Спосіб визначення присутності лептину або лептиноміметика

1. Спосіб визначення присутності лептину або лептиноміметика, який включає в себе приведення у контакт проби з клітиною або клітинною лінією, 2 (19) 1 3 77153 4 Ang-2, яка включає в себе промотор і щонайменше 13. Вектор, який включає у себе нуклеотидну посодин елемент лептинової відповіді, і репортерний лідовність, що кодує промоторну область Ang-2, ген, оперативно зв'язаний з областю промотору, яка містить промотор і щонайменше один елемент трансфекції клітини-хазяїна, яка експресує Ang-2 у лептинової відповіді, і репортерний ген, оперативвідповідь на лептин, інкубування у присутності но зв'язаний з областю промотору. зразка та кількісного визначення експресії репортерного гена звичайним способом. Даний винахід пов'язаний з системами аналізу для визначення активності лептину. Більш конкретно, винахід пов'язаний з аналізом in vitro лептину або агентів, які імітують біологічну активність лептину (тут: лептин імітуючі агенти, або лептиноміметики). Такий аналіз придатний для застосування, наприклад, при широкому скринінгу бібліотек молекул. Ожиріння, що визначається як надлишок жиру в організмі по відношенню до "пісної" маси тіла, асоційоване з психологічною та медичною хворобливістю, причому останнє включає у себе гіпертонію, підвищений рівень ліпідів у крові та інсулінонезалежний цукровий діабет або цукровий діабет типу II (NIDDM). У США нараховується 6-10 мільйонів індивідуумів з NIDDM, включаючи 18% популяції у віці 65 років [Kamel, UK, et al., Clin. Geriatr. Med., 1999, 15, 265]. Приблизно 45% чоловіків та 70% жінок з NIDDM мають ожиріння, причому при зниженні ваги вияви діабету у них суттєво полегшуються або ж зникають [Harris 1991, Diabetes Care, 14, 639]. Лептин, продукт гена гладкості [Zhang, Y., et al., 1994, Nature 372, 425], функціонує як периферичний сигнал для мозку, який регулює поглинання їжі та енергетичний обмін. Вважають, що лептин діє на гіпоталамус через свій рецептор, OB-R [Tartaglia, L. Α., et al., 1995, Cell 83, 1263]. У гризунів з мутаціями, які запобігають нормальній експресії або лептину, або повнорозмірного OB-R, спостерігаються сильне ожиріння, діабет та зниження швидкості метаболізму [Coleman, D. L. 1978, Diabetologia 14, 141]. Однак у людини ожиріння виникає, імовірніше за все, не у зв'язку з мутаціями в генах, що кодують лептин або OB-R [Considine, R. V., et al., 1995, J. Clin. Invest. 95, 2986: Considine. R. V., et al., 1996, Diabetes 19, 992]. Незважаючи на те, що мишам з мутантним геном гладкості можна повернути нормальну вагу шляхом введення рекомбінантного лептину [Pelleymounter, Μ, Α., et al., 1995, Science 269, 540: Halaas, J. L., et al, 1995, Science 269, 543; Campfield, L. Α., et al, Science 269, 546], малоймовірно, щоб такий підхід був успішним у застосуванні до людини з ожирінням, оскільки у неї рівні лептину у сироватці хронічно підвищені [Maffei, Μ., et al., 1995, Nature Med. 1, 1155; Considine, R. V., et al., 1996, N. Engl. J. Med. 334, 292; Sinha, M. K., et al., 1996, J. Clin. Invest. 98, 1277]. Таким чином, люди з ожирінням, імовірніше за все, є "лептинрезистентними" [Maffei, Μ., et al., 1995, Nature Med. 1, 1155; Flier, J. 5. & Elmquist, J. K. 1997, Nature Biotech. 15, 20; Campfield, L. Α., et al., 1996, Horm. Metab. Res. 28, 619] у тому відношенні, що у них не виробляється сигнал, пропорційний рівню лептину в їх сироватці, можливо, через дефект транспорту лептину через гематоенцефалічний бар'єр [Саго, J. F., et al., 1996, Lancet 348, 159] або неадекватну відповідь OB-R. Кількісні аналізи шляхів передачі сигналу OB-R можуть виявити альтернативні терапевтичні підходи до посилення відповідей OB-R для подолання резистентності до лептину та оборотності ожиріння. Лептин та OB-R є, відповідно, членами суперсімейств чотрьохспірального пучка цитокінез та рецепторів [Tartaglia, L. Α., et al., 1995, Cell 83, 1263; Madej, Т., et al., 1995, FEBS Lett. 373, 13]. OB-R має найбільшу схожість з передаючим сигнал рецептором gpl30, який активується цитокінами, такими як інтерлейкін 6 та CNTF, шляхи передачі сигналів яких інтенсивно досліджувалися [Kishimoto, Т., et al., 1992, Science 258, 593; Stahl. N. & Yancopoulos. G. D. 1994, J. Neurobiology 25, 1454]. Рецептори лептину транслюються у вигляді продуктів декількох альтернативних сплайсингів з різними цитоплазматичними доменами [Tartaglia, L. Α., et al., 1995, Cell 83, 1263; Lee, G.