Кобальт біс(цитрато)германат – протигрипозний засіб

Реферат: Кобальт біс(цитрато)германат, який має протигрипозну дію. UA 93994 U (12) UA 93994 U UA 93994 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до біологічно активних речовин (БАР), а саме - кобальт біс(цитрато)германату, яка виявляє протигрипозну активність і може застосовуватись в медицині. Грип є найбільш масовою інфекцією серед тих, що представляють значну соціальноекономічну проблему в міжнародному масштабі. Найважливішими його характеристиками є епідемічна природа та висока смертність в умовах пандемії. Незважаючи на успіхи, досягнуті в області хіміотерапії та вакцинопрофілактики грипу, він залишається важко контрольованою інфекцією внаслідок високої генетичної мінливості і різних довготривалих ускладнень після гострої стадії хвороби. Нові віруси грипу, що з'явилися в людській популяції в останні роки, є небезпечним патогеном людини. На сьогодні, за рекомендаціями ВООЗ, протигрипозними препаратами першого ряду, ефективними по відношенню до штамів вірусів грипу А, є похідні адамантанового ряду (амантадин, ремантадин). Препаратами другого ряду, ефективними у відношенні вірусів грипу А та В, вважаються інгібітори нейрамінідази (занамівір, озельтамівір) [1]. На жаль, переважна більшість людських ізолятів вірусів грипу набувають стійкості до дії найбільш розповсюджених протигрипозних препаратів - ремантадину, озельтамівіру [2, 3]. У дослідженнях 2013 року, оприлюднених в он-лайн журналі "mВіо", наведені результати, які свідчать про те, що ізолят штаму вірусу H7N9, виділений від першого хворого на грип з підтвердженим діагнозом, містить змішану популяцію. Приблизно 35 % віріонів несуть у собі мутацію R292K, яка робить їх нечутливими до інгібіторів нейрамінідази, 65 % вібріонів чутливі до цих препаратів. Використання інгібіторів нейрамінідази для лікування пацієнта, інфікованого стійким штамом грипу H7N9, тільки сприяє розмноженню штаму, тобто до посилення розповсюдження саме стійкого штаму. Вказано про те, що пошук нових противірусних засобів серед сполук з різними структурними характеристиками є вкрай актуальним. В цьому плані особливу увагу привертають координаційні сполуки металів з біолігандами. Значна частина з них проявляє фармакологічну активність по відношенню до бактерій, що підтверджує перспективність їх використання у медицині [4]. Є всі підстави вважати, що завдяки особливостям структури металокомплексів, просторового розташування функціональних груп, розмірам та іншим характеристикам, вони можуть діяти на вірус різними шляхами: інактивувати вірус, зайнявши на його поверхні активні центри; проникати через клітинну мембрану; перешкоджати розмноженню вірусу в клітині; руйнувати вірус поза клітиною. Найбільш близьким до заявленого технічного рішення є референс-препарат таміфлю, який містить озельтамівір у вигляді озельтамівіру фосфату та має протигрипозну дію [1]. Однак вказаний препарат є токсичним, виявляє гепатотоксичну (гепатит), нейротоксичну (судоми, делірій, галюцинації) дію, викликає токсичний епідермальний некроліз, анафілактичні та анафілактоїдні реакції тощо. В основу корисної моделі поставлена задача створення нової низькотоксичної різнометальної сполуки кобальту(ІІ)-германію(ІV) з лимонною кислотою, що має протигрипозну активність і усуває недоліки існуючих засобів для тієї ж мети. Поставлена задача вирішується тим, що згідно з корисною моделлю, розроблена нова протигрипозна речовини, а саме кобальт біс(цитрато)германату O C O C [ Co (H2O) 6 ] O H2C H2C C HO C O O C O O Ge O O O O C CH2 CH2 . 2H2O C , OH C O 45 яка має протигрипозну дію. Як вихідні речовини для синтезу сполуки використовували діоксид германію GeO2 "ос.ч", ацетат кобальту(ІІ) Со(СН3СОО)2·4Н2О "ч.д.