Антитіло до ох40 і способи його застосування

Реферат: Винахід належить до виділеного моноклонального антитіла, яке специфічно зв'язується з ОХ40. Також винахід належить до клітини-хазяїна, способу одержання та застосування зазначеного антитіла для лікування раку та аутоімунного захворювання опосередкованого ОХ40. UA 107851 C2 (12) UA 107851 C2 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0001] Даний винахід стосується в основному модуляції активації рецептора OX40 і, зокрема, модуляції рецептора OX40, для інгібування імуносупресивної функції інтерлейкін-10 + + (ІЛ-10)-продукуючих CD4 регуляторних Т-клітин 1-го типу ("Tr1-клітини") і Foxp3 -експресуючих + регуляторних Т-клітин (також іноді називаних у даному документі "Foxp3 T-reg" клітини) і + формування Tr1-клітин із CD4 клітин або наївних клітин, і продукції ІЛ-10. ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ [0002] Дана заявка претендує на пріоритет за заявкою на патент США № 61/375999, поданою 23 серпня 2010 р., і заявкою на патент США № 61/380827, поданою 8 вересня 2010 р. Обидві заявки включені в даний документ за допомогою посилання. ЗАЯВА ЩОДО ФІНАНСУВАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ АБО РОЗРОБКИ ІЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТУ [0003] Описуваний винахід зроблений за підтримки уряду на підставі грантів R01 AI06164501, R01 AI062888-01 і U19 AI071130-01, виданих National Institute of Health. Уряд має певні права на винахід. ІМЕНА СТОРІН УГОДИ ПРО СПІЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ [0004] Відсутні. ПОСИЛАННЯ НА СПИСКИ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ Цей винахід містить списки послідовностей, представлені у вигляді текстового файлу відповідно до 37 CFR § 1.52 (е) (V), названого sequence listing.txt, створеного 23 серпня 2011 року, розміром 13836 байт, який включений у даний документ за допомогою посилання. Додані описи послідовностей і Списки Послідовностей відповідають правилам, яеі регулюють опис нуклеотидних і/або амінокислотних послідовностей у патентних заявках, як зазначено в 37 CFR §§ 1.821-1.825. Списки Послідовностей містять однобуквений код для символів нуклеотидних послідовностей і трибуквені коди для амінокислот, що визначено у відповідності зі стандартами IUPAC-IUBMB, описаними в Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) і в Biochemical J. 219 (No. 2):345-373 (1984). Символи і формат, використовувані для нуклеотидних та амінокислотних послідовностей, відповідають правилам, викладеним в 37 CFR § 1.822. ВІДОМИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ [0005] Tr1-клітини відіграють важливу роль у периферичній толерантності. Tr1-клітини є особливо важливими у обмеженні ушкодження тканин хазяїна при запальних імунних відповідях. Формування Tr1-клітин супроводжує як TH1, так і TH2 імунні відповіді in vivo та in vitro. + [0006] Tr1-клітини формуються з наївних CD4 Т-клітин під час антиген-індукованої Tклітинної імунної відповіді. Tr1-клітини анергічні у відповідь на активацію через рецептори TCR, + CD28 та ІЛ-2 і мають здатність пригнічувати антиген-індуковну проліферацію наївних CD4 Тклітин in vivo та in vitro. Tr1-клітини мають здатність інгібувати розвиток аутоімунних захворювань та обмежувати величину імунної відповіді на мікробні патогени. [0007] Незважаючи на те, що були вивчені молекулярні сигнали, які ведуть до формування Tr1-клітин, мало відомо про молекулярні сигнали, які негативно регулюють формування цих клітин. Хоча імуносупресивні препарати, цитокіни, співстимулюючі молекули і ДК залучені в індукцію Tr1-клітин, сигнали, які негативно регулюють формування Tr1-клітин, залишаються невловимими. СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ + [0008] Активація рецептора OX40 блокує формування Tr1-клітин з наївних або CD4 Т-клітин пам'яті, а також продукцію ІЛ-10 Tr1-клітинами і імуносупресивну функцію Tr1-клітин. Активація + рецептора OX40 також блокує продукцію ІЛ-10 Foxp3 T-reg клітинами та імуносупресивну функцію. Таким чином, представлений в даному документі є агоністичними антитілами, які зв'язуються з рецептором OX40, де агоніст модулює активацію рецептора OX40 для блокування + ІЛ-10-цитокінової секреції і/або загальної імуносупресивної функції Tr1 і Foxp3 T-reg клітин. Фактично антитіла можуть імітувати ліганд OX40 та ініціювати OX40-рецептор на Tr1 і/або + натуральних регуляторних T-клітинах ("nTregs"), також називаних "Foxp3 T-regs". [0009] Як показано в заявках, які перебувають на спільному розгляді, на патент США 11/659266 і 12/861135, OX40L інгібує формування і функцію ІЛ-10-продукуючих Tr1-клітин з + наївних і CD4 T-клітин пам'яті, які були індуковані імуносупресивними препаратами дексаметазоном і вітаміном D3. Ми виявили, що OX40L інгібує формування і функцію ІЛ-10продукуючих регуляторних Т-клітин. Ці відкриття показують, що активація OX40 OX40L пригнічує в культурі формування імуносупресивних ІЛ-10-продукуючих Т-клітин людини. Ця унікальна функція OX40L не характерна для двох інших співстимулюючих членів сімейства TNF, ліганда GITR і ліганда 4-1BB. OX40L також сильноінгібує формування і функцію ІЛ-10продукуючих Tr1-клітин, індукованих двома фізіологічними імпульсами, які генеруються 1 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 індуцибельним співстимулюючим лігандом і незрілими ДК. Активація рецептора OX40 на Тклітинах людини за допомогою моноклональних антитіл, малих молекул або OX40L, або білком, який має щонайменше 90 відсотків гомології йому, модулює і регулює формування і функцію ІЛ10-продукуючих імуносупресивних Т-клітин. [00010] Відкриття має безліч практичних застосувань у лікуванні. Наприклад, агоністичні антитіла, малі молекули або OX40L можуть бути використані для пригнічення формування і функції ІЛ-10-продукуючих імуносупресивних Т-клітин і, отже, можуть використовуватися для посилення імунних відповідей для лікування раку та інфекційних захворювань або як ад'ювант для протиракових вакцин. Антагоністичні антитіла до OX40 або OX40L або антагоністичні малі молекули можуть використовуватися для посилення формування і функції ІЛ-10-продукуючих імуносупресивних Т-клітин і, отже, можуть бути використані для розробки терапії аутоімунних захворювань і реакцій "трансплантат проти хазяїна". Наше відкриття також створює високопродуктивні способи скринінгу антитіл або малих молекул, таких, які активують рецептор OX40 (або, навпаки, які блокують активацію OX40) на Т-клітинах для розробки терапевтичних засобів для лікування раку або, альтернативно, аутоімунних захворювань і реакцій "трансплантат проти хазяїна". [00011] Моноклональні та антитіла людини (іноді називані в даному документі "антитіло до OX40" і/або інші подібні варіанти), які зв'язуються з рецептором OX40 людини, наведені в даному документі. Ці антитіла корисні при лікуванні або профілактиці гострих або хронічних захворювань або станів, патологія яких пов'язана з OX40. В одному аспекті даного винаходу описане ізольоване антитіло людини або його антиген-зв'язуюча детермінанта, яке зв'язується з OX40 людини і є ефективним при лікуванні раку або лікуванні аутоімунних захворювань. Кожне з описаних у даному документі антитіл до OX40 може бути використане як лікарський засіб. Будь-яке одне або більше антитіл до OX40 можуть бути використані для лікування одного або декількох різних видів раку або аутоімунних захворювань, описаних у даному документі. [00012] У даному документі наведені виділені гуманізовані антитіла, які зв'язуються з OX40. Виділені антитіла, як описано в даному документі, зв'язуються з OX40 і можуть зв'язуватися з OX40, закодованим наступними генами: ідентифікаційний номер за NCBI NP_003317, ідентифікаційний номер за Genpept P23510, або генами, які мають 90 відсотків гомології до них. Наведене в даному документі виділене антитіло може додатково зв'язуватися з рецептором OX40, який має один з наступних ідентифікаційних номерів за Genbank: AAB39944, CAE11757 або AAI05071. [00013] Відповідно до викладеного в даному документі, типовим є виділене антитіло, яке зв'язується з OX40, що містить: (а) CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1; (б) CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2; (в) CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 3; (г) CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 7; (д) CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 8; і (е) CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 9. [00014] Крім того, іншим прикладом є виділене антитіло, яке зв'язується з OX40, що містить: (а) CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13; (б) CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 14; (в) CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 15; (г) CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 19; (д) CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 20; і (е) CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO. 21. [00015] Альтернативно виділене антитіло може мати CDR1 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або 13; CDR2 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або 14; і/або CDR3 варіабельної області важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або 15, або мати CDR варіабельної області важкого ланцюга, що має 90 відсотків гомології до них. [00016] Крім того, виділене антитіло може мати CDR1 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7 або 19; CDR2 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8 або 20; і/або CDR3 варіабельної області легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9 або 21, або варіабельну область важкого ланцюга, що має 90 відсотків гомології до них. 2 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00017] Виділене антитіло може мати варіабельну область легкого ланцюга ("VL"), яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10, 11, 22 або 23, або амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 відсотків ідентичну амінокислотним послідовностям SEQ ID NO: 10, 11, 22 або 23. Виділене антитіло може мати варіабельну область важкого ланцюга ("VH"), яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4, 5, 16 і 17 або амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 відсотків ідентичну амінокислотним послідовностям SEQ ID NO: 4, 5, 16 і 17. Таким чином, як приклад, виділене антитіло може мати варіабельну важку послідовність SEQ ID NO: 5 і варіабельну легку послідовність SEQ ID NO: 11 або послідовність, що має 90 відсотків гомології до них. Аналогічно виділене антитіло може мати варіабельну важку послідовність SEQ ID NO: 17 і варіабельну легку послідовність SEQ ID NO: 23 або послідовність, що має 90 відсотків гомології до них. [00018] Виділене антитіло може містити варіабельний легкий ланцюг, який кодується послідовністю нуклеїнових кислот SEQ ID NO: 12 або 24 або послідовністю нуклеїнових кислот, щонайменше на 90 відсотків ідентичною нуклеотидним послідовностям SEQ ID NO: 12 або 24. Виділене антитіло може містити варіабельний важкий ланцюг, який кодується послідовністю нуклеїнових кислот SEQ ID NO: 6 або 18 або послідовністю нуклеїнових кислот, щонайменше на 90 відсотків ідентичною нуклеотидним послідовностям SEQ ID NO: 6 або 18. [00019] Також у даному документі наведені моноклональні антитіла. Моноклональні антитіла можуть мати варіабельний легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10 або 22 або амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 відсотків ідентичну амінокислотним послідовностям SEQ ID NO: 10 або 22. Додатково наведені моноклональні антитіла, які мають варіабельний важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4 або 16 або амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 відсотків ідентичну амінокислотним послідовностям SEQ ID NO: 4 або 16. [00020] Також у даному документі наведена виділена нуклеїнова кислота, яка кодує будь-яке з антитіл до OX40, наведених у даному документі. Додатково в даному документі наведені клітини-хазяїни, кожна з яких містить нуклеїнову кислоту, що кодує будь-яке з описаних у даному документі антитіл до OX40. Далі наведені способи одержання антитіл (наприклад, клітин-хазяїнів, які містять нуклеїнову кислоту, що кодує будь-яке з описаних у даному документі антитіл до OX40), які включають культивування клітин-хазяїнів таким чином, що продукується антитіло і/або відновлення антитіла із клітини-хазяїна. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ [00021] Манеру, у якій вищезгадані ознаки, аспекти і переваги винаходу, а також інше, що стане очевидним, досягаються і можуть бути зрозумілі в деталях, більш конкретний опис винаходу, коротко викладений вище, можливо побачити шляхом посилання на варіанти його втілення, які представлені на фігурах, які є частиною цього опису винаходу. Необхідно, однак, відзначити, що додані фігури ілюструють деякі варіанти втілення винаходу і, отже, не повинні розглядатися як обмежуючі рамки винаходу, для винаходу можуть бути визнані інші настільки ж ефективні варіанти втілення винаходу. + [00022] Фігура 1 демонструє, що FOXP3 Tregs проникнули в тканини фолікулярної лімфоми (ФЛ) людини і співлокалізувалися з пухлинними В-клітинами і моноцитами. Ліворуч: подвійне + + імунне фарбування FOXP3 Tregs (червоний колір) і CD20 B-клітин лімфоми (зелений колір); + + праворуч: FOXP3 Tregs (червоний колір) і CD11c моноцити/макрофаг/ДК (зелений колір). + + [00023] Фігури 2A і 2B описують число CD4 FOXP3 Tregs, яке виросло, у пацієнтів із ФЛ. Пухлинні клітини і МКПК були отримані від шести пацієнтів із ФЛ при початковій діагностиці до лікування. МКПК були також отримані від шести здорових донорів для порівняння. Відсотки + регуляторних Т-клітин від загального числа CD4 Т-клітин визначали за допомогою проточного + + + цитометричного аналізу CD4 CD25 CD127lowFOXP3 Treg. Фігура 2А демонструє репрезентативний FACS-аналіз Tregs. МКПК ФЛ і клітини пухлини ФЛ були взяті від того ж пацієнта. Фігура 2В демонструє відсоток Tregs усіх донорів. Горизонтальна смуга вказує значення. + + + [00024] Фігура 3 демонструє виділення ICOS FOXP3 або ICOS–FOXP3 Tregs із ФЛ. Була отримана суспензія окремих клітин зі зразка селезінки до будь-якого лікування. Клітини + – – – – – – відтавали в день аналізу. Збагачені CD4 CD8 CD14 CD16 CD56 CD11c TCRγδ Т-клітини були low high + high + розділено на субпопуляції CD25 і CD25 . CD4 CD25 FOXP3 Tregs були додатково high low розділені на субпопуляції ICOS та ICOS на основі поверхневої експресії ICOS. Була визначена внутрішньоклітинна експресія FOXP3 у всіх субпопуляціях. + – [00025] Фігура 4 демонструє інгібування проліферації інфільтруючих CD4 CD25 Т-клітин у ФЛ внутрішньопухлинними Tregs, і інгібування може бути частково блоковане анти-ІЛ-10+ – нейтралізуючими антитілами. Мічені CFSE інфільтруючі пухлину CD4 CD25 Т-клітини 3 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культивували з аутологічними пухлинними клітинами, попередньо активованими + + рекомбінантним CD40L у присутності або за відсутності аутологічних ICOS FOXP3 Tregs або + ICOS-FOXP3 Tregs, або анти-ІЛ-10 (10 мкг/мл). Після 72 годин культивування визначали + – проліферацію клітин CD4 CD25 за допомогою проточного цитометричного аналізу розведення CFSE. + [00026] Фігура 5A демонструє внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів наївними CD4 Т-клітинами, що встановлено за допомогою проточної цитометрії відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00027] Фігура 5B демонструє продукцію цитокінів наївними CD4 Т-клітинами, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00028] Фігура 5C демонструє супресивну функцію ІЛ-10-продукуючих Tr1-клітин, що встановлено захопленням [3H]тимідину відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00029] Фігура 6A демонструє внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів CD4 Тклітинами пам'яті, що встановлено за допомогою проточної цитометрії відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00030] Фігура 6B демонструє продукцію ІЛ-10 CD4 Т-клітинами пам'яті, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00031] Фігура 7A демонструє внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів наївними + CD4 T-клітинами, що встановлено за допомогою проточної цитометрії відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00032] Фігура 7B демонструє продукцію ІЛ-10 наївними CD4 T-клітинами, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00033] Фігура 7C демонструє число життєздатних T-клітин, підраховане відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00034] Фігура 8A демонструє внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів наївними + CD4 T-клітинами, що встановлено за допомогою проточної цитометрії відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00035] Фігура 8B демонструє продукцію ІЛ-10 наївними CD4 T-клітинами, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00036] Фігура 8C демонструє внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів CD4 Tклітинами пам'яті, що встановлено за допомогою проточної цитометрії відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00037] Фігура 8D демонструє продукцію ІЛ-10 CD4 T-клітинами пам'яті, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00038] Фігура 8E демонструє внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів наївними + CD4 T-клітинами, що встановлено за допомогою проточної цитометрії відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. + [00039] Фігура 8F демонструє продукцію ІЛ-10 наївними CD4 T-клітинами, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00040] Фігура 9 демонструє продукцію ІЛ-10 регуляторними T-клітинами, що встановлено ELISA відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00041] Фігура 10 демонструє результати скринінгу супернатантів гібридоми анти-OX40 людини на L-OX40 проти батьківських L-клітин, що встановлено ELISA. [00042] Фігура 11 демонструє скринінг специфічних моноклональних антитіл до OX40 людини, що встановлено за допомогою проточного цитометричного аналізу відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00043] Фігура 12 демонструє підтвердження специфічності моноклональних антитіл до hOX40, використовуючи клітини SUPM2, які експресують OX40 (SUPM2-OX40) відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00044] Фігура 13 демонструє специфічні моноклональні антитіла до OX40, які можуть + інгібувати формування ІЛ-10-продукуючих клітин (Tr1) із CD4 T-клітин, стимульоване вітаміном D3 (0,1 мкM)/дексаметозон (50 нм), CD32L/ICOSL та анти-CD3/CD28 (0,2 мкг/мл) відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. Репрезентативні дані сортування флуоресцентно активованих клітин (FACS) наведені на А, а відсотки ІЛ-10- продукуючих клітин для всіх препаратів моноклональних антитіл до OX40 показані на B. [00045] Фігура 14 демонструє результати специфічних моноклональних антитіл до hOX40, + які інгібують формування Tr1-клітин, а також стимулюють проліферацію CD4 T-клітин відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. 