Гідрохлорид n-(3,4-диметилфеніл)-6-морфолін-4-їл-n1-(пара-толуїл)-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну, що проявляє противірусну активність щодо вірусів h1n1 штаму california/07/2009 та h3n2 штаму brisbane/10/2007

Реферат: 1 Гідрохлорид N-(3,4-диметилфеніл)-6-морфолін-4-їл-N -(пара-толуїл)-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну O HCl N N N H N N N H DAM0011141, що проявляє противірусну активність щодо вірусів H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/ 2007. UA 95732 U (12) UA 95732 U UA 95732 U Корисна модель належить до фармацевтичної хімії та медицини, а саме до фармакології, зокрема, одержання біологічно активного гідрохлориду N-(3,4-диметилфеніл)-6-морфоліно-4-їл1 N -(пара-толуїл)-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну (сполука DAM0011141) формули: O HCl N N N H 5 10 15 20 25 30 35 40 45 N N N H DAM0011141, який пригнічує віруси грипу H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007. Вірус грипу H1N1 штаму California/07/2009 є вкрай небезпечним для людини, оскільки на фоні притаманних гострим респіраторним вірусним інфекціям захворюванням симптомів: температури  38 °C, лихоманки, кашлю, болю в горлі та суглобах, головного болю тощо, він тяжко вражає легеневу тканину [1], що часто призводить до летальних випадків. Загалом, механізм дії зазначеного вірусу подібний до інших вірусів грипу. Вхідними воротами інфекції є епітелій слизових оболонок дихальних шляхів людини, де відбувається його реплікація та репродукція. Спостерігається поверхневе ураження клітин трахеї та бронхів, що характеризується процесами дегенерації, некрозу та відторгнення уражених клітин. Розвиток патологічного процесу супроводжується вірусемією впродовж 10-14 діб з переважанням токсичних та токсикоз-алергічних реакцій зі сторони внутрішніх органів, у першу чергу - серцевосудинної та нервової систем. Головною ланкою в патогенезі є ураження судинної системи, що проявляється підвищенням проникності та ламкості судинної стінки, порушенням мікроциркуляції. Ці зміни виражаються у хворих появою носових кровотеч, геморагій на шкірі та слизових оболонках, крововиливами у внутрішні органи, а також призводять до розвитку патологічних змін у легенях (набряку легеневих тканин з множинними крововиливами в альвеоли). Падіння тонусу судин призводить до утворення венозної гіперемії шкіри та слизових оболонок, застійному повнокров'ю внутрішніх органів, порушенню мікроциркуляції, крововиливам, на пізніших строках - тромбозами вен та капілярів [2]. Висока вірулентність та патогенність цього штаму може бути обумовлена здатністю неструктурованого білка NS1 (що властивий цьому вірусу) інгібувати продукцію інтерферонів типу І інфікованими клітинами [3]. Окрім високої активності сполуки DAM0011141 щодо вірусу H1N1 штаму California/07/2009, виявлено також значну активність цієї сполуки по відношенню до вірусу грипу H3N2 штаму Brisbane/10/2007. Відомо, що вірус грипу H3N2 штаму Brisbane/10/2007 є збудником зоонозного респіраторного захворювання людини, причому свині та дикі качки відіграють значну роль у його розповсюдженні та зараженні ним людини. Вірус грипу H3N2 (Гонконгський грип) [4] стає все більш розповсюдженим під час сезонного грипу, який вбиває по всьому світу тисячі людей на рік [5]. Лікування захворювання викликаного вірусом H1N1 штам California/07/2009 по суті не відрізняється від лікування звичайного грипу. При виражених явищах інтоксикації та порушенні кислотно-лужного балансу проводиться дезинтоксикаційна та коригувальна терапія. З препаратів, що діють на сам вірус та на його розмноження, доведена ефективність Рибавірину. Лікування тяжких та середнього