Похідні n-(41-хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-n1-арил-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну, що проявляють противірусну активність щодо вірусів h1n1 штаму california/07/2009 та h3n2 штаму brisbane/10/2007

Реферат: 1 1 Похідні N-(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-N -арил-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну, формули: структурної O N Cl N N H R N N N H R1 , що проявляють противірусну активність щодо вірусів H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007. UA 117265 U (12) UA 117265 U UA 117265 U 5 Патент на корисну модель належить до фармацевтичної хімії та медицини, а саме до 1 1 фармакології, зокрема одержання біологічно активних N-бензо[1,3] діоксол-5-іл-N -(4 1 хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну (DAM0011880) та 1-{3-[4 хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]-триазин-2-іл-аміно]феніл}етанону (DAM0011882) загальної формули: O N Cl N N H 10 15 20 25 30 R N N N H R1 , де RR1: -O-СН2-О- (DAM0011880); R = Н, R1 = СОСН3 (DAM0011882). Зазначені сполуки пригнічують віруси грипу H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007. За даними ВООЗ щорічно в світі на сезонний грип хворіє близько одного мільярда людей, а помирає від нього - біля 3 мільйонів населення планети [1]. Вірус грипу H1N1 штаму California/07/2009 є особливо небезпечним для людини. Так, пандемія 2009/2010 pp. призвела до смерті біля 500 тисяч осіб. В Україні було зафіксовано 1128 летальних випадків, або 0,02 % від усіх, хто захворів [2]. Лікування тяжких та середнього ступеня тяжкості випадків направлено на попередження вірусної пневмонії, яка важко протікає та викликає геморагію та дихальну недостатність, а також на профілактику вторинної бактеріальної інфекції, що обумовлює розвиток бактеріальної пневмонії. До ускладнень належать також токсичний геморагічний набряк легень, міокардит, несправжній круп, набряк головного мозку, арахноїдит, поліневрит, радикуліт, невралгії різної локалізації, ендокардит, міозит, нефрит, гломерулонефрит, периферичний висхідний параліч м'язів кінцівок тощо [3]. За даними ВООЗ, в сезоні 2008-2009 pp. в більшості країн Європейського регіону переважним збудником епідемічного підйому був штам Brisbane/10/2007 (H3N2). В Україні головним збудником епідемії грипу в сезоні 2011-2012 років був штам вірусу грипу A(H3N2), який склав 99 % усіх виділених вірусів грипу у цьому сезоні [4]. Різкий підйом захворюваності супроводжувався появою великого числа тяжких форм та летальних випадків. Він стає все більш розповсюдженим і вбиває по всьому світу тисячі людей на рік. Відомим противірусним препаратом, що використовується для лікування важкої інфекції, викликаної респіраторним синцитіальним вірусом, вірусним гепатитом С тощо є рибавірин. Він активний у формі метаболіту, що має структуру, подібну до нуклеотиду [5]: NH2 O N N N OH O HO 35 OH . Серед побічних ефектів рибавірину є дозозалежна анемія, важка форма якої викликає смерть пацієнта. Рибавірин також є тератогеном для деяких тварин. При захворюваннях нирок, серцево-судинної системи застосовують препарат після ретельного обстеження. Медичному персоналу слід враховувати його потенційну тератогенність [5]. В основу корисної моделі поставлена задача пошуку нових біологічно активних сполук з противірусною активністю, що перешкоджають реплікацію вірусів та які здатні лікувати гострі респіраторно-вірусні інфекції, викликані як вірусами H1N1, штамом California/07/2009, так і H3N2 штамом Brisbane/10/2007. 