Гідрохлориди 2,4-диморфоліно-6-ариламіно-[1,3,5]триазинів, що проявляють антивірусну активність відносно до коронавірусу атипової пневмонії sars

Реферат: Гідрохлориди 2,4-диморфоліно-6-ариламіно-[1,3,5]триазинів, R HCl R1 HN N N N O N N O , де R, R1=Н, СН3, Сl, що виявляють антивірусну активність відносно до коронавірусу атипової пневмонії SARS. UA 118684 U (12) UA 118684 U UA 118684 U Патент на корисну модель належить до фармацевтичної хімії та медицини, а саме до фармакологічних засобів, зокрема, одержання біологічно активних 2,4-диморфоліно-6ариламіно-[1,3,5]триазинів загальної формули: R HCl R1 HN N N N N O 5 10 15 20 25 30 35 40 N O , де R, R1 = Н, СН3, СІ, що виявляють антивірусну активність. Це дозволяє передбачити їх використання у практичній медицині як антивірусні лікарські засоби, а саме для лікування атипової пневмонії, викликаної вірусом SARS [1]. Відомо, що вірус SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome - важкий гострий респіраторний синдром або ВГРС) належить до коронавірусів і є новим інфекційним захворюванням, яке виникло в 2002 році в Південному Китаї [2]. Офіційно повідомлено про 8422 випадки захворювання, з яких понад 900 мали летальний характер. Після 2004 р. повідомлень про захворювання на SARS не було. Він викликає важку пневмонію, що викликано геморагічним токсичним набряком легень. Крім того, ВГРС може викликати респіраторний дистрес-синдром, бронхоектатичну хворобу, міокардит, гостру ниркову недостатність та гепатит. Тому вірус характеризується швидким розвитком хвороби та високою летальністю. Інкубаційний період SARS-CoV продовжується 2-10 днів і характеризується підвищенням температури тіла хворого до 38 °C та неспецифічними грипоподібними симптомами, а саме: ознобом, головним болем, діареєю, біллю у горлі, нежиттю, нездужанням і м'язовими болями. Далі з'являється сухий кашель, ядуха, інфекції верхніх дихальних шляхів. У важких випадках розвивається дихальна недостатність і гострий респіраторний дистрес-синдром та лімфопенія. Захворювання поширюється повітряно-крапельним та побутово-контактним шляхами. Виявлення вірусу у фекаліях та сечі хворих не виключає можливість і фекально-орального шляху передачі [3]. Віруси потрапляють до клітин альвеолярного епітелію, у цитоплазмі яких і відбувається реплікація вірусу. Дія вірусу викликає підвищення проникності клітинних мембран та посилений транспорт рідини, збагаченої білком у інтерстеціальну тканину легень та міжальвеолярний простір. При цьому руйнується сурфактант, що призводить до колапсу альвеол, в результаті чого порушується газообмін. У результаті цього розвивається важка дихальна недостатності, яка є основною причиною смерті у гострій фазі хвороби [1-3]. Методи специфічної терапії, ефективність яких підтверджено, відсутні. Зазвичай, проводять симптоматичне лікування інфекцій коронавірусів, яке включає традиційній набір методів, що застосовуються для лікування важких та середньо-важких форм пневмонії невідомої етіології, а саме: противірусні препарати, зазвичай - рибавірин та стероїдні гормональні препарати. Випробовуються також як специфічні засоби проти SARS-CoV ціла група інгібіторів, в число яких