Спосіб моделювання хронічного панкреатиту

Реферат: Спосіб моделювання хронічного панкреатиту включає порушення рівня оксиду азоту шляхом внутрішньочеревного введення діючої речовини. Розчин нітропрусиду натрію виготовлений ex tempore вводять один раз на добу з розрахунку 1,5 мг сухої речовини на кілограм ваги лабораторним тваринам протягом 30 діб. UA 87879 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ ХРОНІЧНОГО ПАНКРЕАТИТУ UA 87879 U UA 87879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до способів моделювання панкреатиту в експерименті, може бути використана у лабораторіях, науково-дослідних установах, для вивчення ефективності різних лікарських препаратів на перебіг та розвиток експериментального хронічного панкреатиту (ХП) у дрібних лабораторних тварин. ХП - запальне захворювання підшлункової залози (ПЗ), яке характеризується рецидивуючими панкреатичними атаками, прогресуючим фіброзом, асоційованим з незворотними структурними змінами її паренхіми, що призводить до розвитку екзокринної, а пізніше й до ендокринної недостатності. Гострий панкреатит відрізняється від ХП тим, що це частіше одна атака запального процесу, після якої функціональний та морфологічний стан ПЗ може повернутись до норми. Провідні панкреатологи всього світу в процесі дискусій прийшли до висновку, що панкреатит є мультифакторним захворюванням, при якому залишається не до кінця вивченими патогенетичні механізми розвитку патологічних змін в ПЗ та участі оксиду азоту (NО) в цьому процесі. Відомо, що NО здійснює міжклітинну комунікацію і регуляцію важливих фізіологічних функцій, таких як вазодилатація, нейротрансмісія, зниження агрегації тромбоцитів, активацію процесів запам'ятовування, регуляцію тонусу гладких м'язів, впливає на перекисне окиснення ліпідів (ПОЛ) під час розвитку і протікання запальних процесів. З одного боку, в шлунково-кишковому тракті NО регулює мікроциркуляцію, секрецію та моторику, та, за фізіологічних умов, має цитопротекторну дію. NО є головним інгібіторним медіатором, що забезпечує розслаблення гладкої мускулатури стравоходу, шлунка, тонкої та товстої кишок, жовчного міхура, сфінктера Одді, а також приймає участь у дуоденальній секреції бікарбонатів. З іншого боку, вступаючи в реакцію з киснем, NО утворює пероксинітрит і приймає участь у формуванні запальних процесів в шлунку, ПЗ та кишечнику. Негативний вплив NО починає проявлятися, коли його сумарна концентрація або різко знижується, або зростає, призводячи до функціонального та структурного пошкодження органу (в залежності від дози та тривалості впливу). Поліморфізм прояву його впливу пов'язаний з присутністю в травній системі різних форм NO-синтаз. NО, як яскравий та потужний "модератор" багатьох фізіологічних функцій, приймає участь не тільки при гострих станах, але й при хронічних запальних процесах, зокрема при ХП. Відомо що дефіцит або гіперпродукція NО може мати як про-, так й протизапальні властивості. Так, при ХП дефіцит NО може сприяти інтенсифікації ПОЛ і виснаженню резервних можливостей антиоксидантного захисту. В свою чергу, хронічне запалення ПЗ та прогресування фіброзу у її тканині призводить до розвитку нутритивної недостатності і зменшення надходження основного субстрату для синтезу NО. Підвищений рівень ліпопротеїдів низької щільності при ХП з порушеним ліпідним обміном також призводять до зменшення продукції NО. Але, все ще бракує досліджень про роль NО та його взаємозв'язок з показниками окислювального стресу при загостренні ХП. В дослідженнях Петракова А.В. (А.