4 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00046] Фігури 15A і 15B деталізують титрацію моноклональних антитіл до OX40 на їх + здатність інгібувати формування Tr1-клітин із CD4 T-клітин відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. Репрезентативні дані FACS наведено на фігурі 15A, а відсотки Tr1клітин після обробки дев'ятьма моноклональними антитілами до OX40 наведено на фігурі 15B. [00047] Фігури 16A, 16B і 16C описують специфічні моноклональні антитіла до OX40, які + інгібують формування ІЛ-10-продукуючих Tr1-клітин із CD4 T-клітин, а також інгібують продукцію + + high ІЛ-10 ICOS CD4 CD25 CD127-Treg та імуносупресивну функцію. Свіжовідсортовані + + high + ICOS CD4 CD25 CD127 Tregs (ICOS Tregs) були стимульовані анти-CD3 (0,2 мкг/мл) у присутності клітин CD32L/ICOSL і клітин CD32L/OX40L (фігура 16A) або моноклональних антитіл до OX40, або контрольного антитіла (фігура 16B) протягом п'яти днів. Далі клітини повторно стимулювалися анти-CD3/CD28 24 години, і супернатанти були оцінені на ІЛ-10 твердофазним імуносорбентним аналізом (ELISA). Фігура 16C – це аналіз проліферації, + заснований на моноцитах, який показує, що два з антитіл блокували функцію ICOS Treg. [00048] Фігури 17A і 17B описують ідентифікацію моноклональних антитіл до hOX40, які + + high інгібують формування Тr1-клітин і блокують функцію FOXP3 CD4 CD25 Treg відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. Репрезентативні аналізи методом проточної цитометрії представлено на фігурі 17A. Дані для шести моноклональних антитіл наведено на фігурі 17B. [00049] Фігура 18 демонструє ідентифікацію моноклональних антитіл до hOX40, які не + + high інгібують формування Tr1-клітин, але блокують функцію FOXP3 CD4 CD25 Treg відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. [00050] Фігури 19A і 19B описують агоністичні антитіла до hOX40, які блокують + high лімфомоопосередковану функцію CD4 CD25 Treg відповідно до варіанта втілення способу даного винаходу. Репрезентативні FACS-аналізи представлено на фігурі 19A, а дані для всіх експериментів представлено на фігурі 19B. [00051] На фігурі 20 показано, що моноклональні антитіла до hOX40 можуть зв'язуватися з + CD4 T-клітинами макаки-резусу. Як показано, шість із МАт до hOX40 можуть зв'язуватися з + активованими CD4 T-клітинами макаки-резусу і будуть зв'язуватися з OX40 макаки-резусу та активувати стимуляцію OX40. [00052] Фігура 21 показує, що кожне з антитіл Hu106-222, Серія I і II прикладу I, складається із важкого ланцюга з молекулярною вагою близько 50 кДа і легкого ланцюга з молекулярною вагою близько 25 кДа. Чистота антитіл Hu106-222, Серія I і II, становить більше 95 %. [00053] Фігура 22 демонструє аналіз зв'язування мишачих антитіл 106-122, Ch106 і Hu106222 (Серія II) із клітинами L/OX40 (Приклад I). [00054] Фігура 23 зображує схематичну структуру вектора експресії антитіла Hu106 IgG1/каппа (вектор експресії). Рухаючись за годинниковою стрілкою із сайту SalI вгору, плазміда містить транскрипційну ділянку важкого ланцюга, що починається з головного передраннього промотора цитомегаловіруса людини (CMV) та енхансера (CMV промотор) для ініціації транскрипції гена важкого ланцюга антитіла. За CMV-промотором іде екзон VH, геномна послідовність, яка містить гама-1 константну область важкого ланцюга людини, що має екзони CH1, шарніра, CH2 і CH3 із проміжними інтронами, і сайт поліденілювання за екзоном CH3. Після нуклеотидної послідовності гена важкого ланцюга з CMV промотора починається ділянка транскрипції легкого ланцюга, за яким іде екзон VL і геномна послідовність, яка містить екзонланцюги каппа константної області людини (CL) з попереднім інтроном і сайт поліаденілювання після екзона CL. Після гена легкого ланцюга іде передранній промотор SV40 (SV40 промотор), ген ксантин-гуанін-фосфорибозил трансферази E. coli (gpt) і сегмент, що містить сайт поліаденілювання SV40 (SV40 полі(A) сайт). Наприкінці плазміда містить частину плазміди pUC19, яка містить бактеріальну точку початку реплікації (pUC ori) і ген бета-лактамази (беталактамаза). Локалізація відповідних сайтів рестрикції ферментів показана на фігурі. [00055] Фігура 24 демонструє порівняння між зв'язуванням антитіл Hu 106-222, Серія I і II, із клітинами L/OX40 (Приклад I нижче). [00056] Фігура 25 демонструє Hu119-122, що містить важкий ланцюг з молекулярною вагою близько 50 кДа і легкий ланцюг з молекулярною вагою близько 25 кДа. Чистота Hu119 становить більше 95 % (Приклад II нижче). [00057] Фігура 26 демонструє результат FACS-аналізу антитіл Ch119-122 і Hu119-122, описаних у даному документі (Приклад II нижче). [00058] Фігура 27 демонструє, що клон 119-122 (Hu119) гуманізованого моноклонального антитіла до OX40 людини і його мутуюче антитіло (Hu119-AA), яке зв'язується Fc-рецептором, + підсилили проліферацію наївних CD4 T-клітин. Hu119-122 викликав кращу стимуляцію Т-клітин у порівнянні з батьківським мишачим моноклональним антитілом до OX40 людини (Mouse119 5 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 122). Однак, химерне МАт до OX40 людини (Ch119, мишачі VH і VL, але константні області гама-1 і каппа людини) не підсилювало проліферації Т-клітин. [00059] Фігура 28 демонструє, що FcR зв'язаний мутуючий клон 106-222 (Hu222AA) МАт до OX40 людини і клон 106-222 (Ch222) химерного МАт до OX40 людини підсилив стимульовану + анти-CD3 проліферацію наївних CD4 T-клітин. Ці антитіла мають схожу стимулюючу активність у порівнянні з мишачим МАт до OX40 людини (Mouse222). Однак, повністю гуманізоване Ат до OX40 людини Hu222 не підсилювало Т-клітинної проліферації у порівнянні з IgG1 людини. + [00060] Фігури 29A і B описують блокування супресивної функції CD4 Treg-клітин гуманізованим і мишачим клоном 119-122 МАт до OX40 людини. + + [00061] Фігура 30 надає дані, що показують посилення CD4 і CD8 T-клітинної проліферації антитілами до OX40 людини, використовуючи антитіла, пов'язані із пластиною. [00062] Фігура 31 демонструє, що гуманізовані і мишачі антитіла до OX40 людини вимагають перехресного зв'язування для посилення T-клітинної проліферації. + + [00063] Фігура 32 демонструє блокування активності CD4 FOXP3 nTregs антитілами до OX40 людини, використовуючи антитіла, пов'язані із пластиною. [00064] Фігура 33 показує, що висока концентрація мишачих антитіл до OX40 людини + переважно вбиває FOXP3 Tregs. [00065] Фігура 34 показує, що мишачі моноклональні антитіла до OX40 людини діють або прямо на ефекторні Т-клітини, або на nTregs для блокування супресивної функції Tregs. [00066] Фігури 35A, 35B і 35C описують результати лікування пухлини у мишей за допомогою + + МАт до hOX40, яким були пересаджені hOX40 CD8 T-клітини. МАт до ОX40 людини поліпшує Tклітинну експансію і виживаність in vivo. На фігурі 35А наведений терапевтичний режим вакцинування. Репрезентативні in vivo біолюмінісцентні зображення наведено на фігурі 35B. Результати лікування пухлини антитілом наведено на фігурі 35C. [00067] Фігура 36 демонструє розташування амінокислотних послідовностей VH 106-222, гуманізованого 106-222 (Hu106) і людського акцептора X61012 (ідентифікаційний номер за Genbank). Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Номери вище послідовностей указують на локалізацію відповідно до Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, також представлені у Списку Послідовностей, і номери позицій можуть бути різними. На фігурі 36 CDR послідовності, визначені Kabat et al. (1991), підкреслені у VH 106-222. Залишки CDR у VH X61012 пропущені на фігурі. Був проведений пошук послідовностей VH людини, гомологічних каркасним ділянкам VH 106-222 у базі даних Genbank, і послідовність VH, яка кодується людською X61012 кДНК (VH X61012), була вибрана як акцептор для гуманізації. Послідовності CDR VH 106-222 були вперше перенесені у відповідні позиції VH X61012. Крім цього, у каркасних ділянках, де тривимірна модель варіабельних областей 106-222 продемонструвала значний контакт із CDR, амінокислотні залишки VH 106-222 миші замінили відповідні залишки людини. Ці заміни були виконані у позиціях 46 і 94 (підкреслено в VH Hu106). Крім того, залишок каркасної ділянки людини, яка виявилася атиповою у відповідній підгрупі області V, був замінений на найбільш типовий залишок, щоб зменшити можливу імуногенність. Ця заміна була виконана у положенні 105 (двічі підкреслено в VH Hu106). [00068] Фігура 37 демонструє розташування амінокислотних послідовностей VL 106-222, гуманізованого 106-222 (Hu106) і людського акцептора AJ388641 (ідентифікаційний номер за Genbank). Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Номери вище послідовностей указують на локалізацію відповідно до Kabat et al. (1991). Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, також представлені у Списку Послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними. Послідовності CDR, визначені Kabat et al. (1), підкреслені у VH 106-222. Залишки CDR у VL AJ388641 пропущені на фігурі. Був проведений пошук послідовностей VL людини, гомологічних каркасним ділянкам VL 106-222, у базі даних Genbank, і послідовність VL, яка кодується людською AJ388641 кДНК (VL AJ388641), була вибрана як акцептор для гуманізації. Послідовності CDR VL 106-222 були вперше перенесені у відповідні позиції VL AJ388641. У каркасних ділянках гуманізованої форми не було проведено ніяких замін. [00069] Фігура 38 демонструє нуклеотидну послідовність гена VH Hu106, оточену сайтами SpeI і HindIII (підкреслене), показані разом з виведеною амінокислотною послідовністю. Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Послідовність сигнального пептиду наведена курсивом. N-кінцевий амінокислотний залишок (Q) зрілої VH має подвійне підкреслення. Послідовності CDR, відповідно до визначення Kabat et al. (1991), підкреслені. Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, наведені в Списку Послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними у Списку Послідовностей. Інтронна послідовність виділена 6 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 курсивом. Фрагмент гена Hu106 VH, оточений SpeI і HindIII, був клонований між відповідними сайтами вектора експресії, як показано на фігурі 23. [00070] Фігура 39 демонструє послідовність нуклеотидів гена VL Hu106-222, оточену сайтами NheI і EcoRI (підкреслене), показані разом з виведеною амінокислотною послідовністю. Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Послідовність сигнального пептиду наведена курсивом. N-кінцевий амінокислотний залишок (D) зрілої VL має подвійне підкреслення. Послідовності CDR відповідно до визначення Kabat et al. (1991) підкреслені. Інтронна послідовність виділена курсивом. Фрагмент гена VL Hu106, оточений NheI і EcoRI, був клонований між відповідними сайтами вектора експресії, як показано на фіг. 23. Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, наведені у Списку послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними у Списку послідовностей. [00071] Фігура 40 демонструє розташування амінокислотних послідовностей VH 119-122, гуманізованого 119-122 (Hu119) і людського акцептора Z14189 (ідентифікаційний номер за Genbank). Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Номери вище послідовностей указують на локалізацію відповідно до Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Послідовності CDR, визначені Kabat et al. (1991), підкреслені у VH 119-122. Залишки CDR VH Z14189 пропущені на фігурі. Був проведений пошук послідовностей VH людини, гомологічних каркасним ділянкам VH 119-122, у базі даних Genbank, і послідовність VH, яка кодується людською Z14189 кДНК (VH Z14189), була вибрана як акцептор для гуманізації. Послідовності CDR VH 119-122 були вперше перенесені у відповідні позиції VH Z14189. Крім того, у каркасних ділянках, де тривимірна модель варіабельних областей 119-122 продемонструвала значний контакт із CDR, амінокислотні залишки VH 119-122 миші замінили відповідні залишки людини. Ці заміни були виконані у позиціях 26, 27, 28, 30 і 47 (підкреслено у послідовності VH Hu119), як показано на фігурі. Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, наведені у Списку послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними у Списку послідовностей. [00072] Фігура 41 демонструє розташування амінокислотних послідовностей VL 119-122, гуманізованого 119-122 (Hu119) і людського акцептора M29469 (ідентифікаційний номер за Genbank). Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Номери вище послідовностей указують на локалізацію відповідно до Kabat et al. (1991). Послідовності CDR, визначені Kabat et al. (1), підкреслені у VL 119-122. Залишки CDR VL M29469 пропущені у послідовності. Був проведений пошук послідовностей VL людини, гомологічних каркасним ділянкам VL 119-122, у базі даних Genbank, і послідовність VL, яка кодується людською M29469 кДНК (VL M29469), була вибрана як акцептор для гуманізації. Послідовності CDR VL 119-122 були вперше перенесені у відповідні позиції VL M29469. У каркасних ділянках гуманізованої форми не було проведено ніяких замін. Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, наведені у Списку послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними у Списку послідовностей. [00073] Фігура 42 демонструє нуклеотидну послідовність гена VH Hu119, оточену сайтами SpeI і HindIII (підкреслене), показані разом з виведеною амінокислотною послідовністю. Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Послідовність сигнального пептиду наведена курсивом. N-кінцевий амінокислотний залишок (Е) зрілої VH має подвійне підкреслення. Послідовності CDR відповідно до визначення Kabat et al. (1991) підкреслені. Інтронна послідовність виділена курсивом. Фрагмент гена Hu119 VH, оточений SpeI і HindIII, був клонований між відповідними сайтами вектора експресії, як показано на фігурі 23. Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, наведені у Списку послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними у Списку послідовностей. [00074] Фігура 43 демонструє послідовність нуклеотидів гена VL Hu119, оточену сайтами NheI і EcoRI (підкреслене), показані разом з виведеною амінокислотною послідовністю. Амінокислотні залишки показані однобуквеним кодом. Послідовність сигнального пептиду наведена курсивом. N-кінцевий амінокислотний залишок (Е) зрілої VL має подвійне підкреслення. Послідовності CDR відповідно до визначення Kabat et al. (1991), підкреслені. Інтронна послідовність виділена курсивом. Фрагмент гена VL Hu119, оточений NheI і EcoRI, був клонований між відповідними сайтами вектора експресії, як показано на фіг. 23. Ті ж послідовності, як заявлено в даному документі, наведені у Списку послідовностей, хоча номери позицій можуть бути різними у Списку послідовностей. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [00075] Термін "антитіло" містить у собі молекулу імуноглобуліну, яка містить чотири поліпептидні ланцюги, дві важкі (H) ланцюги і дві легкі (L) ланцюги, з'єднані між собою дисульфідними зв'язками. Кожен важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга 7 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (скорочено в даному документі як HCVR або VH) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домени CH1, CH2 і CH3. Кожен легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (скорочено в даному документі як LCVR або VL) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга містить один домен CL. VH і VL області можуть бути додатково поділені на області гіперваріабельності, називані гіперваріабельними областями (CDR), що чергуються з областями, які є більш консервативними, називаними каркасними ділянками (FR). Кожен VH і VL складається із трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. [00076] Термін "антиген-зв'язуюча детермінанта" антитіла (або "детермінанта антитіла") містить фрагменти антитіла, які забезпечують здатність специфічно зв'язуватися з антигеном (наприклад, hOX40). Було показано, що антиген-зв'язуюча функція антитіла може забезпечуватися фрагментами повнорозмірного антитіла. Приклади єднальних фрагментів, охоплюваних терміном "антиген-зв'язуюча детермінанта" антитіла, містять у собі (i) Fabфрагмент, моновалентний фрагмент, що складається із доменів VL, VH, CL і СН1; (ii) F(аb') 2фрагмент, бівалентний фрагмент, що містить два Fab-фрагмента, зв'язаних дисульфідним містком в районі шарнірної петлі; (iii) Fd-фрагмент, що складається із доменів VH і CH1; (iv) Fvфрагмент, що складається із доменів VL і VH одного плеча антитіла, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), який складається із домена VH, і (vi) ізольовану гіперваріабельну область (CDR). Крім того, хоча два домена Fv-фрагмента, VL і VH, кодуються окремими генами, вони можуть бути з'єднані за допомогою рекомбінантних способів, використовуючи синтетичний лінкер, який дозволяє їм бути побудованими у вигляді одного білкового ланцюга, у якому області VL і VH паруються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюговий Fv (ScFv); див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; і Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла також визначаються терміном "антиген-зв'язуюча детермінанта" антитіла. Інші форми одноланцюгових антитіл, такі як діатіла, також включені. Діатіла є бівалентними, біспецифічними антитілами, у яких домени VH і VL виражені на одному поліпептидному ланцюзі, але з використанням лінкера, який є занадто коротким, щоб дозволити спарювання між двома доменами одного ланцюга, тим самим змушуючи домени спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і створювати два сайти зв'язування антигена (див., наприклад, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Більше того, антитіло або його антиген-зв'язуюча детермінанта можуть бути частиною більших молекул імуноадгезії, утворених ковалентною або нековалентною асоціацією антитіла або детермінанти антитіла з одним або декількома іншими білками або пептидами. Приклади таких молекул імуноадгезії включають використання області ядра стрептавідину для одержання тетрамірної молекули ScFv (Kipriyanov S.M. et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) і використання залишку цистеїну, маркерного пептиду і С-кінцевої полігістидинової мітки для одержання бівалентних і біотинільованих молекул ScFv (Kipriyanov S.M. et al. (1994) Mol. Immunol., 31:10472 1058). Детермінанти антитіл, такі як Fab і F(аb') -фрагменти, можуть бути отримані із цілих антитіл з використанням традиційних способів, таких як розщеплення папаїном або пепсином, відповідно, цілих антитіл. Більше того, антитіла, детермінанти антитіл і молекули імуноадгезії можуть бути отримані з використанням стандартних способів із застосуванням рекомбінантної ДНК, як описано в даному документі. Кращими антиген-зв'язуючими детермінантами є повні домени або пари повних доменів. [00077] OX40/ліганд OX40 (рецептор OX40)/(OX40L) являють собою пари спів-стимулюючих молекул, які є важливими для Т-клітинної проліферації, виживаності, продукції цитокінів і формування клітин пам'яті. Попередні експерименти in vitro показали, що активація через OX40 + на CD4 Т-клітинах приводила до формування TH2, але не формування TH1. Ці результати знайшли підтримку в дослідженнях in vivo, які продемонстрували, що блокування взаємодії OX40/OX40L запобігало індукції та підтримці TH2-опосередкованих алергійних імунних відповідей. Проте, блокування взаємодії OX40/OX40L поліпшує або запобігає TH1опосередкованим захворюванням. Крім того, приймання розчинного OX40L або перенесення генів OX40L у пухлини продемонстрували сильне підвищення протипухлинного імунітету у мишей. Недавні дослідження також дозволяють припустити, що OX40/OX40L можуть відігравати роль у промотуванні CD8 Т-клітинної імунної відповіді. Як уже згадувалося у даному документі, + + активація OX40 блокує інгібуючу функцію натуральних CD4 CD25 регуляторних Т-клітин, і пара OX40/OX40L відіграє важливу роль у глобальній регуляції периферичного імунітету проти толерантності. 8 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [00078] Терміни "нумерація Kabat", "визначення Kabat" і "маркування Kabat" використовуються в даному документі взаємозамінно. Ці терміни, які прийняті в даній галузі, стосуються системи нумерації амінокислотних залишків, які є більш варіабельними (тобто гіперваріабельними) у порівнянні з іншими амінокислотними залишками варіабельних областей важкого і легкого ланцюга антитіла або його антиген-зв'язуючої детермінанти (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 і, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). [00079] Вираз "рекомбінантне антитіло людини" включає в себе антитіла людини, які підготовлені, експресовані, створені або виділені за допомогою рекомбінантних способів, такі як антитіла, експресовані з використанням рекомбінантного вектора експресії, перенесеного в клітину-хазяїна, антитіла, виділені з рекомбінантної комбінаторної бібліотеки антитіл людини, антитіла, виділені із тварин (наприклад, мишачі), які є трансгенними за генами імуноглобулінів людини (див., наприклад, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), або антитіла, отримані, експресовані, створені або виділені будь-яким іншим способом, які використовують сплайсинг нуклеотидних послідовностей гена імуноглобуліну людини в інші послідовності ДНК. Такі рекомбінантні антитіла людини мають варіабельні і константні області, отримані з послідовностей зародкових ліній імуноглобуліну людини (див. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). [00080] "Виділене антитіло" включає в себе антитіло, яке, по суті, не містить інших антитіл, що мають різні антигенні особливості (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з hOX40, практично не містить антитіла, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від hOX40). Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з hOX40, може зв'язуватися з молекулами OX40 інших видів. Крім того, виділене антитіло може бути, по суті, вільним від іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин. [00081] Термін "активність" включає в себе такі властивості як специфічність /афінність зв'язування антитіла з антигеном, наприклад, антитіло до OX40 людини, яке зв'язується з антигеном OX40, і/або активаційна сила антитіла, наприклад, антитіло до OX40, зв'язування якого з рецептором hOX40 активує біологічну активність hOX40, або активація рецепторного зв'язування в L/OX 40-клітинному аналізі людини. [00082] Термін "Koff", використовуваний у даному документі, призначений для визначення константи швидкості дисоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген. Термін "К d", використовуваний у даному документі, призначений для позначення константи дисоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло. [00083] Вираз "поверхневий плазмонний резонанс" включає в себе оптичне явище, яке дозволяє проводити аналіз біоспецифічних взаємодій у режимі реального часу шляхом виявлення змін у концентрації білка в біосенсорній матриці, наприклад, за допомогою системи BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Для подальших описів див. Приклад 5 і Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; і Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277. [00084] Термін "вектор" включає в себе молекулу нуклеїнової кислоти, здатну транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, до якої вона була приєднана. Одним типом вектора є "плазміда", яка відноситься до кільцевої дволанцюгової ДНК-петлі, у яку можуть лігуватися додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, де додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до автономної реплікації в клітиніхазяїні, у яку вони вбудовані (наприклад, бактеріальні вектори, що мають бактеріальну точку початку реплікації та епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) можуть бути інтегровані в геном клітини-хазяїна при введенні в клітину-хазяїна й, таким чином, реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні направляти експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори в даному документі називаються "рекомбінантні вектори експресії" (або просто "вектори експресії"). Загалом вектори експресії, застосовувані в технології рекомбінантних ДНК, часто перебувають у формі плазмід. У даному описі винаходу "плазміда" і "вектор" можуть бути використані взаємозамінно, оскільки плазміда є найбільш часто використовуваною формою вектора. Проте, мається на увазі, що винахід включає і такі інші форми векторів експресії як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси з дефективною реплікацією, аденовіруси та адено-асоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції. [00085] Фраза "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") включає в себе клітину, у яку був введений рекомбінантний вектор експресії. Слід розуміти, що такі терміни 9 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 призначені не тільки для позначення конкретної клітини, але і для потомства такої клітини. Оскільки можуть відбутися деякі зміни в наступних поколіннях внаслідок або мутації, або впливів навколишнього середовища, таке потомство може не бути насправді ідентичним батьківській клітині, але як і раніше включене в обсяг терміна "клітина-хазяїн", використовуваного в даному документі. [00086] Термін "моноклональне антитіло" (моноклональне антитіло) стосується антитіла або популяції інших антитіл, отриманих з популяції по суті гомогенних антитіл і не повинен бути розтлумачений як імперативне одержання антитіла яким-небудь конкретним способом, включаючи, але не обмежуючись цим, моноклональні антитіла, які можуть бути отримані гібридомним способом, вперше описаним Kohler and Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975), або способами рекомбінантної ДНК. [00087] Термін "химерне антитіло" (або "химерний імуноглобулін") стосується молекули, що містить важкий і/або легкий ланцюг, який ідентичний або гомологічний відповідним послідовностям антитіл, отриманим від конкретного виду або приналежних до антитіл певного класу або підкласу, у той час як інша частина ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям антитіл, отриманим від іншого виду або приналежним до антитіл іншого класу або підкласу, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони проявляють бажану біологічну активність (Cabilly et al. (1984), infra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851). [00088] Термін "гуманізоване антитіло" стосується форм антитіл, які містять послідовності з нелюдських (наприклад, мишачих) антитіл, а також антитіл людини. Гуманізоване антитіло може включати консервативні амінокислотні заміни або ненатуральні залишки того самого або інших видів, які суттєво не змінюють своєї єднальної і/або біологічної активності. Такі антитіла являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, отриману з нелюдських імуноглобулінів. Гуманізовані антитіла переважно являють собою імуноглобуліни людини (антитіло-реципієнт), у яких залишки гіперваріабельної області (CDR) реципієнта замінені залишками CDR нелюдських видів (антитіло-донор), таких як миша, пацюк, верблюд, велика рогата худоба, коза або кролик, що мають необхідні властивості. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не знайдені ні в антитілі-реципієнтові, ні в імпортованій CDR або каркасних ділянках. Ці модифікації здійснені для подальшого поліпшення і максимізації параметрів антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити, по суті, всі щонайменше з одного і, як правило, із двох варіабельних доменів, у яких усі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповідають останнім нелюдського імуноглобуліну, та усі або по суті всі області FR із послідовності імуноглобуліну людини. Також гуманізоване антитіло, необов'язково, буде містити щонайменше ділянку константної області (Fc) імуноглобуліну, як правило, константної області імуноглобуліну людини (див., наприклад, Cabilly et al., U.S. Pat. No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent No. 0,125,023 B1; Boss et al., U.S. Pat. No. 4,816,397; Boss et al., European Patent No. 0,120,694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., European Patent No. 0,194,276 B1; Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539; Winter, European Patent No. 0,239,400 B1; Padlan, E. A. et al., European Patent Application No. 0,519,596 A1; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 86:10029-10033). [00089] Кожне з антитіл, описаних і заявлених у даному документі, можуть бути передані в однині або множині як: "антитіло до OX40"; "антитіло до hOX40"; "моноклональне антитіло до hOX40"; "антитіло до OX40 людини"; "МАт до OX40 людини"; "МАт до hOX40"; "специфічне моноклональне антитіло до hOX40"; "антитіло до OX40L"; "антитіло до hOX40L"; "антитіло до OX40L людини"; "специфічне антитіло до OX40 людини"; "специфічне моноклональне антитіло до OX40 людини"; "специфічне антитіло до OX40 людини"; "антилюдське OX40 специфічне антитіло"; "моноклональне специфічне антитіло до OX40 людини"; "специфічне антитіло до hOХ40"; "специфічне моноклональне антитіло до h-OХ40"; "агоністичне антитіло до hOX40"; "антагоніст hOX40" і/або інші подібні їх варіації. [00090] Як описано в заявці на патент США 11/659 266 під назвою "Methods to Treat Disease States by Influencing the Signaling of OX-40-Receptors and High Throughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof", яка включена в даний документ як посилання, було виявлено, що функцією OX40L є негативна регуляція формування Tr1-клітин, індукованого імуносупресивними препаратами - дексаметазоном і Вітаміном D3, ICOSL або незрілими ДК. Це відкриття демонструє загальний механізм, за допомогою якого OX40L підвищує імунітет і порушує імунологічну толерантність. [00091] За допомогою імуногістологічного аналізу (фіг. 1), внутрішньоклітинного фарбування + (фіг. 2) і сортування клітин (фіг. 3) ми показали, що як ІЛ-10-продукуючі ICOS , так і ICOS-TGF-β+ продукуючі Tregs інфільтрували тканини ФЛ людини. Ці ФЛ-опосередковані FOXP3 Tregs 10 UA 107851 C2 – 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 + – можуть сильно інгібувати проліферацію інфільтруючих пухлину FOXP3 CD4 CD25 Т-клітин у відповідь на попередньо активовані лігандом CD40- аутологічні клітини лімфоми (фіг. 4). + Супресивна активність ICOS Tregs може бути частково заблокована нейтралізуючим анти-ІЛ-10 + антитілом, підтверджуючи роль ІЛ-10-продукуючих ICOS Tregs у ФЛ (фіг. 4). В експерименті на фіг. 2 пухлинні клітини та МКПК були отримані від 7 хворих з початковою діагностикою до лікування. МКПК були також отримані від 7 здорових донорів для порівняння. Відсотки + регуляторних Т-клітин у загальній кількості CD4 Т-клітин визначали за допомогою проточного + + low + цитометричного аналізу CD4 CD25 CD127 FOXP3 Tregs. Фіг. 2А демонструє репрезентативний FACS-аналіз Tregs, а фіг. 2В демонструє відсоток Tregs усіх донорів. + [00092] Було також виявлено, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин із CD4 Т-клітин, індуковане дексаметазоном і вітаміном D3. Відомо, що комбінація імуносупресивних препаратів + дексаметазону і вітаміну D3 стійко індукує диференціювання наївних CD4 Т-клітин в Tr1клітини. Щоб досліджувати, чи може OX40L інгібувати формування і функцію Tr1-клітин, наївні + CD4 T-клітини культивували з моноклональними анти-CD3 плюс анти-CD28 антитілами у присутності або за відсутності OX40L-трансфікованих L-клітин у чотирьох різних умовах культивування, включаючи: (1) Tr1 (дексаметазон і вітамін D3), (2) TH1 (ІЛ-12), (3) TH2 (ІЛ-4) або (4) нейтральне (тільки середовище) протягом 7 днів (фіг. 5А). Продукція ІЛ-10 активізованими Тклітинами була проаналізована внутрішньоклітинним фарбуванням цитокінів та ELISA. [00093] В експериментах на фіг. 5А був проведений внутрішньоклітинний аналіз продукції + + цитокінів наївними CD4 Т-клітинами методом проточної цитометрії. Наївні CD4 T-клітини культивували з моноклональними анти-CD3 та анти-CD28 антитілами у присутності ІЛ-2 на батьківських L-клітинах або OX40L-L-клітинах із зазначеними рекомбінантними цитокінами або реагентами 7 днів. Відсотки відповідних цитокін-продукуючих T-клітин зазначені у кожному профілі дот-блот. Результати показують, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин із наївних + CD4 Т-клітин, індуковане різними поляризаційними сигналами. Як показано на фіг. 5А, від 2 % + до 4 % Tr1-клітин було отримано з наївних CD4 T-клітин, культивованих у нейтральних або TH1, або TH2 умовах. Більше 15 % Tr1-клітин було отримано в культурі з дексаметазоном плюс вітамін D3. Додавання OX40L повністю блокувало формування Tr1-клітин, а також сприяло утвору ФНО-α-продукуючих Т-клітин у всіх культуральних умовах. [00094] Ці дані були підтверджені даними ELISA (фіг. 5В). В експериментах на фіг. 5B + продукція цитокінів наївними CD4 клітинами в супернатантах після повторної стимуляції моноклональними анти-CD3 і анти-CD28 антитілами протягом 24 годин була виміряна за + допомогою ELISA. Наївні CD4 T-клітини культивували з моноклональними анти-CD3 і антиCD28 антитілами у присутності ІЛ-2 на батьківських L-клітинах або OX40L-L-клітинах із зазначеними рекомбінантними цитокінами або реагентами 7 днів. Дані представлені як середнє ± стандартна помилка середнього (SEM) чотирьох незалежних експериментів. Результати показують, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин з наївних CD4+ Т-клітин, індуковане різними поляризаційними сигналами. + [00095] Наївні CD4 Т-клітини, активізовані умовами Tr1 (дексаметазон плюс вітамін D3) + були анергічні і мали здатність пригнічувати проліферацію наївних CD4 Т-клітин у відповідь на моноклональні анти-CD3 плюс анти-CD28 антитіла (фіг. 5С). В експериментах на фіг. 5C супресивну функцію Т-клітин вимірювали поглинанням [3H]тимідину. Суміші зазначених Tклітинних популяцій були повторно стимульовані моноклональними анти-CD3 і анти-CD28 антитілами. Планки погрішностей представляють SEM для трьох лунок. Було виявлено, що + наївні CD4 Т-клітини, активізовані тими ж умовами Tr1 у присутності OX40L, енергійно + проліферували і не інгібували проліферацію наївних CD4 Т-клітин у відповідь на моноклональні анти-CD3 плюс анти-CD28 антитіла. Отримані дані свідчать про те, що OX40L блокує + формування функціональних Tr1-клітин із наївних CD4 Т-клітин, індуковане дексаметазоном і вітаміном D3. + + [00096] Було виявлено, що Tr1-клітини можуть бути отримані з CD4 CD45RA CD45RO Т+ клітин пам'яті і що OX40L може пригнічувати формування Tr1-клітин із CD4 Т-клітин пам'яті. + + CD4 CD45RA CD45RO Т-клітини пам'яті культивували протягом 7 днів з моноклональними анти-CD3 плюс анти-CD28 антитілами у присутності або за відсутності OX40L-трансфікованих Lклітин в умовах Tr1 (дексаметазон плюс вітамін D3). В експериментах фіг. 6А + внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів CD4 T-клітинами пам'яті проводився методом + + проточної цитометрії. CD4 CD45RO CD25 Т-клітини пам'яті культивували з моноклональними анти-CD3, анти-CD28 антитілами та ІЛ-2 на батьківських L-клітинах або OX40L-L-клітинах у присутності або за відсутності дексаметазону плюс вітамін D3 протягом 7 днів. Відсотки відповідних цитокін-продукуючих T-клітин зазначені у кожному профілі дот-блот. Результати + показують, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин з CD4 Т-клітин пам'яті в умовах з 11 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дексаметазоном плюс вітамін D3. Фіг. 6А показує, що велика кількість Tr1-клітин (>20 %) + сформувалася із CD4 T-клітин пам'яті в культурі з дексаметазоном плюс вітамін D3. Додавання OX40L повністю блокувало формування Tr1-клітин і сприяло формуванню ФНО-α-продукуючих + клітин з CD4 Т-клітин пам'яті. + [00097] Здатність дексаметазону плюс вітамін D3 активувати продукцію ІЛ-10 CD4 Тклітинами пам'яті, а також те, що ця здатність може бути інгібована OX40L, було підтверджено + аналізами ІЛ-10 ELISA (фіг. 6B). В експериментах на фіг. 6B продукція ІЛ-10 CD4 Т-клітинами пам'яті була виміряна в супернатантах після повторної стимуляції з моноклональними анти-CD3 і анти-CD28 антитілами протягом 24 годин за допомогою ELISA. Дані представлені як середнє ± SEM чотирьох незалежних експериментів. Результати демонструють, що OX40L інгібує + формування Tr1-клітин із CD4 Т-клітин пам'яті в умовах з дексаметазоном плюс вітамін D3. [00098] Крім того, було виявлено, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин, у той час як інші члени сімейства TNF не інгібують (GITRL і 4-1BBL). У суперсімействі TNF OX40L ліганд індукованого глюкокортикоїдами TNF-рецептора (GITRL) і ліганд 4-1BB (4-1BBL) мають співстимуляційну функцію для Т-клітин. Щоб досліджувати, чи був OX40L унікальним в інгібуванні + Tr1-клітин, наївні CD4 T-клітини культивували з моноклональними анти-CD3 плюс анти-CD28 антитілами з дексаметазоном плюс вітамін D3, з батьківськими L-клітинами або L-клітинами, трансфікованими OX40L, GITRL або 4-1BBL протягом 7 днів. У той час як OX40L, GITRL і 41BBL всі сприяли утворенню ФНО-α-продукуючих клітин, тільки OX40L інгібував формування Tr1-клітин (фіг. 7A і 7B). [00099] В експериментах на фіг. 7A внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів наївними + + CD4 Т-клітинами був проведений методом проточної цитометрії. Наївні CD4 T-клітини культивували з моноклональними анти-CD3, анти-CD28 антитілами та ІЛ-2 на батьківських Lклітинах, OX40L-L-клітинами, GITRL-L-клітинами або 4-1BBL-L-клітинами у присутності дексаметазону плюс вітамін D3 протягом 7 днів. Відсотки відповідних цитокін-продукуючих Tклітин зазначені в кожному профілі дот-блот. Результати показують, що OX40L, але не GITRL, ні 4-1BBL, пригнічує формування Tr1-клітин. + [000100] В експериментах на фіг. 7В ІЛ-10 наївних CD4 клітин був виміряний у супернатантах після повторної стимуляції з моноклональними анти-CD3 і анти-CD28 антитілами протягом 24 годин за допомогою ELISA. Дані представлені як середнє ± SEM чотирьох незалежних експериментів. Результати показують, що OX40L, але не GITRL, не 4-1BBL, пригнічує формування Tr1-клітин. [000101] OX40L, GITRL і 4-1BBL усі сприяли підвищенню загальної кількості Т-клітин (фіг. 7С). В експериментах на фіг. 7С підраховували кількість життєздатних T-клітин. Дані представлені як середнє ± SEM чотирьох незалежних експериментів. [000102] Як зрозуміло фахівцям у даній області, результати на фіг. 7A, 7B і 7C показують, що OX40L, але не GITRL, не 4-1BBL, пригнічує формування Tr1-клітин. Ці дані дозволяють припустити, що серед трьох членів суперсімейства TNF, які спів-стимулюють Т-клітини, OX40L має нову і унікальну функцію інгібування утворення Tr1-клітин. [000103] Крім того, було виявлено, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин, індуковане ICOSL або незрілими ДК. ICOS і CD28 являють собою два позитивних спів-стимулюючих рецептора в сімействі CD28, які експресуються на Т-клітинах. Було показано, що активація + через ICOS агоністичними антитілами або ICOSL промотує CD4 T-клітини продукувати ІЛ-10. Щоб досліджувати, чи може OX40L інгібувати здатність ICOS стимулювати продукцію ІЛ-10 + + CD4 Т-клітинами, наївні та CD4 T-клітини пам'яті культивували з анти-CD3 у присутності ICOSL-трансфікованих L-клітин або ICOSL-трансфікованих L-клітин у присутності OX40L протягом 7 днів. [000104] В експериментах на фіг. 8A внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів + + наївними CD4 T-клітинами був проведений методом проточної цитометрії. Наївні CD4 T-клітини культивували протягом 7 днів на батьківських L-клітинах, на суміші ICOSL-L-клітин та L-клітин або на суміші ICOSL-L-клітин і OX40L-L-клітин, які були попередньо покриті моноклональним анти-CD3 антитілом. Відсотки відповідних цитокін-продукуючих T-клітин зазначені у кожному профілі дот-блот. Результати показують, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин з наївних + CD4 T-клітин, індукованих ICOSL. + [000105] В експериментах на фіг. 8B продукція ІЛ-10 наївними CD4 клітинами була виміряна в супернатантах після повторної стимуляції моноклональними анти-CD3 та анти-CD28 + антитілами протягом 24 годин за допомогою ELISA. Наївні CD4 T-клітини культивували протягом 7 днів на батьківських L-клітинах, на суміші ICOSL-L-клітин і L-клітин або на суміші ICOSL-L-клітин і OX40L-L-клітин, які були попередньо покриті моноклональним анти-CD3 12 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитілом. Дані представлені як середнє ± SEM трьох незалежних експериментів. Результати + показують, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин з наївних CD4 T-клітин, індукованих ICOSL. + [000106] В експериментах на фіг. 8С внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів CD4 T+ клітинами пам'яті був проведений методом проточної цитометрії. CD4 T-клітини пам'яті культивували протягом 7 днів на батьківських L-клітинах, на суміші ICOSL-L-клітин і L-клітин або на суміші ICOSL-L-клітин і OX40L-L-клітин, які були попередньо покриті моноклональним антиCD3 антитілом. Відсотки відповідних цитокін-продукуючих T-клітин зазначені в кожному профілі + дот-блот. Результати показують, що OX40L інгібує формування Tr1-клітин із CD4 T-клітин пам'яті, індукованих ICOSL. + [000107] В експериментах на фіг. 8D продукція ІЛ-10 CD4 T-клітинами пам'яті була виміряна в супернатантах після повторної стимуляції моноклональними анти-CD3 і анти-CD28 антитілами + протягом 24 годин за допомогою ELISA. CD4 T-клітини пам'яті культивували протягом 7 днів на батьківських L-клітинах, на суміші ICOSL-L-клітин і L-клітин або на суміші ICOSL-L-клітин і OX40L-L-клітин, які були попередньо покриті моноклональним анти-CD3 антитілом. Дані представлені як середнє ± SEM трьох незалежних експериментів. Результати показують, що + OX40L інгібує формування Tr1-клітин із CD4 T-клітин пам'яті, індукованих ICOSL. [000108] Результати експериментів на фіг. 8A, 8B, 8C і 8D показують, що ICOSL значно + сприяв утворенню Tr1-клітин як з наївних, так і з CD4 T-клітин пам'яті. Додавання OX40L + повністю інгібувало формування Tr1-клітин як з наївних, так і з CD4 T-клітин пам'яті, у той же час значно промотуючи формування ФНО-α-продукуючих клітин. [000109] Відомо, що незрілі ДК або ДК, оброблені ІФН-α або ІЛ-10, можуть індукувати наївні + CD4 T-клітини до диференціювання в Tr1-клітини. Було досліджено, чи може OX40L інгібувати формування Tr1-клітин, індуковане ДК. Як показано на фіг. 8E, незрілі ДК або ДК, оброблені + ІФН-α або ІЛ-10, усі індукували формування Tr1-клітин з наївних CD4 T-клітин більш ніж на 10 %. На противагу цьому ДК, активовані CD40L, індукують сильну TH1-відповідь, яка супроводжується формуванням близько 3 % Tr1-клітин. Додавання рекомбінантного OX40L у ДК-T-клітинні культури повністю інгібувало формування Tr1-клітин, індуковане незрілими ДК і ДК, обробленими ІЛ -10 та ІФН-α. Крім того, OX40L також інгібувало формування залишкової кількості Tr1-клітин, індуковане CD40L-активованими зрілими ДК. В експериментах на фіг. 8E + внутрішньоклітинний аналіз продукції цитокінів наївними CD4 T-клітинами був проведений + методом проточної цитометрії. Наївні CD4 T-клітини співкультивували у присутності або за відсутності розчинного рекомбінантного OX40L протягом 7 днів з незрілими ДК або ДК, культивованими з ІФН-α, ІЛ-10 і CD40L. Відсотки відповідних цитокін-продукуючих T-клітин зазначені в кожному профілі дот-блот. Результати показують, що OX40L інгібує формування + Tr1-клітин із CD4 T-клітин, індукованих ДК. [000110] Здатність OX40L інгібувати формування Tr1-клітин, індуковане ДК, була підтверджена даними ELISA (фіг. 8F). В експериментах на фіг. 8F продукція ІЛ-10 наївними + CD4 клітинами була виміряна в супернатантах після повторної стимуляції з моноклональними + анти-CD3 та анти-CD28 антитілами протягом 24 годин за допомогою ELISA. Наївні CD4 Tклітини співкультивували у присутності або за відсутності розчинного рекомбінантного OX40L протягом 7 днів з незрілими ДК або ДК, культивованими з ІФН-α, ІЛ -10 і CD40L. Дані представлені як середнє ± SEM трьох незалежних експериментів. Результати показують, що + OX40L інгібує формування Tr1-клітин із CD4 T-клітин, індукованих ДК. Таким чином, ці дані показують, що OX40L може інгібувати формування Tr1-клітин, індуковане великою кількістю фізіологічних сигналів, переданих ICOSL і ДК. [000111] Раніше було припущено, що регуляторні Т-клітини високо представлені в Bклітинній області неходжкінської лімфоми і що В-клітини беруть участь у нагромадженні регуляторних Т-клітин в області лімфоми. Було досліджено, чи може вплив на активацію рецептора OX40, наприклад, за допомогою OX40L, забезпечити терапію проти B-клітинної лімфоми. Кріоконсервовані зразки від пацієнтів з B-клітинною лімфомою були використані для оцінки здатності OX40L відключати Tr1-клітини. Використовуваними зразками була фолікулярна 6 лімфома, отримана зі зразка селезінки до будь-якого лікування. Клітини відтавали, з 400 × 10 6 6 заморожених клітин одержували 127 × 10 живих клітин і 33,9 × 10 мертвих клітин (79 % + виживаності). Достатня кількість CD25 клітин було виявлено шляхом FACS-фарбування. В + експериментах на фіг. 9 секрецію ІЛ-10 ІЛ-10-продукуючими ICOS Tregs визначали за допомогою ELISA. Treg клітини культивували у двох різних умовах. В умові 1 клітини + + CD25 /ICOS культивували з анти-CD3 у присутності ІЛ-2 (900 мкл/мл) на батьківських Lклітинах або OX40L-L-клітинах з анти-ICOS-антитілом протягом 3-6 днів. В умові 2 клітини + + CD25 /ICOS культивували з анти-CD3 у присутності ІЛ-2 (900 мкл/мл) на ICOS-L-L-клітинах або суміші OX40L-L інфільтрованих ICOS-L-L-клітин від 3 до 6 днів. Продукцію цитокінів у 13 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 супернатантах вимірювали за допомогою ELISA. Результати показують, що OX40L значно інгібує продукцію ІЛ-10 Treg-клітинами. [000112] Отримані результати того, що OX40L має здатність інгібувати формування і функцію Tr1-клітин, індуковані імуносупресивними препаратами - дексаметозоном плюс вітамін D3, ICOSL або ДК; підкреслює новий механізм, за допомогою якого OX40L підвищує імунітет і порушує толерантність у різних формах CD4- або CD8-опосередкованих імунних відповідей, що зрозуміло фахівцям у даній області. Здатність OX40L інгібувати формування Tr1-клітин під час як ІЛ-12-індукованих TH1, так і ІЛ-4-індукованих TH2 відповідей дає підстави припускати, що OX40L може контролювати силу TH1- або TH2-опосередкованих імунних відповідей. Крім того, здатність OX40L інгібувати формування Tr1-клітин представляється унікальною властивістю OX40L, оскільки два інших члена сімейства TNF – GITRL і 4-1BBL - не мають цієї функціональної властивості. Більше того, здатність OX40L інгібувати продукцію ІЛ-10 Tregклітини визначає OX40L як сильні ліки проти B-клітинної лімфоми та інших видів раку. [000113] Було виявлено багато молекул, які промотують утворення Tr1-клітин, включаючи ІЛ-10, ІФН-α, ICOSL та імуносупресивні сполуки, такі як дексаметазон плюс вітамін D3. OX40L + являє собою потужний інгібітор утворення Tr1-клітин не тільки з наївних CD4 T-клітин, але й із + CD4 T-клітин пам'яті і регуляторних T-клітин. Ця нова властивість OX40/OX40L може пояснити недавній звіт, який показує, що активація OX40 дозволяє анергічним аутореактивним Т-клітинам набути ефекторних клітинних функцій. Таким чином, таргетинг OX40/OX40L забезпечує лікарські засоби проти алергійних та аутоімунних захворювань людини, а також для розробки препаратів для лікування інфекційних захворювань людини і раку, включаючи, але не обмежуючись цим, меланому, рак мозку, рак кістки, лейкоз, лімфому, епітеліальну неоплазію (епітеліальний рак), таку як базальноклітинна карцинома, аденокарцинома, рака шлунковокишкового тракту, такий як рак губи, рак порожнини рота, рак стравоходу, рак тонкої кишки та рак шлунка, рак товстої кишки, рак печінки, рак сечового міхура, рак підшлункової залози, рак яєчників, рак шийки матки, рак легенів, рак молочної залози і рак шкіри, такий як плоскоклітинний рак і базальний рак, рак передміхурової залози, нирково-клітинну карциному та інші відомі види раку. [000114] Порушення або стани, яким можна запобігти або лікувати антитілами і способами, описаними в даному документі, включають профілактику або лікування раку, такого як шкірний Т-клітинний лейкоз, пухлини голови і шиї, рак підшлункової залози, рак сечового міхура, гліома високого ступення злоякісності, метастази мозку, меланома, рак шкіри, рак легенів, рак молочної залози, рак передміхурової залози, рак товстої кишки, лейкоз, мієлодиспластичний синдром (передлейкозний стан) і множинна мієлома. Загалом, метастазам будь-якого раку можливо запобігти або лікувати сполуками і способами, описаними в даному документі. Антитіла також можуть бути використані для запобігання або лікування проліферативних станів кровоносних судин, включаючи талангектазію, венозні ангіоми, гемангіобластому. Інші порушення, захворювання або стани включають вірусні захворювання, деякі з яких можуть традиційно вважатися "невиліковними". Антитіла, наприклад, можуть також бути використані для класифікації штамів одного патогена. Дослідники можуть використовувати антитіла, описані в даному документі, щоб ідентифікувати та відслідковувати специфічні клітини або молекули в організмі. [000115] Як правило, терміни "рак" і "раковий" стосуються або описують фізіологічний стан у ссавців, який звичайно характеризується неконтрольованим ростом клітин. Зокрема, рак, який можна лікувати або запобігати за допомогою одного або більше антитіл, описаних у даному документі, або їх варіантів, включає, але не обмежується цим, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Більш конкретні приклади такого раку включають як необмежуючі приклади плоскоклітинний рак, рак легенів (у тому числі дрібноклітинний рак легенів, недрібноклітинний рак легенів, аденокарциному легенів і плоскоклітинний рак легенів), рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунка (у тому числі рак шлунково-кишкового тракту і гастроінтестинальний стромальний рак), рак підшлункової залози, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки, колоректальний рак, карциному ендометрія або карциному матки, карциному слинної залози, рак нирки і ренальний рак, рак печінки, рак передміхурової залози, рак вульви, рак щитовидної залози, карциноми печінки і різні типі раку голови та шиї, меланому, меланому, яка поширюється поверхово, меланому типу злоякісного лентіго, акральні лентігінозні меланоми, вузлові меланоми, а також B-клітинну лімфому (у тому числі низькодиференційовану/фолікулярну неходжкінську лімфому (НХЛ); дрібнолімфоцитарну (ДЛ) НХЛ, середньої диференціації/фолікулярну НХЛ, дифузійну НХЛ середньої диференціації, імунобластну злоякісну НХЛ, лімфобластну злоякісну НХЛ, злоякісну дрібноклітинну НХЛ із 14 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нерозщепленим ядром, генералізовану лімфаденопатичну