входять: інгібітори РНК-залежної РНК-полімерази; інгібітори вірус-кодованих протеаз (наприклад, лікарський засіб МІ28533 - як інгібітор протеази [4]); інгібітори речовин, що відповідають за приєднання вірусів до специфічних рецепторів на клітинній поверхні [3]. Препарати типу рибавірину іноді можуть знижувати смертність. Його застосовують для лікування важкої інфекції, викликаної респіраторним синцитіальним вірусом, вірусним гепатитом С, а також при багатьох вірусних лихоманках та пневмонії. Рибавірин є активним у формі метаболіту, бо має структуру, що подібна до нуклеотиду [5]: 1 UA 118684 U O NH2 N N HO N O H 5 10 15 H OH H OH H . Він порушує реплікацію вірусу, механізм якої не встановлений. У США та Великобританії рибавірин призначають орально для лікування гепатиту С у поєднанні з інтерферонами. У формі аерозолю рибавірин використовують для лікування захворювань респіраторним синцитіальним вірусом у дітей. Питання доцільності застосування рибавірину залишається відкритим, бо він має виражену негативну побічну дією і у деяких хворих відзначалося погіршення стану після прийому цього препарату [6]. Одним із побічних ефектів рибавірину є дозозалежна анемія, важка форма якої викликає смерть пацієнта (у зв'язку з чим необхідний повний контроль показників крові у процесі лікування). Рибавірин також є тератогеном для деяких тварин [5]. В основу патенту на корисну модель поставлена задача пошуку нових біологічно активних сполук з противірусною активністю, що перешкоджають реплікації вірусу та можуть лікувати хворобу, викликану вірусом SARS. Поставлена задача вирішується тим, що як нові біологічно активні сполуки запропоновані гідрохлориди 2,4-диморфоліно-6-ариламіно-[1,3,5]триазинів 3 a-f, які отримують із середніми виходами при використанні відомих синтетичних підходів у декілька стадій (схема 1). Схема 1. Синтез гідрохлоридів 2,4-диморфоліно-6-ариламіно- [1,3,5] триазинів 3 a-f. R R O 2 Cl N N Cl N R1 Cl N H N 20 25 N N N N N O 1 HN H2N N N Cl R1 O N O N O 3 a-f 2 , де 3а: R=CH3 R1=H; 3b: R=HR1=4-C1; 3c: R=HR1=4-COOCH3; 3d: R=CH3 R1=4-CH3; 3e: R=C1 R1=4-CH3; 3f:R=CH3 R1=5-CH3. Синтезовані сполуки 3а-f є кристалічними речовинами білого кольору, що розчинні у ДМФА. 1 Склад і хімічну будову сполук 3а-f доведено даними методу ЯМР Н спектроскопії. Спектри 1 ЯМР Н синтезованих сполук записані на приладі Bruker-300, робоча частота - 300 МГц, розчинник - ДМСО-d6, внутрішній стандарт - ТМС. Експериментальне визначення противірусної активності було проведено в рамках скринінгової програми Національного Інституту Здоров'я США (NIH/NIAID) у Південному дослідному інституті США (Southern Research Institute-SRI, Birmingham, Alabama). Ефективність одержаних сполук 3а-f щодо вірусу SARS-CoV виражали показниками ЕС50, ІС50 та SI. Результати досліджень наведено в табл. 1. 