-H., et al., 1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al., 1996, Cell 84, 491; Cioffi, J. Α., et al., 1996, Nature Med. 2, 585; Wang, Μ. Υ., et al., 1996, FEBS Lett. 392, 87), але ймовірно, тільки одна ізоформа, відома як довга форма, або OB-Rb, здатна до опосередкування контролюючих вагу ефектів лептину (Lee, G.-H., et al., 1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al., 1996, Cell 84, 491; Ghilardi, N., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 6231; Baumann, H., et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 8374]. У діабетичних (db) мишей з ожирінням є мутація в OB-R, яка запобігає експресії довгої сплайсованої ізоформи OB-R, що робить їх нездатними відповідним чином опосередковувати дію лептину (Lee, G.-H., et al., 1996, Nature 379, 632; Chen, H., et al., 1996, Cell 84, 491]. Вивчення нових біологічно активних молекул, які використовуються як лікарські засоби для лікування небезпечних для життя захворювань, включає у себе дві основні операції: (і) більш або менш випадковий вибір молекули-кандидата, одержаної або шляхом хімічного синтезу, або шляхом виділення з природних джерел, і (іі) тестування молекули-кандидата на предмет виявлення у неї властивості або властивостей, що представляють інтерес. Цикл тестування незалежно повторюється доти, доки не буде ідентифікована молекула, яка має необхідні властивості. У більшості випадків типи молекул, які вибираються для тестування, частіше за все належать вузько визначеним хімічним класам. Наприклад, вивчення нових пептидних гормонів включає у. себе роботу з лептидами; 5 77153 6 вивчення нових терапевтичних стероїдів включає Традиційно випробування лептину проводили у себе роботу зі стероїдними ядрами. У результаті in vivo, ін'єкуючи його мишам ob/ob, а потім сповивчення нових функціональних молекул, яких у стерігаючи за їх втратою ваги. Таке біологічне виприроді безліч, майже завжди є надзвичайно трипробування є дуже обтяжливим, що не відтворювалим, стомлюючим, непередбачуваним та дороється та віднімає багато часу. Воно також не гим підприємством. підходить для застосування при широкомасштабУ нових теоріях про біологічну активність ному скринінгу бібліотек, що містять мільйони спостверджується, що біологічна активність, а отже, і лук. Крім цього, були описані також деякі простіші фізіологічні стани, є результатом явища молекусистеми аналізу. Наприклад, виявлення того, що лярного пізнавання. Наприклад, нуклеотиди здатні довга форма OB-R містить послідовність YXXQ утворювати комплементарні пари основ, так, що [Tartaglia, L. Α., et al., (1995) Cell 83, 1263], що є комплементарні одноланцюгові молекули гібридимотивом, який в точності зумовлює активацію зуються, утворюючи структури подвійної та потSTAT3 [Stahl, N., et al., (1995) Science 267, 1349], рійної спіралі, які, імовірніше за все, беруть участь дає можливість передбачити, що STAT3 є критичв регуляції експресії генів. Як інший приклад, біоним для відповідей, опосередкованих лептином. логічно активна молекула, названа лігандом, зв'яРезультати недавніх досліджень дозволили визується з іншою молекулою, звичайно макромолеявити, що STAT3 активується як у клітинах кулою, названою акцептор ліганду (наприклад, (Ghilardi, N., et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA рецептор або фермент), і таке скріплення спричи93, 6231; Baumann, H., et al., (1996) Proc. Natl. няє цілий ряд молекулярних явищ, які обов'язково Acad. Sci. USA 93, 8374; Rosenblum, C. I., et al., позначаться