НХЛ; лімфому клітин мантії; Снідасоційовану лімфому; і макроглобулунемію Вальденстрема); хронічний лімфолейкоз (ХЛЛ); гострий лімфобластний лейкоз (ГЛЛ); волосатоклітинний лейкоз, хронічний мієлобластний лейкоз; і посттрансплантаційне лімфопроліферативне захворювання (ПТЛЗ), а також анормальну проліферацію судин, пов'язану з факоматозом, набряк (наприклад, асоційований з пухлинами головного мозку) і синдром Мейгса. [000116] Способи лікування або профілактики імунного порушення також наведені в даному документі. Ці способи включають введення ефективної кількості антитіла суб'єктові, який потребує такого лікування. У деяких варіантах втілення винаходу імунологічне порушення - це імунологічне порушення або аутоімунологічне порушення. Цим порушенням є астма, атопічний дерматит, алергійний риніт, запальне захворювання кишечника, розсіяний склероз, РТПХ і/або системний червоний вовчак. У деяких варіантах втілення винаходу порушення - це захворювання, асоційоване з вірусом, бактеріями або іншим інфекційним агентом. [000117] Крім того, антитіла і способи, описані в даному документі, можуть бути використані для профілактики або лікування запальних захворювань і станів, таких як остеоартрит, ревматоїдний артрит, хвороба Крона, виразковий коліт, та аутоімунних захворювань, таких як вовчак і змішані аутоімунні захворювання. Наприклад, антитіла, описані в даному документі, можуть бути корисні в лікуванні різних аутоімунних і запальних захворювань, які включають стадію введення терапевтично ефективної кількості антитіла суб'єктові, який цього потребує, де аутоімунним захворюванням або запальним захворюванням є одне або більше із наступних захворювань: інсулінозалежний цукровий діабет (ІЗЦД), цукровий діабет, розсіяний склероз, експериментальний аутоімунний енцефаломієліт, гострий розсіяний енцефаломієліт, артрит, ревматоїдний артрит, експериментальний аутоімунний артрит, міастенія гравіс, тиреоїдит, хвороба Хашимото, первинна мікседема, тиреотоксикоз, перниціозна анемія, аутоімунний атрофічний гастрит, хвороба Адісона, передчасна менопауза, чоловіча безплідність, ювенільний діабет, синдром Гудпасчера, вульгарний пемфігус, пемфігоїд, симпатична офтальмія, фагогенний увеїт, аутоімунна гемолітична анемія, ідіопатична лейкопенія, первинний біліарний цироз, активний хронічний гепатит Hbs-vе, криптогенний цироз, виразковий коліт, синдром Шегрена, склеродермія, гранулематоз Вегенера, поли/дерматоміозит, дискоїдний ЧВ, системний червоний вовчак, хвороба Крона, псоріаз, анкілозуючий спондиліт, синдром антифосфоліпідних антитіл, апластична анемія, аутоімунний гепатит, целіакія, хвороба Грейвса, синдром Гійена-Барре (СГБ), ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, опсоклонусміоклонус синдром (OMС), неврит зорового нерва, тиреоідит Орда, пемфігус, поліартрит, первинний біліарний цироз, синдром Рейтера, Такаясу, темпоральний артериїт, теплова аутоімунна гемолітична анемія, гранулематоз Вегенера, алопеція універсальна, хвороба Бехчета, хвороба Чагаса, синдром хронічної втоми, дизавтомія, ендометріоз, гнійний гідраденіт, інтерстиціальний цистит, нейроміотонія, саркоїдоз, склеродермія, виразковий коліт, витиліго, вульводинія, запальні захворювання шкіри, алергійний контактний дерматит; гастрит, асоційований з H. pylory, хронічна закладеність носа, атеросклероз і реакція "трансплантат проти хазяїна". [000118] Зокрема, "аутоімунне захворювання", про яке говориться в даному документі, - це захворювання або розлад, викликаний і спрямований проти власних тканин або органів індивіда або спільна косегрегація, або їх прояв, або викликаний цим стан. Аутоімунне захворювання може відноситися до стану, який є результатом або погіршується продукцією антитіл Вклітинами, які є реактивними на нормальні тканини організму і антигени. Крім того, аутоімунним захворюванням є захворювання, яке може містити в собі секрецію аутоантитіл, які є специфічними для епітопа аутоантигена (наприклад, ядерний антиген). [000119] Аутоімунні захворювання або порушення, які піддаються лікуванню і/або запобігаються за допомогою одного або більше із антитіл, описаних у даному документі, включають як необмежуючі приклади артрит (ревматоїдний артрит, такий як гострий артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагру або подагричний артрит, гострий подагричний артрит, гострий імунологічний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, індукований колагеном II типу артрит, інфекційний артрит, артрит Лайма, проліферативний артрит, псоріатичний артрит, хвороба Стілла, хребетний артрит і ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит, хронічний прогресуючий артрит, деформуючий артрит, первинний хронічний поліартрит, реактивний артрит, анкілозуючий спондилоартрит), запальні гіперпроліферативні захворювання шкіри, псоріаз, такий як бляшковидний псоріаз, каплевидний псоріаз, пустульозний псоріаз і псоріаз нігтів, атопія, у тому числі такі атопичні захворювання як сінна лихоманка і синдром Джоба, дерматит, включаючи контактний дерматит, хронічний контактний дерматит, ексфоліативний дерматит, алергійний дерматит, алергійний контактний дерматит, 15 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 герпетиформний дерматит, монетовидний дерматит, себорейний дерматит, неспецифічний дерматит, первинний дратівний контактний дерматит та атопічний дерматит, х-зчеплений гіперIgМ-синдром, алергійні інтраокулярні запальні захворювання, кропивницю, таку як хронічна алергійна кропивниця і хронічна ідіопатична кропивниця, включаючи хронічну аутоімунну кропивницю, міозит, поліміозит/дерматоміозит, ювенільний дерматоміозит, токсичний епідерммальний некроліз, склеродермію (включаючи системну склеродермію), склероз, такий як системний склероз, розсіяний склероз (РС), такий як спинооптичний РС, первинний прогресуючий РС (ППРС) і ремітуючо-рецидивуючий РС (РРРС), прогресуючий системний склероз, атеросклероз, артеріосклероз, хвороба Шарко-Вюльпіана, атаксичний склероз, оптиконейромієліт (NMO), запальні захворювання кишечника (ВЗК) (наприклад, хвороба Крона, аутоімуноопосередковані гастроінтестинальні захворювання, коліт, такий як неспецифічний виразковий коліт, виразковий коліт, мікроскопічний коліт, колагеновий коліт, поліпозний коліт, некротизуючий ентероколіт і трансмуральний коліт, та аутоімунне запальне захворювання кишечника), запалення кишечника, гангренозну піодермію, вузликову еритему, первинний склерозуючий холангіт, респіраторний дистрес-синдром, який включає респіраторний дистрессиндром дорослих або гострий респіраторний дистрес-синдром (ГРДС), менінгіт, запалення всієї або частини судинної оболонки ока, ірит, хоріоідит, аутоімунне гематологічне порушення, ревматоїдний спондиліт, ревматоїдний синовіт, спадковий ангіоневротичний набряк, ушкодження черепного нерва як при менінгіті, гестаційний герпес, пемфігоїд вагітних, сверблячка мошонки, аутоімунне передчасне згасання функції яєчників, раптова втрата слуху внаслідок аутоімунного стану, IgЕ-опосередковані захворювання, такі як анафілаксія та алергійний і атопічний риніт, енцефаліт, такий як енцефаліт Расмуссена і лімбічний енцефаліт і/або енцефаліт стовбура головного мозку, увеїт, такий як передній увеїт, гострий передній увеїт, гранулематозний увеїт, негранулематозний увеїт, факоантигенний увеїт, задній увеїт, або аутоімунний увеїт, гломерулонефрит (ГН) з нефротичним синдромом і без нього, такий як хронічний або гострий гломерулонефрит, такий як первинний ГН, імуноопосередкований ГН, мембранозний ГН (мембранозна нефропатія), ідіопатичний мембранозний ГН або ідіопатична мембранозна нефропатія, мембрано- або мембранозно-проліферативний ГН (МПГН), у тому числі тип I і тип II, швидко прогресуючий ГН, проліферативний нефрит, аутоімунна полігландулярна ендокринна недостатність, баланіт, включаючи обмежений плазмоклітинний баланіт, баланопостит, відцентрова кільцеподібна еритема, стійка дисхромічна еритема, мультиформна еритема, кільцевидна гранульома, блискучий лишай, склеротичний атрофічний лишай, простий хронічний лишай, шпильковидний лишай, плоский лишай, ламелярний іхтіоз, епідермолітичний гіперкератоз, передраковий кератоз, гангренозна піодермія, алергійні стани і відповіді, алергійна реакція, екзема, включаючи алергійну або атопічну екзему, астеатозну екзему, дисгідротичну екзему та пухирчасту долонно-підошовну екзему, астму, таку як бронхіальна астма та аутоімунна астма, стани, що включають інфільтрацію T-клітин і хронічні запальні відповіді, імунні реакції проти чужорідних антигенів, такі як групи крові A-B-О плоду при вагітності, хронічне легеневе запальне захворювання, аутоімунний міокардит, недостатність адгезії лейкоцитів, вовчак, включаючи вовчаковий нефрит, вовчаковий енцефаліт, педіатричний вовчак, небруньковий вовчак, екстраренальний вовчак, дискоїдний вовчак та дискоїдний червоний вовчак, вовчакову алопецію, системний червоний вовчак (СЧВ), такий як шкірний СЧВ або підгострий шкірний СЧВ, неонатальний вовчаковий синдром (NLE), і дисемінований червоний вовчак, юнацький (типу I) цукровий діабет, включаючи дитячий інсулін-залежний цукровий діабет (ІЗЦД), цукровий діабет дорослих (діабет типу II), аутоімунний діабет, ідіопатичний нецукровий діабет, діабетичну ретинопатію, діабетичну нефропатію, діабетичне порушення великих артерій, імунні відповіді, асоційовані з гострою або уповільненою гіперчутливістю, опосередкованою цитокінами та T-лімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, гранулематоз, включаючи лімфоматоїдний гранулематоз, гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкуліти, включаючи васкуліт, васкуліт великих судин (включаючи ревматичну поліміалгію та гігантоклітинний (Такаясу) артериїт), васкуліт судин середнього калібру (включаючи хворобу Кавасакі і вузликовий полиартериит/вузликовий периартериїт), мікроскопічний поліартериїт, імуноваскуліт, васкуліт ЦНС, шкірний васкуліт, васкуліт внаслідок гіперчутливості, некротизуючий васкуліт, такий як системний некротизуючий васкуліт та АНЦАасоційований васкуліт, такий як васкуліт Черджа-Стросса або синдром (СЧС) і АНЦАасоційований васкуліт судин дрібного калібру, темпоральний артериїт, апластичну анемію, аутоімунну апластичну анемію, анемію з позитивним тестом Кумбса, анемію ДаймондаБлекфана, гемолітичну анемію або імунну гемолітичну анемію, включаючи аутоімунну гемолітичну анемію (АІГА), перниціозну анемію (anemia perniciosa), хворобу Адісона, дійсну еритроцитарну анемію або аплазію (ДЕА), дефіцит фактора VIII, гемофілію A, аутоімунну 16 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нейтропенію, панцитопенію, лейкопенію; захворювання, що включають діапедез лейкоцитів, запальні порушення ЦНС, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, синдром поліорганного ушкодження, такий як вторинні синдроми септицемії, травми або крововиливи, опосередковані комплексами антиген-антитіло захворювання, хворобу антитіл до базальної мембрани клубочків, синдром антифосфоліпідних антитіл, алергійний неврит, хвороба/синдром Бехчета, синдром Кастлмена, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стівенса-Джонсона, пемфігоїд, такий як бульозний пемфігоїд і пемфігоїд шкіри, пемфігус (у тому числі вульгарний пемфігус, ексфоліативна пухирчатка, пемфігусний пемфігоїд слизової оболонки та пемфігусний еритематоз), аутоімунні поліендокринопатії, хворобу Рейтера або синдром, термічну травму, прееклампсію, порушення внаслідок імунних комплексів, таке як нефрит імунних комплексів, антитілоопосередкований нефрит, полінейропатію, хронічну нейропатію, таку як IgМ-полінейропатії або IgМ-опосередкована нейропатія, тромбоцитопенію (наприклад, яка розвивається у пацієнтів з інфарктом міокарда), включаючи тромботичну тромбоцитопенічну пурпуру (ТТП), посттрансфузійну пурпуру (ПТП), гепариніндуковану тромбоцитопенію та аутоімунну або імуноопосередковану тромбоцитопенію, таку як ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ІТП), включаючи хронічну або гостру ІТП, склерит, такий як ідіопатичний кератосклерит, епісклерит, аутоімунне захворювання сім'яників і яєчників, включаючи аутоімунний орхит та оофорит, первинний гіпотиреоз, гіпопаратиреоз, аутоімунні ендокринні захворювання, включаючи тиреоїдит, такий як аутоімунний тиреоїдит, хворобу Хашимото, хронічний тиреоїдит (тиреоїдит Хашимото), або підгострий тиреоїдит, аутоімунну хворобу щитовидної залози, ідіопатичний гіпотиреоз, хворобу Грейвса, полігландулярні синдроми, такі як аутоімунні полігландулярні синдроми (або полігландулярні ендокринопатичні синдроми), паранеопластичні синдроми, включаючи неврологічні паранеопластичні синдроми, такі як міастенічний синдром Ламберта-Ітона або синдром Ламберта-Ітона, синдром завмерлої людини або завмерлого індивідуума, енцефаломієліт, такий як алергійний енцефаломієліт та експериментальний алергійний енцефаломієліт (ЕАЕ), міастенію гравіс, таку як асоційовану з тимомою міастенію гравіс, дегенерацію мозочка, нейроміотонію, опсоклонус або опсоклонусміоклонус синдром (OMС) і сенсорну нейропатію, мультифокальну моторну нейропатію, синдром Шихана, аутоімунний гепатит, хронічний гепатит, вовчаковий гепатит, гігантоклітинний гепатит, хронічний активний гепатит або аутоімунний хронічний активний гепатит, лімфоїдний інтерстиціальний пневмоніт (ЛІП), облітеруючий бронхіоліт (нетрансплантатний) проти NSIP, синдром Гійена-Барре, хвороба Бергера (IgА-нефропатія), ідіопатичну IgА-нефропатію, лінійний IgА дерматоз, гострий фебрильний нейтрофільний дерматоз, субкорнеальний пустульозний дерматоз, транзиторний акантолітичний дерматоз, цироз, такий як первинний біліарний цироз і пневмоноцироз, аутоімунний синдром ентеропатії, целіакію, целіакію-спру (глютенова ентеропатія), рефракторну спру, ідіопатичну спру, кріоглобулінемію, бічний аміотрофічний склероз (БАС, хвороба Лу Геріга), ішемічну хворобу серця, аутоімунне захворювання вух, таке як аутоімунне захворювання внутрішнього вуха (АЗВВ), аутоімунна втрата слуху, поліхондрит, такий як рефракторний або рецидивуючий поліхондрит, легеневий альвеолярний протеїноз, синдром Когана/несифілітичний інтерстиціальний кератит, параліч Белла, хвороба/синдром Світа, аутоімунна розацеа, біль, пов'язаний з оперізувальним лишаєм, амілоїдоз, незлоякісний лімфоцитоз, первинний лімфоцитоз, який включає B-клітинний лімфоцитоз (наприклад, доброякісну моноклональну гамапатію та моноклональну гамапатію невизначеного значення, МГНЗ), периферичну нейропатію, паранеопластичний синдром, каналопатії, такі як епілепсія, мігрень, аритмія, м'язові порушення, глухота, сліпота, періодичний параліч і каналопатії ЦНС, аутизм, запальна міопатію, фокальний або сегментарний, або фокально-сегментарний гломерулосклероз (ФСГС), ендокринну офтальмопатію, увеоретиніт, хориоретиніт, аутоімунне гепатологічне порушення, фіброміалгію, множинну ендокринну недостатність, синдром Шмідта, адреналіт, атрофію шлунка, пресенільну деменцію, демієлінізуючі захворювання, такі як аутоімунні демієлінізуючі захворювання і хронічну запальну демієлінізуючу полінейропатію, синдром Дресслера, осередкову алопецію, тотальну алопецію, CREST-синдром (кальциноз, феномен Рейно, езофагальна дискенезія, склеродактилія та телангіектазія), чоловічу та жіночу аутоімунну безплідність, наприклад, внаслідок антитіл до сперматозоїдів, змішане ураження сполучної тканини, хворобу Чагаса, ревматичну лихоманку, звичний викидень, легеня фермера, мультиформну еритему, посткардіотомічний синдром, синдром Кушинга, легеня птахівника, алергійний гранульоматозний ангиїт, доброякісний лімфоцитарний ангиїт, синдром Альпорта, альвеоліт, такий як алергійний альвеоліт і фіброзуючий альвеоліт, інтерстиціальне захворювання легенів, трансфузійну реакцію, лепру, малярію, паразитарні захворювання, такі як лейшманіоз, кіпаносоміоз, шистозомоз, аскаридоз, аспергілез, синдром Семптера, синдром Каплана, денге, ендокардит, ендоміокардіальний фіброз, дифузійний інтерстиціальний фіброз 17 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 легенів, інтерстиціальний фіброз легенів, фіброз легенів, ідіопатичний фіброз легенів, муковісцидоз, ендофтальміт, стійку еритему, яка піднімається, еритробластоз плоду, еозинофільний фаcциїт, синдром Шульмана, синдром Фелті, фларіаз, цикліт, такий як хронічний цикліт, гетерохронний цикліт, іридоцикліт (гострий або хронічний) або цикліт Фуксу, пурпуру Шенлейн-Геноха, інфекцію вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), ТКІН, синдром набутого імундефіциту (СНІД), еховірусну інфекцію, сепсис, ендотоксемію, панкреатит, тиреотоксикоз, парвовірусну інфекцію, інфекцію вірусом краснухи, поствакцинальні синдроми, уроджену інфекцію краснухи, інфекцію вірусом Епштейна-Барра, епідемічний паротит, синдром Евана, аутоімунне ураження гонад, хорею Сиденгама, постстрептококовий нефрит, облітеруючий тромбангіїт, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозку, хориоїдит, гігантоклітинну поліміалгію, хронічний гіперчутливий пневмоніт, сухий кератокон'юнктивіт, епідемічний кератокон'нктивіт, ідіопатичний нирковий синдром, нефропатію з мінімальними змінами, доброякісну сімейну недостатність і недостатність внаслідок ішемії-реперфузії, реперфузію трансплантованого органа, аутоімунну реакцію на сітківку, запалення суглобів, бронхіт, хронічну обструктивну хворобу дихальних шляхів/легенів, силікоз, афту, афтозний стоматит, артеріосклеротичні порушення, асперніогенез, аутоімунний гемоліз, хворобу Бека, кріоглобулінемію, контрактуру Дюпюітрена, факоанафілактичну