Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку synchytrium endobioticum (schilb.) perc. шляхом аналізу нуклеїнових кислот

Спосіб визначення успадкування стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. шляхом аналізу нуклеїнових кислот, що включає виділення ДНК з вихідних батьківських форм картоплі, а також з отриманих після схрещування гібридів, аналіз ПДРФ (поліфомізму довжини рестрикційних фрагментів) ДНК, який відрізняється тим, що у різних за стійкістю до раку зразків картоплі отримують ПДРФ ДНК, за яким підбирають вихідні батьківські форми картоплі і отримують ракостійкі гібриди без використання збудника хвороби, при цьому у стійких сортів та гібридів картоплі він охоплює зону 2,3-18 тисяч пар полінуклеотидів, у сприйнятливих - 1618 тисяч пар полінуклеотидів. Корисна модель відноситься до галузі сільського господарства, зокрема до захисту рослин від шкідливих організмів та хвороб. У картоплярстві відомі лабораторні та польові способи визначення ракостійкості картоплі засновані на безпосередньому зараженні сортів та гібридів картоплі літніми зооспорами від свіжих ракових наростів в лабораторних умовах [7], а також зимовими зооспорами у польових умовах [4]. Відомі біохімічні способи визначення ракостійкості картоплі білковим екстрактом із ракових наростів [6] та шляхом інфрачервоної спектроскопії [1]. Також відомий спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку шляхом гібридологічного аналізу селекційного матеріалу картоплі та його вихідних батьківських форм на реакцію до патогену (найближчий аналог) [З]. Спосіб, що вирішується у найближчому аналогу, полягає в тому, що він включає в себе оцінку стійкості вихідних батьківських форм картоплі та потомства, одержаного від їх схрещування (у відсотках). Після зараження зразків картоплі на 60-ту добу проводять аналіз ураження зразків картоплі і підраховують відсоток стійких (неуражених) та сприйнятливих (уражених) зразків. Згадані способи мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. Дослідження по визначенню ракостійкості пов'язані з використанням збудника хвороби. 2. Ці способи є довготривалими. їх використання пов'язане з затратою часу (від 21 до 60 діб). 3. Складові компоненти згаданих способів досить дефіцитні. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити більш досконалий метод визначення наслідування ракостійкості картоплі, який буде використаний селекційними установами для підбору ракостійких батьківських форм картоплі і отримання ракостійких гібгидів. Поставлені завдання досягаються тим, що у запропонованому способі шляхом здійснення ряду прийомів, а саме: виділення ДНК з вихідних батьківських форм картоплі; а також з отриманих після схрещування гібридів шляхом рестрикційного аналізу ДНК вдається отримати різні показники рестриктів ДНК без використання збудника раку. В результаті цього отримано різну кількість рестрикційних фрагментів ДНК, які розташовані в зоні 2,7-18тис. пар нуклеотидів у стійких та 1618тис. пар нуклеотидів у сприйнятливих сортів та гібридів картоплі. Суттєвою відмінністю даного способу є те, що він реалізується без використання збудника раку картоплі, який є карантинним об'єктом. Запропонований спосіб займає набагато менше часу (7 діб). Спосіб дозволяє за даним біохімічним тестом підібрати ракостійкий вихідний батьківський мате со 6317 ріал картоплі для схрещування і отримати ракостійкі гібриди. Приклади здійснення способів Приклад 1 Зразки бульб картоплі різних сортів та гібридів заражають збудником раку в лабораторних умовах [7]. Коли паростки бульб картоплі досягали 1-2мм, їх інфікували літніми зооспорами з ракових наростів. Для цього навколо паросткової частини бульби закріпляли вазеліном та парафіном (2:1) паперове кільце, в