а.» та лимонну кислоту (H4Citr) "ч.»: 1 UA 93994 U OH O C CH2 O C CH2 HO C OH C O HO 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 . Синтез кобальт біс(цитрато)германату [Co(H2O)6][Ge(HCitr)2]·4H2O проводили за наступною методикою: в 400 мл гарячої (90 °C) води розчиняли наважки 1,046 г (0,01 моль) GeO 2 і 4,2 г (0,02 моль) лимонної кислоти, розчин упарювали до об'єму 100 мл (~ 2 год.), охолоджували, додавали 2,49 г (0,01 моль) Со(СН3СОО)2·4Н2О при постійному перемішуванні до повного розчинення наважки солі. Отриманий розчин залишали для кристалізації при кімнатній температурі. Через 1-2 доби з розчину випадав рожевий осад координаційної сполуки [Co(H2O)6][Ge(HCitr)2]·2H2O, який промивали холодною водою та висушували при температурі 20 °C. Вихід продукту 80 %. Елементний аналіз сполуки виконаний на напівавтоматичному С,N,Н-аналізаторі [5]. Вміст германію та кобальту при спільній присутності визначали методом атомно-емісійної спектроскопії з індуктивно зв'язаною плазмою на приладі Optima 2000DV фірми Perkin Elmer, ІЧ -1 спектри поглинання (400-4000 см ) ліганду і комплексу записували на спектрофотометрі Frontier фірми Perkin Elmer [7-9]. Рентгеноструктурний аналіз (РСА) проводили на автоматичному дифрактометрі Bruker SMART APEX II. За результатами елементного аналізу (обчислено/знайдено%: Ge - 10,53/10,49, Со 8,54/8,59, С - 20,87/20,93, Н - 4,35/4,31) отриманому комплексу відповідає брутто-формула C12H30O24GeCo, у комплексі реалізується мольне співвідношення Ge:цитрат: Co=1:2:1. Сполука стійка на повітрі. Термічний розклад комплексу має складний ступінчастий характер. На першому етапі в інтервалі 60-240 °C спостерігається ендотермічний ефект, пов'язаний з видаленням 10 молекул кристалізаційної та координованої води. Подальший термоліз (після 260 °C) супроводжується чотирма екзоефектами, при яких відбувається декарбоксилювання та подальша окисна термодеструкція. Кінцевими продуктами глибокого термічного розпаду (1000 °C) є суміш оксидів металів, що входять до складу заявленого препарату. -1 -1 В ІЧ-спектрі комплексу наявні смуги ν(C=O)=1706 см , ν(C-O)=255 см , дві νas(COO ) (1672; -1 -1 -1 -1 1599 см ) і дві νs(COO ) (1420; 1360 см ), дві ν(Ge-О)=670, 634 см , δ(Η2Ο)=1639 см , -1 -1 ρ(Н2О)=730 см та ω(Η2Ο)=470 см коливань, які є характерними для гексааквакомплексів 3d-1 металів, а також ν(C-O) (1072 см ) алкоголятного типу [5] (при відсутності деформаційних коливань С-ОН). За результатами РСА [5], сполука побудована з центросиметричних октаедричних катіонів 2+ 2[Со(Н2О)6] , аніонів [Ge(HCitr)2] та кристалізаційних молекул води. У кристалах комплексні катіони і аніони об'єднані безпосередньо між собою і через кристалізаційні молекули води водневими зв'язками в тривимірний каркас. Визначена гостра токсичність нової сполуки у щурів при пероральному прийомі, LD50=1748,86 мг/кг. Відповідно до класифікації і загальних вимог безпеки, вона належить до малотоксичних (IV клас) [6]. Токсичність БАР також визначали за її впливом на життєдіяльність культури інфузорій Colpoda steinii виробництва підприємства "Відродження-М". Критерієм визначення токсичності був час від початку дії досліджуваного зразку на культуру інфузорій Colpoda steinii до загибелі більшості (90 % і більше) інфузорій, яка констатується на підставі повного припинення руху інфузорій та наявності їх розпаду. У контрольній пробі всі інфузорії повинні залишатися рухливими. Крім того, проводили визначення токсичності досліджуваної сполуки на культурі тканини хоріон-алантоїсних оболонок (ХАО) 11-14-добових курячих ембріонів. Розведення БАР на глюкозо-желатиновому підтримуючому середовищі вносили до лунок полістиролових панелей, де розміщували фрагменти хоріон-алантоїсних оболонок на шкаралупі, використовуючи по 4 лунки на одне розведення. Контролем були лунки, що містили фрагменти хоріон-алантоїсних оболонок на шкаралупі і глюкозо-желатинове підтримуюче середовище. Панелі розміщували в термостаті при 37 °C та перевіряли стан клітинного шару протягом 48 год., відмічаючи наявність чи відсутність дегенерації клітин ХАО візуально. Мінімальною токсичною дозою була найменша концентрація БАР, що викликала загибель 50 та більше відсотків фрагментів ХАО. 2 UA 93994 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Протигрипозну активність досліджуваної сполуки in vitro