Спосіб відтворення гетерозиготних форм вищих рослин (варіанти)

1. Спосіб відтворення гетерозиготних форм вищих рослин, що включає отримання гомозигот C2 2 (19) 1 3 розиготної форми, незалежно від способу її отримання. У відомому способі можливе відтворення тільки гетерозиготних форм, отриманих у результаті схрещування гомозиготних ліній, а гетерозиготні рослини, отримані в інший спосіб, не можуть бути відтворені, оскільки при самозапиленні відбувається перерозподіл генів внаслідок кросинговеру та незалежного розходження рекомбінованих хромосом, що призводить до неможливості відновлення гетерозиготного генотипу ідентичного вихідному. В основу винаходу поставлено задачу розширення спектру гетерозиготних форм вищих рослин, що можуть бути відтворені при застосування способу, шляхом створення гомозиготних ліній, - або використовуючи культуру мікроспор чи макроспор in vitro, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, - або використовуючи механізми апоміксису in vivo, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, - відбору серед створених гомозиготних ліній таких пар, щоб кожна з ліній в парі несла одну із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини, а генотипи ліній відібраної пари у сукупності відповідали генотипу вихідної гетерозиготної рослини та відновлювали його при схрещуванні. Поставлена задача вирішується тим, що у способі відтворення гетерозиготних форм вищих рослин, який включає отримання гомозиготних ліній із гетерозиготних рослин, схрещування гомозиготних ліній та оцінку отриманих гетерозиготних рослин, розмноження гомозиготних ліній та відтворення гетерозиготної форми шляхом схрещування, відповідно до винаходу, із гетерозиготної форми, яку необхідно відтворити отримують гомозиготні лінії шляхом, - або використовуючи культуру мікроспор чи макроспор in vitro, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, - або використовуючи механізми апоміксису in vivo, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, - далі з отриманих гомозиготних ліній підбирають пари ліній так, що кожна з ліній в парі несе одну із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини, а їх генотипи у сукупності відповідають генотипу вихідної гетерозиготної рослини і відновлюють його при схрещуванні. Запропонований спосіб характеризується такими суттєвими ознаками: отримання гомозиготних ліній із гетерозиготних рослин, - або використовуючи культуру мікроспор чи макроспор in vitro, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, - або використовуючи механізми апоміксису in vivo, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, 91861 4 - підбір пар ліній так, що кожна з ліній в парі несе одну із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини, а їх генотипи у сукупності відповідають генотипу вихідної гетерозиготної рослини та відновлюють його при схрещуванні, схрещування гомозиготних ліній та проведення оцінки отриманих гетерозиготних рослин, розмноження ліній, які є батьківськими формами відібраних на основі оцінки гетерозиготних рослин, відтворення гетерозиготної форми шляхом схрещування. Нові, відмінні від прототипу, ознаки забезпечують відтворення гетерозиготних форм незалежно від способу їх отримання - як тих, що отримані внаслідок схрещування гомозиготних ліній так і тих, які отримані в інший спосіб, а також значне скорочення часу на отримання та відтворення гетерозиготної форми, оскільки відсутня необхідність проводити інбридинг протягом 8-10 поколінь для отримання гомозиготних ліній. Методика культивування мікро- та макроспор в умовах in vitro є одним із сучасних способів вирішення ряду питань практичної селекції, розмноження та підтримання певних рослинних форм (Vratislav Kucera, Miroslava Vyvadilova and Miroslav Klima (2002) Utilisation of doubled haploids in winter oilseed rape (Brassica napus L.) Breeding. Czech J. Genet. Plant Breed., 38: 50-54). Сутність даного підходу полягає у використанні явища тотіпотентності та високої регенераційної здатності, що притаманні