В. Петраков та ін., 2011 р.) показано прямий кореляційний зв'язок між підвищенням рівня NО в сироватці крові пацієнтів та загостренням ХП. Таким чином, збільшення рівня NО пов'язано з активацією процесів ПОЛ, що в свою чергу може призводити до посилення уражень ПЗ. Отже, участь NО в розвитку патологічних процесів в ПЗ не викликає сумніву. У зв'язку з цим, правомірним є створення нової моделі експериментального ХП, що ґрунтується на порушенні балансу NO - ергічної системи регуляції шляхом введення донатора NО. ХП у тварин досить важко відтворювати, оскільки складно імітувати характерні клінічні або морфологічні особливості, так як розвиток патології в більшості випадків викликається порушеннями не тільки на морфологічному, а й на функціональному рівнях. Існуючі моделі фокусують увагу на різні аспекти ХП, але не об'єднують характерні загальні зміни ПЗ, які спостерігаються при перебігу цієї патології. Так, існує модель панкреатиту, яка виникає за рахунок тимчасової оклюзії біліопанкреатичних проток та введення 12 г/кг алкоголю щодня протягом 2-х місяців (Рар A. Alcohol-induced chronic pancreatitis in rats after temporary occlusion of biliopancreatic ducts with Ethibloc / A. Pap, U. Boros // Pancreas. - 1989. - Vol. 4. - P. 249-255). Ця модель дуже нагадує клінічну ситуацію пацієнтів, що страждають на хронічний алкогольний панкреатит. Однак, відтворення цієї моделі потребує тривалого часу та зусиль. Існує спосіб моделювання панкреатиту в експерименті, який включає введення піддослідним тваринам блокатора NO-синтаз NG-нітро-L-аргініну (40 мг/кг, внутрішньочеревно) протягом 12 діб (Крилова O.O. Роль NO в розвитку хронічного панкреатиту // Буковинський медичний вісник. - 2011. - Том 15. № 2 (58). - С. 218-221). 1 UA 87879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний спосіб, як найбільш близький до того, що заявляється, за суттю та ефектом, який досягається, вибрано за прототип. Недоліком способу є те, що він не враховує єдину ланку механізмів розвитку ХП, яка ґрунтується на патологічному впливі підвищеного рівня NO. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективну модель ХП, яку можна відтворити за відносно короткий проміжок часу, яка максимально характеризує зміни ПЗ, викликані порушенням регуляторних механізмів, а не токсичною дією різних агентів та дає змогу прослідити всю динаміку патологічного процесу - від норми до панкреатиту. Поставлена задача вирішується тим, що для відтворення моделі ХП щурам порушують баланс NO, за допомогою введення діючої речовини внутрішньочеревно. Відмінною ознакою є те, що для відтворення моделі ХП використовується донатор готових молекул NO - нітропрусид натрію: Дослідження проведено на 40 лабораторних білих щурах-самцях лінії Wistar вагою 180-230 г. Експеримент проводився шляхом внутрішньочеревного введення донатора NO нітропрусиду натрію виробництва "Реахим" (Україна) в дозі 1,5 мг / кг протягом 1 доби (n=6); 2 діб (n=6); 6 діб (n=6); 12 діб (n=6); 30 діб (n=6). Розчин готували безпосередньо перед експериментом (згідно з рекомендаціями виробника препаратів) і вводили тваринам внутрішньочеревно о 9-10 годині ранку. Контрольну групу (n=8) становили інтактні щури, яким внутрішньочеревно вводили 0,9 % розчин NaCl протягом 1, 2, 6, 12 і 30 діб. Після закінчення дослідження тварин декапітували після попереднього введення летальної дози кетаміну гідрохлориду (200 мг/кг). Для виконання гістологічних досліджень ПЗ відчищали від жиру і лімфатичних вузлів. Після цього ПЗ фіксували в 10,0 % розчині нейтрального забуферованого формаліну для подальшого гістологічного дослідження. Біоптати зневоднювали в спиртах висхідної концентрації і заливали в парафін. Гістологічні зрізи товщиною 3-5 мкм були пофарбовані гематоксиліном і