30 2 UA 118684 U Таблиця 1 Противірусна активність щодо коронавірусу SARS похідних 2,4-диморфоліно-6-ариламіно-[1,3,5]триазинів (3а-f) Сполуки EC50, мкг/мл 3a 3b 3с 3d 3е 3f 0.29 0.71 0.32 0.71 0.29 4.9 0.31 0.42 0.32 0.55 0.18 2 ІС50, мкг/мл 47 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 Препарати порівняння М128533 Рибавірин M128533 Рибавірин M128533 Рибавірин M128533 Рибавірин M128533 Рибавірин М128533 Рибавірин SI 160 >140 >310 >140 >340 >20 >320 >240 >310 >180 >560 >50 EC50, мкг/мл 0.81 0.51 0.81 0.51 0.81 0.51 0.81 0.51 0.81 0.51 0.81 0.51 ІС50, мкг/м л >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 SI >120 >200 >120 >200 >120 >200 >120 >200 >120 >200 >120 >200 Примітки: 1. ЕС50 - ефективна концентрація, що визначається з кривої доза/ефект і є концентрацією речовини, при якій ефект спостерігається для 50 % популяції після проходження певного часу дії. Виражається у мкг/мл. 2. ІС50 - концентрація, при якій інгібування клітин організму речовиною складає 50 %. Виражається у мкг/мл. 3. SI - індекс селективності, що є показником ефективності препарату, та виражається співвідношенням ІС50 до ЕС50. 5 10 15 20 25 30 Приклади конкретного виконання. 2-Хлор-4,6-диморфолін-4-іл-[1,3,5]триазин 2 був одержано взаємодією ціанурхлориду 1 з морфоліном в розчині ацетону за методикою [7]. 1 Приклад 1. Гідрохлорид 2,4-диморфоліно-6-(3 -метилфеніламіно)-[1,3>5]триазину 3а одержаною за видозміненою методикою [8]: до розчину 1.43 г (0.005 моль) 2-хлор-4,6диморфолін-4-іл-[1,3,5]триазину 2 в 40 мл ацетонітрилу при перемішуванні додають 0.535 г (0.005 моль) мета-толуїдину. Після чого суміш кип'ятять протягом трьох годин. Реакційну суміш охолоджують і осад, що випав, відфільтровують та кристалізують з пропанолу-2. Вихід 1.45 г (74 %). Тпл.=220-221 °C. Знайдено, %: N 21.1; Сl 8.92. C18H25C1N6O2. Вирахувано, %: N 21.4; Сl 1 9.03. ЯМР Н (δ, м.ч.): 2/29 (с, 3Н, СН3); 3.72 (м, 8Н, 2N(CH2)2), 3.74 (м, 8Н, 2О(СН2)2), 6.85 (д, 1Н, Ph), 7.17 (т, 1Н, Ph), 7.45 (д. 1Н, Ph), 7.50 (с, 1H, Ph); 9,93 (уш. с. 1Н, NH). 1 Приклад 2. Гідрохлорид 2,4-диморфоліно-6-(4 -хлорфеніламіно)-[1,3>5]триазину 3b одержано аналогічно сполуці 3а з 1.43 г (0.005 моль) 2-хлор-4,6-диморфолін-4-іл-[1,3,5]триазину 2 та 0.638 г (0,005 моль) парахлораніліну. Вихід складає 1.67г (81 %). Тпл.=218-219 °C. Знайдено, 1 %: N 20.1, СІ 17.5. C17H22Cl2N6O2. Вирахувано, %: N 20.3, СІ 17.2. ЯМР Н (δ, м.ч.): 3.72 (м, 8Н, 2N(CH2)2), 3.74 (м, 8Н, 2О(СН2)2), 7.37 та 7,67 (д-д, 4Н, С6H4), 9.98 (уш. с, 1H, NH). 1 Приклад 3. Гідрохлорид 2,4-диморфоліно-6-(4 -карбометоксифеніл-аміно)-[1,3,5]триазину 3с одержано аналогічно сполуці 3а з 1.43 г (0.005 моль) 2-хлор-4,6-диморфолін-4-іл-[1,3,5]триазину 2 та 0.755 г (0,005 моль) метилового естеру параамінобензойної кислоти. Вихід складає 1.49г (68 %). Тпл…=206-207 °C. Знайдено, %: N 19.0, СІ 7.98. C19H25ClN6O4. Вирахувано, %: N 19.2, СІ 1 8.12. ЯМР Н (δ, м.ч.): 3.72 (м, 8Н, 2N(CH2)2), 3.74 (м, 8Н, 2О(СН2)2), 3.86 (с, 3Н, СООСН3), 7.81 та 7.92 (д-д, 4Н, С6H4), 10.1 (уш. с. 1Н, NH). 1 1 Приклад 4. Гідрохлорид 2,4-диморфоліно-6-(3 ,4 -диметилфеніл-аміно)-[1,3,5]триазину 3d одержано аналогічно сполуці 3а з 1.43 г (0.005 моль) 2-хлор-4,6-диморфолін-4-іл-[1,3,5]триазину 2 та 0.605 г (0,005 моль) 3,4-диметилфеніламіну. Вихід складає 1.53 г (75 %). Тпл=194-195 °C. 1 Знайдено, %: N 20.4, СІ 8.87. C19H27ClN6O2. Вирахувано, %: N 20.6, СІ 8.72. ЯМР Н (δ, м.ч.): 2.17 (с. 3Н, СН3), 2.19 (с. 3Н, СН3), 3.71 (м, 8Н, 2N(CH2)2), 3.73 (м, 8Н, 2О(СН2)2), 7.06 (д, 1Н, Ph), 7.37 (с, 1Н, Ph), 7.38 (д, 1Н, Ph); 9,95 (уш. с. 1H, NH). 