Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до нематод globodera

Реферат: Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до нематод Globodera включає зараження зразків картоплі цистами збудника хвороби і їх аналіз. З вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування виділяють білки, проводять їх ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0, за виявленими білковими компонентами в інтервалі рН 8,1-8,2 підбирають стійкі до нематод вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і отримують стійкі нащадки. UA 80826 U (12) UA 80826 U UA 80826 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від негативної дії шкідливих організмів та хвороб. В сільському господарстві відомий метод інфрачервоної мікроскопії для діагностики ушкодження і стійкості зернових до шкідників [1]. В картоплярстві відомі польові та лабораторні способи визначення стійкості сортів та гібридів картоплі до золотистої цистоутворюючої картопляної нематоди Globodera rostochiensis Woll та блідої Globodera palida. Польовий спосіб визначення стійкості картоплі до глободерозу заснований на безпосередньому зараженні зразків картоплі цистами нематоди у природних польових умовах [2]. Також відомий лабораторний спосіб, який включає в себе зараження зразків картоплі цистами нематоди (найближчий аналог) [3]. Спосіб, що вирішується у найближчому аналозі, полягає в тому, що він включає в себе зараження бульб картоплі цистами нематоди у кристалізаторах. Через 2 місяця проводять облік ураження глободерою. У сприйнятливих сортів картоплі спостерігається поява цист нематоди на коріннях, столонах та бульбах, а у стійких - нематодоочищувальний ефект складає 40-80 %. Згадані способи та спосіб-аналог мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. їх використання пов'язане з затратою часу, який займає цілий вегетаційний період розвитку рослин картоплі та патогену. 3. Їх використання потребує зараження зразків картоплі цистами нематод, які є регульованими шкідливими організмами і потребують строгого дотримання правил щодо роботи з карантинними організмами. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до нематод шляхом аналізу білків ізоелектрофокусуванням в поліакриламідному гелі вихідних батьківських форм картоплі, а також отриманих після схрещування гібридів. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі шляхом виділення білків з вихідних батьківських форм картоплі, а також з отриманих після схрещування гібридів, з наступним аналізом білків шляхом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі в градієнті рН 3,5-10,0 вдається визначити характерні білкові компоненти стійких до нематод зразків картоплі в інтервалі рН 8,1-8,2 і таким чином відібрати стійкі вихідні батьківські форми отримати стійкі нащадки без використання збудника хвороби, який є регульованим шкідливим організмом. Запропонований спосіб має переваги: 1. Для аналізу не використовується інфекційний матеріал (цисти нематод). 2. Запропонований спосіб дозволяє визначити успадкування стійкості за значно коротший термін часу - 2 доби (при прототипі - на протязі 60 діб). 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі вдається відбирати стійкі до нематод вихідні батьківські форми картоплі і отримати стійкі нащадки. Приклади здійснення способів Приклад 1. (аналог). У результаті схрещування вихідних батьківських форм стійкий х стійкий до нематод (Серпанок х Слов'янка) з 3-х отримано 3 стійких нащадків (П 09 2-1, П 09 2-2, П 09 2-3), у яких нематодоочищувальний ефект був вище 43-48 %. При схрещуванні сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева х Сантарка) з 3 х гібридів отримано 1 нащадок картоплі (П 09 1-1), що мав нематодоочищувальний ефект вище 40 %. У варіанті схрещування стійкий х сприйнятливий до нематоди (Слов'янка х Поліська рожева) з 4 гібридів отримано 2 гібрида, у яких нематодоочищувальний ефект був вище 40 % (Н 09 2-4 та Н 09 2-8). У результаті схрещування вихідних батьківських форм картоплі сприйнятливий х сприйнятливий (Мелодія х Червона рута) не було отримано стійких до ЗКЦН нащадків. У гібридів Н 00 8-2, Н 00 8-3, Н 00 8-4, Н 00 8-6, Н 00 8-7 нематодоочищувальний ефект був нижче 40 % (таблиця 1). Приклад 2. Ізоелектрофоретичні дослідження запасних білків бульб картоплі проводили в ультратонких пластинах поліакриламідного гелю (при С - відношення маси метиленбісакриламіду до загальної маси обох полімерів: акриламід + метиленбісакриламід - 3 %, Т - відношення сумарної маси обох полімерів до об'єму їх розчину - 5 %) з амфолітом інтервалу рН 3,5-10,0. В основі 1 UA 80826 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 методу лежить принцип розділення білків за ізоелектричними точками в градієнті рН (оборотний логарифм концентрації іонів водню в розчині) (4, 6, 7). Для дослідницької роботи використовували три вихідні форми картоплі: Поліська рожева, Сантарка, Слов'янка, Червона рута, різні за стійкістю до нематод, а також 15 гібридів, одержаних в результаті схрещування даних форм. Для виділення запасних білків тканину бульб розтирали в фарфоровій ступці і центрифугували, супернатант в кількості 7 мкл наносили за допомогою аплікатора на поліакриламідному