Антитіло проти a5b1

Реферат: Винахід стосується нового антитіла проти 51, фармацевтичної композиції та набору, що містять вказане антитіло, способу одержання та застосування вказаного антитіла. UA 108199 C2 (12) UA 108199 C2 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ По даній заявці вимагається пріоритет по попередній патентній заявці США No. 61/163241, поданої 25 березня 2009 року, опис якої включений як посилання в повному об'ємі для будьяких цілей. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується нових антитіл проти α5β1, композицій і наборів, що містять ці антитіла, і способів застосування антитіл. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ α5β1-інтегрин являє собою глікопротеїн клітинної мембрани, який опосередковує взаємодії клітина-ECM через його основний ліганд фібронектин. α5β1-інтегрин бере участь в міграції, диференціюванні і виживанні клітин. Рівні α5β1-інтегрину підвищені в ендотелії судин пухлини (наприклад, карцином шлунка, товстої і прямої кишки, печінково-клітинної карциноми, карцином шийки матки і молочної залози) і інших ангіогенних судинах. α5β1-інтегрин модулює асоціацію внутрішньостінкових клітин з ендотеліальними клітинами і зборку ендотеліального позаклітинного матриксу в ході ангіогенезу. По суті α5β1-інтегрин є придатною мішенню для інгібування ангіогенезу і сенсибілізації клітин до ефектів антагоніста VEGF. Таким чином, існує потреба в композиціях і способах націлювання на α5β1-інтегрин. Даний винахід задовольняє цю і інші потреби. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується нових антитіл проти α5β1, які походять з моноклонального антитіла 18C12, наборів і композицій, що містять нові антитіла проти α5β1, і способів їх отримання і/або застосування. Один з варіантів здійснення винаходу стосується антитіла проти α5β1, що містить VL-домен, що містить CDR-L1, яка містить TL-S/T-S/Р/T-Q/N-H-F/S-T/I-Y-K/T-I-G/D/S (SEQ ID NO: 15); CDRL2, яка містить L/I-N/T-S-D/Н/S-G/S-S/L/T-H/Y-N/K/Q/I-K/T-G/A-D/S/V (SEQ ID NO: 16); CDR-L3, яка містить G/A-S/А/Y-S/Y-Y-S/А/Y-S/Y/T-GY-V/I (SEQ ID NO: 17); і VH-домен, що містить CDRH1, яка містить GFTFS-N/A-RW-I/V-Y (SEQ ID NO: 18); CDR-H2, яка містить GIKTKP-N/А/T-I/RYAT-E/Q-YADSVKG (SEQ ID NO: 19); і CDR-H3, яка містить L/V-TG-M/K-R/K-YFDY (SEQ ID NO: 20). У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 містить VL-домен, що містить CDR-L1, CDR-L2 і CDR-L3, кожна з яких містить послідовність, вказану на фігурі 3, і VH-домен, що містить CDR-H1, CDR-H2 і CDR-H3, кожна з яких містить послідовність, вказану на фігурі 3, тобто, VL-домен, що містить CDR-L1, яка містить послідовність, вказану в SEQ ID NO: 21, 22, 23 або 24, CDR-L2, яка містить послідовність, вказану в SEQ ID NO: 25, 26, 27 або 28, і CDR-L3, яка містить послідовність, вказану в SEQ ID NO: 29, 30, 31 або 32; і VH-домен, що містить CDR-H1, яка містить послідовність, вказану в SEQ ID NO: 34 або 35, CDR-H2, яка містить послідовність, вказану в SEQ ID NO: 36 або 37, і CDR-H3, яка містить послідовність, вказану в SEQ ID NO: 38, 39 або 40. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 містить VL-домен, що містить будь-який з SEQ ID NO: 3-8, і VH-домен, що містить будь-який з SEQ ID NO: 11-14. В деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 містить VL-домен, що містить SEQ ID NO: 4, і VHдомен, що містить SEQ ID NO: 11. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α 5β1 містить VL-домен, що містить SEQ ID NO: 5, і VH-домен, що містить SEQ ID NO: 12. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 містить VL-домен, що містить SEQ ID NO: 6, і VH-домен, що містить SEQ ID NO: 13. