Спосіб удосконалення моделювання геміпаркінсонізму у щурів

Реферат: UA 87583 U UA 87583 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної біології та медицини і може бути використана для вивчення хвороби Паркінсона (ХП), її профілактики і корекції моторних, когнітивних і вегетативних порушень, що розвиваються за цієї патології. В основі ХП, яка вражає старшу вікову категорію населення, лежить дефіцит нігростріатного дофаміну (ДА) внаслідок загибелі ДА-ергічних нейронів компактної частини substantia nigra (чорна субстанція) середнього мозку (SNc). В експерименті ідіопатичний паркінсонізм, як системне прогресуюче захворювання у всіх його проявах можна змоделювати лише на приматах [1, 2]. Але відносно ізольоване порушення функції нігростріатної ДА-ергічної системи можливо відтворити у гризунів шляхом локального руйнування SNc [3]. Як руйнівний агент використовують селективні нейротоксини, зокрема 6гідроксидофамін (6-ГОДА) [4]. Дегенерація ДА-ергічних клітин середнього мозку після стереотаксичного введення 6-ГОДА була вперше описана U. Ungerstedt ще в 1968 році [5]. Білатеральне введення нейротоксину щурам викликало важке захворювання, що супроводжувалось афагією, адипсією і акінезією. Однак, незважаючи на значну схожість порушень при двобічному 6-ГОДА-індукованому пошкодженні нігростріатної ДА-ергічної системи у щурів і сиптоматики хвороби Паркінсона у людини, дана модель не отримала широкого розповсюдження, оскільки прооперованні на обох півкулях тварини виявилися не життєздатними внаслідок розвитку вище зазначених вегетативних розладів. Враховуючи це, була розроблена модель з однобічним стереотаксичним введенням 6-ГОДА у середній мозок (модель геміпаркінсонізма) [6, 7], яка виявилася більш адекватною для тривалих хронічних експериментів [8]. Спосіб, що є найбільш близьким до запропонованої корисної моделі, [7] базується на тому, що наркотизованій тварині одноразово стереотаксично вводиться 6-ГОДА у висхідний медіальний ДА-ергічний пучок переднього мозку, у якому проходять аксони всіх ДА-ергічних нейронів SNc. Нейротоксин захоплюється нервовими волокнами через вільні від мієліну перехвати Ранвьє і ретроградно транспортується у соми клітин. При цьому спостерігається визначена селективна дегенерація ДА-синтезуючих клітин середнього мозку і, як наслідок, суттєве зниження концентрації ДА у неостріатумі, в якому закінчуються більшість терміналей ДА-ергічних нейронів SNc. Кількісний аналіз ступеня однобічної деструкції нігростріатної ДА-ергічної системи здійснюють шляхом реєстрації індукованих у тварин ротацій у поведінковому апоморфіновому тесті. При однобічному пошкодженні ДА-ергічних нейронів SNc у щурів виникає суттєва асиметрія ДА-ергічної інервації неостріатума з доменуванням інтактної півкулі над оперованою. Використання агоністів ДА-рецепторів виявляє прихований дисбаланс ДА-інервації та індукує у тварин ротаційні рухи, інтенсивність яких залежить від рівня однобічного падіння концентрації ДА [6]. Таким чином, феномен індукованих ротацій може бути використаним як динамічний тест, що дозволяє кількісно оцінити ступінь однобічної ДА-ергічної інервації неостріатума. Для індукування поведінкової асиметрії використовують неселективний агоніст D1- і D2рецепторів апоморфін. В результаті дефіциту секреції ДА у неостріатумі денервованної півкулі виникає розвиток гіперчутливості ДА-рецепторів. Тому системне введення апоморфіну викликає у тварин циркуляторні рухи у бік котралатеральний по відношенню до денервованної півкулі [7, 9]. Однак, низкою авторів, що користуються цим