рослинним мікро та макроспорам (Dunwell, J.M. (1985) Anther and ovary culture. In S.W.J. Bright and M.G.K. Jones (ed.) Cereal tissue and cell culture. Matinus Nijhoff/Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, the Netherlands. P. 1-44). Мікро та макроспори рослинних організмів утворюються у процесі мейозу і регенеровані з них рослини є гаплоїдними, що відображається на їх фенотипі та фертильності. Для більшості практичних цілей необхідно подвоювати гаплоїдний набір хромосом створюючи дигаплоїдні рослини (Weiguo Liu, Ming Y. Zheng, Enrique A. Polle and Calvin F. Konzak (2002) Highly efficient doubled-haploid production in wheat (Triticum aestivum L.) via Induced microspore embryogenesis. Crop Science, 42: 686-692). Це дозволяє у способі відтворення гетерозиготних форм із однієї гетерозиготної рослини отримати достатню кількість диплоїдних ліній для подальшого підбору пар ліній так, що кожна з ліній в парі несе одну із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини. Імовірність підібрати комплементарну лінію у рослин, які мають 10 хромосом у галоїдному наборі, при блокуванні обміну ділянками між хромосомами, складає 1/2048. Кросинговер - одне із ключових явищ, яке лежить в основі рекомбінації генетичного матеріалу. Це явище включає ряд послідовних процесів: кон'югація хромосом, утворення бівалентів, утворення хіазм, гомологічна рекомбінація. У нормі кросинговер забезпечує рекомбінацію генетичного матеріалу в межах гомологічних хромосом. Репресія експресії генів, які контролюють ці процеси на різних рівнях та активності відповідних ферментів призведе до відсутності обміну ділянками між гомологічними хромосомами. Наприклад, 5 на сьогодні розроблені методи репресії експресії генів (Patent No: US 6,573,099 В2 Genetic construction for delaying or repressing expression of a target gene). Існують і більш прості шляхи попередження обміну ділянками між гомологічними хромосомами. Так, при пригніченні функціонування клітин тапетуму пшениці, жита, кінських бобів та цибулі 0,04% НСІ спостерігався повний асинапсис хромосом. Індукований асинапсис спостерігали і інші дослідники при дії низькими та високими температурами та хімічними речовинами (цит. по Константинов «Мейоз» Мн., Изд-во. БГУ 1971). Це дозволяє отримати дигаплоїдні форми, хромосоми яких успадковані цілісно без змін. Рекомбінація відбувається лише на рівні незалежної сегрегації хромосом. Гомологічні хромосоми диплоїдного організму, за виключенням дигаплоїдних ліній, різняться одна від одної послідовністю нуклеотидів у молекулі ДНК. На сьогодні розроблено велику кількість молекулярно-генетичних методик, які дозволяють розрізнити відмінні за нуклеотидним складом молекули ДНК. Наприклад SSR-PCR придатний для ідентифікації молекули ДНК хромосоми, оскільки ДНК еукаріотів містять прості повтори нуклеотидів, а хромосоми мають поліморфізм за кількість мотивів у повторах (наприклад мотив (GGT) може повторюватись 22 рази в одній хромосомі та 29 разів в гомологічній). Це дозволяє, використавши олігонуклеотидні праймери, ампліфікувати ділянки повторів та методом гель-електрофорезу визначити їх довжину (А.Е. Солоденько, А.В. Саналатий, Ю.М. Сиволап Идентификация генотипов подсолнечника с помощью микросателитных маркеров // Цитология и генетика № 2.- 2004). Найбільш придатним для ідентифікації гомологічних хромосом є метод SNP (single nucleotide polymorphism) аналізу, що дозволяє ідентифікувати поліморфізм на рівні одного нуклеотиду, який властивий гомологічним молекулам ДНК (Giancola S, McKhann HI, Berard A, Camilleri C, Durand S, Libeau P, Roux F, Reboud X, Gut IG, Brunei D. Utilization of the three high-throughput SNP genotyping methods, the GOOD assay, Amplifluor and TaqMan, in diploid and polyploid plants //Theor Appl Genet. 