Спосіб оцінки стану апоптозу при інфекційному мононуклеозі епштейна-барр вірусної етіології у дітей

Реферат: Спосіб оцінки стану апоптозу при інфекційному мононуклеозі Епштейна-Барр вірусної етіології у дітей передбачає визначення рівня експресії CD95 в крові. Додатково досліджують експресію в імунокомпетентних клітинах інших маркерів апоптозу, таких як -Fas/Apo-1, Bcl-2, Bax, INF, TNF, анексин V і при наявності їх оцінюють стан апоптозу. UA 69524 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ СТАНУ АПОПТОЗУ ПРИ ІНФЕКЦІЙНОМУ МОНОНУКЛЕОЗІ ЕПШТЕЙНА-БАРР ВІРУСНОЇ ЕТІОЛОГІЇ У ДІТЕЙ UA 69524 U UA 69524 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до педіатрії, і може бути використана для оцінки стану апоптозу при інфекційному мононуклеозі Епштейна-Барра вірусної етіології у дітей. Апоптоз представляє собою форму загибелі клітини, яка виявляється за допомогою морфологічної ідентифікації: конденсації хроматину, зменшення розміру клітини, фрагментації ядра та цитоплазми, утворення апоптотичних тілець [1]. Апоптоз має налагоджений біохімічний і клітинний механізм розвитку. В даний час інтенсивно вивчається роль апоптозу у регуляції імунної відповіді, розвитку імунодефіцитних станів і імунопатології. Особливий інтерес представляє участь апоптозу в патогенезі інфекційних захворювань, так як їх збудники мають різноманітний вплив на програмовану загибель клітин - стимулюючу або пригнічуючу. Встановлено, що ряд вірусів захищають від апоптозу інфіковані клітини, одночасно підсилюючи апоптоз незаражених клітин, в чому можна запідозрити важливий механізм вірус індукованої імуносупресії. До таких вірусів, що має двоякий вплив на апоптоз клітин імунної системи, належить і вірус Епштейна-Барра (ВЕБ) - збудник інфекційного мононуклеозу (IМ). Імунокомпетентні клітини (ІКК), як і клітини інших тканин, яким властива довічна фізіологічна регенерація, в диференціюванні набувають програму на апоптоз. Лімфоцитам властивий апоптоз, що перевищує інші клітини, оскільки вони повинні ділитися при лімфопоезі і на периферії при ініціації імунної відповіді [12]. Виділяють сполуки, що сприяють виживанню клітини - антиапоптичні молекули (ВсI-2, Bcl-xl, Bag-І, Вік) і призводять до загибелі клітини - проапоптичні молекули (Вах, Bak, Bad, Bid) [5,12]. Ген Bcl-2 кодує синтез білка мембраноасоційованого Bcl-2, розташованого на мітохондріальній та перинуклеарній мембранах [7], роль якого полягає у підтримці процесів клітинного виживання і проліферації. Вах і Bad - білки, які здатні формувати гетеродімери з ВсI-2 та Bcl-xl внаслідок їх високої амінокислотної гомології. Зв'язування цих білків скасовує антиапоптичні властивості Всі2 та Bcl-xl. Баланс про- і антиапоптичних молекул визначає розвиток або запобігання загибелі клітини [5]. ВЕБ може викликати апоптоз у клітинах дихального епітелію [3,5,6,7] і при цьому процес апоптозу може активуватися через TNF (фактор некрозу пухлини α) - апоптозіндукуючий ліганд (TRAIL), який призводить до селективного знищення інфікованих вірусом клітин [8,4]. TNF представляє собою розчинний цитокін, що синтезується активованими Т-лімфоцитами і макрофагами у відповідь на запалення та інфекцію. TNF стимулює адгезію нейтрофілів на ендотеліальних клітинах і їх екстравазацію - міграцію до вогнища запалення із судинного русла (сприяючи розпушуванню міжклітинного матриксу), сприяє активації нейтрофілів, посилюючи фагоцитоз та продукцію супероксидних радикалів, а також експресію рецепторів комплементу на нейтрофілах, індукує експресію додаткових Fas-рецепторів на Т-лімфоцитах, HLA-DR експресію і високоафінного рецептора інтерлейкіну 2 (IL-2). Т-клітини під дією TNF прискорюють проліферацію у відповідь