ендофтальмію, алергійний ентерит, лепрозну вузликову еритему, ідіопатичний лицьовий параліч, синдром хронічної втоми, ревматичну лихоманку, хворобу Хаммена-Річа, сенсоневральну втрату слуху, пароксизмальну гемоглобінурію, гіпогонадизм, регіональний ілеїт, лейкопенію, інфекційний мононуклеоз, поперечний мієліт, первинну ідіопатичну мікседему, нефроз, симпатичну офтальмію, гранульоматозний орхит, панкреатит, гострий полірадикуліт, гангренозну піодермію, тиреоїдит Квервайна, набуту атрофію селезінки, незлоякісну тимому, вітиліго, синдром токсичного шоку, харчове отруєння, стани, які включають інфільтрацію T-клітин, недостатність адгезії лейкоцитів; імунні відповіді, асоційовані з гострою або уповільненою гіперчутливістю, опосередкованою цитокінами та Tлімфоцитами; захворювання, які включають лейкоцитарний діапедез, синдром поліорганної недостатності; захворювання, опосередковані комплексами антиген-антитіло; захворювання, обумовлене антитілами до базальної мембрани клубочків; алергійний неврит, аутоімунні поліендокринопатії, оофорит, первинну мікседему, аутоімунний атрофічний гастрит, симпатичну офтальмію, ревматичні захворювання, змішане ураження сполучної тканини, нефротичний синдром, інсуліт, поліендокринна недостатність, аутоімунний полігландулярний синдром типу I, ідіопатичний гіпопаратиреоз дорослих (AOIH), кардіоміопатію, таку як дилатаційна кардіоміопатія, набутий бульозний епідермоліз (НБЕ), гемохроматоз, міокардит, нефротичний синдром, первинний склерозуючий холангіт, гнійний або негнійний синусит, гострий або хронічний синусит, етмоїдний, фронтальний, максилярний або сфеноїдний синусит; порушення, пов'язане з еозинофілами, таке як еозинофілія, легенева інфільтруюча еозинофілія, синдром еозинофілії-міалгії, синдром Лефлера, хронічну еозинофільну пневмонію, тропічну легеневу еозинофілію, бронхопневмонічний аспергілез, аспергілему або гранульоми, які містять еозинофіли, анафілаксію, серонегативні спондилоартрити, поліендокринне аутоімунне захворювання, склерозуючий холангіт, склерозний, епісклерозний, хронічний шкірно-слизовий кандидоз, синдром Брутона, перехідну гіпогамаглобулінемію дитячого віку, синдром ВіскоттаОлдрича, синдром атаксії-телеангіектазії, ангіектазію, аутоімунні порушення, асоційовані з колагеновим захворюванням, ревматизм, неврологічну хворобу, лімфаденіт, зниження артеріального тиску спрацьовування, судинну дисфункцію, ушкодження тканин, серцевосудинну ішемію, гіпералгезію, ниркову ішемію, ішемію головного мозку і захворювання, яке супроводжує васкуляризацію, алергійні розлади чутливості, гломерулонефрити, реперфузійне ушкодження, ішемічне реперфузійне ушкодження, реперфузійна травму міокардіальної або інших тканин, лімфоматозний трахеобронхіт, запальні дерматози, дерматози з гострими запальними компонентами, поліорганну недостатність, бульозні захворювання, нирковий кортикальний некроз, гострий гнійний менінгіт або інші запальні порушення центральної нервової системи, окулярні та орбітальні запальні порушення, гранулоцитарні синдроми, асоційовані із трансфузією, індуковану цитокінами токсичність, нарколепсію, гостре важке запалення, хронічне запалення, яке не піддається лікуванню, пієліт, ендартеріальну гіперплазію, пептичну виразку, вальвуліт та ендометріоз. [000120] Антитіла, описані в даному документі, можуть мати різне наукове, медичне і комерційне використання. Антитіла можуть бути використані в різних типах діагностичних тестів, наприклад, для виявлення широкого спектру захворювань або наявності препаратів (лікарських засобів), токсинів або інших білків, у тому числі гормонів або in vitro, або in vivo. Антитіла, описані в даному документі, можуть бути корисні при тестуванні на наявність хвороби, наприклад, у сироватці або крові пацієнтів. Хвороба може включати OX40-опосередковані 18 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 захворювання або захворювання, або показання, не пов'язані із OX40, у тому числі різні види раку, запальне або аутоімунне захворювання. Антитіла також можуть бути використані в радіоімуноаналізі та радіоімунотерапії раку, а деякі нові способи тестування можуть використовувати ці описані антитіла для націлювання тільки на клітинні мембрани специфічних типів клітин, наприклад, раку. [000121] Антитіла, описані в даному документі, можуть бути частиною набору або іншого діагностичного пакету. Як такий у даному документі наведений діагностичний набір або виріб для використання зі способом попередньої обробки в даному документі. Діагностичний набір може містити один або більше із наступних: антагоніст/антитіло/референтний препарат, позитивне контрольне нейтралізуюче антитіло (переважно кози або яванського макака); протеїн + A G-колонку (наприклад, протеїн A/ G-колонка); реагент, який знежирює; буфер(и) для афінного очищення імуноглобуліну (наприклад, зв'язуючий, елююючий та нейтралізуючий буфери); комплементарну сироватку; розчин для розведення клітин, інструкції для експлуатації або літературу; пробірку заморожених клітин (наприклад, клітини WIL2); реагент для мічених клітин (такий як CELL TITER GLO.RTM) і т.д. Як приклад, діагностичний набір може включати, але не обмежується цим: (а) реагент, який знежирює; (б) буфери (наприклад, зв'язуючий та елююючий буфери) для афінного очищення імуноглобулінів, а також (в) інструкцію, яка інструктує користувачів діагностичного набору, як використовувати набір для попередньої обробки біологічних зразків від суб'єкта з аутоімунним захворюванням або раком до проведення клітинного біотестування (такого як аналіз нейтралізуючого антитіла) на зразку (наприклад, щоб уникнути сироваткової інтерференції). Діагностичний набір, необов'язково, додатково включає один або більше із: референтного препарату, позитивного контрольного нейтралізуючого антитіла, комплементарної сироватки, розчину для розведення клітин і реагента для мічення клітин, і т.д. [000122] Антитіла та інші відкриття, описані в даному документі, також забезпечують високопродуктивні скринінгові способи. Зокрема, і як зрозуміло фахівцям у даній області, стали можливими високопродуктивні способи для виявлення антагоністичних або агоністичних моноклональних антитіл або малих молекул, які зв'язуються з рецепторами OX40 і можуть інгібувати формування і функцію Tr1-клітин або сприяти утворенню і функції Tr1-клітин. В одному із таких способів лінія Т-клітин людини (SU-DHL-1), які мають здатність продукуватися ІЛ-10, була трансфікована геном OX40 людини (SUOX40). 100 000 клітин SUOX40 культивували або зі 100 000 мишачих фібробластів (L-клітин), або зі 100 000 мишачих фібробластів, експресуючих ліганд OX40 людини (ліганд OX40 L-клітин) в 96-лунковому планшеті. Після 48годин культивування супернатанти культури збирали для вимірювання ІЛ-10 ІЛ-10-специфічним ELISA. У репрезентативному експерименті 100 000 клітин SUOX40, які культивуються за відсутності ліганда OX40, секретували до 6000 пг/мл ІЛ-10. У присутності ліганда OX40 100 000 клітин SUOX40 секретували менше 1000 пг/мл ІЛ-10. Цей спосіб культивування може бути використаний для скринінгу, зокрема, антагоністичних моноклональних антитіл або малих молекул, які блокують здатність ліганда OX40 інгібувати продукцію ІЛ-10 клітинами SUOX40. У якості альтернативного варіанта цей спосіб культивування може бути змінений шляхом заміни L-клітин, експресуючих ліганд OX40, потенційними агоністичними моноклональними антитілами або малими молекулами, специфічними до OX40, щоб визначити, зокрема, їх здатність інгібувати продукцію ІЛ-10 клітинами SUOX40. [000123] Антитіла до OX40, описані в даному документі, можуть бути використані як аналіз або в аналізі для тестування або вимірювання активності препарату або іншої молекули, виявленої в організмі або органічному зразку. Вони також можуть бути використані в кількісному аналізі для вимірювання кількості речовини в зразку. Біотестування та імунотестування є одними з багатьох різновидів спеціалізованих біохімічних аналізів, якими ці антитіла можуть бути використані. Антитіла до OX40, викладені в даному документі, можуть бути використані в інших тестах для оцінки процесів, таких як активність ферменту, захоплення антигена, активність стовбурних клітин і конкурентне білкове зв'язування. [000124] Людські L-клітини, які експресують GITRL, OX40L, 4-1BBL, ICOSL, були отримані ретровірус-опосередкованою трансдукцією, що зрозуміло фахівцям у даній області. Коротко, повнорозмірна кодуюча послідовність GITRL людини (ідентифікаційний номер NM_005092), OX40L (ідентифікаційний номер NM_003326), 4-1BBL (ідентифікаційний номер NM_003811), ICOSL (ідентифікаційний номер NM_015259) була ампліфікована ОТ-ПЦР із РНК, отриманої з HSV-1, стимульованого МКПК. Потім кДНК клонували в ретровірусний вектор pMIGW2 на основі MSCV і отримані плазміди були верифіковані розщепленням рестриктазою і секвенуванням ДНК. Для одержання рекомбінантного ретровіруса, кожен вектор співтрансфікували пакувальними конструкціями pCL-gp (gag/pol) і pHCMV-VSVg (VSV-глікопротеїновий зовнішній 19 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 шар) у клітинах HEK293T. Через два дні збирали супернатанти вірусвмісних культур і використовували для інфікування CD32 L-клітин при ПУМ 100. За цієї умови >95 % клітин були продуктивно трансдуковані. + [000125] Ізольовані CD14 моноцити (чистота >94 %) культивували за присутності 100 нг/мл GM-CSF і 50 нг/мл ІЛ-4 (обидва від R&D) протягом 5 днів, що зрозуміло фахівцям у даній області. Отримані незрілі ДК промивали та культивували протягом 24 год. з ІФН-α (1000 одиниць/мл, PBL Biomedical Laboratories), ІЛ-10 (10 нг/мл, R&D) і опроміненими CD40 Lтрансфікованими L-клітинами (співвідношення ДК до L-клітин 4:1) для одержання зрілих ДК, що зрозуміло фахівцям у даній області. + + [000126] Наївні CD4 Т-клітини і CD4 Т-клітини пам'яті (кожні чистотою >99 %) були виділені + із МКПК використанням набору II для виділення CD4 Т-клітин (Miltenyi Biotec) з наступним + + + сортуванням клітин (CD4 CD45RA CD45RO CD25-фракція як наївні Т-клітини і CD4 CD45RA + CD45RO CD25 -фракція як Т-клітини пам'яті), що зрозуміло фахівцям у даній області. 4 × 104 + свіжих очищених алогенних наївних CD4 Т-клітин було співкультивовано з незрілими або культивованими ДК (співвідношення ДК до Т 1:10) у присутності або за відсутності рекомбінантного OX40L людини (R&D, 100 нг/мл) у круглодонних 96-лункових планшетах для + культури протягом 7 днів, що зрозуміло фахівцям у даній області. Очищені CD4 Т-клітини також культивували з ІЛ-12 (10 нг/мл, R&D), ІЛ-4 (25 нг/мл, R&D) або з комбінацією дексаметазону (5 × 10-8 M, Life Technologies) і 1альфа, 25-дигідроксивітаміну D3 (10-7 M) протягом 7 днів у присутності розчинного моноклонального анти-CD28 антитіла (CD28.2, 1 мкг/мл) та ІЛ-2 (50 одиниць/мл, R&D) на опромінених CD32/OX40L-L-клітинах, CD32/GITRL-L-клітинах, CD32/4-1 BBL-L-клітинах або батьківських CD32-L-клітинах, які були попередньо покриті моноклональним анти-CD3 антитілом (OKT3, 0,2 мкг/мл) у 48-лункових планшетах для культури (співвідношення Т-клітини до L-клітини 2,5:1), що зрозуміло фахівцям у даній області. У деяких експериментах + CD4 Т-клітини культивували протягом 7 днів на CD 32-L-клітинах, суміші CD 32-L-клітин і CD32/ICOSL-L-клітин (співвідношення 1:1) або суміші CD32/ICOSL-L-клітин і CD32/OX40L-Lклітин (співвідношення 1:1), попередньо покритих моноклональним анти-CD3 антитілом (0,2 мкг/мл) в 48-лункових планшетах для культури, що зрозуміло фахівцям у даній області. Для культур була використана RPMI 1640 з додаванням 10 % FCS, 2 мМ L-глутаміну, 1 мМ пірувату натрію, пеніциліну G і стрептоміцину, що зрозуміло фахівцям у даній області. [000127] Культивовані T-клітини були зібрані і промиті, потім повторно стимульовані антиCD3, зв'язаними із пластиною (5 мкг/мл), і розчинним анти-CD28 (2 мкг/мл) у концентрації 1 × 106 клітин/мл протягом 24 год., що зрозуміло фахівцям у даній області. Рівні ІЛ-4, ІЛ-10, ФНО-α і ІФН-α у супернатантах вимірювали за допомогою ELISA (усі комплекти R&D), що зрозуміло фахівцям у даній області. Для внутрішньоклітинної продукції цитокінів, культуровані Т-клітини повторно стимулювали 50 нг/мл PMA плюс 2 мкг/мл іономіцину протягом 6 годин. Брефелдин А (10 мкг/мл) був доданий протягом останніх 2 год., що зрозуміло фахівцям у даній області. Клітини фарбували комбінацією мічених фікоеритрином монклональних антитіл до ІЛ-4 або ФНО-α з FITC-міченими моноклональними антитілами до ІФН-α і міченими алофікоцианіном анти-ІЛ-10 (усі від BD) з використанням набору FIX і PERM (CALTAG), що зрозуміло фахівцям у даній області. [000128] Т-клітини були зібрані і ресуспендовані в середовищі, яке містить ЕДТА, щоб дисоціювати кластери, що зрозуміло фахівцям у даній області. Підраховували живі клітини методом виключення мертвих клітин трипановим синім, що зрозуміло фахівцям у даній області. + + Для аналізу супресивної функції наївні CD4 Т-клітини (А) і Tr1-клітини, утворені з наївних CD4 Т-клітин під дією моноклонального анти-CD3 антитіла, моноклонального анти-CD28 антитіла, ІЛ2, дексаметазону і вітаміну D3 у присутності батьківських L-клітин, (В) або OX40L-L-клітини (C), ці три типи клітин і їх суміші у співвідношенні 1:1 потім повторно стимулювали протягом 5 днів культивуванням у присутності 5 мкг/мл моноклонального анти-CD3 антитіла та 1 мкг/мл моноклонального анти-CD28 антитіла, після чого клітинну проліферацію оцінювали за захватом [3Н]тимідину, що зрозуміло фахівцям у даній області. [000129] Одержання специфічних моноклональних антитіл до OX40 людини [000130] Ми одержали множинні агоністичні мишачі моноклональні антитіла до OX40 людини. Антигенспеціфічна єднальна здатність антитіл була підтверджена методом проточної цитометрії (фіг. 10-12). Агоністична активність антитіл була підтверджена за допомогою функціональних аналізів. Ми виявили, що дев'ять із 20 специфічних антитіл до OX40 можуть + блокувати вітамін D3/дексаметазон-індуковане формування Tr1-клітин із CD4 Т-клітин (фіг. 13), + підсилювати CD4 Т-клітинну проліферацію (фіг. 14) і пригнічувати продукцію ІЛ-10 + + high + ICOS CD4 CD25 FOXP3 Treg (фіг. 16). Ми титрували антитіла і виявили, що п'ять мали 20 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 потужну активність у придушенні формування Tr1-клітин у концентраціях всього 4 нг/мл (фіг. 15). + high + [000131] Антитіла до OX40 інгібують функцію CD4 CD25 FOXP3 Treg + [000132] Деякі з моноклональних антитіл до OX40 інгібують супресивну функцію FOXP3 Treg (фіг. 17). Із п'яти антитіл (119-8B, 119-43, 119-122, 119-173B і 106-222), які потужно інгібують + high + продукцію ІЛ-10 Tr1-клітинами і CD4 CD25 CD127–FOXP3 Tregs, три (119-43, 119-122 і 106+ high + 222) були потужними у блокуванні функції CD4 CD25 CD127–FOXP3 Treg (фіг. 17). Проте, два (119-33 і 120-140А) з 11 антитіл, які не мають активності проти продукції ІЛ-10, блокують + high + функцію CD4 CD25 FOXP3 Treg (фіг. 18). [000133] Моноклональні антитіла до OX40 людини [000134] Одержання моноклональних антитіл до OX40 людини було проведено, наприклад, шляхом імунізації 6-8-тижневих мишей лінії BALB/с лінією мишачих клітин, трансфікованих OX40 людини відповідно до встановлених протоколів. Клони гібридоми, які секретують + моноклональне антитіло, яке специфічно фарбувало клітини OX40 , були встановлені і далі проаналізовані. [000135] Ми розробляємо вичерпний скринінг для виявлення тих клонів, які запускають активацію OX40 (наприклад, агоністичні антитіла) шляхом інгібування утворення і функції Tr1клітин. Ці клони надалі очищалися. Агоністичні антитіла до hOX40 можуть бути гуманізовані і використані в клінічних протоколах для протипухлинної терапії в людини, або самостійно, або в комбінації із протипухлинною вакцинацією та іншими ад'ювантами. Кілька різних типів пухлин можуть бути ціллю цих антитіл, у тому числі меланома, лімфома і рак молочної залози. [000136] В іншому варіанті втілення винаходу для імунізації шляхом ін'єкції в подушечки лап або пішкірної імунізації використовували 6-8-тижневих самок мишей лінії BALB/с. Кожній миші вводили 5 млн мишачих L-клітин, трансфікованих OX40 людини (L-OX40) 6 раз з інтервалом в 3 дні. Через три дні після шостої ін'єкції мишей умертвляли і видаляли підколінні лімфатичні вузли (при імунізації шляхом ін'єкції в подушечки лап) або селезінку (при підшкірній імунізації) і клітини зливали із клітинами мієломи SP2.0 або мієломи NSO у співвідношенні 1 до 1 для одержання гібридомних клонів, використовуючи встановлені протоколи. Клони гібридом, які секретують моноклональне антитіло, були потім перевірені на їх афінність зв'язування із клітинами L-hOX40 аналізами ELISA. Супернатанти гібридом, які зв'язуються із клітинами LhOX40, але не з батьківськими L-клітинами, були додатково підтверджені на зв'язування із клітинами L-hOX40 і SUPM2-hOX40 проточним цитометричним аналізом. [000137] В експерименті на фіг. 10 супернатанти гібридоми hOX40 були перевірені проти LhOX40 у порівнянні з батьківськими L-клітинами за допомогою ELISA. Були вибрані двадцять специфічних моноклональних антитіл до hOX40. Двадцять мільйонів L-клітин або L-клітин, які експресують OX40 людини (L-hOX40), наносили на 96-лунковий планшет, змішуючи клітини з 0,01 % хлоридом магнію кальцію в PBS, і залишали висихати протягом ночі в ламінарній шафі. Планшети потім заморожували при температурі -20 °C щонайменше за день до використання. Для реакції преципітації антитіл заморожені клітини регідратували з PBS і промивали промивним буфером, що містять PBS плюс 0,05 % Твін-20, і