Спосіб одержання абсорбційних ентероцитів порожньої кишки птиці хімічним методом

Спосіб одержання абсорбційних ентероцитів порожньої кишки птиці, який відрізняється тим, що спочатку видаляють порожню кишку птиці, промивають її фізіологічним розчином NaClHEPЕS при рН 7,4 для видалення вмісту, після чого відділяють порожню кишку від брижі, визначають її загальну довжину, знаходять середину, від якої відміряють рівновіддалені точки у краніальному та каудальному напрямах та відрізають ділянку кишки, довжина якої складає третину від загальної, яку потім розрізають на фрагменти по 23 см, та розтинають вздовж, після чого підготовлені відрізки порожньої кишки інкубують протягом 20 хв. в розчині такого складу (мМ/л): NaCl – 80, КН2РО4 – 3, тріс-НСl – 20, маніт – 37, ЕГТО – 0,1, натрію цитрат – 27, сироватковий альбумін – 1 мг/мл при 37 ºС, при рН 7,4, при співвідношенні середовище інкубації/кишечник – 2 мл/г; після завершення інкубації ізольовані клітини із середовища осаджують центрифугуванням впродовж 3 хв. при 500 g із дворазовим промиванням розчином інкубації. UA (21) a201009170 (22) 21.07.2010 (24) 26.12.2011 (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) БУГАЙ АНДРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, ЦВІЛІХОВСЬКИЙ МИКОЛА ІВАНОВИЧ, БЕРЕЗА ВОЛОДИМИР ІЛІЧ, ДУЛЬНЄВ ПЕТРО ГЕОРГІЙОВИЧ (73) ДУЛЬНЄВ ПЕТРО ГЕОРГІЙОВИЧ (56) Barfull A, Garriga C, Mitjans M, Planas JM Ontogenetic expression and regulation of Na(+)-Dglucose cotransporter in jejunum of domestic chicken // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002 Mar;282(3):G559-64 Mac Donal O, Chediack JG, Caviedes-Vidal E. Isolation of epithelial cells, villi and crypts from small intestine of pigeons (Columba livia) // Biocell. 2008 Dec;32(3):219-27 Uni Z, Platin R, Sklan D. Cell proliferation in chicken intestinal epithelium occurs both in the crypt and along the villus // J Comp Physiol B. 1998 May;168(4):241-7 Garriga C, Moreto M, Planas JM. Hexose transport in the apical and basolateral membranes of enterocytes in chickens adapted to high and low NaCl intakes //J Physiol. 1999 Jan 1;514 ( Pt 1):189-99 C2 2 (19) 1 3 До основних недоліків даного способу виділення ентероцитів порожньої кишки належить отримання всіх клітин зі слизового шару порожньої кишки (власне ентероцити, слизові клітини, Мклітини, ентероендокринні клітини тощо), а також клітин з власної пластинки ворсинок порожньої кишки (фібробласти, лейкоцити, тощо). Також слід зазначити, що використання ЕДТО призводить до незворотної втрати транспортної функції плазмолеми, що унеможливлює вивчення транспортних процесів. В основу винаходу поставлена задача створення ефективної схеми виділення фракції абсорбційних ентероцитів хімічним методом зі збереженням їх транспортних властивостей. Поставлена задача досягається за рахунок застосування як хелатуючого агента етиленглікольдіамінтетраоцтова кислота (ЕГТО), скорочення часу інкубації відрізків порожньої кишки в розчині хелатуючого агента під контролем біохімічних та морфологічних критеріїв. Для кращого розуміння опису матеріалів заявки наводиться конкретний приклад. Приклад 1. Одержання ізольованих абсорбційних клітин порожньої кишки курчат-бройлерів для вивчення транспортних властивостей їх плазмолеми. Об'єктом дослідження були курчата-бройлери кросу "Конкурент-3" 14-добового віку, які утримувались у клітках з 1-добового віку на збалансованому за всіма показниками раціоні, який змінювався згідно технологічного графіку. Евтаназію курчат проводили шляхом декапітації, вранці, без попереднього голодування, після чого видаляли порожню кишку, промивали її фізіологічним розчином (NaCl-HEPES, pH 7,4) для видалення вмісту. Для виділення ентероцитів порожню кишку відділяли від брижі, визначали її загальну довжину, знаходили середину, від якої відміряли рівновіддалені точки у краніальному та каудальному напрямах та відрізали ділянку кишки. При цьому довжина кишки складала третину від загальної. Отриману ділянку кишки розрізали на фрагменти по 2-3 см та розтинали вздовж. Підготовлені відрізки порожньої кишки інкубували протягом 90 хв. в розчині такого складу (мМ): NaCl - 80; КН2РО4 - 3; тріс-НСl - 20; маніт - 37; ЕГТО - 0,1; натрію цитрат -27; сироватковий альбумін - 1 мг/мл при 37 °С , рН 7,4 (співвідношення середовище інкубації/кишечник 2мл/г). Після завершення інкубації ізольовані клітини із середовища осаджували центрифугуванням впродовж 3 хв. при 500 g із дворазовим промиванням розчином інкубації. Результати досліджень показали, що виділення ентероцитів зі слизової оболонки курчатбройлерів у середовище інкубації впродовж всього періоду спостереження відбувається нерівномірно (табл. 1). Це свідчить про різні властивості клітин та наявність осі «ворсинки-крипти». Так, на 5-й та 10-й хвилинах інкубації відрізків порожньої кишки в середовищі виділення інтервальний та відсотковий вихід білку ентероцитів майже не відрізнявся, а на 20-у хвилину збільшився у 2,2 рази (Р