яке наливали дистильовану воду і клали відмиті ракові нарости розміром 0,5см3, які містять літні зооспорангії з зооспорами збудника раку. Експозиція зараження 24 години при температурі 12-13°С. Після цього інфікований матеріал та кільце знімали з бульб, а заражені зразки картоплі залишали у темряві на 21 добу. На 21-у добу, коли проявились симптоми захворювання, проводили облік уражених бульб під бінокулярною лупою і відзначали ступінь ураження патогеном. Результати наведено в таблиці. В аналізованих таким чином 10 зразках картоплі (таблиця) виявлено 7 стійких зразків картоплі: Gitte, Barbara, Радич, гібриди 81459 с 19, 91 7/1, 91 7/2, П 96 28/27 і 3 сприйнятливих до раку: Польска рожева, гібриди 91 10/5, 91 10/6. Приклад 2 Маючи на увазі, що багато ракостійких сортів картоплі отримано від схрещування культурного виду картоплі Solanum tuborosum і диких видів Solanum demissum та ін. (роботи Салтикової Л.П. [3]), які відрізняються різним рівнем плоїдності (набором хромосом), ми вивчали поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів ДНК контрастних за ракостійкістю сортів картоплі, які були отримані при схрещуванні різних видів картоплі: - стійких - Gitte, Barbara, Радич, гібридів 81 459 с 19, 91 7/1, 91 7/2, П96 28/27; - сприйнятливих - Поліська рожева, гібридів 91 10/5,91 10/6. Сумарні нуклеїнові кислоти виділяли з паростків різних за ракостійкістю зразків картоплі за методом Aniehlung J., Gerhardt С. та ін. [8]. Паростки картоплі (5г) заморожували в рідкому азоті і розтирали у фарфоровій ступці з 5-ма об'ємами лізуючого буферу, який вміщує 0,1М трис-НСІ рН7,8; 0,1 М NaCI, 0,2М ЕДТА; 3% цетавлон; 0,2% 2меркаптоетанол. Лізис проводили протягом 90 хвилин при температурі 60°С. Очистку або депротеїнізацію проводили з рівним об'ємом хлороформ: ізоаміловий спирт (24:1) і центрифугували на протязі 10 хвилин при 8000 обертах за хвилину. Операцію повторювали 3 рази до повного зникнення проміжного білкового шару. Нуклеїнові кислоти (НК) осаджували 2-ма об'ємами 96%-ного етилового спирту протягом 2-х годин при -20°С. "Медузу", що утворилась в результаті осадження НК, промивали 70%-ним етиловим спиртом 3 рази, центрифугували і підсушували. Осад розчиняли в 0,01 М трис-НСІ буфері + 0,001 М ЕДТА. Для розділення ДНК від РІНК розчинений осад ділили на 2 частини. Першу частину використовували для відокремлення ДНК від РНК, другу - навпаки РНК від ДНК. Першу частину обробляли РНК-азою для розчинення РНК на протязі 15 хвилин при 37°С і очищали ДНК три рази сумішшю: фе нол:хлороформ:ізоаміловий спирт (25:24:1) двічі. Чисту ДНК осаджували 96%-м етиловим спиртом, промивали 80%-м етиловим спиртом 3 рази і центрифугували, підсушували і розчиняли в 0,01 М трис-НСІ буфері з 0,001 М ЕДТА. Вміст і ступінь її чистоти від білків та полісахаридів визначали на спектрофотометрі ЛОМО-26 при 260нм [5]. Додаткову очистку ДНК проводили через колонку з сефарозою 4В. Вміст ДНК визначали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 260нм. Про чистоту отриманих препаратів судили за поглинанням при 230нм (забруднення за поліцукрами) і при 280нм (забруднення за білками). Рестрикцію ДНК проводили протягом 14 годин при 37°С за допомогою ретриктази Barn H. І. Електрофорез рестриктів ДНК проводили за Маніатісом Т. та ін. [2] в 0,8% агарозному гелі в трисацетатному буфері рН7,8 протягом 12-14 годин при ЗОВ при температурі +4°С, використовуючи в якості індикатора бромфеноловий синій. Рестрикти ДНК фарбували 0.003М бромистим етидієм протягом 40 хвилин. Флуорисцуючий оранжевий колір рестриктів ДНК спостерігали під ультрафіолетом. В якості маркера молекулярних мас використовували ДНК фага ^ . Блот-переніс рестриктів ДНК проводили на капроновому фільтрі протягом 14-16 годин при