2006 Apr; 112(6): 111524. Epub 2006 Feb 2.). Методи SSR-PCR та/або SNP-аналізу дозволяють розрізнити яка із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини потрапила до конкретної дигаплоїдної рослини і на основі цього підібрати пари ліній, кожна з яких буде нести одну із гомологічних хромосом вихідного гетерозиготного організму. По п. 1 спосіб здійснюють таким чином: Гетерозиготну рослину кукурудзи, яку необхідно відтворити, вирощують в ґрунті. В період цвітіння кукурудзи волоть занурюють у розчин 0,04% НСІ. Проводять цитологічне дослідження мейозу в пиляках і відмічають ті квітки, де спостерігається асинапсис. Потім волоті з такими квітками збирають на одноядерній або ранній двоядерній стадії формування мікроспор, загортають у вологий паперовий рушник та алюмінієву фольгу і витримують при температурі +4°С протягом 14 днів. Колоски відділяють від волоті та стерилізують 15 хвилин у 2,5 % розчині гіпохлориду натрію з дода 91861 6 ванням детергенту. Матеріал 3 рази відмивають у стерильній дистильованій воді. Для виділення мікроспор з пиляків, останні обробляють 0,44 М розчином сахарози та фільтрують отриману суміш через фільтр з розміром пор 100 мкм. Фільтрат центрифугують у градієнті щільності перкола (10, 15 та 30% у 0,44% розчині сахарози) та відбирають життєздатні мікроспори, культивують та отримують дигаплоїдні рослини згідно методик, що описані (Ingrid E. Aulinger Combination of in vitro androgenesis and biolistic transformation: an approach for breeding transgenic maize (Zea mays L.) lines. A dissertation for the degree of Doctor of Natural Sciences, Zurich, 2002 P. 32-33) та (Guichang Zhang, Connie M. Williams, Mary K. Campenot, Locksley E. McGann and David D. Cass (1992) Improvement of longevity and viability of sperm cells isolated from pollen of Zea mays L. Plant Physiol. 100, 47-53). Із отриманих дигаплоїдних рослин та вихідної гетерозиготної рослини екстрагують ДНК. Проводять полімеразну ланцюгову реакцію із олігонуклеотидними праймерами до SSR локусів і розподіляють продукти ампліфікації методом гельелектрофорезу. На основі отриманих даних визначають за якими SSR локусами вихідна рослина була гетерозиготною і відбирають пари ліній, які містять різні алелі даного локусу. При цьому SSR локуси повинні бути локалізовані у всіх 10 хромосомах кукурудзи не менше, ніж по 2 локуси на кожному плечі хромосоми. На основі отриманих даних визначають групи зчеплення алелів SSR локусів і відбирають дигаплоїдні рослини, хромосоми яких були сформовані без кросинговеру у мейозі вихідної рослини. Підбирають пари ліній так, щоб кожна з ліній в парі несла одну із гомологічних хромосом вихідного гетерозиготного організму. Рослини адаптують до умов in vivo і пересаджують у грунт. Проводять самозапилення рослин і в наступному поколінні схрещують їх у межах підібраних пар. У наступному поколінні проводять вивчення гібридів та ліній і відбирають ті, які найбільш придатні для відтворення вихідного гетерозиготного генотипу в польових умовах. Відібрані лінії розмножують в польових умовах до необхідних об'ємів і схрещують на ділянках гібридизації. Отримують гібридне насіння, генотип зародків якого відповідає генотипу вихідної гетерозиготної форми. По п. 2 спосіб здійснюється таким чином: Гетерозиготну рослину кукурудзи, яку необхідно відтворити, вирощують в грунті. В період цвітіння кукурудзи волоть занурюють у розчин 0,04% НСІ. Проводять цитологічне дослідження мейозу в пиляках і відмічають ті квітки, в яких спостерігається асинапсис. Потім із цих квіток збирають пилок, наносять його на попередньо ізольовані жіночі суцвіття рослин кукурудзи, гомозиготних за рецесивним геном igl (indeterminate gametophytel), який обумовлює андрогенез та гомозиготні за домінантним геном Вх (benzoxazinlessl), який обумовлює фіолетове забарвлення сходів FeCl3. Гомозиготність за геном igl обумовлює утворення на даній рослині насіння шляхом андрогенезу, а маркерний ген дозволяє розрізнити рослини, сформовані 7 91861 внаслідок нормального статевого розмноження (мають прояв домінантного гена - забарвлюються) і гаплоїдні андрогенні рослини (рослини дикого типу - не забарвлюються). Збирають насіння і пророщують на фільтрувальному папері. Відбирають форми за маркерним геном, і проводять