на IL-2, а також збільшують IL-2-залежний синтез інтерферону-у (IFN). TNF діє переважно на початкових етапах запального процесу. Для його завершення необхідний TGF-. Синтез TNF згасає вже через кілька годин після активації. TNF надає сильну протизапальну і катоболітичну дію, має антимікробну і протипухлинну активність; взаємодіє з мембранним рецептором Fas родини (Р55). Роль апоптозу при ВЕБ- інфекції пов'язана з обмеженням масштабів інфекції, включаючи запалення і є спільною клітинною відповіддю. Макрофагальні клітини, які фагоцитували апоптотичні клітини, набувають при цьому протизапальні властивості. У таких макрофагах підвищується експресія TGF- і PGE2, зменшується продукція інтерлейкіну 8 (IL-8), TNF, інтерлейкіну ір (IL-1), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Макрофаги, які фагоцитували апоптотичні клітини, здатні інгібувати проліферацію Т-лімфоцитів, на відміну від макрофагів фагоцитуючих некротичну клітину [10]. Останнім часом приділяється велика увага вивченню біологічної активності білків, що належать до родини аннексинів. Аннексин V належить до родини Са 2 - і фосфоліпідзв'язуючих білків, блокуючих фосфоліпазу А. У механізмі дії аннексину V велике значення має його властивість зв'язуватися з негативно зарядженими фосфоліпідами, в тому числі з фосфатидилсерином (ФС), експозиція якого на клітинній мембрані є однією з ранніх ознак апоптозу [4]. Аннексин V, як і інші аннексини, не виділяється з нормальних клітин; джерелом позаклітинного аннексину V є апоптотичні і зруйновані клітини [3,2]. У дослідженнях було показано, що ВсI-2 прямо або опосередковано перешкоджає вивільненню цитохрому С. Транслокація гена Всl-2, що призводить до його гіперекспресії, характерна для В-клітинної лімфоми, деяких форм раку та резистентності до хіміотерапії. Протизапальна і зберігаюча функція білка Всl-2 полягає в захисті ендотеліальних клітин шляхом інгібування ядерного чинника NF-kB і зниження вироблення прозапальних генів [9,10]. Проапоптозний білок Вах, переміщаючись з цитоплазми на поверхню мітохондрій, інактивує 1 UA 69524 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антиапоптозні білки, що призводить до утворення пор в мітохондріях і виходу цитохрому С та інших проапоптозних молекул з міжмолекулярного простору. Проапоптозні члени Всі-2 також збільшують проникність мітохондріальної мембрани, що призводить до потрапляння проапоптозних білків в цитоплазму. Подібно іншим членам родини, Вах складається з константних доменів Всl-2 гомологів 1 (ВН1) і 2 (ВН2), що зумовлює їх гомо- або гетеродимеризацію з Всl-2. Незважаючи на те, що Вах сам по собі не викликає апоптоз, збільшення рівня Вах прискорює розвиток апоптозу після сигналів смерті, таких як цитокінова депривація або взаємодія Fas з Fas-лігандом. Виникнення апоптозу визначається співвідношенням гомодимера Вах та Вах/Всl-2 гетеродимерів. Коли Всі-2 у надлишку апоптоз інгібується. Однак, якщо рівень Вах збільшується у відповідь на сигнал смерті, це сприяє клітинній смерті. Т-лімфоцити, що перебувають у стані спокою, характеризуються відносно високим рівнем експресії антиапоптозних білка Всl-2 і низькою експресією молекул Fas і рецепторів до TNF. Якщо ІКК активується, то чутливість до апоптозу зростає в десятки разів, при цьому в цитоплазмі Т-лімфоцитів різко знижується експресія білка Всі-2, а на мембрані з'являється значна кількість молекул Fas і TNF [12]. Дані про утворення аннексину V, Fas/Apol, Вах, Всl-2, інтрацеллюлярних INF і TNF при інфекційному мононуклеозі Епштейна-Барр вірусної етіології нечисленні і суперечливі. Інфекційний мононуклеоз (IМ) - це антропонозна вірусна інфекція з повітряно-крапельним механізмом передачі