блокували 2 % BSA у промивному буфері. Висушені клітини потім були використані для зв'язування з антитілами до OX40 супернатантів. Зв'язування антитіла із клітинам потім виявляли вторинним антитілом, антимишачим IgG FC HRP. Гібридомні специфічні hOX40 супернатанти пізнають L-клітини, які експресують OX40, але не батьківські L-клітини. [000138] В експерименті на фіг. 11 моноклональні специфічні антитіла до hOX40 були досліджені за допомогою проточного цитометричного аналізу. Рівне число (100k) L-клітин і LhOX40 змішали в буфері FACS (1 % FCS/2 мМ ЕДТА/ФСБ) та інкубували з 0,5 мкг антитіл, очищених FPLC (Protein A Hitrap/Gentle Ag/Ab елююючий буфер). Потім клітини промивали і фарбували вторинним антитілом, фікоеритринкон'югованим анти-IgG миші. Два піки вказують на позитивне та негативне фарбування моноклональним антитілом до hOX40. Один пік говорить про відсутність зв'язування або неспецифічне зв'язування антитіл. Двадцять специфічних моноклональних антитіл до hOX40 були підтверджені методом проточної цитометрії. [000139] В експерименті на фіг. 12 специфічність моноклональних антитіл до hOX40 була підтверджена за допомогою клітин SUPM2, які експресують hOX40 (SUPM2-hOX40). Рівне число (100k) SUPM2 і SUPM2-hOX40-клітин змішали в буфері FACS (1 % FCS/2 мМ ЕДТА/ФСБ) і використали для зв'язування моноклональних антитіл до hOX40, як на фіг. 11. Специфічність зв'язування кожного антитіла була проаналізована методом проточної цитометрії. Два піки вказують на позитивне і негативне фарбування моноклональним антитілом до hOX40, у той час 21 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як один пік говорить про відсутність зв'язування або неспецифічне зв'язування антитіл. Двадцять специфічних моноклональних антитіл до hOX40 були підтверджені. [000140] В експерименті на фіг. 13 ми спробували ідентифікувати специфічні моноклональні + антитіла до OX40 людини, які можуть інгібувати формування Tr1-клітин із CD4 Т-клітин, стимульованих вітаміном D3 (10 мікромоль, мМ)/дексаметазоном (50 наноМ), CD32L/ICOSL і анти-CD3/CD28 (0,2 мікрограм/мл). Моноклональні антитіла до hOX40 були додані в день 0 + культури клітин, і CD4 Т-клітини після 7 днів стимуляції були піддані внутрішньоклітинному фарбуванню ІЛ-10 з наступним аналізом методом проточної цитометрії. Дані репрезентативного аналізу за допомогою активізованої флюоресценції сортування клітин (FACS) наведені на А, а відсотки Tr1-клітин для всіх обробок моноклональними антитілами до hOX40 показані на В. Використовуючи клітини, отримані в цьому експерименті, ми спробували виявити специфічні + моноклональні антитіла до hOX40, які стимулюють CD4 Т-клітинну проліферацію (фіг. 14, + клітини підраховували на 7 день після стимуляції) та інгібують формування Tr1 із CD4 (фіг. 13). [000141] Для того, щоб ідентифікувати такі моноклональні антитіла до hOX40 на їх здатність + інгібувати утворення Tr1-клітин із CD4 Т-клітин, Tr1-клітини були отримані і культивовані, як описано в експериментах на фіг. 13 вище. Репрезентативні дані FACS наведені на А, а відсотки Tr1-клітин після обробки дев'ятьма моноклональними антитілами до hOX40 наведені на B. П'ять специфічних моноклональних антитіл до hOX40 сильно інгібували формування Tr1-клітин у концентрації 4 нг/мл (фіг. 15). + + high [000142] В експерименті на фіг. 16A, 16B і 16C свіжовідсортовані ICOS CD4 CD127 CD25 Т-клітини стимулювали анти-CD3 (0,2 мкг/мл) у присутності CD32L/ ICOSL-клітин і CD32L/hOX40 L-клітин або моноклональних антитіл до hOX40, або контрольного антитіла протягом 5 днів. Потім клітини підраховували і 5 × 104 клітин повторно стимулювали з анти-CD3/CD28 протягом 24 годин, і супернатанти аналізували на продукцію ІЛ-10 набором Elisa. Ми ідентифікували, що + специфічні моноклональні антитіла до hOX40, які інгібують формування Tr1 із CD4 Т-клітин, + + high також пригнічують продукцію ІЛ-10 натуральними ICOS CD4 CD25 Т-клітинами. + + high Свіжовідсортовані ICOS ICOS CD4 CD127 CD25 Tregs культивували з міченими CFSE + low клітинами CD4 CD25 у присутності опромінених моноцитів і анти-CD3 (0,3 мкг/мл), і МАт до hOX40. Через 3,5 дні культивування проліферацію клітин оцінювали розведенням CFSE у клітинах FACS-аналізом (фіг. 16С). [000143] Фіг. 17А і 17В описують ідентифікацію моноклональних антитіл до hOX40, які + + high інгібують формування Tr1-клітин і блокують функцію FOXP3 CD4 CD25 Treg. + + high 4 Свіжовідсортовані FOXP3 CD4 CD127 CD25 Т-клітини (3,5 × 10 ) культивували з міченими + low CFSE клітинами CD4 CD25 (7 × 104) у присутності опромінених моноцитів (7 × 104, 6000 рад) і 0,3 мкг/мл анти-CD3, і різних концентрацій моноклонального антитіла до hOX40. Після 3-4 днів культивування проліферацію клітин оцінювали за розведенням CFSE у клітинах методом проточної цитометрії. Відсоток розділених клітин зазначений. Репрезентативні аналізи проточної цитометрії наведені на фіг. 17А. Дані для 6 моноклональних антитіл наведені на фіг. 17B. + + high [000144] В експерименті на фіг. 18 свіжовідсортовані FOXP3 CD4 CD127 CD25 Т-клітини 4 + low 4 (3,5 × 10 ) культивували з міченими CFSE клітинами CD4 CD25 (7 × 10 ) у присутності опромінених моноцитів (7 × 104, 6000 рад) і 0,3 мкг/мл анти-CD3, і різних концентрацій моноклонального антитіла до OX40. Після 3-4 днів культивування проліферацію клітин оцінювали за розведенням мітки CFSE у клітинах методом FACS. Дані є репрезентативними для двох експериментів. Ми визначили моноклональні антитіла до hOX40, які не інгібують + + high формування Tr1, але блокують функцію FOXP3 CD4 CD25 Treg. + high [000145] В експерименті на фіг. 19А і 19В отримані з лімфоми CD4 CD25 Т-клітини + low культивували з міченими CFSE клітинами CD4 CD25 (7 × 104), ізольованими від здорового 4 донора, у присутності опромінених алогенних моноцитів (7 × 10 , 6000 рад) і 0,3 мікрограм/мл анти-CD3, і 25 мкг/мл моноклонального антитіла до hOX40. Після 3-4 днів культивування проліферацію клітин оцінювали за розведенням CFSE FACS-аналізом. Репрезентативні FACSаналізи показані на фіг. 19A, а дані для всіх експериментів показані на фіг. 19B. Ми виявили, що + high агоністичні антитіла до hOX40 блокують функцію CD4 CD25 Treg, отриманих з лімфоми. [000146] Фіг. 20 демонструє ідентифікацію агоністичних антитіл до OX40, які специфічно зв'язуються з OX40 людини і макаки резусу. Мононуклеарні клітини периферичної крові макаки + резусу були отримані шляхом фікол-центрифугування. CD4 Т-клітини були отримані з + мікрогранульованих CD4. CD4 Т-клітини стимулювали 10 мкг/мл лектину квасолі звичайної (PHA). Через два дні після стимуляції клітини фарбували МАт до hOX40 з козячим антимишачим IgG APC і CD69-PE. 106-317 служив у якості негативного контролю. Показано, що шість МАт до hOX40, які сильно активують Т-клітинну проліферацію, могли зв'язувати 22 UA 107851 C2 + 5 активовані CD4 Т-клітини макаки резусу. Ці результати вказують на те, що токсичність цих шести моноклональних антитіл до hOX40 може бути перевірена на мавпах. [000147] Тільки сім з 500 позитивних клонів до OX40 людини, отриманих з використанням прийнятих протоколів злиття, виявили властивість активування OX40, включаючи, але не обмежуючись цим, здатність блокувати формування ІЛ-10-продукуючих Tr1 і супресивну функцію nTreg, як описано в таблиці 1. Таблиця 1 Список специфічних моноклональних антитіл до OX40 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 10 15 20 25 30 Клон моноклонального антитіла 106-108 106-317 106-107 106-148 119-204A 119-220C 119-33A 119-58 119-181A 119-157A 120-140A 119-8B 119-173B 106-132 106-222 119-43 119-122 119-69A 120-56 120-270 Блокує ІЛ-10 + + + + + + + + + Блокує nTreg + + + + + + + + + + + + + Клони гібридоми 106-222 і 119-122 були вибрані, ґрунтуючись на трьох критеріях: + 1. Вони інгібують формування Tr1-клітин з Т-клітин CD4 (індуцибельні Treg). + 2. Обертають супресивну функцію FOXP3 nTreg-клітин. 3. Вони пригнічують дозозалежне інгібування вимикання Tr1-клітин і обіг функції + FOXP3 Treg-клітин. [000148] Химерні та гуманізовані антитіла [000149] Гуманізація (також називана решейпінг або CDR-пересадження) є визнаною технікою для зниження імуногенності моноклональних антитіл із ксеногенних джерел (включаючи, але не обмежуючись цим, гризунів), а також для поліпшення активації ними імунної системи людини. Хоча механізм одержання інженерного моноклонального антитіла з використанням способів молекулярної біології відомий, просте пересадження гіперваріабельних ділянок гризунів (CDR) у людські каркасні ділянки не завжди відтворює спорідненість і специфічність вихідного моноклонального антитіла. [000150] Щоб гуманізувати антитіло, розробка гуманізованого антитіла стає найважливішим етапом у відтворенні функції вихідної молекули. Ця розробка містить у собі різні варіанти: довжина CDR, використовувані каркасні ділянки людини і заміна залишків моноклонального антитіла гризунів на каркасні ділянки людини (зворотні мутації). Положення цих зворотних мутацій були визначені головним чином секвенуванням/структурним аналізом або аналізом гомологічної моделі 3D-структури варіабельних областей. [000151] Останнім часом були використані бібліотеки фагів для варіювання амінокислотами у вибраних позиціях. Аналогічно було використано багато підходів для вибору найбільш підходящих каркасних ділянок людини, у які прищеплювали CDR гризунів. У ранніх експериментах використовували обмежений набір добре вивчених моноклональних антитіл людини (часто, але не завжди там, де структура була доступна), незалежно від ідентичності послідовності моноклональному антитілу гризуна (так званий підхід фіксованих каркасних ділянок). Деякі групи використовують варіабельні області з високою ідентичністю 23 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислотної послідовності варіабельним областям гризунів (гомологічна відповідність або найкращий збіг), інші використовують консенсусні послідовності або послідовності зародкової лінії, а треті вибирають фрагменти послідовностей каркасних ділянок у кожній варіабельній області легкого або важкого ланцюга з декількох різних моноклональних антитіл людини. Є також розроблені підходи до гуманізації, які замінюють поверхневі залишки гризуна на найбільш схожі залишки, знайдені в моноклональних антитілах людини ("resurfacing" або "veneering"), і ті, які використовують різні визначення довжини CDR. Гуманізовані антитіла описані нижче. Однак, химерне антитіло, яке містить варіабельні важкі і легкі області SEQ ID NO: 4 і 10 або SEQ ID NO: 16 і 22, також описані в даному документі. [000152] Гуманізовані моноклональні антитіла були отримані з мишачого антитіла до OX40. [000153] Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати CDR1 варіабельного важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 1 або 13. Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати CDR2 варіабельного важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2 або 14. Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати CDR3 варіабельного важкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 3 або 15. [000154] Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати CDR1 варіабельного легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 7 або 19. Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати CDR2 варіабельного легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8 або 20. Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати CDR3 варіабельного легкого ланцюга, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 9 або 21. [000155] Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати варіабельний легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 11 або 23 або який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 відсотків ідентичну амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 11 або 23. Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати варіабельний важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 5 або 17 або який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 відсотків ідентичну амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 5 або 17. [000156] Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати варіабельний легкий ланцюг, який кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 12 або 24, або нуклеотидної послідовністю, щонайменше на 90 відсотків ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 12 або 24. Виділене гуманізоване антитіло до OX40 може мати варіабельний важкий ланцюг, який кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 6 або 18, або нуклеотидною послідовністю, щонайменше на 90 відсотків ідентичною амінокислотній послідовності SEQ ID NO: 6 або 18. [000157] Експресія гуманізованих антитіл до OX40 [000158] Антитіло або детермінанта антитіла, відповідно до винаходу, можуть бути отримані шляхом рекомбінантної експресії генів легкого і важкого ланцюга імуноглобуліну в клітиніхазяїні. Щоб експресувати антитіло рекомбінантно, клітину-хазяїна трансфікують одним або більше рекомбінантних векторів експресії, що несуть фрагменти ДНК, які кодують легкий і важкий ланцюги антитіла, таким чином, що легкі і важкі ланцюги експресуються в клітині-хазяїні і, переважно, секретуються в середовище, у якому культивують клітини-хазяїни, із цього середовища антитіла можуть бути відновлені. Стандартні методики рекомбінантної ДНК використовуються для одержання генів важкого і легкого ланцюга антитіл, включення цих генів у рекомбінантні вектори експресії і введення векторів у клітини-хазяїни, як описано в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989), і в патенті США № 4 816 397, Boss et al. [000159] Антитіла або фрагменти антитіл і варіанти можуть бути отримані з різних клітин тварин, переважно із клітин ссавців, особливо кращими є клітини миші і людини. Крім того, системи для експресії рекомбінантних ДНК можуть містити в собі ті, які використовують клітинихазяїни та експресійні конструкції, які були розроблені для продукування високих рівнів того або іншого білка. Такі клітини-хазяїни та експресійні конструкції можуть включати Escherichia coli; несучі експресійні конструкції, отримані із плазмід або вірусів (бактеріофагів), дріжджі, такі як Saccharomyces cerevisieae або Pichia pastoras, що несуть епісомні або хромосомні інтегровані експресійні конструкції; клітини комах і вірусів, такі як клітини Sf9 і бакуловірус; клітини ссавців, що несуть інтегровані в епісоми або хромосоми (включаючи, але не обмежуючись цим, ретровірусні) експресійні конструкції (такі способи, наприклад, показані в рукописі Verma et al., J. Immunol. Methods 216:165-181, 1998). Антитіла можуть також продукуватися в рослинах (такі способи, наприклад, показані в патенті США № 6046037; Ma et al., Science 268:716-719, 1995) 24 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 або за технологією фагового дисплея (такі способи, наприклад, показані в Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994). [000160] Антитіла до OX40 людини, які показали рівень активності і специфічність зв'язування/афінність, які є бажаними, можуть бути надалі маніпульовані стандартними технологіями рекомбінантної ДНК, наприклад, для перетворення генів варіабельної області в гени повнорозмірного ланцюга антитіла, у гени Fab-фрагмента або ген ScFv. У цих маніпуляціях VL- або VН-кодуючий фрагмент ДНК функціонально пов'язаний з іншим фрагментом ДНК, який кодує інший білок, таким як константна область антитіла або гнучкий лінкер. Термін "функціонально зв'язаний", використовуваний у даному контексті, передбачає, що два фрагменти ДНК з'єднані таким чином, що амінокислотні послідовності, які кодуються цими двома фрагментами ДНК, залишаються усередині рамки. [000161] В іншому аспекті ізольована ДНК, яка кодує область VH, може бути перетворена в ген повнорозмірного важкого ланцюга шляхом функціонального зв'язування VН-кодуючої ДНК із іншою молекулою ДНК, яка кодує константні області важкого ланцюга (CH1, CH2 і CH3). Послідовності генів важкого ланцюга константної області людини відомі в даній області техніки (див., наприклад, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), і фрагменти ДНК, що охоплюють ці області, можуть бути отримані за допомогою стандартної ПЦРампліфікації. Константною областю важкого ланцюга може бути константна область IgG-1, IgG2, IgG3, IgG4, IgА, IgE, IgM або IgD і будь-який їх алотиповий варіант, як описано в Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), але найбільш кращими константними областями є IgG1 і IgG4. Для гена важкого ланцюга Fab-фрагмента, VН-кодуюча ДНК може бути функціонально зв'язана з іншою молекулою ДНК, що кодує тільки важкий ланцюг CH1 константної області. [000162] Крім того, гуманізоване антитіло, пов'язане з поверхневим антигеном, може взаємодіяти з FcR-несучими клітинами. Така взаємодія може викликати ефекторну функцію, таку як ADCC, і/або підвищити активацію через Fc-опосередковане перехресне зшивання. Взаємодія може бути корисною або шкідливою для терапії. Такі шкідливі побічні ефекти включають озноб, лихоманку, артеріальну гіпотензію, а в деяких випадках - задишку (Thistlethwaite JR Jr., Cosimi AB, Delmonico FL, et al.). [000163] Початок деяких шкідливих ефектів може бути покладений білковим комплексом, знайденим на поверхні Т-клітини. Після активації Т-клітини білковий комплекс бере участь у трансдукції сигналів, які генеруються за допомогою рецептора антигена. Коротко, активація Тклітини починає каскад подій, які містять у собі посилене перехресне зшивання рецептора антигена. Перехресне зшивання рецепторів може сприяти сильній мітогенній активації, яка приводить до індукування деяких цитокінів, таких як фактор некрозу пухлин альфа (ФНО-α), інтерлейкін-2 (ІЛ-2) і гама-інтерферон (ІФН-γ). Ці цитокіни, як відомо, токсичні, якщо продукуються у великих кількостях. [000164] Наприклад, моноклональні анти-CD3-антитіла використовуються в даний час для лікування аутоімунних захворювань, включаючи цукровий діабет I типу, у якому Т-клітини медіювали напад на панкреатичні острівці, продуценти інсуліну (Kaufman A, and Herold K.AntiCD3 mAbs for treatmentof type 1 diabetes Diabetes Metab Res Rev 2009; 25: 302–306). Анти-CD3антитіла, як відомо, інгібують лізис мішеней Т-клітинами і підсилюють перехресне зшивання рецептора антигена CD3. Крім того, разом з його потужною мітогенною активністю, анти-CD3антитіло, як відомо, є потужним індуктором цитокінів, зокрема, фактору некрозу пухлин альфа (ФНО-α), інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) і гама-інтерферону (ІФН-γ). Масивне вивільнення цитокінів, зокрема ФНО-α, з Т-клітин у відповідь на препарат (Chatenoud L.) створює токсичні ефекти. Ці небажані побічні ефекти були віднесені до перехресного зшивання T-клітин, що несуть молекули CD3, і FcR-несучих клітин, які зв'язуються з Fc-детермінантою антитіл. Перехресне зшивання активує як Т-клітини, так і FcR-несучі клітини, що веде до масивного вивільнення цитокінів, як згадувалося раніше. [000165] Аналогічно до потенційних небажаних побічних ефектів може привести використання антитіл до OX40. Наприклад, антитіла до OX40, які зв'язуються з OX40експресуючими Т-клітинами, можуть також зв'язуватися з FcR-несучими клітинами і провокувати вироблення цитокінів, що може бути корисним або шкідливим для пацієнтів з антитілом. Щоб подолати цю потенційну проблему, ми розробили і представили в даному документі способи мутування FcR-детермінанти антитіла OX40, щоб уникнути токсичних ефектів і забезпечити мутації FcR-детермінанти, які можуть бути бажаними. 