кімнатній температурі в 0,1-0,05М фосфатному буфері з питомою вагою 1,15 [2]. Блотгібридизацію на капронових фільтрах проводили протягом 12-14 годин при температурі +52°С, використовуючи 0,1 М фосфатний буфер + 0,001 М ЕДТА + 4% ДДС натрію рН6,8 з розрахунку 0,2мл на 1см2 фільтру і зонд 18S [32Р] рРНК. Фільтр відмивали слабим фосфатним буфером, висушували і закладали під рентгенівську плівку РМ-В для проявлення рентгенограм [2]. Розподіл радіоактивності на фільтрі вивчали методом авторадіографії на підсилюючому екрані ЕУ-ВЗ. Результати рестрикції сумарної ДНК зразків картоплі рестриктазою Ват Н І, яка розщеплює ДНК у послідовності нуклеотидів 51...GGATCC...3 31...GGATCC...5 Відображено на Фіг. 1. У стійких до раку сортів картоплі: Gitte (1) - 5 рестрикаційних фрагментів, Bapbara (5) - 6 рестрикаційних фрагментів Радич (6) - 5 рестрикаційних фрагментів, У гібридів 81 459 с 19 (2) - 5 фрагментів, 91 7/1 (3) - 5 рестрикаційних фрагментів 91 7/2 (4) - теж 5 рестрикаційних фрагментів, П96 28/27 (7) - 6 рестрикаційних фрагментів ДНК. У сприйнятливих до раку сортів картоплі: Поліська рожева (8), гібридів 91 10/5, 91 10/6 (10) - виявлено 3 рестрикаційних фрагментів ДНК. У стійких сортів картоплі рестрикційні фрагменти ДНК розташовані в зоні 2,3-18 тис. пар полінуклеотидів. У сприйнятливих сортів картоплі зона розташування рестрикційних фрагментів ДНК охоплює 12-17 тис. пп. Таким чином, методом аналізу поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) ДНК можна виявити різницю полінуклео 6317 тидних послідовностей ДНК контрастних за ракостійкістю сортів картоплі. Отримані дані по вивченню нуклеїнових кислот мають значення в селекції картоплі і можуть бути рекомендовані селекціонерам при підборі вихідних батьківських форм для отримання ракостійкого потомства. Літературні джерела 1. Зеля А.Г., Романюк О.П, Мельник ПО., Костишин С.С. Деклараційний патент на винахід №38722, МКВ ё А01С1/00, G01J3/28. Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Регістр. №2000095181. Заявл. 06.09.2000, опубл. 15.05.2001 // Офіційний бюлетень. Промислова власність, 2001. -№4, частина 2. -С.14 2. Маниатис Т., Фрич Э. Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: 1984. -350с. 3. Салтыкова Л.П. Обоснование подбора исходных форм для селекции картофеля на ракоус тойчивость // Рак картофеля и картофельная нематода. Черновцы. - 1984. - С.25-33 4. Салтыкова Л.П., Тарасова В.П. Методические указания по испытанию картофеля на ракоустойчивость.Л.:1988. -51с. 5. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение ДНК// Биохимия. -1968, т.6. -С.679-683 6. Яковлева Н.Н., Кадырматов И.Н. Авторское свидетельство СССР №380264. МКИ А01. Способ определения ракоустойчивости картофеля. №02/30-15. Заявлено 23.09.1971. Опубл. 15.09.1973. 7. Яковлева В.И., Салтыкова Л.П. Лабораторная диагностика ракоустойчивости картофеля методом заражения ростков от свежих раковых наростов // Методическое указания. М.: 1979. 9с. 8. Anielung A., Gebhardt J. et al. Theor. Appl. Genet. 1989, №78. Таблиця 1 Реакція сортів та гібридів картоплі на ураження збудником раку №п/п Материнська форма Сорт, гібрид 1 2 3 4 Gitte 81 459 с 19 91 7/1 91 7/2 5 Barbara 6 7 8 9 10 Радич П 96 28/27 Поліська рожева 91 10/5 91 10/6 Реакція на зараження Weihenst 6032/501 xS. andigenum 81 459 с 19 81 459 с 19 Батьківська форма Weihenst 8681/255k Скл. міжв. гібрид Gitte Gitte МРІ 64.956/68 (S. stol., S. acaule, S. demis., S. andig , S. spegaz., S. tuber) Посвіт Barbara Немішаєвска ювілейна Поліська рожева Поліська рожева АМ-62.740 (chi) П8228-15 Радич Перлина 81 459 с 19 81 459 с 19 + + + "•*} '-Ч.С г 2 5 mm я н 6 Комп'ютерна верстка Н. Лисенко 7 8 10 Підписне * *nt,C Г К Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601