на фізіологічному стані, наприклад, (1996) Endocrinology 137, 5178], що культивуються, нормальному зростанні та диференціюванні клітак та in vivo [Vaisse, С, et al., (1996) Nature Gen. тин, аномальному зростанні клітин, яке веде до 14, 95] за допомогою довгої форми OB-R, але не канцерогенезу, регуляції тиску крові, вироблення укороченої (внаслідок процесінгу) форми OB-R та та поширення нервового імпульсу та ін. Скріпленне довгою формою OB-R з мутантним мотивом ня між лігандом та акцептором ліганду є геометриYXXQ [Baumann, Η., et al., (1996) Proc. Natl. Acad. чною характеристикою, виключно специфічною, Sci. USA 93, 8374; White, D. W., et al., (1997) J. Biol. що включає в себе відповідне аранжування трьоChera. 272, 4065]. [У патентній заявці РСТ хмірної структури та хімічні взаємодії. No.WO9857177] пропонується застосування актиВідтепер переважна стратегія розвитку агенвації STAT3 як основи для простого .біологічного тів, які можуть бути використані для лікування зааналізу лептину in vitro. Однак STAT3 активується хворювань, включає у себе виявлення форм лігатакож і багатьма іншими гормонами та цитокінами, ндів біологічних рецепторів, ферментів або включаючи IL-6, CNTF, інтерферон альфа та бета, споріднених макромолекул, які імітують такі лігангормон росту і багато інших цитокінів та поліпепди і або посилюють (тобто діють на зразок агоністидних гормонів. Отже, активація STAT3 не може тів), або гальмують (тобто діють як антагоністи) бути використана як специфічний маркер активноактивність, що виявляється акцептором або рецесті лептину. птором. Виявлення таких лігандів звичайно здійс[У заявці РСТ WO9740380] описується застонюється або шляхом випадкового скринінгу молесування касети ДНК, так званого "елемента лептикул (які продукуються шляхом хімічного синтезу нової відповіді". Прикріплення цієї касети ДНК до або виділених з природних джерел, [див., наприпромотору, такого як промотор тимідинкінази, та клад, K. Nakanishi, Acta Pharm. Nord., 1992, 4, 319репортерного гену, такого як [ген] люциферази, 328], або за допомогою так званого "раціональнозабезпечить відповідний репортерний вектор: Кліго" підходу, що включає в себе ідентифікацію ветини, які експресують рецептор лептину OB-Rb, дучої структури - звичайно, як правило, структури трансфікуються репортерним вектором. Такі клітинативного ліганду, і оптимізацію її властивостей ни пропонуються як засіб для аналізу лептину in внаслідок численних циклів структурних перебуvitro. Однак згідно [із заявкою РСТ WO9740380], дов та біологічного тестування [див., наприклад, що пропонується "елемент лептинової відповіді" Testa, В. & Kіеr, L.B. Med. Res. Rev. 1991, 11, 3548 ідентичний "послідовності гамма-активації", добре and Rotstein, S.H. & Mureko, M.A., J. Med. Chera. відомому елементу, який активується багатьма 1993, 36, 1700]. Оскільки більшість корисних лікаріншими цитокінами, і зокрема, інтерфероном гамських засобів була відкрита не внаслідок "раціонама, інтерфероном альфа та інтерфероном бета; льного" підходу, а шляхом скринінгу випадково Отже, в аналізах, заснованих на послідовності вибраних сполук, в цей час з'явився змішаний підгамма-активації, не можна буде відрізнити активхід до відкриття лікарських речовин, який заснованість лептиноміметика від активності, наприклад, ний на застосуванні комбінаторної хімії для побуінтерферономіметика. дови величезних бібліотек побудованих наздогад Ще один спосіб аналізу in vitro заснований на хімічних структур, які зазнають скринінгу з метою химерному рецепторі, що складається з позаклівиявлення специфічної біологічної активності. тинного домену OB-R, злитому з трансмембран[Brenner, S. & Lemer, R.A. Proc. Natl. Acad. Sci. ним доменом та з позаклітинним доменом репорUSA 1992, 89, 5381]. Будь-який скринінг таких ветерного рецептора, такого як рецептор IL-3. личезних бібліотек створених наздогад хімічних Показано, що IL-3-залежні клітини, які експресують структур повинен являти собою виправданий з