25 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [000166] Сайт IgG1 людини, який взаємодіє з FcR (CD16, CD32 і CD64), відомий. Він розташований у верхньому домені CH2. Найбільш важливими амінокислотами є два залишки Leu у положеннях 234 і 235. Шляхом мутації цих двох залишків у два залишки Ala, взаємодія IgG1 з усіма FcR припиняється. Гуманізоване анти-CD3, яке містить ці мутації (HuOKT3AA), є більш безпечним препаратом і має механізм дії, який відмінний від HuOKT3. Див., наприклад, патент США № 6491916, включений за допомогою посилання у всій своїй повноті в даний документ. [000167] Позиції AА-мутанта показані в наступному порядку: 234 235 ---A---P---E---L---L---G---G---P--- Дикий тип верхнього CH2 IgG1 ---A---P---E---A---A---G---G---P--- AA-мутант верхнього CH2 IgG1. [000168] Hu222AA і Hu122AA, описані в даному документі, можуть містити ці мутації. Якщо тест-система містить FcR-несучі клітини, ви можете побачити різницю між диким типом і AАмутантом. У протилежному випадку два антитіла повинні поводитися однаково. [000169] Ізольована ДНК-область, яка кодує VL, може бути конвертована в ген повнорозмірного легкого ланцюга (а також ген легкого ланцюга Fab) шляхом функціонального зв'язування VL-кодуючої ДНК з іншою молекулою ДНК, яка кодує легкий ланцюг константної області, CL. Послідовності генів константних областей легкого ланцюга людини відомі в даній області техніки (див., наприклад, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), і фрагменти ДНК, що мають ці області, можуть бути отримані за допомогою стандартної ПЦРампліфікації. Константна область легкого ланцюга може бути константною областю каппа або лямбда. [000170] Для створення гена ScFv VH- і VL-кодуючі фрагменти ДНК функціонально зв'язуються з іншим фрагментом, який кодує гнучкий лінкер, наприклад, який кодує послідовність амінокислот (Gly.sub.4-ser).sub.3, таким чином, що послідовності VH і VL можуть бути експресовані у вигляді безперервного одноланцюгового білка з областями VL і VH, з'єднаними гнучким лінкером (див., наприклад, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554. [000171] Розглядається модифікація(ції) амінокислотних послідовностей антитіл, описаних у даному документі. Наприклад, може бути бажаним поліпшення афінності зв'язування і/або інших біологічних властивостей антитіла. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла одержують шляхом внесення відповідних змін нуклеотидів у нуклеїнову кислоту антитіла або синтезом пептиду. Такі модифікації включають, наприклад, делеції із і/або інсерції в, і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях антитіла. Будь-яка комбінація делеції, інсерції і заміни зроблена для одержання остаточної конструкції, за умови, що кінцева конструкція має необхідні характеристики. Ці зміни амінокислот можуть бути введені в конкретну амінокислотну послідовність антитіла під час створення послідовності. [000172] Корисний спосіб ідентифікації певних залишків або областей антитіла, які є кращими місцями для мутагенезу, називається "аланін-скануючий мутагенез", як описано Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Тут визначають залишок або групу цільових залишків (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, his, lys і glu) і заміщують нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найбільш переважно аланіном або поліаланіном), щоб вплинути на взаємодію амінокислот з антигеном. Ті локалізації амінокислот, які демонструють функціональну чутливість до замін, потім змінюють шляхом введення додаткових або інших варіантів, або сайтів заміщення. Таким чином, у той час як сайт для введення варіанта амінокислотної послідовності визначений, природу самої мутації не потрібно визначати. Наприклад, для аналізу прояву мутації в даному сайті проводяться сканування аланіном або випадковий мутагенез у цільовому кодоні або області, а імуноглобуліни, які еспресуються, скринують на бажану активність. [000173] Інсерції амінокислотної послідовності включають аміно- і/або карбокси-кінцеві злиття в довжину від одного залишку з поліпептидами, що містять сто або більше залишків, а також інсерції одного або декількох амінокислотних залишків у послідовності. Приклади термінальних інсерцій включають антитіло з N-кінцевим залишком метіоніну або антитіло, злите із цитотоксичним поліпептидом. Інші інсерційні варіанти молекули антитіла включають злиття Nабо С-кінця антитіла з ферментом (наприклад, для ADEPT) або поліпептидом, який збільшує період напіврозпаду антитіла в сироватці. Інший тип варіанта амінокислот антитіла змінює початковий патерн глікозилювання антитіла. Така зміна містить у собі видалення одного або декількох вуглеводних залишків, знайдених в антитілі, і/або додавання одного або більше сайтів глікозилювання, які не присутні в антитілі. 26 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [000174] Інший тип варіанта – це варіант заміни амінокислоти. Ці варіанти мають щонайменше один амінокислотний залишок у молекулі антитіла, замінений іншим залишком. Сайти, що представляють найбільший інтерес для замісного мутагенезу, включають гіперваріабельні області, але зміни FR також розглядаються. Консервативні заміни, представлені в таблиці 1 патенту США № 7812133, кол. 43, ст. 55 до кол. 44 ст. 49, включені в даний документ шляхом посилання і під заголовком "переважні заміни". Якщо такі заміни приводять до зміни біологічної активності, то більш істотні зміни, названі "типові заміни" у таблиці 1, або, як описано далі відносно класів амінокислот, можуть бути введені, а продукти проскриновані. [000175] Крім того, істотні модифікації біологічних властивостей антитіла досягаються шляхом вибору замін, які значно відрізняються за їх впливом на підтримку (а) структури поліпептидного кістяка в області заміни, наприклад, листа або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобності молекули в цільовому сайті, або (в) основної частини бічного ланцюга. Натуральні залишки діляться на групи на основі загальних властивостей бічного ланцюга: (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) кислі: аsp, Glu; (4) основні: his, lys, arg; (5) залишки, що впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; і (6) ароматичні: trp, tyr, phe. Неконсервативні заміни спричинять заміну члена одного із цих класів на інший клас. [000176] Для експресії антитіл або детермінант антитіл, описаних у даному документі, ДНК, які кодують часткові або повнорозмірні легкі і важкі ланцюги, отримані, як описано вище, вводяться у вектори експресії таким чином, що гени функціонально зв'язані з послідовностями, які управляють транскрипцією і трансляцією. У цьому контексті термін "функціонально зв'язаний" призначений для позначення того, що ген антитіла лігують у вектор таким чином, що послідовності, які управляють транскрипцією і трансляцією, у векторі служать своєму цільовому призначенню регуляції транскрипції і трансляції гена антитіла. Вектор експресії і послідовності, які контролюють експресію, вибираються таким чином, щоб вони були сумісні з використовуваною експресуючою клітиною-хазяїном. Ген легкого ланцюга антитіла і ген важкого ланцюга антитіла можуть бути вставлені в окремий вектор або, що більш типово, обидва гени вставляють у той самий вектор експресії. Гени антитіл вставляються у вектор експресії за допомогою стандартних способів (наприклад, лігування комплементарних сайтів рестрикції на фрагменті гена антитіла і вектора або лігування тупих кінців, якщо немає сайтів рестрикції). [000177] На фіг. 23 показана одна така схематична структура вектора експресії для антитіла Hu106-222 IgG1/каппа. Рухаючись за годинниковою стрілкою із сайту SalI вгору, плазміда містить транскрипційну ділянку важкого ланцюга, що починається з головного передраннього промотора цитомегаловіруса людини (CMV) і енхансера (CMV промотор) для ініціації транскрипції гена важкого ланцюга антитіла. За CMV-промотором іде екзон VH, геномна послідовність, що містить гама-1 константну область важкого ланцюга людини, яка включає екзони CH1, шарнір, CH2 і CH3 із проміжними інтронами і сайт поліаденілювання за екзоном CH3. Після послідовності гена важкого ланцюга з CMV-промотора починається ділянка транскрипції легкого ланцюга, за яким іде екзон VL і геномна послідовність, що містить екзон ланцюга каппа константної області людини (CL) з попереднім інтроном, і сайт поліаденілювання після екзона CL. Після гена легкого ланцюга іде передранній промотор SV40 (SV40 промотор), ген ксантин-гуанін-фосфорибозилтрансферази E. coli (gpt) і сегмент, що містить сайт поліаденілювання SV40 (SV40 полі(A) сайт). Наприкінці плазміда містить частину плазміди pUC19, яка містить бактеріальну точку початку реплікації (pUC ori) і ген бета-лактамази (беталактамаза). Локалізація відповідних сайтів рестрикції ферментів показана на фігурі. [000178] Рекомбінантний вектор експресії може кодувати сигнальний пептид, який сприяє секреції ланцюга антитіла із клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла може бути клонований у вектор таким чином, що сигнальний пептид зв'язаний у рамці з аміно-кінцем гена ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може бути сигнальним пептидом імуноглобуліну або гетерологічним сигнальним пептидом (тобто, сигнальний пептид з неімуноглобулінового білка). [000179] Як відзначалося вище, на додаток до генів ланцюгів антитіла, рекомбінантні вектори експресії, відповідні винаходу, несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюга антитіла в клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" призначений для охоплення промоторів, енхансерів та інших елементів, які контролюють експресію (наприклад, сигнали поліаденілювання), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюга антитіла. Такі регуляторні послідовності описані, наприклад, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Слід розуміти, що розробка вектора експресії, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів як вибір клітини-хазяїна для трансформації, 27 UA 107851 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бажаний рівень експресії білка і т.д. Кращі регуляторні послідовності для експресії в клітиніхазяїні ссавців включають вірусні елементи, які направляють експресію білка в клітинах ссавців на високому рівні, такі як промотори і/або енхансери, виділені із цитомегаловіруса (CMV) (такі як промотор/енхансер CMV), вірус Simian 40 (SV40) (такі як промотор/енхансер SV40), аденовірус (наприклад, аденовірусний головний пізній промотор (AdMLP)) і поліома. Для подальшого опису вірусних регуляторних елементів і їх послідовностей див., наприклад, патент США № 5168062, Stinski, патент США № 4510245, Bell et al., і патент США № 4968615, Schaffner et al., Патент США № 5464758, Bujard et al., і патент США № 5654168, Bujard et al. [000180] На додаток до генів ланцюгів антитіла і регуляторних послідовностей, рекомбінантні вектори експресії, відповідні винаходу, можуть нести додаткові послідовності, такі як послідовності, що регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, точки початку реплікації) і гени маркерів, які селектуються. Ген маркера, який селектується, полегшує селекцію клітини хазяїна, у яку був інтродукований вектор (див., наприклад, Патенти США під номерами 4399216, 4634665 і 5179017, усі Axel et al.). Наприклад, у типовому випадку ген маркера, який селектується, обумовлює стійкість до лікарських речовин, таких як G418, гігроміцин або метотрексат клітини-хазяїна, у яку був інтродукований вектор. Кращі гени маркерів, які селектуються, включають ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для застосування в dhfr.sup.-клітинах-хазяїнах із селекцією/ампліфікацією, заснованою на метотрексаті) і ген neo (для селекції, заснованої на G418). [000181] Для експресії легких і важких ланцюгів вектор(и) експресії, який кодує(ють) важкий і легкий ланцюги, трансфікують у клітину-хазяїна за допомогою стандартних способів. Різні трактування терміна "трансфекція" передбачені для включення широкого ряду способів, звичайно використовуваних при інтродукції екзогенної ДНК у прокаріотну або еукаріотну клітинухазяїна, наприклад, електропорацію, преципітацію фосфатом кальцію, трансфекцію за допомогою DEAE-декстрану і т.п. Хоча теоретично є можливим експресувати антитіла, відповідні винаходу, або в прокаріотних, або в еукаріотних клітинах-хазяїнах, експресія антитіл в еукаріотних клітинах, і найбільш переважно - у клітинах-хазяїнах ссавців, є найкращою, оскільки такі еукаріотні клітини, і особливо клітини ссавців, більш ймовірно, ніж прокаріотні клітини, збирають і секретують правильно утворене та імунологічно активне антитіло. Клітини-хазяїни ссавців для експресії рекомбінантних антитіл, описані в даному документі, включають яєчник китайського хом'ячка (клітини СНО) (такі як клітини dhfr-CHO, описані в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, використані із селективним маркером DHFR, наприклад, як описано в R. J. Kaufman and P. A. Sharp, (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клітини мієломи NS0, клітини COS і клітини SP2. Коли рекомбінантні вектори експресії, що кодують гени антитіла, інтродукують у клітини-хазяїни ссавців, антитіла утворюються при культивуванні клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для експресії антитіла в клітині-хазяїні або секреції антитіла в культуральне середовище, у якому вирощують клітини-хазяїни. Антитіла можуть бути виділені з культурального середовища з використанням стандартних способів очищення білків. [000182] Клітини-хазяїни також можуть бути використані для одержання детермінант інтактних антитіл, таких як Fab-фрагменти або молекули ScFv. Слід розуміти, що варіанти вищеописаної процедури входять в обсяг даного винаходу. Наприклад, може бути бажаним трансфікувати клітину-хазяїна ДНК, яка кодує або легкий ланцюг, або важкий ланцюг (але не обидва) антитіла, відповідно до винаходу. Технологія рекомбінантної ДНК також може бути використана для видалення деяких або всіх ДНК, які кодують окремо або обидва легкий і важкий ланцюги, які не є необхідними для зв'язування OX40. Молекули, які експресуються з таких скорочених молекул ДНК, також охоплюються антитілами, відповідними винаходу. Також можуть бути отримані біфункціональні антитіла, у яких один важкий і один легкий ланцюг є антитілом, відповідним винаходу, а інший важкий і інший легкий ланцюг специфічний до антигена, відмінного від OX40, шляхом перехресного зшивання антитіла, відповідного винаходу, із другим антитілом за допомогою стандартних хімічних способів перехресного зшивання. [000183] Фармацевтичні композиції і фармацевтичне застосування [000184] Антитіла і детермінанти антитіл, відповідні винаходу, можуть бути включені у фармацевтичні композиції, придатні для введення суб'єктові. Як правило, фармацевтична композиція містить антитіло або детермінанту антитіла, відповідні винаходу, і фармацевтично прийнятний носій. У даному документі "фармацевтично прийнятний носій" містить у собі будьякі і усі розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові агенти, ізотонічні і затримуючі абсорбцію агенти і т.п., які є фізіологічно сумісними. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв містять у собі один або більше із: води, фізіологічного розчину, фосфатного буферного розчину, декстрози, гліцерину, етанолу і т.п., а також їх комбінації. У багатьох випадках буде переважним включати до складу ізотонічні агенти, 28