1 UA 117265 U 5 Поставлена задача вирішується тим, що в якості нових біологічно активних сполук 1 1 запропоновано N-бензо[1,3] діоксол-5-іл-N -(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2,41 діаміну (DAM0011880) та 1-{3-[4 -хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]-триазин-2-іламіно]феніл}етанону (DAM0011882), які отримують із середніми виходами при використанні відомих синтетичних підходів у декілька стадій (Схема. 1). 1 1 Схема 1. Синтез N-бензо[1,3] діоксол-5-іл-N -(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин1 2,4-діаміну (DAM0011880) та 1-{3-[4 -хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]-триазин-2-іламіно]феніл}етанону (DAM0011882). O O O Cl Cl N Cl N H N N N N Cl H2N N Cl Cl N 1 N N N H Cl 2 N N 3 R R1 NH2 O N Cl N N H 10 R N N N H R1 4a ,b , 15 20 де RR1: -O-CH2-O- (DAM0011880); R=H, R1=COCH3 (DAM0011882). Експериментальне визначення противірусної активності було проведено в рамках скринінгової програми Національного Інституту Здоров'я США (NIH/NIAID) у Південному дослідному інституті США (Southern Research Institute-SRI, Birmingham, Alabama). В табл. 1 наведено експериментальні дані активності зазначених сполук щодо вірусів H1N1 та H3N2 (штами A California/07/2009 і Brisbane/10/2007 відповідно). Ефективність цих сполук виражали показниками ЕС50, IC50 та SI, які визначали в дослідах in vitro при дії сполук в розчині ДМСО в діапазоні концентрацій від 0,1 до 100 мкг/мл. Зазначені сполуки мають перевагу у пригніченні вірусів порівняно з прототипом - рибавірином. В умовах експерименту заявлені сполуки виявили високу противірусну активність як до штаму вірусу California/07/2009 IVA(HINI), так і до і Brisbane/10/2007 (H3N2) (табл. 1). 2 Cl UA 117265 U Таблиця 1 Противірусна активність щодо вірусів грипу H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму 1 1 Brisbane/10/2007 N-бензо [1,3] діоксол-5-іл-N -(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2,41 діаміну (DAM0011880) та 1-{3-[4 -хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]-триазин-2-іламіно]феніл}етанонy(DAM0011882) ID DAM 0011880 DAM 0011882 5 10 15 20 25 30 35 40 Virus / Strain FluA(HlNl) Colifornia/07/09 FluA(HlNl) Colifornia/07/2009 Flu A (H3N2) Brisbane/10/2007 FluA(HlNl) Colifornia/07/09 Flu A (H3N2) Brisbane/10/2007 ЕС50, мкг/мл ІС50, мкг/мл SI >1000 Рибавірин 1 >320 >320 >100 >180 Рибавірин 10 >320 >32 0,33 >100 >300 Рибавірин 4.3 >320 >74 320 >32 0,42 >100 >240 Рибавірин 4.3 >320 >74 EC50, мкг/мл IC50, мкг/мл 100 0,56 SI 6,3 Control Drug 1. ЕС50 - ефективна концентрація, що визначається з кривої доза/ефект і є концентрацією речовини, при якій ефект спостерігається для 50 % популяції після проходження певного часу дії. Виражається у мкг/мл. 2. ІС50 - це концентрація, при якій інгібіція клітин організму речовиною складає 50 %. Виражається у мкг/мл. 3. SI - це індекс селективності, що є показником ефективності препарату, та виражається співвідношенням ІС50 до EC50. Відповідно до результатів скринінгу, наведених у табл. 1, пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) штаму California/07/2009 сполукою (DAM0011880) у пробі за нейтральним червоним виражено ефективною концентрацією ЕС50, у першому досліді становить 0.1 мкг/мл, а у рибовірину - 1 мкг/мл. Отже, ефективність пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) штаму California/07/2009 сполукою (DAM0011880) в 10 раз вища, ніж у рибавірину. Поряд з різницею у токсичному впливі на клітини сполуки (DAM0011880) та рибавірину, вираженою концентраціями ІС50 (>100 та >320 відповідно), сумарна корисна активність сполуки (DAM0011880) виражена індексом селективності SI перевищує 1000, а у рибавірину - 320, що означає, що DAM0011880 в більш ніж у 3,12 рази ефективніший за рибовірин, У другому досліді пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) штаму California/07/2009 сполукою (DAM0011880) становить 0,56 мкг/мл, тоді як у рибовірину - 10 мкг/мл. Отже, ефективність пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) штаму California/07/2009 сполукою (DAM0011880) в 17,86 рази вища, ніжу рибавірину. Індекс селективності SI сполуки (DAM0011880) > 180, а у рибавірину вона в 5,63 рази менша і складає >32. Пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) штаму California/07/2009 сполукою (DAM0011882) ЕС50 становить 300, а у рибавірину вона в 4,05 рази менша і складає >74. Для сполуки (DAM0011882) ЕС50, становить 0,42, тобто в 10,24 рази вища, ніж у рибавірину Індекс селективності SI перевищує рибавірин у 3,24 рази і складає >240. 1 1 Такий високий результат дозволяє пропонувати N-бензо [1,3] діоксол-5-іл-N -(4 -хлорфеніл)1 6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2,4-діамін та 1-{3-[4 -хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2-іл-аміно]феніл}етанон як альтернативу рибавірину. Приклади конкретного виконання Приклад 1. 2,4-Дихлор-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин (2) одержано взаємодією ціанурхлориду 1 з морфоліном у ацетоні при 5 °C за методикою [6]. 1 1 Приклад 2. N-бензо[1,3] діоксол-5-іл-N -(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2,4діаміну (DAM0011880): До розчину 4,7 г (0,02 моля) 2,4-дихлор-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазину 3 UA 117265 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2) в 50 мл диметилформаміду при перемішуванні додавали послідовно 2,76 г (0,02 моль) поташу та 2,55 г (0,02 моля) 4-хлораніліну. Реакційну суміш перемішували при температурі 20 °C 2 години та виливали в 250 мл води. Осад відфільтровували, промивали водою, сушили. 1 Отримували 5,22 г (4-хлор-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2-іл)-(4 -хлорфеніл)-аміну (2), який без додаткової очистки та ідентифікації розчиняли в 50 мл тетрагідрофурану. До одержаного розчину при перемішуванні додавали 2,21 г (0,016 моль) поташу та 2,20 г (0,016 моля) бензо[1,3]діоксол-5-аміну. Реакційну суміш перемішували 4 години при температурі 40 °C, охолоджували. Осад, що утворився, відфільтровували та кристалізували з етанолу. Вихід становить 4,85 г (71 %). Тпл =222-224 °C. Знайдено, %: N, 19,5, СІ, 8,31 С20Н19СlN6О3. Вирахувано, %: N, 19,7, СІ, 8,20. Спектр ПМР (DMSO-d6, ТМС): 3,60 (м, 4Н, N(CH2)2), 3,73 (м, 4Н, О(СН2)2), 5,95 (с, 2Н, ОСН2О), 6,80-7,43 (м, 3Н, ароматичні протони), 7,26 та 7,74 (д-д, 4Н, С6Н4), 9,22 (уш. с, 1Н, NH), 9,33 (уш. с, 1Н, NH). 1 Приклад 3. 1-{3-[4 -Хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]-триазин-2-іламіно]феніл}етанону (DAM0011882) був одержаний аналогічно сполуці (DAM0011880) з 5,22 г 1 (4-хлор-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2-іл)-(4 -хлорфеніл)-аміну (2), 2,21 г (0,016 моль) поташу та 2,16 г (0,016 моля) 3-аміноацетофенону. Вихід 5,17 г (76 %). Тпл=228-230 °C (з етанолу). Знайдено, %: N, 19,9, СІ, 8,41 C21H21ClN6O2. Вирахувано, %: N, 19,8, СІ, 8,35. Спектр ПМР (DMSO-d6, ТМС): 2,58 (с, 3Н, СОСН3), 3,64 (м, 4H, N(CH2)2), 3,77 (м, 4Н, О(СН2)2), 7,42-8,36 (м, 4Н, ароматичні протони), 7,32 та 7,77 (д-д, 4Н, С6Н4), 9,38 (уш. с, 1Н, NH), 9,46 (уш. с, 1Н, NH). Приклад 4. Експериментальне визначення противірусної активності було проведено в рамках скринінгової програми Національного Інституту Здоров'я США (NIH/NIAID) у Південному дослідному інституті США (Southern Research Institute-SRI, Birmingham, Alabama). Для оцінки противірусної активності сполук (DAM0011880) та (DAM0011882) використано методики [7]. Для визначення противірусної активності досліджуваних сполук був проведений тест in vitro з використанням клітин MDCK. Клітини MDCK вирощували в 96-лунковому мікропланшеті