ступеня тяжкості випадків направлено на попередження вірусної пневмонії, що зазвичай важко протікає та викликає геморагію та дихальну недостатність, а також на профілактику вторинної бактеріальної інфекції, що обумовлює розвиток бактеріальної пневмонії. Рекомендується, також, симптоматична терапія. Відомий противірусний препарат Рибавірин, який застосовують для лікування важкої інфекції, викликаної респіраторним синцитіальним вірусом, вірусним гепатитом С, а також багатьох інших вірусних інфекцій. Рибавірин є активним у формі метаболіту, що має структуру, подібну до пуринового нуклеотиду, та, по не встановленому механізму, порушує реплікацію вірусу. 1 UA 95732 U 5 10 15 Рибавірин інтегрується в РНК замість аденіну або гуаніну та утворює комплементарні пари за урацилом та цитозином, що викликає мутації в РНК-залежній реплікації вірусів [6]. Одним із побічних ефектів рибавірину є дозозалежна анемія, важка форма якої викликає смерть пацієнта (у зв'язку з чим необхідний повний контроль показників крові у процесі лікування). Рибавірин також є тератогеном для деяких тварин. В основу корисної моделі поставлена задача пошуку нових біологічно активних сполук з противірусною активністю, що перешкоджають реплікацію вірусів, та які здатні лікувати ГРВІ, викликану вірусами H1N1, штам California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007. Поставлена задача вирішується тим, що в якості нової біологічно активної сполуки 1 запропонований гідрохлорид N-(3,4-диметилфеніл)-6-морфоліно-4-їл-N -(пара-толуїл)[1,3,5]триазин-2,4-діаміну (сполука DAM0011141). В таблиці 1 наведені експериментальні дані активності сполуки (DAM0011141) щодо вірусів H1N1 та H3N2. Ефективність цієї сполуки виражали показниками ЕС50, ІС50 та SI, які визначали в дослідах in vitro при дії сполук в розчині ДМСО в діапазоні концентрацій від 0,1 до 100 мкг/мл. Зазначена сполука має перевагу в пригніченні вірусів у порівнянні з прототипом - рибавірином. В умовах експерименту заявлена сполука виявила високу противірусну активність щодо H1N1, штам A California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007 (результати наведені в таблиці 1). Таблиця 1 Противірусна активність щодо вірусів грипу H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/2007 гідрохлориду N-(3,4-диме-тилфеніл)-6-морфоліно-4-їл-N'-(пара-толуїл)[1,3,5]триазин-2,4-діаміну (сполука DAM0011141) Мол. маса Тип вірусу EC50, мкг/мл IC50, мкг/мл SI FluA(H1N1) California/07/2009 Flu A (H3N2) Brisbane/10/2007 0.56 >100 >180 427.0 Структура ID 2.3 >100 >43 1.8 >320 >180 4.3 >320 >74 O HCl N DAM0011141 N N H N N N H O N Рибавірин HO N O NH2 N 244,2 FluA(H1N1) California/07/2009 Flu A (H3N2) Brisbane/10/2007 OH OH 20 25 30 35 1. EC50 - ефективна концентрація, що визначається з кривої доза/ефект і є концентрацією речовини, при якій ефект спостерігається для 50 % популяції після проходження певного часу дії. Виражається у мкг/мл. 2. ІС50 - Це концентрація, при якій інгібіція клітин організму речовиною складає 50 %. Виражається у мкг/мл. 3. SI - це індекс селективності, що є показником ефективності препарату, та виражається співвідношенням ІС50 до ЕС50. Відповідно до результатів скринінгу, наведених у табл.1, пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) 4 штаму California/07/2009 сполукою (DAM0011141) N-(3,4-диметилфеніл)-6-морфоліно-N -(паратолуїл)-1,3,5-триазин-2,4-діаміну гідрохлориду у пробі за нейтральним червоним виражено ефективною концентрацією ЕС50, становить 0.56 мкг/мл. Це вказує на те, що ефективність пригнічення вірусу грипу IVA(HINI) штаму California/07/2009 в 3,2 рази вища, ніж у рибавірину, для якого ЕС50, становить 1.8 мкг/мл. Поряд з різницею