Спосіб оцінки функціонального стану печінки в експерименті

Реферат: Спосіб оцінки функціонального стану печінки в експерименті за допомогою ЛКС-метрії. В якості досліджуваного матеріалу використовують гомогенат тканини печінки експериментальних тварин, якій центрифугують на протязі 25-30 хв при 7000 об/хв при температурі 0-4 °С, після чого отриманий супернатант у кількості 0,2 мл піддають дослідженню методом ЛКС і за підвищенням вкладу в світлорозсіювання часток великого, від 96 до 264 нм, та надвеликого, більш ніж 264 нм, розмірів судять про наявність порушення функціонального стану печінки. UA 70302 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ПЕЧІНКИ В ЕКСПЕРИМЕНТІ UA 70302 U UA 70302 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель відноситься до галузі медицини, а саме до експериментальної фармакології і токсикології, патологічної фізіології, і може бути використаний для оцінки функціонального стану печінки при експериментальних дослідженнях, у тому числі при моделюванні патологічних станів, встановленні як позитивної, так і негативної гепатотропної дії різноманітних біологічно активних речовин і лікарських засобів. Печінка виконує цілий ряд найважливіших функцій (дезінтоксикаційна, бар'єрна, участь у травленні, обміні речовин, гемостазі тощо) і тому є одним з основних органів, що забезпечує гомеостаз організму [1]. Прямо або побічно печінка має відношення практично до всіх сторін життєдіяльності організму. її функціональна недостатність може посилити перебіг патологічного процесу в інших органах, змінити гормональну регуляцію, вплинути на ефективність і безпечність фармакотерапії. У той же час печінка активно включається в адаптивні реакції при хворобах інших органів і систем. Порушення будь-якого обміну (білкового, вуглеводного, мінерального та ін.) може вказувати на патологічні зміни функцій печінки. Тому далеко не завжди є можливість точно визначити долю безпосередньо печінкової патології у виявлених порушеннях, залежних значною мірою від стану інших органів. Це суттєво утрудняє дослідження функціонального стану печінки, особливо в експерименті при моделюванні патології, визначенні фармакотерапевтичної активності нових біологічно активних речовин тощо. Крім того, при виборі та аналізі тестів можуть виникати труднощі ще й тому, що функціональні резерви печінки досить великі і для виявлення її патології (особливо персистуючої) необхідне застосування багатокомпонентного комплексу функціональних досліджень. Відомий спосіб оцінки функціонального стану печінки у клініко-експериментальній медицині за змінами значень біохімічних показників у гомогенаті тканини печінки [2], у супернатанті якого визначають активність маркерних ферментів (аланінамінотрансферази, аспартатамінотрансферази, γ-глутамілтрансферази, лужної фосфатази тощо), показників білкового (вміст загального білку, альбуміну тощо), пігментного (вміст загального білірубіну та його фракції), вуглеводного (вміст глюкози), електролітного (вміст купруму, феруму тощо) обмінів. Недоліками зазначеного методу є те, що він різновекторний, складний і трудомісткий у виконанні. Труднощі полягають ще й в тому, що важко визначити коло тестів і коректно дати їх багатофакторну інтегральну оцінку, особливо на ранній стадії захворювання. Найбільш близьким до запропонованого є метод оцінки функціонального стану печінки у клініко-експериментальній медицині шляхом дослідження плазми крові методом лазерної кореляційної спектроскопії (ЛКС) [3]. При цьому, із крові тварин отримують плазму, яку піддають дослідженню методом ЛКС. За коливаннями субфракційного складу плазми крові проводять комплексну оцінку стану гомеостазу в динаміці розвитку токсичного гепатиту. Недоліками зазначеного методу, у першу чергу, є те, що на гомеостаз плазми крові впливають різні фактори порушення функції не тільки печінки, а й усіх систем і органів, тому він не є специфічним для оцінки функціонального стану печінки. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу оцінки функціонального стану печінки при експериментальних дослідженнях методом ЛКС, при цьому дослідженню піддається супернатант гомогенату тканини печінки тварин, в результаті чого стає можливим підвищення інформативності і достовірності виявлених порушень, тобто запропонований спосіб є універсальним і застосовним для оцінки при різних формах токсичного ураження печінки. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю в якості дослІджуванного матеріалу використовують гомогенат тканини печінки експериментальнихтварин, якій центрифугують на протязі 25-30 хв при 7000 об/хв при температурі 0-4° С, після чого отриманий супернатант у кількості 0,2 мл піддають дослідженню методом ЛКС і за підвищенням вкладу в світлорозсіювання часток великого, від 96 до 264 нм, та надвеликого, більш ніж 264 нм, розмірів судять про наявність порушення функціонального стану печінки. У разі потреби збереження отриманого супернатанту гомогенату печінки його однократно заморожують при температурі -20 °C і нижче, що дозволяє коректно зберегти основні його властивості до 2-х міс. Пропонований спосіб здійснюється таким чином. В експериментальної тварини при розтині проводиться забір шматочка тканини печінки масою 0,9-1,1 г, який гомогенізується при 5000 об/хв у 10 мл 0,9 % розчині натрію хлориду при температурі 0 °C протягом 5 хв, потім отриманий гомогенізат центрифугують на рефрижераторній центрифузі протягом 30 хв при 7000 об/хв і температурі 0 °C. Отриманий супернатант досліджують біофізичним методом ЛКС. У разі неможливості дослідження супернатанту гомогенату тканини печінки безпосередньо після центрифугування його відбирають у пробірку "епендорф", щільно закривають кришкою і занурюють її в морозильну 1 UA 70302 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 камеру при температурі -20 °C. У такому стані супернатант гомогенату тканини печінки може зберігатися до 2-х місяців. При необхідності пробірки виймають із морозильної камери, ставлять в термостат на 30 хв. Після цього досліджують біофізічним методом ЛКС. Допускається тільки одноразове розморожування супернатанта. Досліди проводилися згідно біоетичних вимог на 30 щурах-самцях лінії Вістар масою 180200 г розведення віварію Одеського національного медичного університету (ОНМедУ). Тварини утримувалися в звичайних умовах на стандартному харчовому раціоні. На щурах була відтворена лабораторна модель гострого токсичного гепатиту шляхом внутрішньоочеревинного (в/о) введення D-галактозаміну солянокислого у вигляді 20 % водного розчину із розрахунку 400 мг на 1 кг маси тіла. Щури були розподілені на 2 групи (n=12). Тваринам І групи (дослідна група) в/о одноразово вводився гепатотоксин, а потім протягом VII діб в/о середньотерапевтичною дозою вводилась нова координаційна біологічно активна речовина на основі оксіетилідендифосфонової кислоти, мікроелементів германію і купруму - купрумоксіетилідендифосфонатогерманат (медгерм). Щурам II групи (група порівняння) в/о одноразово вводився гепатотоксин, потім протягом VII діб 0,9 % розчин хлориду натрію. Усі БАР вводилися вранці о 9-10 годині. Як контроль використовували інтактних тварин (n=6), які не отримували ніяких біологічно активних речовин. За тваринами здійснювали спостереження впродовж VII днів гострого токсичного гепатиту. На І і VII у добу гострого галактозамінового гепатиту під легким ефірним наркозом проводили забій тварини (відповідно по 6 тварин з кожної групи). Сироватку крові отримували стандартним методом. Гомогенат тканини печінки готували згідно описаного вище способу. Сироватка крові та супернатант гомогенату печінки щурів піддавалися дослідженню біофізичним методом ЛКС на лазерному кореляційному спеткрометрі ЛКС-03. Оцінку отриманих результатів ЛКС-вимірів аналізували за допомогою спеціальної програми. Метод ЛКС-метрії дозволяє за коливаннями субфракційного складу проводити комплексну оцінку стану гомеостазу сироватки крові та тканини печінки. Внесок в світлорозсіювання часток різних розмірів виражався у відсотках. Розміри часток були об'єднані в п'ять дискретних зон (ДЗ): І - 0-11 нм, II-12-38 нм, III-39-95 нм, IV-96-264 нм, V - більш ніж 264 нм. Для пояснення способу на Фіг. 1-8 представлені усереднені гістограми спектрів відповідно сироватки крові (Фіг. 1-4) та супернатанту гомогенату тканини печінки (Фіг. 5-8) у тварин контрольної, дослідної груп та групи порівняння, де: Фіг. 1 - узагальнений ЛК-спектр сироватки крові у тварин контрольної групи; Фіг. 2 - узагальнений ЛК-спектр сироватки крові на І добу токсичного гепатиту; Фіг. 3 - узагальнений ЛК-спектр сироватки крові на VII добу токсичного гепатиту у тварин дослідної групи; Фіг. 4 - узагальнений ЛК-спектр сироватки крові на VII добу токсичного гепатиту у тварин групи порівняння. Фіг. 5 - узагальнений ЛК-спектр гомогенату тканини печінки у тварин контрольної групи; Фіг. 6 - узагальнений ЛК-спектр гомогенату тканини печінки на І добу токсичного гепатиту; Фіг. 7 - узагальнений ЛК-спектр гомогенату тканини печінки на VII добу токсичного гепатиту у тварин дослідної групи; Фіг. 8 - узагальнений ЛК-спектр гомогенату тканини печінки на VII добу токсичного гепатиту у тварин групи порівняння. За результатами ЛКС-дослідження сироватки крові встановлено, що у щурів контрольної групи основний вклад в світлорозсіювання склали частки від 39 до 95 нм (Фіг. 1). На І добу токсичного гепатиту у сироватці крові відмічено значне збільшення вкладу в світлорозсіювання часток надвеликого розміру (63,5 %) за рахунок часток малого, середнього та великого розмірів (Фіг. 