Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку synchytrium endobioticum (schilb) perc.. спектрофотометрією

Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку, що включає зараження паростків картоплі літніми зооспорангіями збудника хвороби і їх аналіз, який відрізняється тим, що з вихідних батьківських форм картоплі, а також з гібридів, отриманих від різних комбінацій схрещування, виділяють нуклеопротеїди, визначають їх вміст спектрофотометричним способом при 450 нм, підбирають стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримують стійкі нащадки. (19) (21) u201001867 (22) 22.02.2010 (24) 25.08.2010 (46) 25.08.2010, Бюл.№ 16, 2010 р. (72) ЗЕЛЯ АВРЕЛІЯ ГЕОРГІЇВНА, СОЛОГУБ ОЛЕКСАНДР СЕРГІЙОВИЧ, МЕЛЬНИК ПАВЛО ОЛЕКСІЙОВИЧ, БОНДАРЧУК АНАТОЛІЙ АНДРІЙОВИЧ, ОСИПЧУК АНДРІЙ АНТОНОВИЧ, ОЛІЙНИК ТЕТЯНА МИКОЛАЇВНА, ЗАХАРЧУК НАТАЛЬЯ АНАТОЛІВНА, ПИСАРЕНКО НАТАЛЬЯ ВАСИЛІВНА, КОЗУНЬ ІГОР ІВАНОВИЧ, СИДОРЧУК ВАСИЛІЙ ІВАНОВИЧ, ДЕМКОВИЧ ЯРОСЛАВ БОГДАНОВИЧ, ПЛОТНИЦЬКА ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВНА, ЗЕЛЯ ГЕОРГІЙ ВІОРЕЛОВИЧ 3 2. Запропонований спосіб дозволяє визначити успадкування стійкості за значно коротший термін часу - 1 день (при найближчому аналозі - на протязі 21 дня). 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що шляхом визначення вмісту нуклеопротеїдів вдається відібрати стійкі до раку вихідні батьківські форми картоплі і отримати стійкі нащадки. Отже, спосіб, що заявляється, відповідає критерію винаходу "новизна" та "суттєві відміни". Приклад 1 Зразки бульб сортів та гібридів картоплі, коли паростки досягають 1-2мм, заражають літніми зооспорангіями зі свіжих ракових наростів на протязі 24 годин при 11-13°С. Для цього на верхівку бульби картоплі навколо паросткової частини приліплюють паперове кільце за допомогою суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливають дистильовану воду, кладуть шматочки свіжого ракового наросту. Зразки залишають у клімокамері з підвищеною вологістю і температурі 11-13°С. Час експозиції 24 години. Інфекцію з паперовими кільцями знімають з бульб і залишають зразки картоплі при температурі 17-18°С на протязі 20 діб, після чого відзначають реакцію паростків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізують під бінокулярною лупою і відрізняють ступінь ураження: 1 - некротизована тканина паростка, одиничні соруси; 2 - розсіяні соруси (якщо більше 5), щільні соруси без деформації паростка; 3 - щільні соруси з деформацією паростка, раковий наріст. В аналізованих таким чином 4-х комбінаціях схрещування картоплі (48шт.) (Таблиця 1, додаток 1) ступінь ураження паростків картоплі збудником раку склала: 1-а комбінація (стійкий х стійкий): 1 - 13 зразків; 2 - 0 зразків; 3 - 0 зразків картоплі. 2-а комбінація (стійкий х сприйнятливий): 1 - 3 зразка; 2 - 2 зразка; 3 - 4 зразка картоплі: 3-я комбінація (сприйнятливий х стійкий): 1 - 6 зразків; 2 - 0 зразків; 3 - 5 зразків картоплі; 4-а комбінація (сприйнятливий х сприйнятливий): 1 - 0 зразків; 2 - 1 зразок; 3 - 7 зразків картоплі. Приклад 2 З 5г паростків зразків картоплі виділяли нуклеопротеїди (нуклеїнові кислоти + гістонові ядерні білки) за методом Anlehlung J., Gerhardt С. та ін. [8] з модифікаціями Prem Das О. та ін. [9]. Паростки заморожували в рідкому азоті і розтирали у фарфоровій ступці з 5-ма об'ємами лізуючого буферу, який вміщував 0,1М трис-НСІ рН 7,8; 0,1М NaCl, 0,2М ЕДТА - етилендіамінтетраоц-това кислота; 3% цетавлон; 0,2% 2-меркаптоетанолу. Лізис 52385 4 проводили протягом 90 хвилин при температурі 60°С. Гомогенат віджимали крізь капронову сітку і центрифугували 10 хвилин при 8000об/хв. При цьому нуклеопротеїди виділяються в супернатанті, а залишки випадають в осад. Супернатант 5мл очищали через колонку з сефадексом G - 25, врівноважену тим же лізуючим буфером (рН 7,8). Після початку виходу нуклеопротеїдів відбирали 2-3мл і зберігали в холодильнику при 4-6°С для визначення їх вмісту. На спектрофотометрі "Ломо-46" при довжини хвилі 450нм визначали величину пропускання світла Р (в %) за формулою: Р=Ро-Рбуф., де Р - підсумковий результат проби в відсотках пропускання світла, або одиниця оптичної щільності, Ро - відсоток пропускання світла дослідного зразка, Рк - відсоток пропускання світла лізуючого буфера. Визначали величину екстинкції: Е=-lgP. Концентрацію нуклеопротеїдів (в мг/мл) визначали за формулою Е=кС, де Е - величина екстинкції, к - коефіцієнт пропускання світла, С - концентрація нуклеопротеїдів [4]. Математичну обробку даних проводили за Масловим Ю.І. [6]. Результати досліджень представлені у таблиці 1. За результатами аналізу вмісту нуклеопротеїдів зразків картоплі відмічена залежність їх вмісту з стійкістю проти раку. Величина екстинкції у сприйнятливих до раку сортів та гібридів коливається в межах 0,4-0,8мкг/мл; у стійких - в межах 1,2-1,8мкг/мд В таблиці1 зображено концентрація нуклеопротеїдів комбінації схрещування вихідних форм картоплі стійкий х стійкий до раку. У варіанті схрещування стійких до раку картоплі сорту Гітте х гібрид П 88 128-7. із 11 досліджених гібридів виділяються всі з концентрацією 1,3-1,8мкг/мл. У варіанті схрещування нестійкого до раку картоплі сорту на стійкий (Поліська рожева х Гітте) із 11 досліджених гібридів виділяються 6 (54%) зразків стійких до раку, у яких концентрація нуклеопротеїдів досягає 1,4-1,8мкг/мл (таблиця 2). У сприйнятливих до раку зразків картоплі концентрація нуклеопротеїдів находилась у межах 0,4-0,8мкг/мл (таблиця 2). У варіанті схрещування стійкого до раку сорту картоплі на нестійкий (Гітте х Поліська рожева ) з 9 гібридів виділено 5 (56%) зразків стійких до хвороби, у яких концентрація сягала 1,6-1,8мкг/мл. Концентрація нуклеопротеїдів у сприйнятливих до раку зразків картоплі сягає 0,4-0,8мкг/мл. (таблиця 3). У варіанті схрещування нестійкого до раку сорту картоплі на нестійкий (Поліська рожева х П85 145-5) з отримано 1 гібрид (6%) стійкий до раку з концентрацією нуклеопротеїдів 1,6мкг/мл. У 8 гібридів (сприйнятливих до хвороби) вміст нуклеопротеїдів склало 0,4-0,9мкг/мл (таблиця 4). Концентрація даних комплексів (нуклеїнова кислота + гістонові ядерні білки) знаходиться в прямій залежності з ступенем стійкості даних сортів та гібридів картоплі до раку. Таким чином, шляхом визначення концентрації нуклеопротеїдів різних комбінацій схрещування 5 52385 вихідних батьківських форм картоплі, що відрізняються за ступенем стійкості до раку сортів та гібридів картоплі вдається визначити їх ступінь стійкості до патогену та його успадкування. За такою ознакою можна підібрати стійкі вихідні форми для схрещування і прогнозувати вихід стійких нащадків проти хвороби. Процес визначення ступеню стійкості 48 зразків картоплі до раку на спектрофотометрі склав 1,5 годин, а способом зараження зооспорами зі свіжих ракових наростів (найближчим аналогом) - 21 днів. Запропонований спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до раку підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при ураженні патогеном сортів та гібридів, отриманих з Поліської дослідної станції Інституту картоплярства УААН. Літературні джерела: 1. Вилкова Н.А., Шапиро И.Д., Борщева Т.А. Использование инфракрасной микроскопии для диагностики повреждения и устойчивости зерновок к клопам. В сб. Методы исследований патологических изменений растений. - М.: Колос, 1976. С.216-219. 2. Деклараційний патент на винахід. №38722, МКВ А01C1/00, G01J3/28. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. Заявл. 06.09.2000, опубл. 