1 1 Приклад 5. Гідрохлорид 2,4-диморфоліно-6-(3 -хлор-4 -метилфеніл-аміно)-[1,3»5]триазину 3е одержано аналогічно сполуці 3а з 1.43 г (0.005 моль) 2-хлор-4,6-диморфолін-4-іл 3 UA 118684 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [1,3,5]триазину 2 та 0.605 г (0,005 моль) 3-хлор-4-метилфеніламіну. Вихід складає 1.53 г (75 %). Тпл.=201-202 °C. Знайдено, %: N 20.0, СІ 16.8. C18H24Cl2N6O2. Вирахувано, %: N 19.7, СІ 16.6. 1 ЯМР Н (δ, м.ч.): 2.23 (с. 3Н, СН3), 3.72 (м, 8Н, 2N(CH2)2), 3.74 (м, 8Н, 2О(СН2)2), 7.28 (д, 1Н, Ph), 7.48 (д, 1Н, Ph), 7.81 (с. 1Н, Ph), 9,89 (уш. с. 1Н, NH). Приклад 6. Гідрохлорид 2,4-диморфоліно-6-(3',5'-диметилфеніл-аміно)-[1,3>5]триазину 3f одержано аналогічно сполуці 3а з 1.43 г (0.005 моль) 2-хлор-4,6-диморфолін-4-іл-[1,3,5]триазину 2 та 0.605 г (0,005 моль) 3,5-диметилфеніламіну. Вихід складає 1.49 г (73 %). Тпл=190-191 °C. 1 Знайдено, %: N 20.3, СІ 8.65. C19H27C1N6O2. Вирахувано, %: N 20.6, СІ 8.72. ЯМР Н (δ, м.ч.): 2.22 (с. 6H, 2СН3), 3.73 (м, 8Н, 2N(CH2)2), 3.75 (м, 8Н, 2О(СН2)2), 6.67 (с, 1Н, Ph), 7.37 (с, 1Н, Ph), 7.28 (с. 2Н, Ph), 9.61 (уш. с. 1Н, NH). Приклад 7. Експериментальне визначення противірусної активності синтезованих сполук 3аf до коронавірусу SARS було проведено в рамках скринінгової програми Національного Інституту Здоров'я США. Для визначення противірусної активності сполук 3а-f був проведений тест in vitro з використанням клітин Vero [9, 10]. Клітини Vero 76 вирощували в 96-лунковому мікропланшеті до того часу, поки дно кожної лунки не покриється клітинами. Залишкове культуральне середовище повністю видаляли, і кожну лунку двічі промивали фосфатним буфером. В кожну лунку додавали розчин штам Urbani коронавірусу SARS, скорегований до необхідної концентрації. Кожну із сполук (3а-f), противірусний засіб Рибавірин (Sigma) та МІ28533 (інгібітор протеази для вірусу атипової пневмонії) розчиняли у ДМСО, додавали до кожної лунки до кінцевої концентрації від 0,1 до 100 мкг/мл. Після культивування протягом 48 год. клітини Vero 76 спостерігали в мікроскоп. Після додавання 100 мкл 70 % ацетону кожну лунку витримували при -20 °C протягом 1 год. Після висушування в сушильній шафі додавали 100 мкл 0,4 % (w/v) розчину SRB (сульфородаміну Б), розчиненого в 1 % (v/v) оцтовій кислоті. Після 30 хв. забарвлення розчин SRB, що не зв'язався з клітинами, чотири рази промивали 1 % (v/v) оцтовою кислотою. Після висушування в кожну лунку додавали 100 мкл 10 шМ розчину Tris (pH 10,5) для розчинення забарвлюючої речовини на дні лунки. Для оцінки противірусної активності вимірювали оптичну густину. Як контроль використано лунки, у які не внесено клітини, з вірусом без сполуки і в які не внесено ні вірус, ні сполуку (контроль культури клітин) [10], а як препарати порівняння - рибавірин та М128533. Відповідно до результатів скринінгу, наведених у табл. 1, пригнічення вірусу SARS-CoV гідрохлоридами 2,4-диморфоліно-6-ариламіно-[1,3,5]триазинів 3а-f, що виражене концентрацією ЕС50, становить 0.42-4.9 мкг/мл, а у рибавірину він складає 0.51 мкг/мл, тоді як індекс селективності SI знаходиться в межах >20→240 (у рибавірину →200). У