і довжина від 2 до 5 мм. 4 UA 114402 C2 Приклади 7 – 15 [0034] Додаткові результати розведень та посіву для підрахунку колонієутворюючих одиниць a на грам (КУО/г) NRRL 21882 Aspergillus flavus # 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 10 15 Склад Чисті спори ізоляту NRRL 21882 (партія #45252) Сировина з прикладу 1 WDG з прикладу 6 (вихідна) WDG з прикладу 6 (2 тижні RT) WDG з прикладу 6 (1 місяць RT) WDG з прикладу 6 (3 місяці RT) WDG з прикладу 6 (6 місяців RT) WDG з прикладу 6 (9 місяців RT) WDG з прикладу 6 (12 місяців RT) Середнє КУО /г b c RSD (%) 10 19 9 26 25 9 15 10 19 14 7 1,17 × 10 8,3 × 10 9 6,5 × 10 9 5,3 × 10 9 5,8 × 10 9 5,3 × 10 9 6,5 × 10 9 7,3 × 10 9 5,9 × 10 a Приблизно 0,1 г досліджуваного виробу суспендували в 9,9 мл фосфатного буферу + 0,2 % -5 -6 Tween 80 при розведенні 10 (# 7) і 10 (всі інші) і 0,1 мл з трьох найбільших розведень розподіляли у двох повторностях на плашки DRBC агару. Колонії підраховували після двох днів інкубування при 30 °C. b КУО/г=(сума підрахованих значень для плашок у двох повторностях / 0,2 мл) X коефіцієнт розведення X 10 мл суспензії / вага частини зразка. Під середнім КУО/г мають на увазі середнє значення для п'яти частин зразка. c Відносне стандартне відхилення = (стандартне відхилення/ середнє КУО/г) X 100 % [0035] Наведені вище дані вказують на те, що склад WDG за даним винаходом має відмінну біологічну стабільність. [0036] Вищенаведені опис і приклади представлені виключно з метою ілюстрації та не обмежують обсяг правової охорони, яка має бути надана даному винаходу. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 40 1. Композиція для біоконтролю у вигляді гранули, що диспергується у воді, яка містить: 5-75 % за вагою спор щонайменше одного нетоксикогенного штаму Aspergillus; 25-95 % за вагою щонайменше одного водорозчинного цукру; 0-35 % за вагою щонайменше однієї аніонної поверхнево-активної речовини, де водорозчинний цукор містить 4-О-бета-D-галактопіранозил-альфа-D-глюкопіранозу у вигляді безводної лактози. 2. Композиція для біоконтролю за п. 1, де аніонна поверхнево-активна речовина є вибраною з натрію N-метил-N-олeїлтаурату, натрію алкілнафталінсульфонату та їх сумішей. 3. Композиція для біоконтролю за п. 2, де аніонна поверхнево-активна речовина містить 2-10 % за вагою натрію N-метил-N-олеїлтаурату. 4. Композиція для біоконтролю за п. 2, де аніонна поверхнево-активна речовина містить 0,5-5 % за вагою натрію алкілнафталінсульфонату. 5. Композиція для біоконтролю за п. 1, яка додатково містить 0,1-3 % за вагою поліорганосилоксану. 6. Композиція для біоконтролю за п. 1, де штам Aspergillus включає A. flavus. 7. Композиція для біоконтролю за п. 1, де штам A. flavus є вибраним із біологічно чистого штаму, що має всі відмітні ознаки штаму, вибраного з NRRL 21882, NRRL 30797, NRRL 18543 та їх сумішей. 8. Спосіб зниження забруднення афлатоксином сільськогосподарської культури, який включає внесення на рослину, місцезростання або рослинний продукт ефективної для зниження забруднення афлатоксином кількості водного розчину для розпилення композиції для біоконтролю за п. 1. 9. Спосіб за п. 8, де сільськогосподарську культуру вибирають із групи, що складається і арахісу, кукурудзи, бавовнику та плодів горіхових дерев. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5