способом, відмічається неоднорідна чутливість щурів до 6-ГОДА: значна частина прооперованих тварин не виявляє ротаційну асиметрію у апоморфіновому тесті, що свідчить про низький ступінь дегенерації ДА-ергічних клітин. Викликана апоморфіном ротаційна асиметрія виникає тільки при загибелі більш ніж 80 % ДАсинтизуючих нейронів SNc, оскільки при частковому пошкодженні ДА-ергічної системи розвиток дегенеративної гіперчутливості попереджають компенсаторні механізми підтримання концентрації ДА у неостріатумі, такі як розростання і переорієнтація відростків ДА-ергічних нейронів, що залишилися неушкодженими, і збільшення їх секреторної активності [10]. У зв'язку з цим в експериментах з моделюванням геміпаркінсонізму доводиться відбраковувати значну частину (більше половини) тварин після введення 6-ГОДА, у яких денервація виявляється недостатньою. Наш особистий багаторічний досвід з використанням 6-ГОДА свідчить про те, що тільки у 42 % щурів після стереотаксичного введення нейротоксину розвивається значна нейродегенерація, яка супроводжується інтенсивними ротаційними рухами у апоморфіновому тесті [11]. Враховуючи вартість реактивів, утримування тварин, а також час роботи експериментаторів, необхідні для операцій зі стереотаксичним введенням 6-ГОДА, це значно збільшує собівартість відтворення моделі геміпаркінсонізму у щурів. 1 UA 87583 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Основним фактором нейротоксичної дії 6-ГОДА є активні форми кисню (АФК) [12, 13], що індукують розвиток оксидативного стресу в нейронах, недостатність систем антиоксидантного захисту, і здійснюють пошкодження клітинних мембран. Крім того, під дією нейротоксину в клітинах запускаються процеси швидкого неферментативного аутоокиснення ДА з утворенням токсичних хінонів і великої кількості АФК [14]. Було показано, що екзогенне застосування антиоксидантів (мелатонін, тролокс та ін.) попереджає ушкоджуючу дію 6-ГОДА [15]. Цей факт підтверджує вільнорадикальну природу нейротоксичного впливу останнього. Таким чином, потужний оксидативний стрес, викликаний дією 6-ГОДА, спричиняє апоптичну смерть ДАергічних нейронів. Водночас, ендогенні антиоксиданти, такі як глутатіонпероксидаза можуть виступати компенсаторним механізмом в боротьбі з токсичною дією 6-ГОДА, і попереджати дегенерацію ДА-ергічних клітин. Тому цілком доцільно було припустити, що застосування блокатора глутатіону L-бутіонінсульфоксиміну (БСО) може запобігти активації глутатіонзалежних антиоксидантних ферментів і сприяти посиленню нейродегенеративної дії 6ГОДА. В основу корисної моделі поставлена задача запобігання активації ендогенних антиоксидантних систем і посилення дегенерації ДА-ергічних нейронів SNc щурів при утворенні моделі 6-ГОДА-індукованого геміпаркінсонізму. Технічним результатом корисної моделі є збільшення відносної кількості модельних тварин з великим відсотком руйнування ДА-синтезуючих нейронів, відібраних за допомогою апоморфінового поведінкового тесту, і зменшення собівартості моделі з однобічним ушкодженням нігростріатної ДА-синтезуючої системи. Поставлена задача вирішується тим, що завдяки застосуванню блокатора глутатіону L бутіонінсульфоксиміну, що системно вводили напередодні стереотаксичних ін'єкцій нейротоксину в головний мозок. Запропонований спосіб дозволяє пригнітити розвиток захисних ендогених механізмів клітини у відповідь на введення 6-ГОДА, зокрема активації компонентів антиоксидантної системи у вигляді відновленого глутатіону та глутатіонзалежних ферментів антиоксидантного захисту глутатіонпероксидази та глутатіон-S-трансферази. Такий