дослідженнях, де за препарат порівняння використано М128533, ЕС50 для сполук (3а-f) складає 0.18-0.32 мкг/мл, а у М128533-0.81 мкг/мл, тоді як SI для (3а-f) перевищує 160-560, а у М128533 він у 1.33-4.46 разу менший і складає >120. Таким чином, запропонований ряд нових біологічно активні сполуки, які можуть бути потенційними противірусними засобами щодо SARS-CoV. Джерела інформації: 1. SARS coronavirus. [Електронний ресурс]. Режим жоступу: https://en.wikipedia.org/wiki/SARS_coronavirus/ - Назва з екрану. 2. Печінка A.M. Гострі респіраторні захворювання: питання клінічної діагностики та лікування (лекція): лікарю-практику/ A.M. Печінка, М.І. Дземан. // Український медичний часопис. № 5 (79) ІХ/Х 2010. - [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http:// www.umj.com.ua. - Назва з екрану. 3. Короваева И.В. Новый коронавирус - возбудитель атипичной пневмонии / И.В.Короваева, С.И.Вовк, Л.А.Панченко // Анали Мечниковського Інституту, № 1, 2005. - С 66-74. 4. Нетесов С.В. Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), вызываемый коронавирусом / С.В.Нетесов, В.М.Блинов, Т.Ю.Иванькина и др. // ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцове, Новосибирск, Россия. 5. Patent WO2016012536A1-Gak modulators as antivirals-Google [Електронний ресурс]. Режим доступу: http://google.com/patents/WO2016012536A1l?c1=zh-cn/. - Назва з екрану. 6. Рибавирин. [Електронний ресурс]. Режим доступу: https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0 %A0 %D0 %B8 %D0 %B1 %D0 %B0 %D0 %B2 %D0 %B8 %D1 %8 0 %D0 %B8 %D0 %BD/ - Назва з екрану. 7. Misawa, Takashi; Salim, Mohammed T.A.; Okamoto, Mika; Baba, Masanori; Aoyama, Hiroshi; Hashimoto, Yuichi; Sugita, Kazuyuki. Synyhesis and anti-hepatitis С virus activity of morpholino triazine derivatives. Heterocycles, 2010, vol.81, #6 p. 1419-1428. 8. Zhou Z. Design, Synthesis and Biological Evaluation of Novel 1,3,5-triazines Derivatives as Potent Antitumor Agents / Zhou Z., Zhang Y., Yan N. et al. // Med Chem-2015. - V. 5(8). - P. 345-350. 4 UA 118684 U 5 10 [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http://dx.doi.org/10.4172/2161-04 44.1000284 - Назва з екрану. 9. Lucas-Hourani, M, Munier-Lehmann, H., Helynck, О., Komarova, A., Despres, P., Tangy, F., et al. High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses. J. Vis. Exp. (87), e51222, doi:10.3791/51222 (2014). [Електронний ресурс]. - Режим доступу: https://www.jove.com/video/51222/high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitorsrna - Назва з екрану. 1 10. Пат. № 100048 Україна, МПК C07D 253/065 C07D 295/00 (2013.01) N, N -Бicбeнзo[1,3]дioкcoл-5-їл-6-мopфoлiн-4-їл-[1,3,5]тpиaзин-2,4-дiaмiн, що проявляє антивірусну активність відносно до вірусу H1N1 / A.M. Демченко, В.В.Суховєєв, Р.С. Шаінова, В.А. Синицин № u201413249; Заявл. 10.12.2014; Опубл. 10.07.2015, Бюл. № 13. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Гідрохлориди 2,4-диморфоліно-6-ариламіно-[1,3,5]триазинів, R HCl R1 HN N N N O N N O , 20 де R, R1=Н, СН3, Сl, що виявляють антивірусну активність відносно до коронавірусу атипової пневмонії SARS. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5