вказаний химерний рецептор, можуть бути викоточки зору грошових витрат ефективний біологічристані для кількісного визначення лептину, який ний кількісний, аналіз, який піддавався б автомаздійснює промоцію клітинної проліферації. Таким тизуванню. чином, при експозиції з лептином вказані клітини 7 77153 8 будуть проліферовувати, і їх проліферацію можна чає в себе приведення проби у контакт з клітиною буде визначити шляхом забарвлення МТТ або ж або клітинною лінією, яка у відповідь на лептин шляхом включення радіоактивно міченого тимідиекспресує Ang-2, і кількісне визначення або Ang-2 ну [Verploegen SA, et al., 1997, FEBS Lett. 405, у культуральному середовищі, або клітинної РНК, 237]. Така система аналізу надійна, вона викорисщо кодує Ang-2, або активації промотору Ang:2. товується. для кількісного визначення лептину і Переважно використати еукаріотичну клітину придатна для широкомасштабного скринінгу. Одабо клітинну лінію, більш переважно - клітину або нак молекули, відібрані у результаті такого широклітинну лінію ссавця. комасштабного скринінгу на основі вказаного анаВідповідними лініями клітин є, наприклад, лінії лізу, можуть взагалі не бути лептиноміметиками. клітин диференційованих адипоцитів миші, наприБуло показано, наприклад, що агент, який є дійсклад,, лінія мишачих преадипоцитів Swiss 3T3 ним інсуліноміметиком, виявлений у результаті F442A, або лінії клітин людини, наприклад, лінія широкомасштабного скринінгу, реалізовує свою стромальних клітин кісткового мозку людини дію шляхом взаємодії з цитоплазматичним домеhMS2-12. ном інсулінового рецептора [Zhang В., et al., 1999, Відповідно до винаходу, кількісне визначення Science 284, 974]. Отже, існує ризик, що молекули, Ang-2 проводять звичайним способом у культуравідібрані за допомогою химерних рецепторів, тальному середовищі з використанням твердофазких як вказаний химерний рецептор лептин-1L-3, ного імуноферментного аналізу (ELISA), який будуть взаємодіяти з цитоплазматичним доменом, включає в себе моноклональні та поліклональні одержаним з химерного IL-3, а отже, будуть являантитіла проти Ang-2. ти собою швидше міметики IL-3, ніж лептиномімеТакий метод ELISA можна адаптувати до сутики. Отже, такий шлях аналізу не придатний для часних методів скринінгу, таких як широкомасштаскринінгу імітуючих лептин агентів, лептиномімебний скринінг. тиків. Наявність Ang-2-PHK визначається у клітинах, Лептин, продукт гена гладкості, експресується що культивуються, або клітинних лініях звичайним в адипоцитах та регулює поглинання їжі та енергеспособом з використанням ланцюгової реакції потичний обмін через свій гіпоталамічний рецептор лімерази зворотної транскрипції (RT-PCR). OB-Rb. Відсутність лептину, як у випадку мишей Активацію промотору ANG-2 реєструють, відob/ob, або ж відсутність OB-Rb, як у випадку миповідно до даного винаходу, шляхом створення шей db/db, приводить до хворобливої повноти. конструкції, яка містить область промотору Ang-2, Однак найбільш поширені випадки ожиріння у люяка включає в себе промотор і щонайменше один дини, не пов'язані з дефіцитом лептину. Фактично елемент лептинової відповіді, а також репортеррівень лептина у сироватці корелює з показником ний ген, оперативно зв'язаний з областю промотомаси тіла, а отже, гладкі індивідууми мають висору, переважно вбудованою у відповідний вектор, кий рівень лептину у сироватці. Така кореляція дає трансфікуючий клітину хазяїна, яка експресує Angпідставу вважати, що ожиріння асоціюється з де2 у відповідь на лептин, шляхом інкубування'з якою формою резистентності до лептину. Одним з пробою та кількісного визначення експресії репорможливих механізмів резистентності до лептину є терного гена звичайним способом. нездатність лептину долати гематоенцефалічний Даний винахід також забезпечує вектор, який бар'єр. Дійсно, інтрацеребровентрикулярне ввемістить нуклеотидну послідовність, що кодує продення лептину було значно більш ефективним у моторну область Ang-2, яка містить