збудника, що характеризується лихоманкою, інтоксикацією, генералізованою лімфаденопатією, збільшенням печінки і селезінки. Важливою особливістю ВЕБ є вибіркове інфікування В-лімфоцитів через специфічний рецептор CD21 (CR2). При цьому знижується здатність В-клітин до загибелі через апоптоз. У той же час ВЕБ (і його поверхневий глікопротеїн gp 350) при гострому ІМ викликає посилення експресії Fas (CD95) на CD4 + і CD8 + Т-лімфоцитах і Fas-ліганда (FasL) на В-лімфоцитах і моноцитах-макрофагах, що веде до Fas опосередкованого апоптозу Т-клітин. Велика частина (до 80 % vs 10 % у донорів) мононуклеарів крові хворих гострим ІМ гине через 48-72 години культивування, при цьому апоптозу піддаються CD4 + і CD8 + Т-лімфоцити фенотипу Т-клітин пам'яті (CD45RO +). Апоптоз активованих ВЕБ Тлімфоцитів може лежати в основі транзиторної імуносупресії, що спостерігається при гострому IМ. Довгий час В-лімфоцити вважалися єдиною мішенню ВЕБ в організмі хворого. Однак пізніше встановлено, що інфікуються також клітини епітелію носоглотки і нейтрофіли. Останні, будучи інфікованими, піддаються загибелі через Fas-залежний апоптоз. Можливе інфікування Тлімфоцитів, а також фолікулярних дендритних клітин, які мають на поверхні рецептор CD21. Зв'язуючись з поверхнею моноцитів і нейтрофілів, ВЕБ індукує в них синтез хемотаксичних факторів, у тому числі IL-8 і макрофагальний запальний протеїн-1 (МІР-1 alpha). У гостру фазу хвороби в крові у хворих зростають рівні цитокінів IL-lalpha, IL-2, IL-6 і IFN-gamma. Інфіковані ВЕБ клітини мигдаликів посилено синтезують IL-lbeta, IL-6 і TNF-alpha. Крім IL-lalpha і IL-lbeta, ВЕБ індукує в нейтрофілах синтез рецепторного антагоніста IL-1 (IL-lRalpha), інгібуючи IL-1залежні механізми клітинного імунітету. За деякими даними, ВЕБ кодує вірусний білок, гомологічний IL-lRalpha і володіє його функціями. Джерелом IL-6, зокрема, можуть бути Влімфоцити, адсорбовані ВЕБ в ініціальну фазу інфекції. Відомий спосіб оцінки стану апоптозу при інфекційному мононуклеозі ВЕБ етіології вибраний нами як прототип передбачає оцінку співвідношення показників активації та апоптозу в імунній системі дітей, хворих гострим IМ із різним ступенем тяжкості клінічних проявів інфекції (15). Однак недоліками даного способу є те, що стан апоптозу оцінювався лише дослідженням + обмеженої кількості маркерів, визначався лише рівень експресії CD95 клітин та визначалася готовність лімфоцитів до спонтанного апоптозу in vitro. Задачею корисної моделі, що вирішується, є оцінка стану апоптозу шляхом дослідження експресії в імунокомпетентних клітинах маркерів апоптозу: Fas/Apo-1, Bcl-2, Bax, INFy, TNF, анексин V. Технічним результатом є зменшення ризику виникнення ускладнень та покращення ефективності лікування. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який передбачає визначення рівня експресії CD95 в крові, згідно з корисною моделлю, додатково досліджують експресію в імунокомпетентних клітинах інших маркерів апоптозу, таких як - Fas/Apo-1, Bcl-2, Bax, INF, TNF, анексин V і при наявності їх оцінюють стан апоптозу. Спосіб здійснюється наступним чином: В дослідження було включено 15 дітей, хворих на IМ ВЕБ, які перебували на стаціонарному лікуванні в КМДКІЛ з 2008 року по 2010 рік у віці від 1 до 18 років. Діагноз встановлювали на 2 UA 69524 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 основі клінічних ознак захворювання, лабораторних даних на присутність циркулюючих AT і корпускулярних Аr, імунофлюоресцентного дослідження. Групу порівняння склали 25 практично здорових дітей-спортсменів віком від 7 до 14 років, які були обстежені у відповідності з міжнародним етичним протоколом. Лімфоцити виділяли з стабілізованої ЕДТА (50 ммоль/10 мл) венозної крові розведеною 1: 2 середовищем RPMI 1640 (Sigma, США) з додаванням 10 % інактивованої фетальної телячої сироватки (GidcoBRL, Англія) в градієнті щільності фіколл - верографину ("Pharmacia", щільність 1,077), що втричі відмивали розчином PBS (рН 7,2; "Flow Labs", Великобританія). Життєздатність клітин становила 95-98 %. Фіксацію препаратів проводили на предметних скельцях в маркованих лунках (1 × 106 клітин в 1 мл) протягом 3 хвилин в парах 10 % нейтрального формаліну. Перед фарбуванням мазки двічі промивали у PBS (рН7, 2). Маркери апоптозу досліджували в поєднанні з маркерами диференціювання CD4, CD8, CD25, CD20. На фіксовані клітини наносили по 20 мкл моноклональних антитіл, мічених FITC або СУ5, до CD4 або CD8, CD25, CD20 (НВЦ "МедБіоСпектр", Москва, ОНЦ РАМН) в оптимальній концентрації ( 0.5 мкг), інкубували 15-30 хв. при 40 С в темряві, двічі промивали PBS. Маркери апоптозу Bax, Bcl-2, iNOs, Fas / Аро, інтрацелюлярний INF, TNF, аннексии V виявляли за допомогою моноклональних антитіл (PharMingen, США), кон'югованих з флуоресцентними мітками різного спектру свічення (FITC/519 - зелений, РЕ/578- жовтий, Су5/667- червоний, РегСР/678 - темночервоний). Після фарбування поверхневих антигенів препарати пермеабілізували в 20 мкл розчину Cytofix / Cytoperm (BDTMPhosFlow) протягом 10-20 хв. при 40° С, двічі промивали у розчині Perm / Wash (BDTMPhosFlow). Потім забарвлювала клітини AT до рецепторів INF і TNF, кон'югованими з FITC, згідно з індивідуальним для кожного маркера протоколом (BD Transduction Laboratories, PharmingenTM, США). Вах досліджували непрямим імунофлюоресцентним методом із застосуванням очищених мишачих моноклональних антитіл проти людського Вах (PharmingenTM, США) у кінцевій концентрації 5 мкг / мл на 106ІКК. Зв'язавшись первинні антитіла візуалізували за допомогою вторинних AT, мічених PerCP (exc488/532, em-тах 678). Вторинні AT - кролячі антимишачі IgGl, кон'юговані з РегСР (PharmingenTM, США) - світяться в червоній частині спектра. Всі-2 виявляли після фіксації розчином 1 % сапоніну в PBS і пермеабілізаціі в 20 мкл Cytofix / Cytoperm (BDTMPhosFlow) 10 хв. при 4° С, двічі промивали PBS і фарбували моноклональними антитілами, міченими РЕ (Pharmingen, США) 30 хвилин при 40° С в темряві. Світіння враховували в жовтому спектрі (Lazer 514 nm, фільтр ВР 560-615). iNOs визначали за допомогою моноклональних антитіл, кон'югованих з FITC, відповідно до протоколу BD Transduction Laboratories (PharmingenTM, США). Фарбували препарати, за допомогою набору PharmingenTM (США) для виявлення аннексину V / пропідія йодиду відповідно до протоколу фірми Pharmingen. Ядра лімфоцитів фарбували Hoetch (Sigma) в синій колір. Результати враховували на двох конфокальних лазерних скануючих мікроскопах: Axioskop-2 LSM 5 PASCAL і Axiocam HRO LSM PASCAL 510 МЕТА (Carl ZEISS) з гелій-неоновим і аргоновим лазерами (Lazer 488 nm, фільтр ВР 505-530; Lazer 514 nm, фільтр ВР 560-615, Lazer 543 nm, фільтр LP650). Об'єктив-100 / 1,4 160/017, окуляр 10, масляна іммерсія. Отримані зображення сканували та оброблялися за допомогою комп'ютерної програми LSV510. Статистичну обробку результатів проводили методами описової статистики і кореляційного аналізу. Дослідження маркерів апоптозу при ЇМ ВЕБ етіології в гострому періоді захворювання показало високу ступінь їх експресії. Всі досліджувані маркери апоптозу: Fas/Apo-1, Bcl-2, Bax, INF, TNF, анексин V перевищували контрольні значення: рівень Fas / Аро-1 перевищував контрольне значення в 2,9 рази; рівень ВсI-2 був підвищений у 2,3 рази; рівень Вах - в 3,2 рази; рівень INF - в 3,1 разів; рівень TNF - у 3 рази; рівень аннексину V (Ann V) - в 2,5 рази (р