до того часу, поки дно кожної лунки не покриється клітинами. Залишкове культуральне середовище повністю видаляли, і кожну лунку двічі промивали фосфатним буфером. У кожну лунку додавали розчин вірусу Flu A (H1N1) Cаlifornia/07/09 або Flu A (H3N2) Brisbane/10/2007, скорегованого до необхідної концентрації. Сполуку DAM 0011880 (або DAM 0011882) та противірусний засіб - рибавірин (Sigma) розчинили в диметилсульфоксиді, додали до кожної лунки до кінцевої концентрації від 0,1 до 10 мкг/мл. Після культивування протягом 48 годин, клітини MDCK спостерігали в мікроскопі. Після додавання 100 мкл 70 % ацетону кожну лунку витримували при -20 °C протягом 1 год. Після висушування в сушильній шафі додавали 100 мкл 0,4 % (w/v) розчину SRB (сульфородаміну Б), розчиненого в 1 % (v/v) оцтовій кислоті. Після 30 хвилин фарбування, розчин SRB, що не зв'язався з клітинами, 4 рази промивали 1 % (v/v) оцтовою кислотою. Після висушування в кожну лунку додавали 100 мкл 10 тМ розчину Tris (pH 10,5) для розчинення забарвлюючої речовини на дні лунки. Для оцінки противірусної активності вимірювали оптичну густину. Клітини, що оброблені тільки DMSO, та клітини, що оброблені DMSO та відповідним вірусом, використовували як контрольні групи. Отже, згідно з одержаними результатами, нові біологічно активні сполуки N1 1 бензо[1,3]діоксол-5-іл-N -(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин-2,4-діамін 1 (DAM0011880) та 1-{3-[4 -хлорфеніламіно)-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]-триазин-2-іламіно]феніл}етанон (DAM0011882) можуть бути запропоновані як потенційні противірусні засоби щодо вірусів Н1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007. Джерела інформації: 1. Вакцина для профилактики гриппа. [Електронний ресурс]. - Режим доступу: ttps://ru.wikipеdіa.оrg/wіkі/Вакцина_для_профилактики_гриппа/ - Назва з екрану. 2. Голубка О.С. Оцінка наслідків тяжких форм грипу та летальності серед осіб груп ризику в пандемічному сезоні 2009-2010 років в Україні /О.С. Голубка, О.В. Онищенко, А.П. Міроненко //Профілактична медицина. -2013. -№ 3-4 (21). - С. 55-58. 3. Москалюк В.Д. Діагностика та лікування грипу: сучасні клініко-патогенетичні аспекти /В.Д. Москалюк, А.С. Сидорчук //Інфекційні хвороби. - 2016. - № 2 (84). - С. 5-14. 4. Лейбенко Л.В. Філогенетичний аналіз вірусів грипу людей A(H3N2), виділених в Україні в епідемічному сезоні 2011-2012 років /Л.В. Лейбенко, В.П. Поліщук, Л.В. Радченко, А.П. Міроненко //Мікробіологія і біотехнологія. - 2013. -№ 1. - С. 37-47. 5. Рибавирин. [Електронний ресурс]. Режим доступу: https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0 %A0 %D0 %B8 %D0 %Bl%D0 %B0 %D0 %B2 % D0 %B8 %Dl%80 %D0 %B8 %D0 %BD/ - Назва з екрану. 4 UA 117265 U 5 6. Mewada N.S. Synthesis and biological evaluation of novel s-triazine based aryl/heteroaryl entities: Design, rationale and comparative study /N.S. Mewada, D.R. Shah, H.P. Lakum, K.H. Chikhalia //Journal of the Association of Arab Universities for Basic and Applied Sciences. - V. 20. 2016. - P. 8-18. [Електронний ресурс]. Режим доступу: http://dx.doi.Org/10.1016/j.jaubas.2014.08.003/ - Назва з екрану. 7. Standard Operating Procedure for In Vitro Antiviral Screening, Institute for Antiviral Research, Institute of Allergy and Infectious Diseases National Institutes of Health. - http://www.niaid.nih.gov. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 1 1 Похідні N-(4 -хлорфеніл)-6-морфолін-4-іл-N -арил-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну, формули: структурної O N Cl N N H 15 R N N N H R1 , де RR1: -О-СН2-О-; R, R1: Н, СОСН3, що проявляють противірусну активність щодо вірусів H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5