промотор і зменшенні маси жирової тканини у гризунів в поріщонайменше один елемент лептинової відповіді, і внянні з периферичними шляхами введення лепрепортерний ген, оперативно зв'язаний з областю тину. промотору. Одержання лептиноміметиків, які можуть доВідповідно до даного винаходу, одержані сполати гематоенцефалічний бар'єр, може вирішити соби аналізу лептину in vitro. Такі способи підхопроблему лептинорезистентності. Для цієї цілі дять для широкомасштабного скринінгу лептинокорисно зробити скринінг бібліотек, що складаютьміметиків. Виявлено, що лептин специфічно ся з нікомолекулярних агентів, з метою ідентифііндукує експресію гена ангіолоетину-2 у жирових кації індивідуальних агентів, які мають активність клітинах, що культивуються. Широкомасштабний лептиноміметиків. Для такого скринінгу потрібний скринінг агентів, що імітують дію лептину, досягапростий та специфічний біологічний аналіз активється шляхом кількісного визначення рівня, секреності лептину. Таким чином, як описано вище, біоції ангіопоетину-2, що індукується лептином, за логічна активність лептину може бути визначена допомогою твердофазного імуноферментного тільки шляхом випробування на тваринах. Такі аналізу (ELISA). Альтернативно, активність лептивипробування є вельми обтяжливими, і отже, не ну може бути встановлена шляхом вимірювання підходять для скринінгу бібліотек, які складаються активації промотору ангіопоетину-2, зв'язаного з з мільйонів різних речовин. Було описано декілька репортерним геном та вбудованого у жирові клітиваріантів випробувань in vitro, але вони не були ни, що культивуються. лептиноспецифічними. Отже, існує необхідність Відповідно до даного винаходу, одержані спостворення простого та специфічного методу аналісоби аналізу лептину, in vitro. Такі способи - підхозу активності лептину, який легко можна буде авдять також для широкомасштабного скринінгу лептоматизувати. тиноміметиків. [У патентній заявці Ізраїлю Даний винахід, таким чином, забезпечує споNo.131739, що спільно розглядається, поданій 5 сіб визначення наявності лептину або агента, що вересня 1999], описано, що лептин специфічно імітує дію лептину (лептиноміметика), який вклюіндукує експресію гена ангіопоетину-2 в адипоци 9 77153 10 тах, що культивуються. У відсутність лептину ангікон'югати використовують козячі антитіла проти опоетин-2 в адипоцитах, що культивуються, не імуноглобуліну кролика, кон'юговані з пероксидаекспресується, а індукція ангіопоетину-2 під дією зою або з лужною фосфатазою. Планшети ELISA лептину є дуже інтенсивною і дуже специфічною. інкубують протягом 1-16- годин, промивають і виОтже, можна кількісно визначити активність лепявляють додаванням відповідного субстрату. Пістину та лептиноміметика, обробивши відповідні ля цього вказані планшети ELISA піддають автоеукаріотичні клітини різними дозами лептину або матизованому широкомасштабному скринінгу. агентів, що імітують лептин, і потім визначивши В іншому втіленні даного винаходу у вказаних або рівень ангіопоетину-2 у культуральному сереклітинах, що культивуються, оброблених лептином довищі, або визначивши клітинну мРНК, що кодує або лептиноміметиком, визначали мРНК, що кодує ангіопоетин-2, або вимірявши активацію промотоангіопоетин-2. Специфічну мишачу мРНК, що кору ангіопоетину-2. Вказаними відповідними клітидує ангіопоетин-2, можна визначити за допомогою нами ссавців можуть бути будь-яка клітина або ланцюгової реакції полімерази зворотної трансклінія клітин, експресуючих ангіопоетин-2 у відпорипції (RT-PCR). Широкомасштабну RT-PCR можвідь на обробку лептином. Звичайно переважними на реалізувати, наприклад, з використанням спеклітинами хазяїв є зручні для культивування еукацифічних "молекулярних маяків" (Research ріотичні клітини, переважно клітини ссавців, і в Genetics; Huntsville Alabama, USA). Існують одноособливо переважному варіанті це диференційоланцюгові олігонуклеотиди, що містять одночасно і вані мишачі адипоцити. Найбільш переважною флуоресцентну