2). На VII добу гепатиту у всіх тварин відмічена позитивна динаміка змін у ЛК-спектрах сироватки крові, яка виражалася у тому, що розподіл вкладу в світлорозсіювання знову наближався до такого у щурів контрольної групи (Фіг. 3, 4). Однак слід відзначити, що найбільш виражений зсув до нормальних ЛК-спектри сироватці крові відмічено у тварин, які на тлі гострого гепатиту в/о отримували медгерм (Фіг. 4). При ЛК-дослідженні супернатанту тканини печінки встановлено (Фіг. 5-6), що у щурів контрольної групи основний вклад в світлорозсіювання склали частки малого (від 12 до 38 нм) та середнього (від 39 до 95 нм) розмірів (Фіг. 5). На І добу токсичного гепатиту у супернатанті тканини печінки всіх тварин відмічено значне збільшення вкладу в світлорозсіювання часток великого та надвеликого розміру (21 і 32 % - відповідно) за рахунок зменшення вкладу у світлорозсіювання часток малого та середнього розмірів (Фіг. 6). На VII добу токсичного 2 UA 70302 U 5 10 15 20 25 30 35 гепатиту у тварин, які в/о отримували медгерм, відмічена значна позитивна динаміка змін у ЛКспектрах супернатанту гомогенату тканини печінки, яка виражалася в тому, що збільшувався вклад в світлорозсіювання часток малого та середнього розмірів (Фіг. 7). У тварин групи порівняння на VII добу токсичного гепатиту хоча й було відмічено підвищення вкладу у світлорозсіювання часток малого та середнього розмірів, однак вклад у світлорозсіювання часток великого та надзвичайно великого розмірів залишався значним (більш 30 %) (Фіг, 8). Результати дослідження є свідоцтвом того, що введення галактозам і ну супроводжується значними змінами у гомеостазі тварин. Підтвердженням тому є характерні зміни у ЛК-спектрах сироватки крові та супернатанту гомогенату тканини печінки на І добу після введення галактозаміну порівняно з тваринами контрольної групи. Такі зміни можуть бути розцінені як патогномонічні до гострого галактозамінового гепатиту. При подальшому дослідженні встановлено, що на VII добу гострого галактозамінового гепатиту ЛК-спектри сироватки крові наближалися до таких у тварин контрольної групи. Нормалізація ЛК-спектрів сироватки крові була більш вираженою у тварин, які в/о отримували медгерм. Динаміка змін у ЛК-спектрах супернатанту гомогенату тканини печінки була також позитивною, однак не настільки однозначною. На VII добу у тварин групи порівняння в ЛКспектрах супернатанту гомогенату тканини печінки зберігалося підвищення вкладу у світорозсіювання часток великого і надвеликого розмірів, яке вірогідно відрізнялося від контролю. В той же час, у тварин, які отримували медгерм, в ЛК-спектрах супернатанту гомогенату тканини печінки відмічено значну позитивну динаміку, і вони наближалися до таких у контрольній групі. Дослідження супернатанту гомогенату тканини печінки методом ЛКС дозволило виявити діагностичні зсуви у ЛК-спектрах при гострому токсичному ураженні печінки, а також за їх динамікою оцінити вплив медгерму на течію гострого токсичного гепатиту. Враховуючи, що дослідження проводиться безпосередньо у біоматеріалі, який отримано з її тканини, вказані результати більш специфічні і чутливі. Таким чином, запропонований спосіб у порівнянні з прототипом, дозволяє більш коректно оцінювати функціональний стан печінки при експериментальному гепатиті за рахунок безпосереднього дослідження тканини цього органу, є більш інформативним, достовірним і універсальним для оцінки порушень функціонального стану печінки при експериментальних дослідженнях. Джерела інформації: 1. Иванников И. О. Общая гепатология / И. О. Иванников, В. Е. Сюткин, В. М. Говорун // М. МАКС Пресе, 2002.-112 с 2. Доклинические исследования лекарственных средств: метод, рекомендации / Под ред. чл.-кор. АМН Украины А. В. Стефанова. — К., 2002.-567 с. 3. Андронов Д. Ю. Лазерна кореляційна спектроскопія крові як метод фармакологічного скринінгу: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. мед. наук: спец. 14.03.05 "фармакологія" / Д. Ю. Андронов. — Одеса, 2001.-19 с. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб оцінки функціонального стану печінки в експерименті за допомогою ЛКС-метрії, який відрізняється тим, що в якості досліджуваного матеріалу використовують гомогенат тканини печінки експериментальних тварин, якій центрифугують на протязі 25-30 хв при 7000 об/хв при температурі 0-4 °С, після чого отриманий супернатант у кількості 0,2 мл піддають дослідженню методом ЛКС і за підвищенням вкладу в світлорозсіювання часток великого, від 96 до 264 нм, та надвеликого, більш ніж 264 нм, розмірів судять про наявність порушення функціонального стану печінки. 3 UA 70302 U 4 UA 70302 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП ―Український інститут промислової власності‖, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5