вивчали по відношенню до штамів вірусу грипу людини А/Гонконг/1/68 (H3N2) і A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів H5N3. Використовували культуру тканини хоріон-алантоїсних оболонок (ХАО) 11-12 добових курячих ембріонів, оскільки цю культуру можна вважати найбільш наближеною до рівня цілого організму, яким є курячий ембріон. Використання культури тканини ХАО є більш економічним методом у порівнянні з використанням курячих ембріонів для визначення противірусної дії препаратів. Вплив БАР на репродукцію вірусів грипу досліджували, розчинюючи його у глюкозожелатиновому підтримуючому середовищі. Після доведення рН розчинів до фізіологічного значення рН 7,2-7,4 визначали протигрипозну активність сполуки. Вірусовмісну рідину (ВВР) з попередньо визначеним інфекційним титром розводили у глюкозо-желатиновому середовищі, який містив (дослід) або не містив (контроль) досліджувану БАР. Для інфікування фрагментів хоріон-алантоїсних оболонок, прикріплених до шкаралупи та розміщених у лунках полістиролових панелей, використовували розведення ВВР на глюкозо-желатиновому підтримуючому середовищі ХАО не нижче за 100 ТІД50 (дози, яка викликає інфікування 50 та більше відсотків фрагментів тканини ХАО). Після термостатування протягом 24 год. при 37 °C контрольні та дослідні зразки окремо поєднувались і в них визначали титр інфекційного вірусу. Титрування вірусу грипу після впливу на нього досліджуваної сполуки проводили в культурі тканини ХАО, визначаючи найбільше розведення ВВР, при якому відбувається репродукція вірусу. Тобто, десятикратними розведеннями цих зразків інфікували фрагменти ХАО, розміщені в лунках полістиролових панелей. Полістиролові панелі розміщували в термостаті при 37 °C. Після 48 год. термостатування визначали наявність вірусу в лунках за результатами реакції гемаглютинації (РГА). Розрахунок ТІД50 в експериментах in vitro проводили за методом Кербера в модифікації І.П.Ашмаріна за формулою: lg ТІД50=L-d(S-0,5), де L - початкове розведення у досліді; d - різниця між послідовними lg розведень; S - сума пропорцій тест-об'єктів, що дали позитивний результат. При дослідженні максимальної переносимої концентрації (МПК) кобальт біс(цитрато)германату на культурі інфузорій Colpoda steinii та тканинній культурі ХАО виявлено, що показник для цих моделей становив 7 мг/мл. Тому для визначення протигрипозної активності нової БАР відносно штаму вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканинній культурі ХАО були відібрані наступні концентрації: 6535 мкг/мл, 3270 мкг/мл, 1635 мкг/мл та 654 мкг/мл. Результати досліджень, а саме вплив препарату на репродукцію штаму вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканинній культурі ХАО, наведені в таблиці 1. Крім того, в таблиці 1 наведені дані порівняння протигрипозної дії референс-препарата таміфлю фірми виробника Хоффманн-Ля Рош (Швейцарія), міжнародна назва - осельтамівір. -3 Концентрація таміфлю складала 410 мкг/мл, що відповідало 110 M. Однак вказаний препарат -3 виявляв токсичну дію на культурі інфузорій Colpoda steinii у концентрації 410 мкг/мл (110 М), а -2 на тканинній культурі ХАО - 1000 мкг/мл (0,2510 М). Тож максимально переносимі концентрації референс-препарату були значно нижчими, ніж МПК кобальт біс(цитрато)германату на цих моделях (7 мг/мл). Таблиця 1 Речовини Кобальт біс(цитрато)германат [Со(Н2О)6] [Ge(HCitr)2]·4Η2Ο Таміфлю (озельтамівір) - референспрепарат Молярна маса, г/моль 653,6 410 45 3 Досліджувана концентрація, мкг/мл (відповідно в Молях) 6535 мкг/мл -2 (110 М) 3270 мкг/мл -3 (510 М) 1635 мкг/мл -3 (2,510 М) 654 мкг/мл -3 (110 М) 410 мкг/мл -3 (110 М) Пригнічення репродукції вірусу Η3Ν2 в lg 5,25 5,17 4,83 1,63 4,17 UA 93994 U 5 10 15 Одержані результати досліджень свідчать, що нова БАР у концентраціях 6535 мкг/мл та 3270 мкг/мл повністю пригнічувала репродукцію штаму вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканинній культурі ХАО в порівнянні з контролем. У концентрації 1635 мкг/мл кобальт біс(цитрато)германат пригнічував репродукцію