мітку, і гасник (флуоресценції) на лінією клітин є лінія Swiss 3T3 F442A мишачих їх 5'- та 3'-кінцях, відповідно. Олігонуклеотид сконпреадипоцитів [Green, Η., and Kehinde, О., 1975, струйований таким чином, щоб включати в себе Cell 5, 19], які-диференціюються в зрілі адипоцити послідовність шпилькової петлі, комплементарну в умовах підтримки конфлуентних клітин у середопослідовності кДНК ангіопоетину-2. Крім того, вищі, доповненому 10% ембріональною бичачою конструкція олігонуклеотида повинна включати у сироваткою (ЕБС), протягом шести днів. Іншою себе стовбурову" структуру шпилькової петлі, так, найбільш переважною лінією клітин є лінія строщо коли молекулярний маяк не зв'язаний з PCRмальних клітин кісткового мозку, людини, hMS2-12, ампліфікованою кДНК ангіопоетину-2, флуорофор які експресують рецептор лептину і можуть бути гаситься 3'-гасником внаслідок передачі енергії, і індуковані до диференціювання в·адипоцити флуоресценція не виникає. Однак якщо додати [Thomas Т., et al., 1999; Endocrinology 140, 1630]. PCR-ампліфіковану кДНК ангіопоетину-2, комплеБагато із загальнодоступних способів, що звиментарна петля молекулярного якоря утворює чайно застосовуються можуть бути адаптовані більш сильний зв'язок з PCR-продуктом-мішенню, фахівцями для визначення ангіопоетину-2 у кульніж зі стовбуром. Така гібридизація приводить до туральному середовищі, клітинної мРНК, що кодує конформаційної зміни, яка відділяє стовбур і яка ангіопоетин-2, або для кількісного визначення акприводить до виникнення флуоресценції [Tyagi S., тивації промотору ангіопоетину-2. В одному з асand Kumar F.R., 1996, Nature Biotech., 1649]. пектів даного винаходу розроблений метод тверДля виконання аналізу клітини, які експресудофазного імуноферментного аналізу (ELISA) для ють ангіопоетин-2 у відповідь на обробку лептикількісного визначення мишачого ангіопоетину-2. ном, вирощують, наприклад, у 96-ямкових планДля розробки методу ELISA потрібне мишаче мошетах. Зразок лептину (нозитивний контроль) або ноклональне антитіло для захоплення ангіопоетипередбачуваний лептино-міметик додають до куну-2 на планшеті ELISA. Очищене моноклональне льтури, і протягом 24-96 годин проводять інкубуантитіло використовується як первинне покриття вання. Потім планшети промивають, і з моношару планшета ELISA, щоб захопити Ang-2 з культураклітин екстрагують тотальну РНК. Проводять звольного супернатанта. У тварин-хазяїв (наприклад, ротну транскрипцію РНК за допомогою випадково у кролика) одержане поліклойальне антитіло проти вибраного праймера, і одержану у результаті кДНК ангіопоетину-2. Потрібно зазначити, що ангіопоепіддають кількісній PCR зі специфічними мишачитин-2, щo використовується при отриманні антитіл, ми ангіопоетин-2-праймерами. Кількість ангіопоеповинен бути одержаний у того ж самого виду, що тин-2-мРНК відображає кількість PCR-продуктуі клітинна лінія, яка використовується для його мішені, яка вимірюється за допомогою вказаного індукції під дією лептину. Для виконання аналізу молекулярного маяка. Всі стадії такого аналізу клітини, які експресують ангіопоетин-2 у відповідь допускають проведення автоматизованого широна дію лептину, вирощують, наприклад, у 96комасштабного скринінгу. ямкових планшетах. Зразок лептину (позитивний В іншому переважному втіленні людський або контроль) або передбачуваний лептиноміметик мишачий промотор ангіопоетину-2 ідентифікували додають до культури, і протягом 24-96 годин прота клонували з геномної ДНК способом, відомим водять інкубування. Потім відбирають аліквоти фахівцям у даній області. Вказаний промотор та культурального середовища і переносять їх на репортерний ген переважно об'єднували у тандем планшети ELISA, які були заздалегідь покриті вкау реплікованому експресуючому векторі ссавців. заним захоплюючим моноклональним антитілом, Однак можуть зустрічатися послідовності, які не специфічним у відношенні ангіопоетину-2. Планзаважають функціонуванню промотору ангіопоешети ELISA