гелі. Розгонку білків в електричному полі проводили на охолоджуючому столику при напрузі 600 В. Час стабілізації - 2 години [8]. Гелі від амфоліту відмивали в розчині трихлороцтової кислоти: етанолу: води (10:25:65). Фарбування білкових треків проводилось за допомогою барвника Commassi blue G-250 Відмивку надлишків фарби проводили розчином оцтової кислоти: етанолу: води (10:25:65) [8]. В результаті аналізу білкових спектрів вихідних форм картоплі та їх гібридів встановлено, що білкові спектри вихідних форм успадковуються - гібридами. В результаті проведення якісного аналізу білків у комбінації схрещування стійкий х стійкий до нематоди (Серпанок х Слов'янка) при ізоелектрофокусуванні білків у вихідних форм та у отриманих гібридів № 2 (П 09 2-1), № 3 (П 09 2-2), № 4 (П 09 2-3) виявлено білкові компоненти в інтервалі рН 8,1-8,2 (Див. Фіг. 1). При аналізі комбінації схрещування сприйнятливий х стійкий (Поліська рожева х Сантарка), у стійкого до нематод гібриду картоплі № 2 (П 09 1-1) виявлено білкові компоненти в інтервалі рН 8,1-8,2 схожі на вихідну батьківську форму Сантарка, яка є стійкою до нематоди (Див. Фіг. 2). У варіанті схрещування сприйнятливий х сприйнятливий (Поліська рожева х Червона рута) всі отримані після схрещування гібриди були сприйнятливими і в цьому інтервалі рН компонентів не було виявлено (Див. Фіг. 3). За наявністю комплексу компонентів білкових спектрів, які розташовані в інтервалі рН 8;18,2 у вихідних батьківських форм картоплі та їх гібридів можна визначити успадкування стійкості картоплі до нематод. Методом ізоелектрофокусування білків картоплі в поліакриламідному гелі вдається встановити відмінності в білковому спектрі у контрастних за стійкістю до нематод вихідних батьківських форм картоплі та у отриманих після їх схрещування гібридів. За такою ознакою можна відібрати стійкі до патогенну вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і планувати вихід стійких нащадків без використання регульованого шкідливого організму. Літературні джерела 1. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщева Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам. В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М: Колос, 1976. - С. 216-219. 2. Положення про порядок випробування селекційного матеріалу картоплі на стійкість проти раку та золотистої картопляної цистоутворюючої нематоди. Ч.-1999.-14 с. 3. Деккер X., Нематоды растений и борьба с ними. - М.: Колос, 1972.-443 с. 4. Кирьянова Е.С. Методы исследования нематод сельскохозяйственных растений, почвы и насекомых. - М., Л.: АН СССР, 1963.-33 с. 5. Патент України на корисну модель № 8365 від 15.08.05 р. Апарат "РуТа" для виділення цист фітогельмінтів із ґрунтових проб. /Коржук Р.Д., Мацьків Т.I., Ющук Т.Д., Купчак М.Г., Сирбу Р.Д. Промислова власність. Бюл. № 8. С. 87. 6. Маслов Ю.И. Статистическая обработка данных биохимических исследований // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. - С. 163-178. 7. Патент України на корисну модель № 10504 МКВ A01H3/00, G01 N33/00. A01C1/00. G01J3/28 від 15.11.2005 р. Спосіб визначення наслідування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. /Зеля А.Г., Костишин С.С., Мельник П.О., Осипчук А.А., Підгаєцький А.А., Бондарчук А.А., Сидорчук В.І., Сологуб О.С. заявл. 05.05.2005 р., опубл. 15.11.2005 р. // Офіційний бюлетень. Промислова власність, Бюл. № 11. С. 56. 8. Ригетти Т… Изоэлектрофокусирование белков в ПААГ. Теория, методы, применение. 1984. - М., Мир, 326 с. 2 UA 80826 U Таблиця 1 Ефективність очищення ґрунту від золотистої картопляної цистоутворюючої нематоди гібридів картоплі та їх батьківських форм, % (2012 р.) № п/п 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Лаб. Рі, = 3 23400 л. + я./ 100 см 3 53,3±0,66 48,5±0,66 45,4±0,33 49,3±0,66 45,6±0,33 35,8±0,33 45,6±0,33 35,6±0,33 38,6±0,33 48,5±0,66 45,6±0,33 44,6±0,66 37,6±0,33 45,6±0,66 38,6±0,33 38,6±0,33 36,3±0,66 31,8±0,66 36,2±0,33 33,3±0,66 35,3±0,33 32,3±0,33 32,8±0,66 3,8 Сорти, гібриди картоплі 2 Серпанок (♀) (стійка) П 09 2-1 П 09 2-2 П 09 2-3 Слов'янка (♂) (стійка) Поліська рожева (♀) (сприйн.) П 09 1-1 П 09 1-2 П 09 1-3 Сантарка (♂) (стійка) Слов'янка (♀) (стійка) Н 09 2-4 Н 09 2-5 Н 09 2-6 Н 09 2-8 Поліська рожева (♂) (сприйнятлива) Поліська рожева (♀) (сприйнятлива) Н 00 8-2 Н 00 8-3 Н 00 8-4 Н 00 8-6 Н 00 8-7 Червона рута (♂) (сприйнятлива) НІР 0,5 Відсоток очищення до контролю 5 27,6±0,77 22,4±0,56 27,6±0,77 24,9±0,54 27,6±0,77 24,4±0,66 28,3±0,53 26,4±0,54 22,5±0,49 21,1±0,57 24,4±0,66 27,6±0,33 26,7±0,43 31,1±0,57 24,1±0,66 27,6±0,77 26,3±0,33 27,6±0,77 28,3±0,53 31,1±0,57 32,1±0,77 32,1±0,77 37,6±0,77 2,3 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до нематод Globodera, що включає зараження зразків картоплі цистами збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування виділяють білки, проводять їх ізоелектрофокусування в поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0, за виявленими білковими компонентами в інтервалі рН 8,1-8,2 підбирають стійкі до нематод вихідні батьківські форми картоплі для схрещування і отримують стійкі нащадки. 3 UA 80826 U 4 UA 80826 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5