додатково цитологічні дослідження кінчиків коренів для визначення рівня плоїдності рослин. Проводять диплоїдизацію. Із отриманих дигаплоїдних рослин та вихідної гетерозиготної рослини екстрагують ДНК. Проводять полімеразну ланцюгову реакцію із олігонуклеотидними праймерами до SSR локусів і розподіл продуктів ампліфікації методом гельелектрофорезу. На основі отриманих даних визначають за якими SSR локусом вихідна рослина була гетерозиготною і відбирають пари ліній, які містять різні алелі даного локусу. При цьому SSR локуси повинні бути локалізовані у всіх 10 хромосомах кукурудзи не менш, ніж по 2 локуси на кожному плечі хромосоми. На основі цих же даних визначають групи зчеплення алелів SSR локусів і відкидають дигаплоїдні рослини, хромосоми яких були сформовані внаслідок кросинговеру у мейозі вихідної рослини. Підбирають пари ліній так, щоб кожна з ліній в парі несла одну із гомологічних хромосом вихідного гетерозиготного організму. Рослини адаптують до умов in vivo і пересаджують у грунт. Проводять самозапилення рослин і в наступному поколінні схрещують їх у межах підібраних пар. У наступному поколінні проводять вивчення гібридів та ліній і відбирають ті, які найбільш придатні для відтворення вихідного гетерозиготного генотипу в польових умовах. Відібрані лінії розмножують у польових умовах до необхідних об'ємів і схрещують на ділянках гібридизації. Отримують гібридне насіння, генотип зародків якого відповідає генотипу вихідної гетерозиготної форми. Порівняльна характеристика варіантів здійснення винаходу: Пункт формули 1 Матеріальні затрати більші, ніж при 2 пунктах здійснення винаходу, в зв'язку із використанням культури мікроспор та/або макроспор, однак цей варіант забезпечує таку кількість дигаплоїдів, яка значно збільшує імовірність підбору комплементарних пар дигаплоїдних ліній, кількість отриманих ліній обмежується кількістю пилкових зерен, що продукує рослина і ефективністю методу культури мікро та/або макроспор. Порівняльний аналіз заявленого винаходу з прототипом показав, що заявлений спосіб характеризується новими суттєвими ознаками, які полягають у тому, що отримують гомозиготні лінії: - або використовуючи культуру мікроспор чи макроспор in vitro, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, - або використовуючи механізми апоміксису in vivo, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі вихідної гетерозиготної рослини, з отриманих гомозиготних ліній підбирають пари ліній так, що кожна з ліній в парі несе одну із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини, а їх генотипи у сукупності відповідають генотипу вихідної гетерозиготної рослини і відновлюють його при схрещуванні. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 8 Пункт формули 2 Матеріальні затрати значно менші, ніж у двох інших варіантах у зв'язку із відсутністю використання методів культури in vitro, однак цей варіант здійснення винаходу може бути застосований тільки для культур, у яких вдалося індукувати андрогенез in vivo. Кількість отриманих ліній обмежується кількістю пилкових зерен, що продукує рослина і ефективністю індукованого андрогенезу. Досягнення такого технічного результату не випливає явним чином із рівня розвитку техніки. В загально доступних джерелах відсутні відомості про те, що гомозиготні лінії із гетерозиготної рослини, які отримують або шляхом використання культури мікроспор чи макроспор in vitro, або шляхом використання механізмів апоміксису in vivo, попередньо блокуючи обмін ділянками між гомологічними хромосомами у мейозі гетерозиготної рослини, або індукуючи соматичну редукцію з подальшим підбором пар ліній так, що кожна з ліній в парі несе одну із гомологічних хромосом вихідної гетерозиготної рослини, а їх генотипи у сукупності відповідають генотипу вихідної гетерозиготної рослини та будуть відновлювати його при схрещуванні використовуються для відтворення гетерозиготних форм вищих рослин незалежно від способу їх отримання. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601