Спосіб раннього прогнозування ризику розвитку раку молочної залози у жінок з доброякісними пухлинами

Реферат: Спосіб раннього прогнозування ризику розвитку раку молочної залози у жінок з доброякісною пухлиною молочної залози включає генетичне дослідження тканини молочної залози (МЗ). Із взятої тканини молочної залози виділяють геномну ДНК за допомогою набору Gene JET DNA Purilication Kit (Thermo scientific). Потім виконують бісульфітну обробку геномної ДНК, згідно з Протоколом до набору Ері Tect-Bisulfite kit (Qiagen). Після чого проводять ампліфікацію обмеженої праймерами ділянки ДНК гену SFRP5 методом Touch Dow ПЦР з Hot Start Tag DNA Polimirase з використанням набору Fermentas Maxima Hot Start PCR Magter Mix PCR Kit (Thermo scientific) і 5 пкмоль специфічних праймерів. Дизайн праймерів здійснюють за допомогою програми Methyl Primer Expres v 1,0. Далі піросеквінують отриманий ПЛР-продукт за Протоколом Qiagen і прогнозують ризик розвитку раку молочної залози у пацієнток з доброякісною пухлиною МЗ. UA 98793 U (54) СПОСІБ РАННЬОГО ПРОГНОЗУВАННЯ РИЗИКУ РОЗВИТКУ РАКУ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ У ЖІНОК З ДОБРОЯКІСНИМИ ПУХЛИНАМИ UA 98793 U UA 98793 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини, а саме онкології і мамології, і може бути використана для раннього прогнозування ризику розвитку раку молочної залози у жінок з доброякісними пухлинами. Метилування ДНК може слугувати діагностичним і прогностичним маркером для клінічного застосування (1). Певні гени можуть бути метиловані при різних локалізаціях пухлини, в той же час метилування інших генів може бути специфічним. Одна з груп генів, які метиловані при захворюванні на рак молочної залози, це гени SFRP-сімейства. Вони є інгібіторами Wntрегуляторного каскаду. Епігенетична інактивація цих генів призводить до активації пухлинного зростання в експерименті. У роботах (3, 4) було виявлено метилування промотора гену SFRP5 в 75 % випадків у хворих на рак молочної залози. Найближчим аналогом до корисної моделі є розробка, в якій ген SFRP, що належить до вказаної вище групи генів-супресів Wnt-шляху, узятий в цій розробці для оцінки можливості використання його як діагностичного маркера ризику розвитку раку молочної залози. Вивчення метилування гену SFRP5 в оцінці прогнозу виживаності пацієнтів при раку молочної залози, показало, що наявність у пухлині метилованої ДНК промотора гену SFRP5 була пов'язана з поганою виживаністю. Однак, у перелічених вище роботах вивчення метилування проводилося за допомогою метилспецифічної ПЦР, яка не дає можливості визначати кількісний вміст метилованої по CG сайтах ДНК у зразку пухлини. Вона оцінює метилування лише за принципом "є" або "ні", тобто наявність чи відсутність метилованої ДНК. Було проведено кількісне визначення змісту метилованої ДНК по 4 CG сайтах у промоторі гену SFRP5 з використанням технології піросеквенування. Метод КОСМет (метод КОСМет кількісна оцінка змісту метилованої ДНК) дозволяє оцінити лише кількість метилованої і неметилованої ДНК у зразку пухлини. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалення способу прогнозування ризику розвитку раку молочної залози шляхом кількісної оцінки в зразках тканини МЗ вмісту метилованої ДНК гену SFRP5 у доброякісній пухлині МЗ як діагностичного маркеру, що дозволить, за рахунок кількісної оцінки ризику малігнізації доброякісних процесів молочної залози, з високим ступенем точності на ранніх етапах прогнозувати ризик розвитку раку МЗ, своєчасно призначити постійне спостереження за пацієнтками з передраковим захворюванням молочної залози. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб раннього прогнозування ризику розвитку раку молочної залози у жінок з доброякісною пухлиною молочної залози включає генетичне дослідження тканини молочної залози (МЗ), згідно з корисною моделлю, із взятої тканини молочної залози виділяють ДНК за допомогою набору Gene JET DNA Purilication Kit (Thermo scentific), потім виконують бісульфітну обробку геномної ДНК, згідно з Протоколом до набору Ері Tect-Bisulfite kit (Qiagen), після чого проводять ампліфікацію обмеженої праймерами ділянки ДНК гену SFRP5 методом Touch Dow ПЦР з Hot Start Tag DNA Polimirase з використанням набору Fermentas Maxima Hot Start PCR Magter Mix PCR Kit (Thermo scientific) і 5 пкмоль специфічних праймерів: 95 °C-15 хв, 10 циклів 95 °C-30 с, 65 °C-1 хв, зі зниженням температури на 1 градус/цикл, 30 циклів - 95 °C-30 с, 60 °C-30 с., 72 °C-45 с, 72 °C-10 с, дизайн праймерів здійснюють за допомогою програми Mcthyl Primer Expres v 1,0, далі піросеквінують отриманий ПЛР-продукт за Протоколом Qiagen і при значеннях вмісту метилованої ДНК гену SERP5 вище 20 % прогнозують високий ризик розвитку раку молочної залози у пацієнток з доброякісними процесами МЗ. Спосіб виконується наступним чином Дослідження метилування генів SFRP5 проводилося на матеріалі біопсії 24 зразків аденокарциноми молочної залози (РМЖ) і 24 зразків незміненої тканини молочної залози від цих же хворих (УНТ-умовно нормальна тканина). Також як контроль було взято 6 зразків нормальної тканини молочної залози і 17 зразків тканини від хворих з доброякісними процесами МЗ. Геномна ДНК була виділена за допомогою наборів GeneJET DNA Purification Kit (Thermo scientific). Бісульфітна обробка геномною ДНК була виконана згідно з Протоколом до набору EpiTect Bisulfite kit (Qiagen). Після бісульфітної обробки виділеної ДНК, була проведена ампліфікація методом TouchDown з HotStartTag DNA Polymerase із використанням набору Fermentas Maxima Hot Start PCR Master Mix PCR kit (Thermo scientific) і 5 пкмоль специфічних праймерів; 95 °C-15 хв., 10 циклів 95 °C-30 с, 65 °C-1 хв, зі зниженням температури на 1 градус/цикл, 30 циклів - 95 °C-30 с, 60 °C-30 с, 72 °C - 45 с; 72 °C-10 хв. Дизайн праймерів здійснювали за допомогою програми MethylPrimer Express v 1,0. Піросеквенування проводилося, згідно з Протоколом фірми Qiagen d у послідовності: розділення ланцюгів ДНК амплікону, за допомогою магнітних моніст, навантажених 1 UA 98793 U 5 10 15 стрептовідином, далі ланцюг ДНК з біотином денатурували в розчині лугу, промивали буфером і додавали в 96-лунковий планшет, що містить 10 pmol секвенуючого праймеру в буфері для відпалення, витримували 2 хвилини при 80 °C і проводили піросеквенування. Кількісний аналіз метилування проводили на піросеквенаторі PyroMark Q96 MD і PyroMark Q24 MDX з програмою Pyro Q - Ср software. Програма автоматично вираховує ступінь метилування CpG сайтів у пробі і показує його у відсотках для кожного метилування. Отримані дані для обчислення параметрів специфічності і чутливості методу оброблені за допомогою програми MEDCALC. На фіг. 1 представлені результати визначення вмісту метилованої ДНК гену SFRP5 у нормальній тканині МЗ. На фіг. 2 - результати вмісту промотора гену SFRP5 при аденокарциномі молочної залози. На представлених малюнках показаний ступінь метилування цитозину в ДНК у пробі для кожного CG сайту метилування в нормальній тканині молочної залози і в зразках тканини аденокарциномі МЗ. Вміст метилованих CG сайтів першого екзона гену SFRP5 у зразках нормальної тканини молочної залози складає в середньому 6±1 %%. При раку молочної залози сумарний рівень метилованої ДНК гену SFRP5 був у середньому 35,9±2,2 %%, що достовірно вище, ніж у зразках нормальної тканини (р