15.05.2001 // Офіційний бюлетень. Промислова власність, 2001. - №4, частина 2. - С.14. 6 3. Деклараційний патент на корисну модель №6317.МПК А01H3/00, G01J3/28. Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. Опубл. 16.05.2005. // Офіційний бюллетень. Промислова власність. - 2005. - Бюл.№5. С.124. 3. Зеля А.Г., Мельник П.О. "Методологія оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі стійкого до раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc." УкрНДСКР - Чернівці, 2007 p. 4. Зеля А.Г. Стійкість картоплі проти збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc, методи його виявлення і диференціації. Авт. канд. дис.К.,2009, 24с. 5. Зеля А.Г. Біохімічні методи визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc// Вісник Чернівецького національного університету, серія «Біологія». 2007. - №343. - С.78-90. 6. Маслов Ю.И. Статистическая обработка данных биохимических исследований // Методы биохимического анализа растений. Л., 1978. С.163-178. 7. Салтыкова Л.П., Тарасова В.П. Методические указания по испытанию картофеля на ракоустойчивость. - Л., 1982. - 51с. 8. Салтыкова Л.П., Яковлева В.И. Лабораторная диагностика ракоустойчивости картофеля методом заражения ростков от свежих раковых наростов: Методические указания. - М., 1979. - 8с. Таблиця 1 Реакція на зараження гібридів картоплі збудником раку при використанні комбінації схрещування стійкий х стійкий (2003р.) № п. Сорти, гібриди картоплі 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Гітте (стійк.) ♀ П95 6/16 П95 6/22 П95 6/26 П95 6/28 П95 6/30 П95 6/37 П95 6/43 П95 6/46 П95 6/47 П95 6/57 П95 6/68 П95 6/70 П95 6/75 П88 128-7 (стійк.) ♂ Ступінь стійкості Прямим способом зараження Спосіб спектроскопії, в мкг/г (М±m) 1 1,7±0,72 1 1,6±0,52 1 1,5±0,51 1 1,3±0,76 1 1,7±0,72 1 1,8±0,53 1 1,6±0,76 1 1,4±0,74 1 1,7±0,72 1 1,8±0,76 1 1,6±057 1 1,8±0,66 1 1,7±0,76 1 1,6±0,73 1 1,8±0,66 Таблиця 2 Реакція на зараження гібридів картоплі збудником раку при використанні комбінації схрещування сприйнятливий х стійкий (2003р.) №п/ Сорти, гібриди картоплі 1 1. 2 Поліська рожева (спр.) ♀ Ступінь стійкості Прямим способом зараження Спосіб спектроскопії, в мкг/г (М±m) 3 4 3 0,6±0,73 7 52385 8 Продовження таблиці 2 1 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 2 П94 27-4 П94 27-6 П94 27-11 П94 27-12 П94 27-21 П94 27-22 П94 27-26 П94 27-39 П94 27-46 П94 27-49 П94 27-52 Гітте (стійк.) ♂ 3 1 1 3 3 3 3 1 1 3 1 1 1 4 1,4±0,56 1,5±0,56 0,6±0,77 0,9±0,54 0,6±0,77 0,4±0,66 1,3±0,53 1,4±0,54 0,5±0,49 1,4±0,57 1,8±0,56 1,7±0,52 Таблиця 3 Реакція на зараження гібридів картоплі збудником раку при використанні комбінації схрещуваннях стійкий х сприйнятливий (2003р.) №п/п Сорти, гібриди картоплі 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Гітте (стійк.) ♀ П95 49/3 П95 49/5 П95 49/21 П95 49/25 П95 49/28 П95 49/35 П95 49/48 П95 49/53 П95 49/54 Поліська рожева (спр.) ♂ Ступінь стійкості Прямим способом зараження Спосіб спектроскопії, в мкг/г (М±m) 1 1,7±0,52 1 1,6±0,56 3 0,7±0,42 2 0,9±0,43 1 1,6±0,54 1 1,8±0,56 3 0,6±0,74 3 0,4±0,74 2 0,7±0,42 3 0,8±0,77 3 0,6±0,73 Таблиця 4 Реакція на зараження гібридів картоплі збудником раку при використанні комбінації схрещування сприйнятливий х сприйнятливий (2003р.) № п/ Сорти, гібриди картоплі 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Поліська рожева (спр.) ♀ П95 8-12 П95 8-15 П95 8-22 П95 8/33 П95 9-1 П95 9-6 П95 9-7 П95 9-10 П85 145-5 (спр.) ♂ Комп’ютерна верстка О. Рябко Ступінь стійкості Прямим способом Зараження з білко- Спосіб інфрачервої спекзараження вим екстрак. троскопії, в % ±m) 3 3 0,6±0,73 3 3 0,8±0,69 2 3 0,9±0,76 3 3 0,4±0,43 3 3 0,6±0,73 3 3 0,7±0,76 3 3 0,6±0,66 3 3 0,4±0,49 3 3 0,6±0,46 3 3 0,9±0,76 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601