інкубують протягом 1-16 годин, протину-2. Репортерним геном може бути будь-який мивають і додають вказане поліклональне антитіген, що кодує пептид, який легко піддається реєстло проти ангіопоетину-2. Планшети ELISA руванню або ж дозволяє легко реєструвати трансінкубують протягом 1-16 годин, промивають, і докрипцію або трансляцію. Звичайно він кодує білок, дають кон'югат фермент-антитіло. Звичайно як який у клітині-хазяїні у природі не існує або ж про 11 77153 12 дукується у клітині-хазяїні в малих кількостях. Припланшетах. Зразок лептину (позитивний-контроль) клади добре відомих репортерних генів включають або передбачуваний лептиноміметик додавали до у себе ген хлорамфеніколацетилтрансферази культури у кінцевій концентрації 1мікрограм/мл, і (CAT), зелений флуоресцентний білок (GFP), люпродовжували інкубувати протягом 24 годин. Потім циферази (або бактерійної, або люциферази світвідбирали аліквоти індукованого лептином або ляка), та інші системи реєстрації на основі фермелептиноміметиком культурального середовища та нтів, таких як бета-галактозидаза, лужна переносили їх на планшети ELISA, які були заздафосфатаза та їм подібних. В особливо переважлегідь покриті вказаним захоплюючим моноклонаному втіленні репортерним геном є ген люцифельним антитілом, специфічним у відношенні мирази. шачого ангіопоетину-2. Мікротитраційні планшети Конструкція репортерного гена включає в себе (Dynatech or Maxisorb, by Nunc) покривали антиа) область промотору ангіопоетину-2, яка містить мишачим моноклональним антитілом проти ангіопромотор і щонайменше один елемент лептинової поетину-2 (безсироватковий супернатант гібридовідповіді, та b) репортерний ген, оперативно зв'ямних клітин або імуноглобуліни асцитної рідини) та заний з областю промотору. її переважно вміщувитримували протягом ночі при 4°С. Планшети ють у відповідний вектор, що, використовується промивали PBS, який містить ЕБС (0,5%) та Tween для трансфекції клітини-хазяїна. Вектором може 20 (0,05%), і замикали у тому самому розчині щослужити будь-який відомий вектор, включаючи найменше на дві години при 37°С. Потім відбирали плазміди, косміди та вірусні вектори, які можуть аліквоти індукованого лептином або лептиномімефункціонувати у вибраній клітині-хазяїні. Такий тиком культурального середовища, і переносили їх вектор складає ще один аспект даного винаходу. на планшети ELISA (100мікролітрів/ямку) на 4 гоКлітиною хазяїном може бути буд-яка клітина або дини при 37°С. Потім планшети тричі промивали клітинна лінія, яка експресує ангіопоетин-2 у відPBS, який містить Tween 20 (0,05%), а потім додаповідь на обробку лептином. Така клітина стабільвали кролячу антисироватку проти мишачого ангіно або транзитно трансфікується вказаним репоропоетину-2 (1:1000, 100 мікролітрів/ямку) і продовтерним вектором. Звичайно переважною клітиноюжували інкубувати протягом ночі при 4°С. хазяїном є зручна для культивування еукаріотична Планшети тричі промивали, після чого у кожну клітина, переважно клітина ссавця, і в особливо ямку додавали кон'югат антикролячих козячих анпереважному втіленні це диференційований адититіл з пероксидазою хрону (HRP, Jackson Labs. поцит миші. Найбільш переважною лінією клітин є 1:10,000, 100мікролітрів/ямку), і інкубували протялінія преадипоцитів миші Swiss 3T3 F442A [Green, гом 2 годин при кімнатній температурі. Планшети Η., and Kehinde, О., 1975, Cell 5, 19], яка диференчотири рази промивали, після чого забарвлення ціюється у зрілі адипоцити при підтриманні конфрозвивалося під дією AETS (2,2'-азино-біс(3луентних клітин у середовищі, доповненому 10% етилбензтіазолін-6-сульфонової кислоти, Sigma), з ембріональною бичачою сироваткою (ЕБС), протявикористанням Н2О2 як субстрату. Планшети готогом шести днів. ві для зчитування за допомогою автоматичного Для проведення аналізу клітину або клітинну зчитуючого пристрою для ELISA. лінію, яка експресує ангіопоетин-2 у відповідь на Приклад 2 обробку лептином, стабільно" або транзитно Аналіз