підхід щодо моделювання геміпаркінсонізму у щурів використовується вперше і дозволяє не лише отримати максимальний відсоток тварин з 90 % руйнуванням ДА-ергічних нейронів, але й значно економити час, необхідний для відтворення моделі. В способі, що заявляється, БСО розчиняли у фізіологічному розчині і вводили щурам внутрішньоочеревинно. Наступного дня здійснювали стандартну операцію по стереотаксичному введенню нейротоксину 6-ГОДА [11]. Через 7 днів проводили поведінковий тест з застосуванням внутрішньоочеревинних ін'єкції апоморфіну, підчас якого підраховували кількість здійснених твариною ротацій. Приклад. Дослідження проводили на дорослих щурах лінії Вістар віком 3 місяці і масою 200-250 г. Контрольну групу складали інтактні тварини (n=16), яким проводили однобічне руйнування ДАергічних нейронів SNc стереотаксичною мікроін'єкцією 8 мкг селективного нейротоксину 6-ГОДА у лівий медіальний висхідний пучок переднього мозку. Для цього 100 мкг 6-ГОДА ("Sigma", США) розчиняли у 50 мкл фізіологічного розчину з додаванням 0,1 % аскорбінової кислоти як стабілізатора, що гальмує окиснення 6-ГОДА. Отриманий розчин ізолювали від повітря краплею силіконової олії і ставили у холодильник і надалі використовували протягом дня. Під нембуталовим наркозом (50 мг/кг, внутрішньоочеревинно, "Sigma", США) тварину поміщали у стереотакс СЭЖ-4 (стереотакс для експериментальних тварин) модифікований для щурів. Далі тварину скальпували і робили трепанаційний отвір ін'єкційною голкою на 2,2 мм каудальніше і на 1,5 мм латеральніше від брегми. Після того внутрішньоочеревинно вводили 40 мг/кг паргіліну ("Sigma", США), що інгібує метаболічні перетворення 6-ГОДА моноамінооксидазою, і 25 мг/кг дезипраміну ("Sigma", США), що блокує захоплення нейротоксину норадренергічними клітинами. Через 30 хв. розчинений 6-ГОДА набирали у мікроін'єктор і занурювали його кінчик у трепанаційний отвір на глибину 8,8 мм від поверхнічерепа. Вводили 4 мкл (8 мкг) нейротоксину у мозок зі швидкістю 1 мкл/хв. Після введення нейротоксину кінчик мікроін'єктора ще 5 хв. залишався у мозку. Після чого мікроін'єктор повільно вилучали з мозку, а тварині на м'які тканини голови накладали шви. В дослідній групі тваринам (n=16) за добу до стереотаксичного введення нейротоксину внутрішньочеревинно вводили БСО з розрахунку 22 мг/кг маси тіла, а наступного дня проводили стереотаксичне введення 6-ГОДА за вище приведеною схемою. 2 UA 87583 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Через 7 діб в обох групах тварин проводили поведінковий тест: щурам внутрішньоочеревинно вводили 0,5 мг/кг апоморфіну ("Sigma", США); реєстрували кількість обертів, виконаних твариною протягом 30 хв., і, таким чином, оцінювали ступінь дегенерації нігростріатної ДА-ергічної системи. З 16 щурів контрольної групи тільки сім тварин (43,75 %) відповідали інтенсивними циркуляторними рухами (більше 180 обертів за 30 хв.) на системне введення апоморфіну. Одна тварина (6,25 %) виявила незначну ротаційну асиметрію у поведінковому апоморфіновому тесті. А вісім щурів (50,0 %) взагалі не відповідали ротаціями на системне введення агоніста ДАрецепторів. Згідно з нашими попередніми морфологічними дослідженнями [11], у цих тварин на боці введення нейротоксину загинуло в середньому 96, 86 і 44 % ДА-ергічних нейронів SNc відповідно. На фіг. 1 представлена кількість нейронів, підрахована після забарвлення за Ніслем, у зрізах чорної субстанції на інтактному (сірі стовпчики) і ушкодженому (білі стовпчики) боках, де n кількість обертів за 30 хв. в апоморфіновому тесті (*Р