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α 5β1 містить VL-домен, що містить SEQ ID NO: 7, і VH-домен, що містить SEQ ID NO: 13. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 містить VL-домен, що містить SEQ ID NO: 8, і VH-домен, що містить SEQ ID NO: 14. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α 5β1 є людським, гуманізованим або химерним. У одному варіанті здійснення антитіло проти α5β1 являє собою моноклональне антитіло. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α 5β1 конкурує з антитілом 18C12 за зв’язування з інтегрином α5β1. У деяких варіантах здійснення моноклональне антитіло являє собою химерне антитіло. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α 5β1 являє собою фрагмент антитіла, який зв'язує α5β1. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 вибране з: Fab, Fab', F(ab)'2, одноланцюжкового Fv (scFv), фрагмента Fv; діантитіла і лінійного антитіла. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α 5β1 являє собою повнорозмірний IgG1 або повнорозмірний IgG4. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 являє собою біспецифічне або поліспецифічне антитіло. У деяких варіантах здійснення біспецифічне антитіло зв'язує VEGF і α5β1 і являє собою антагоніст VEGF. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 має змінену ефекторну функцію. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 змінене для зниження або запобігання активності антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC) або комплементзалежної цитотоксичності (CDC) (наприклад, шляхом зміни послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує Fc-частину антитіла). У деяких варіантах 1 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення Fc-частина антитіла містить заміну N297A. У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 модифіковане для збільшення або зниження його часу напівжиття у людини (наприклад, шляхом зміни послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує Fc-частину антитіла). У деяких варіантах здійснення антитіло проти α5β1 є частиною імунокон’югату, кон’югованого з іншою групою (наприклад, лікарським засобом або детектованою міткою). У деяких варіантах здійснення терапевтична група являє собою цитотоксичний засіб (наприклад, радіоактивний ізотоп, токсин, інгібуючий ріст засіб або хіміотерапевтичний засіб). У деяких варіантах здійснення детектована мітка являє собою флуоресцентний барвник, радіоізотоп або фермент. Наступні варіанти здійснення винаходу стосуються молекул нуклеїнових кислот, що кодують будь-яке з антитіл проти α5β1, описаних в цьому документі, експресуючих векторів, що містять ці нуклеїнові кислоти, і клітин-хазяїв, що містять ці нуклеїнові кислоти. Наступні варіанти здійснення винаходу стосуються способів отримання антитіл проти α5β1, описаних в цьому документі, що включає культивування клітин-хазяїв з тим, щоб продукувалося антитіло. У деяких варіантах здійснення способи, крім того, включають витягання антитіла з клітини-хазяя. Додаткові варіанти здійснення винаходу стосуються фармацевтичних композицій, що містять антитіло проти α5β1 за даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції, крім того, містять щонайменше один, два, три, чотири або більше додаткових засобів, включаючи, наприклад, антагоніст VEGF. У деяких варіантах здійснення, додатковий засіб(и) вибраний з цитотоксичного засобу, хіміотерапевтичного засобу, інгібуючого ріст засобу або антиангіогенного засобу. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF являє собою антитіло проти VEGF. У деяких варіантах здійснення антитіло проти VEGF являє собою бевацизумаб. Також винахід стосується виробів і наборів, що містять інструкції для детекції α5β1 (наприклад, у індивідуума, якого лікують антагоністом VEGF). Інший варіант здійснення винаходу стосується способів лікування індивідуумів, які страждають на захворювання або збудження, що залучає аномальний ангіогенез, проникність судин або пропотівання рідини через судини. Способи включають введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти α5β1, описаного в цьому документі, індивідууму, тим самим здійснюючи лікування захворювання або збудження (наприклад, шляхом часткового або повного інгібування аномального ангіогенезу, проникності судин або пропотівання рідини через судини). У деяких варіантах здійснення також індивідууму вводять антагоніст VEGF. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антитіло проти α 5β1 вводять одночасно. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антитіло проти α5β1 вводять послідовно. У деяких варіантах здійснення захворювання або збудження відповідає на терапію антагоністом VEGF. У деяких варіантах здійснення захворювання або збудження вибране зі: злоякісної пухлини, імунного захворювання або захворювання очей. Згідно з одним варіантом здійснення захворювання або збудження вибране з: солідної пухлини, метастатичної пухлини, пухлини м'яких тканин, захворювання, пов'язаного з неоваскуляризацією ока, запального захворювання, яке має аномальний ангіогенез, захворювання, яке виникає після трансплантації у індивідуума, і захворювання, пов'язаного з аномальної проліферацією судинно-волокнистої тканини. Згідно з іншим варіантом здійснення злоякісна пухлина вибрана з: раку молочної залози (включаючи метастатичний рак молочної залози), раку шийки матки, раку ободової і прямої кишки (включаючи метастатичний рак ободової і прямої кишки), раку легені (включаючи недрібноклітинний рак легені), неходжкінської лімфоми (NHL), хронічного лімфоцитарного лейкозу, нирково-клітинного раку, раку передміхурової залози, включаючи рефрактерний до гормонів раку передміхурової залози, раку печінки, раку голови і шиї, меланоми, раку яєчника, мезотеліоми, раку м'яких тканин, шлунково-кишкової стромальної пухлини, мультиформної гліобластоми і множинної мієломи. Згідно з іншим варіантом здійснення захворювання вибране з: ретинопатії, старечої дегенерації жовтої плями (наприклад, вологої AMD), діабетичного набряку жовтої плями, оклюзії ретинальної вени (RVO), і почервоніння райдужки при сухій AMD/географічний атрофії (для попередження прогресування у вологу AMD); псоріазу, запального захворювання сітківки, гемолітичного уремічного синдрому, діабетичної нефропатії (наприклад, проліферативної діабетичної ретинопатії), артриту (наприклад, псоріатичного артриту, остеоартриту, ревматоїдного артриту), запального захворювання кишечнику, хронічного запалення, хронічного відшаровування сітківки, хронічного увеїту, хронічного запалення склистого тіла, відторгнення трансплантата рогівки, неоваскуляризації рогівки, неоваскуляризації трансплантата рогівки, хвороби Крони, міопії, неоваскулярного захворювання ока, хвороби Педжета, пемфігоїду, поліартериїту, стану після лазерної радіальної кератотомії, неоваскуляризації сітківки, синдрому Шегрена, виразкового коліту, відторгнення трансплантата, запалення легень, нефротичного синдрому, набряку, асцитів, 2 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 асоційованих зі злоякісними пухлинами, інсульту, ангіофіброми і неоваскулярної глаукоми. У одному варіанті здійснення способи, крім того, включають введення індивідууму додаткового лікарського засобу (наприклад, антинеопластичного засобу, хіміотерапевтичного засобу, інгібуючого ріст засобу або цитотоксичного засобу). Інший варіант здійснення винаходу стосується способів лікування злоякісної пухлини у індивідуума, що включають: введення індивідууму терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF і антитіла проти α5β1. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антитіло проти α5β1 вводять одночасно. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антитіло проти α5β1 вводять послідовно. У деяких варіантах здійснення злоякісна пухлина відповідає на терапію антагоністом VEGF. Наступний варіант здійснення винаходу стосується способів лікування старечої дегенерації жовтої плями (AMD) (включаючи, наприклад, вологу старечу дегенерацію жовтої плями) у індивідуума, який страждає на AMD, що включає: введення індивідууму терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF і антитіла проти α5β1. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антитіло проти α5β1 вводять одночасно. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антитіло проти α5β1 вводять послідовно. У іншому варіанті здійснення передбачається спосіб лікування аутоімунного захворювання у індивідуума, що включає стадію введення терапевтично ефективної кількості антагоніста VEGF і антагоніста α 5β1 одночасно або послідовно. У деяких варіантах здійснення спочатку індивідууму, що підлягає лікуванню, вводять антагоніст VEGF, а потім індивідууму вводять антитіло проти α5β1. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF і антагоніст α5β1 вводять індивідууму одночасно. У деяких варіантах здійснення спочатку індивідууму, що підлягає лікуванню, вводять антитіло проти α 5β1, а потім індивідууму вводять антагоніст VEGF. У деяких варіантах здійснення індивідуума лікують антагоністом VEGF дот тих пір, поки індивідуум не перестає відповідати на лікування антагоністом VEGF, а потім індивідуума лікують антитілом проти α 5β1. У одному конкретному варіанті здійснення індивідуума лікують антагоністом VEGF, коли злоякісна пухлина є неінвазивною або являє собою пухлину на ранній стадії, і його лікують антитілом проти α 5β1, коли злоякісна пухлина є інвазивною. У іншому варіанті здійснення індивідуум, якого лікують антитілом проти α5β1, має підвищені рівні α5β1 в ураженій тканині в порівнянні з тканиною індивідуума, який не страждає на захворювання або в порівнянні з неураженою тканиною. У цьому випадку спосіб, крім того, може включати стадію детекції α5β1 у індивідуума, наприклад в ураженій тканині, після лікування антагоністом VEGF. Згідно з одним варіантом здійснення інвазивна злоякісна пухлина, являє собою метастазуючу злоякісну пухлину. Згідно з іншим варіантом здійснення злоякісна пухлина на ранній стадії являє собою злоякісну пухлину, яку лікують допоміжною терапією (наприклад, хіміотерапією або хірургічним видаленням). Згідно з одним варіантом здійснення винаходу, індивідуум, що підлягає лікуванню антитілом проти α5β1, страждає від рецидиву після лікування антагоністом VEGF або став рефрактерним до лікування антагоністом VEGF. Згідно з іншим варіантом здійснення індивідуум, що підлягає лікуванню антитілом проти α5β1 і антагоністом VEGF, страждає на метастазуючу злоякісну пухлину або його раніше лікували допоміжною терапією. У одному варіанті здійснення пацієнткандидат має рецидив, є рефрактерним або стійким до хіміотерапевтичного засобу, такого як іринотекан. Приклади таких захворювань включають, але не обмежуються ними, метастазуючий рак ободової і прямої кишки, метастазуючий рак молочної залози, рецидивуючий рак молочної залози, метастазуючий HER2+ рак молочної залози, ад’ювантний рак молочної залози, ад’ювантний HER2+ рак молочної залози, метастазуючий рак підшлункової залози, ад’ювантний рак товстого кишечнику, ад’ювантний недрібноклітинний рак легені, ад’ювантний рак прямої кишки, ад’ювантний недрібноклітинний рак легені, метастазуючий недрібноклітинний рак легені, метастазуючий рак яєчника, метастазуючий