у токсичному впливі на клітини сполуки (DAM0011141) та рибавірину, вираженою концентраціями ІС50, сумарна корисна активність сполуки (DAM0011141) виражена індексом селективності SI знаходиться на одному рівні з рибавірином, для яких SI становить 180. Пригнічення вірусу грипу H3N2 штаму Brisbane/10/2007 сполукою (DAM0011141), що виражено ефективною концентрацією ЕС50, становить 2.3 мкг/мл, а це в 1.87 раз вища, ніжу рибавірину, для якого ЕС50, становить 4,3 мкг/мл. 2 UA 95732 U Такий високий результат дозволяє пропонувати корисну модель (DAM0011141) в якості альтернативи рибавірину. Заявлену сполуку DAM0011141 отримують з високим виходом за наведеною схемою: O N Cl N N N N O Cl N O Cl N Cl H 2N N N N Cl N H 2 1 N N Cl 3 H2 N O HCl N N N H 5 10 15 20 25 30 N N N H DAM0011141 . Приклади конкретного виконання Приклад 1. 2,4-Дихлор-6-морфолін-4-іл-[1,3,5]триазин 2 одержано взаємодією ціанурхлориду 1 з морфоліном у ацетоні при 5 °C за методикою [7]. Приклад 2. Гідрохлорид N-(3,4-диметилфеніл)-6-морфоліно-4-їл-N'-(пара-толуїл)[1,3,5]триазин-2,4-діаміну (ОАМ0011141)одержано за наступною методикою. До розчину 4.7 г (0,02 моль) 2,4-дихлор-6-морфолін-4-їл-[1,3,5]триазину 2 в 50 мл диметилформаміду при перемішуванні додали послідовно 2.76 г (0.02 моль) поташу та 2.14 г (0,02 моль) паратолуїдину. Реакційну суміш перемішували за температури 20 °C 2 години та вилили в 250 мл води. Осад відфільтровували, промили водою, висушили. Отримали 5,20 г 4-хлор-6-морфолін4-їл-[1,3,5]триазин-2-їл)-(4-толіл)-аміну 3, який без додаткової очистки та ідентифікації розчинили в 50 мл тетрагідрофурану. До одержаного розчину при перемішуванні додали 2,06 г (0,017 моль) 3,4-диметиланіліну. Реакційну суміш перемішували 4 години за температури 40 °C, охолодили. Осад, що утворився, відфільтрували та кристалізували з етанолу. Вихід становить 5.01 г (69 %). Тпл. =219-221 °C. Знайдено, %: N=19.5 C22H27C1N6O. Вирахувано, %: N=19.7. Спектр ПМР (DMSO-d6, ТМС): 2.16 (с, ЗН, СН3), 2.27 (с, 3Н, СН3), 3.67 (м, 4Н, СН2СН2), 3.78 (м, 4Н, СН2СН2), 7.16 та 7.52 (д-д, 4Н, СбН4-пара), 7.10-7.43 (м, 3Н, ароматичні протони), 10.1 (уш.с, 2Н, 2NH). Приклад 3. Експериментальне визначення противірусної активності було проведено в рамках скринінгової програми Національного Інституту Здоров'я США (NIH/NIAID) у Південному дослідному інституті США (Southern Research Institute-SRI, Birmingham, Alabama). Для оцінки противірусної активності сполуки (DAM0011141) використано методики [8]. A. Стандартна проба: Первинний аналіз активності досліджуваної сполуки за пригніченням вірусу з визначення цитопатичного ефекту. Аналіз проводять у 96-лункових плоскодонних мікропалетах. Для визначення цитопатичного ефекту кожен з чотирьох розчинів досліджуваної сполуки, що розбавлено до концентрацій 1000, 100, 10, 1 мкг/мл, вносять утри лунки, що містять моношар з досліджуваними клітинами. Через 5 3 UA 95732 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 хвилин у лунки засівають розчин з культурою вірусу та інкубують за температури 37 °C протягом часу, за який цитопатичний ефект у досліджуваних пробах розвинеться (зазвичай від 72 до 120 год.). Паралельно з тестом досліджуваної сполуки на тій же палеті у лунках ставляться контрольні проби з препаратом порівняння, активність якого щодо конкретного вірусу встановлено достовірно. Сполуки, що проявили активність за первинною пробою, піддаються аналогічному аналізу за умови подальшого розбавлення їх концентрацій. Дані виражаються як 50 % ефективної концентрації (ЕС50). Активність кожної з досліджуваних сполук виражається індексом селективності (SI), що є відношенням ІС50 до ЕС50. Позитивним вважається результат, у якому