лептину та лептиноміметиків за допотранcфікують вказаним репортерним вектором. могою RT-PCR ангіопоетину-2 Вказані клітини зростають у 96-ямкових планшетах Мишачі клітини Swiss ЗТЗ F442A піддавали та диференціюються. Зразок лептину (позитивний зростанню та диференціюванню у 96-ямкових контроль) або передбачуваний лептиноміметик планшетах. Перед стимуляцією лептином клітини додають до культури, і інкубація продовжується. підтримували у середовищі з низьким вмістом сиЧерез 24-96 годин у ямках визначають рівень пророватки (0,5%) протягом 16 годин. Лептин дукту репортерного гена. У цьому аналізі актива(1мікрограм/мл (позитивний контроль)) або, пецію промотору ангіопоетину-2 визначають шляхом редбачуваний - лептиноміметик додавали до кулькількісного визначення продукту гена вказаної тури та продовжували інкубувати протягом 24 гоконструкції репортерного гена. Таким чином, рідин. Планшети осушували, і за допомогою набору вень продукту гена відповідає рівню активності реагентів TRJ (Molecular Research Center Inc.) лептину або лептиноміметика. виділяли тотальну РНК. Зворотну транскрипцію Далі даний винахід ілюструється наступними проводили у 20мікролітрових об'ємах за допомоприкладами, які ніяким чином не закликають обгою зворотної транскриптази FT-РНКази межити обсяг винаходу. Навпаки, вони наведену (Superscript II, GIBCO-BRL, USA), використовуючи для кращого з'ясування того, що дане рішення 1мкг випадково вибраного праймера (N)6 (New може включати в себе і інші питання, модифікації England Biolabs. USA). Аліквоту (2мікролітри) прота їх еквіваленти, які після ознайомлення з даним дукту зворотної транскрипції використовували для описом можуть самі напрошуватися фахівцям у PCR з ДНК-полімеразою VENT (New England даній області, не виходячи за рамки даного винаBiolabs) та зі смисловим та антисмисловим прайходу і/або обсягу прикладеної формули винаходу. мерами: ти-ангіопоетин-2-мРНК, AF4326.gb_ro, Приклади нуклеотиди 637-657 та 1147-1167, відповідно. ТеПриклад 1 рмінування реакцій PCR проводили до насичення. Кількісний аналіз лептину та лептиноміметиків Продукти PCR виділяли, у 1Μ NaCl денатурували за допомогою ELISA ангіогіоетину-2 при 72°С та проводили гібридизацію при 52°С з Мишачі клітини Swiss 3T3 F442A піддавали утворенням молекулярного маяка, що має наступзростанню та диференціюванню у 96-ямкових ну структуру: 13 77153 14 5'-родамін-GCTGAGбачуваного лептиноміметика додавали до культуCTGGAGAAGAAGCTGGTGACA-CTCAGC-3'ри та продовжували інкубувати. Поява зеленої дабцил. флуоресценції вказувала на те, що клітинна кульПетля відповідає нуклеотидам 898-918 мишатура відповідала на дію лептину або агента, що чої мРНК ангіопоетину-2, реєстраційний імітує дію лептину. NO.AF004326, а температура плавлення (Тm) Приклад 4 структури стовбур-петля становить 61,6°С. Аналіз лептину або лептиноміметиків за допоФлуоресцентна проба відповідає тим культумогою репортерного вектора рам, які у відповідь на дію лептину експресували Стромальні преадипоцити людини hMS2-12 мРНК ангіопоетину-2. стабільно трансфікували репортерним вектором, Приклад 3 що складається з повної області промотору людАналіз лептину та лептиноміметиків за допоського ангіопоетину-2 навпроти гена зеленого могою репортерного вектора флуоресцентного білка (GFP). Клітини піддавали Мишачі преадипоцити Swiss ЗТЗ F442А стабізростанню та диференціюванню у 96-ямкових льно трансфікували репортерним вектором, що планшетах. Зразок лептину (позитивний контроль) складається з повної області, промотору мишачого або передбачуваного лептиноміметика додавали ангіопоетину-2 навпроти гена зеленого флуоресдо культури та продовжували інкубувати. Поява центного білка (GFP). Клітини піддавали зростанзеленої флуоресценції вказувала на те, що клітинню та диференціюванню у 96-ямкових планшетах. на культура відповідала на дію лептину або лепЗразок лептину (позитивний контроль) або передтиноміметика. Комп’ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601