нирково-клітинний рак і ад’ювантний нирково-клітинний рак. Згідно з одним варіантом здійснення індивідууму, який страждає на захворювання, описане в цьому документі, проводять підтримуючу терапію після лікування захворювання антагоністом VEGF, де підтримуюча терапія являє собою антагоніст α5β1 окремо або антагоніст α5β1 послідовно або одночасно з антагоністом VEGF. У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF вибраний з: антитіла, імуноадгезину, пептидного антитіла, низькомолекулярної сполуки і нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, що кодує VEGF, в суворих умовах (наприклад, рибозим, siRNA і аптамер). У деяких варіантах здійснення антагоніст VEGF являє собою антитіло (наприклад, моноклональне антитіло). Згідно з одним варіантом здійснення зв’язування антитіла проти VEGF з VEGF людини може конкурентно інгібуватися антитілом Avastin®. Згідно з іншим 3 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантом здійснення антитіло проти VEGF являє собою антитіло людини, гуманізоване або химерне антитіло. Згідно з одним конкретним варіантом здійснення антитіло проти VEGF являє собою антитіло Avastin®. Згідно з іншим варіантом здійснення антитіло проти VEGF вибране з групи, яка складається з Fab, Fab', F(ab)'2, одноланцюжкового Fv (scFv), фрагмента Fv; діантитіла і лінійного антитіла. Згідно з іншим варіантом здійснення, антагоніст VEGF являє собою біспецифічне антитіло, яке зв'язує як VEGF, так і α5β1, і також являє собою антагоніст α5β1. Наступний варіант здійснення винаходу стосується способів детекції білка α5β1 в зразку, що приблизно містить білок α5β1. Ці способи включають (1) контактування антитіл, описаних в цьому документі, із зразком; і детекцію утворення комплексу між антитілом проти α5β1 і білком α5β1. У деяких варіантах здійснення зразок взятий від пацієнта, у якого діагностоване захворювання, що характеризується аномальним ангіогенезом, аномальною проникністю судин і/або пропотіванням рідини через судини. Ці і інші варіанти здійснення винаходу додатково описані в представленому нижче докладному описі. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На фігурах 1A і 1B представлено вирівнювання послідовностей варіабельних доменів легкого ланцюга для наступних: лямбда III людини; 18C12 хом'яка; химерне 18C12.V.1.1; h18C12.v3; h18C12.v6; h18C12.v6.1.Lam3; h18C12.v6.2Lam3; і h18C12.v6.1.5. На фігурах 2A і 2B представлено вирівнювання послідовностей варіабельного домену важкого ланцюга для наступних: 18C12 хом'яка; h18C12.v3; h18C12.v6; h18C12.v6.1.Lam3; h18C12.v6.2Lam3; і h18C12.v6.1.5. На фігурі 3 представлені послідовності CDR h18C12.v3 і h18C12.v3, варіанти після дозрівання афінності h18C12.v6; h18C12.v7; h18C12.v9; h18C12.v15; h18C12.v16; h18C12.v28; h18C12.v30; h18C12.v51; h18C12.v54; h18C12.v70; і h18C12.v78. На фігурі 4 представлені результати фагового конкурентного ELISA, що демонструють зв’язування вихідного клону h18C12.v3 і варіантів 18C12 після дозрівання афінності h18C12.v6; h18C12.v7; h18C12.v9; h18C12.v15; h18C12.v16; h18C12.v28; h18C12.v30; h18C12.v51; h18C12.v54; h18C12.v70; і h18C12.v78 з інтегрином α5β1 людини. На фігурі 5 представлені результати аналізу BIACORE® відносно зв’язування вихідного клону h18C12.v3 і варіантів h18C12.v3 після дозрівання афінності h18C12.v6; h18C12.v15; h18C12.v54; і h18C12.v70 з α5β1-інтегрином людини. На фігурі 6 представлені результати аналізу BIACORE® відносно зв’язування химерного 18C12 і h18C12.v6.1.Lam3 з інтегрином α5β1 людини. На фігурі 7 представлені результати аналізу BIACORE® відносно зв’язування клонів h18C12.v6.1: h18C12.v6.1.1, h18C12.v6.1.2, h18C12.v6.1.3, h18C12.v6.1.4 і h18C12.v6.1.5, і вказана послідовність CDR-L2 в положеннях 