сполука проявила SI порядку 10 і більше. B. Стандартна проба: Візуальна оцінка за поглинанням барвника нейтрального червоного (NR). Цей тест проводиться для перевірки пригнічення вірусу (СРЕ), що отримано в першому тесті за нейтральним червоним, з використанням тієї ж 96-лункової мікропалети, після зчитування з неї результатів СРЕ. До середовища додають нейтральний червоний. Клітини, не пошкоджені вірусом, вбирають більшу кількість барвника. Результат зчитується оптичним комп'ютеризованим приладом. ЕС50 визначається за кількістю поглинутого барвника. Методи аналізу цитотоксичності A. Візуальне спостереження: Для випробування пригнічення клітин досліджуваною речовиною дві лунки неінфікованих клітин, обробляються двома різними концентраціями тестової сполуки і паралельно ставиться тест на двох лунках з інфікованими клітинами, які обробляються тими ж двома концентраціями сполуки. Одночасно з візуальним визначенням цитопатичного ефекту на інфікованих лунках з клітинами за допомогою мікроскопа для порівняння проводиться візуальний мікроскопічний контроль токсичності на предмет виявлення будь-яких змін у зовнішньому вигляді клітин порівняно з неінфікованими клітинами на тій же палеті. Цитотоксична концентрація 50 % пригнічення клітин визначається з регресійного аналізу одержаних даних щодо токсичності та позначається як ІС50. B. Визначення токсичності за поглинанням барвника нейтрального червоного. На описаній вище стадії тестування досліджуваної сполуки за барвником нейтральним червоним при визначенні ЕС50, як кількісної оцінки цитопатичного пригнічення вірусу, на тій же палеті ставляться дві лунки для контролю токсичності, до яких додається нейтральний червоний після чого спектрофотометрично вимірюється інтенсивність забарвлення, за яким проводиться визначення 50 % концентрації пригнічення клітин за нейтральним червоним - ІС50. Джерела інформації: 1. Presti RM, Zhao G, Beatty WL, et al. (November 2009). "Quaranfil, Johnston Atoll, and Lake Chad viruses are novel members of the family Orthomyxoviridae". J. Virol.-2009.-83 (22). 2. Haye K, Burmakina S, Moran T, Garcia-Sastre A, Fernandez-Sesma A (Jul 2009). "The NS1 protein of a human influenza virus inhibits type I interferon production and the induction of antiviral responses in primary human dendritic and respiratory epithelial cells.". J Virol.-2009.-83 (13): 6849-62. 3. Yoshiyuki Suzuki (July 3 2006). "Natural selection on the influenza virus genome". Molecular Biology and Evolution-2006.-23 (10): 1902-1911. 4. Coleman, Marion Т.; Dowdle, Walter R.; Pereira, Helio G.; Schild, Geoffrey C; Chang, W. K. // The Lancet, 1968, 292 (7583), 1384-1386. 5. Kahar-Bador M., Nathan A.M., Soo M.H., Mohd Noor S., AbuBakar S., Lum L.C.S., Syed Hassan S., Sam I.C. // Singapore Medical Journal, 2009.-50 (3), P. 112 6. Crotty S, Cameron C, Andino R (February 2002). "Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis?". J. Мої Med.-2002.-80 (2): 86-95. 7. Treatment of prostate cancer, melanoma or hepatic cancer. ZENYAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA Patent: US2007/244110 Al, 2007. 8. Standard Operating Procedure for In Vitro Antiviral Screening, Institute for Antiviral Research, Institute of Allergy and Infectious Diseases National Institutes of Health. - http://www.niaid.nih.gov. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 1 Гідрохлорид N-(3,4-диметилфеніл)-6-морфолін-4-їл-N -(пара-толуїл)-[1,3,5]триазин-2,4-діаміну 4 UA 95732 U O HCl N N N H N N N H DAM0011141, що проявляє противірусну активність щодо вірусів H1N1 штаму California/07/2009 та H3N2 штаму Brisbane/10/ 2007. 5 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5