еозином і за Маллорі в модифікації Слінченко. Біохімічні процеси фіброзу ПЗ оцінювали за вмістом у сироватці крові оксипроліну вільного (ОПв), оксипроліну білковозв'язаного (ОПб/зв) і гексозамінів (ГА). Продукцію NO визначали за сумарним вмістом нітритів / нітратів у сироватці крові за допомогою реактиву Гріса. Для оцінки зовнішньосекреторної функції ПЗ в сироватці крові визначали активність панкреатичних ензимів: α-амілази набором фірми "Філісіт-діагностика" і трипсину - по Ерлангеру в модифікації Шатернікова. Стан інкреторної функції ПЗ було досліджено за допомогою визначення рівня глюкози сироватки крові (глюкозооксидазний метод) набором фірми "Філісіт-діагностика". Морфологічний аналіз показав, що після 1-добового та 2-добового введення неспецифічного донатору NO натрію нітропрусиду у 100 % тварин в тканині ПЗ відзначалися дилатація судин і протоків, накопичення та застій секрету (схема. 1) Ступінь вираженості даних ознак варіював від незначного до помірного ступеня і не залежав від тривалості введення нітропрусиду натрію. Суть корисної моделі пояснює креслення. Фіг. 1. ПЗ щура через 24 години (ліворуч) та через 48 годин (праворуч). Дилатація протоків і судин, накопичення та застій секрету. Забарвлення за Маллорі в модифікації Слінченко. x100. Після 6 доби введення препарату відзначалися ознаки панкреатиту, структурною основою якого були ознаки запалення - інфільтрація строми лімфоцитами і нейтрофільними лейкоцитами, дилатація судин і внутрішньо часточкових протоків, стаз клітин крові. У 66,6 % усіх випадків виявлені великі групи ацинарних клітин в стані гіперсекреції. У 75,0 % даних випадків серед цих клітин зустрічалися поодинокі дрібні вогнища некрозу. Після 12 доби явища повнокров'я судин ПЗ і стазу формених елементів крові ставали найбільш вираженими. У 100 % випадків строма дифузно інфільтрована клітинами запалення, відзначається надмірне накопичення секрету в ацинарних клітинах, сегментарний апоптоз ацинарної тканини. У 66,6 % тварин розвивається вогнищева дрібно- і крупнокрапельна жирова дистрофія. Незважаючи на виражену запальну активність, яка відзначалася після 12 доби від початку експерименту, у всіх тварин, які були виведені з експерименту через 30 діб щоденного введення нітропрусиду натрію, мікроциркуляторні зміни майже повністю компенсовані. Діаметр судин не відрізнявся від групи порівняння, інфільтрація або не визначалася, або була мінімальною. При цьому на тлі "спокійної" ацинарної тканини у 83,3 % випадків відзначалися дилатація між часточкових протоків і розвиток сполучної тканини. Пухка фіброзна тканина огортала магістральні протоки і великі судини, проникала в міжчасточковий простір (схема 2). 2 UA 87879 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Фіг. 2. А) ПЗ щура на 6 добу експерименту. Дилатація судин і внутрішньо часточкових протоків, стаз клітин крові, запальна інфільтрація. Забарвлення за Маллорі в модифікації Слінченко. х200; Б) ПЗ щура на 12 добу експерименту. Виражена дилатація судин зі стазом формених елементів крові, жирова дистрофія ацинарних клітин. Забарвлення гематоксиліном і еозином. х400; В) ПЗ щура на 30 добу експерименту. Розвиток пухкої фіброзної тканини перидуктулярно (навколо магістральних проток). Забарвлення за Маллорі в модифікації Слінченко. х100. Розвиток у щурів ХП, викликаний введенням донатора NO нітропрусиду натрію, супроводжувався змінами біохімічних показників в крові, що характеризують процеси метаболізму сполучної тканини. Так, про збільшення синтезу колагену свідчило зростання після 30 доби вмісту ОПб/зв в 1,4 разу з (179,28±9,19) мкмоль/л (контрольна група) до (243,81±15,35) мкмоль/л (р