вірусу грипу навіть більше ніж референс-3 препарат (таміфлю) - 4,83 lg ТІД50 проти 4,17 lg - відповідно. В концентрації 654 мкг/мл (110 М), БАР також пригнічувала репродукцію вірусу грипу А/Гонконг/1/68 (H3N2) на тканинній культурі ХАО на 1,63 lg ТІД50. Тому для визначення противірусної активності кобальт біс(цитрато)германату по відношенню до штаму вірусу грипу A/PR/8/34 (H1N1) та вірусу грипу птахів H5N3 на тканинній -3 культурі ХАО було відібрано концентрацію 654 мкг/мл (110 М) (табл. 2). У цій концентрації нова сполука пригнічувала репродукцію штаму вірусу грипу A/PR/8/34 (H1N1) на 4,17 lg ТІД 50, що дорівнює результату впливу на цей штам референс-препарату (таміфлю) у дозі 410 мкг/мл -3 (110 М). Пригнічувальна дія сполуки спостерігалась і по відношенню до вірусу грипу птахів H5N3 - 3,67 lg ТІД50 проти 3,75 lg - відповідно. У таблиці 2 наданий вплив БАР на репродукцію вірусу грипу людини A/PR/8/34 (H1N1) та вірусу грипу птахів H5N3 на тканинній культурі ХАО. Таблиця 2 Речовини Кобальт біс(цитрато)германат [Co(H2O)6][Ge(HCitr)2]·4H2O Таміфлю (озельтамівір) референс-препарат 20 25 30 35 40 45 Досліджувана Пригнічення Молярна концентрація, репродукції маса, мкг/мл (відповідно вірусу H1N1 г/моль в Молях) в lg 654 мкг/мл 653,6 4,17 -3 (110 М) 410 мкг/мл 410 4,17 -3 (110 М) Пригнічення репродукції вірусу H5N3 в lg 3,67 3,75 Таким чином, у порівнянні з найближчим аналогом, заявлене технічне рішення - новий вітчизняний засіб кобальт біс(цитрато)германат проявляє виразну противірусну активність у відношенні вірусу грипу людини штамів А/Гонконг/1/68 (H3N2) та A/PR/8/34 (H1N1), а також вірусу грипу птахів H5N3 на тканинній культурі ХАО. Крім того він виявляє значно меншу токсичність, що дає перспективу для подальшого дослідження та впровадження в медичну практику. Джерела інформації: 1. WHO (2010 February) WHO Guidelines for Pharmacological Management of Pandemic (H1N1) 2009 Influenza and other Influenza Viruses. [Electron resource] Access mode: http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/hlnl_use_antivirals 20090820/en/index.html 2. Bright R.A. Adamantane resistance among influenza A voruses isolated early during the 20052006 influenza season in the Unated States / R.A. Bright, D. Shay, B. Shu [et al.] // Jornal of the American Medical Association. 2006; vol. 295 (doi: 10.1001/jama.295.8.joc60020). 3. Gubareva LV, Hayden FG. M2 and neuraminidase inhibitors: anti-influenza activity, mechanisms of resistance and clinical effectiveness. In: Kawaoka Y, editor. Influenza virology: current topics. Wymondham, United Kingdom: Caister Press; 2006. p. 169-202; Center of Diesis Control and Prevention. Oseltamivir-resistant 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus infection in two summer campers receiving prophylaxis-North Catolina, 2009. MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2009; 58: 969-72. 4. Михасько Т.Α., Дубовик Б.В., Шадыро О.И., Полозов Г.И. // Мед. новости. 2002. No 4. С. 81. 5. Марцинко Е.Э., Миначева Л.Х., Песарогло А.Г., Сейфуллина И.И. и др. Бис(цитрато)германаты двухвалентных 3d-мeтaллoв (Fe, Co, Ni, Cu, Zn). кристаллическая и молекулярная структура [Fe(H2O)6][Ge(HCit)2]·4H2O // Журн. неорган, химии. - 2011. - Т. 56, № 8. - С. 1247-1253. 6. Доклинические исследования лекарственных средств: метод. Рекомендации/ под. ред. чл.- кор. АМН Украины А.В. Стефанова - К.: Авіцена, 2002 - 567 с. 7. Пат. 15629 А Україна, МПК G01N 33/15, C12Q 1/18. Спосіб оцінки ступеня цитотоксичності біологічно активних сполук та фармакологічних препаратів / Лозицький В.П., Григорашева І.М., Федчук А.С. [та ін.]; заявник-патентоутримувач Український наук.-досл. Протичумний ін.-т, ТОВ "Відродження М". - № u200512542; заявл. 26.12.05; опубл. 17.07.06, Бюл. № 7. 4 UA 93994 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Кобальт біс(цитрато)германат O C O C [ Co (H2O) 6 ] O H2C H2C C HO C O O C O O Ge O O O O C CH2 CH2 . 2H2O C OH C O , 5 який має протигрипозну дію. Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5