50a, 50b, 50c і 50d для кожного з клонів h18C12.v6.1. На фігурі 8 представлені результати аналізу зв’язування фібронектину, що порівнює здатність химерного 18C12 і h18C12.v6.1 перешкоджати зв’язуванню клітин U937 з фібронектином. На фігурі 9 представлені результати аналізу зв’язування фібронектину, що порівнює здатність 18C12 і h18C12.v6.1.5 перешкоджати зв’язуванню клітин U937 з фібронектином. На фігурі 10 представлені результати аналізу зв’язування фібронектину, що порівнює здатність 18C12 і h18C12.v6.1.5 хом’яка перешкоджати зв’язуванню α5β1 з фібронектином. На фігурі 11 представлені результати аналізу міграції HUVEC, що порівнює здатність химерного 18C12 і h18C12.v6.1 перешкоджати міграції клітин HUVEC на фібронектині. На фігурі 12 представлені результати аналізу ксенотрансплантата пухлини, що визначає здатність h18C12.v6.1.5 +/- антитіло проти VEGF посилювати виживання. На фігурі 13 представлені результати аналізу ксенотрансплантата пухлини, що визначає здатність h18C12.v6.1.5 +/- антитіло проти VEGF зменшувати пухлинну масу. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ I. Вступ Даний винахід оснований на ідентифікації нових антитіл, які зв'язують інтегрин α5β1. Антитіла проти α5β1 походять з моноклонального антитіла 18C12 і їх можна використовувати в різних терапевтичних і діагностичних способах. Наприклад, антитіла проти α5β1 можна використовувати окремо або в комбінації з іншими засобами для лікування аномального ангіогенезу, новоутворення, захворювань очей і аутоімунних захворювань. Антитіла також можна використовувати для детекції білка α5β1 у пацієнтів або в зразках пацієнтів шляхом введення антитіл до білка α5β1 пацієнтам і детекції антитіла проти α5β1, пов'язаного з білком 4 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 α5β1 в зразку від пацієнта (наприклад, in vivo або ex vivo) або шляхом контактування антитіл із зразками від пацієнтів і детекції кількісно або якісно антитіла проти α5β1, пов'язаного з білком α5β1. II. Визначення "Альфа5бета1" або "α5β1" або "a5b1" або "α5β1" являє собою інтегрин, що містить два різних білки (тобто, субодиниці альфа5 і бета1). Було показано, що α 5β1 зв'язується з фібронектином, L1-CAM і фібриногеном. α5β1-інтегрин також відомий як Very Late Activatin-5, VLA-5, альфа5бета1, CD49e/CD29, рецептор фібронектину, FNR і GPIc-IIa. Відповідно до одного варіанта здійснення, α5β1 являє собою α5β1 людини. "Альфа5", використовуваний у даному документі взаємозамінно з CD49e, α5, субодиницею альфа5 інтегринів, альфа-субодиницею VLA-5, IC-субодиницею GPIc-IIa і альфа-ланцюгом FNR, стосується однієї субодиниці інтегрину α5β1. Альфа5 має чотири ізоформи, що утворюються альтернативним сплайсингом (A-D) і які варіюють у межах їхніх цитоплазматичних доменів. Амінокислотні послідовності для ізоформ альфа5 людини можуть бути знайдені, наприклад, у Genbank під реєстраційними номерами: X07979, U33879, U33882 і U33880, відповідно. "Бета1" також називають CD29, бета1, GPIIa тромбоцитів; бета-ланцюгом VLA; бета-1ланцюгом інтегринів, CD29; FNRB; MDF2; VLAB; GPIIA; MSK12 і VLA5B. Амінокислотні послідовності для бета1 можуть бути знайдені, наприклад, у Genbank під реєстраційним No. X06256. Термін "VEGF" у даному документі стосується судинно-ендотеліального фактора росту людини з 165-амінокислот і споріднених судинно-ендотеліальних факторів росту людини з 121, 189 і 206 амінокислот, як описано Leung et al. Science, 246:1306 (1989), і Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), разом з їх алельними і процесованими формами, які зустрічаються в природі. Термін "VEGF" також стосується VEGF з видів, які не стосуються людини, таких як миша, щур або примат. Іноді VEGF з конкретного виду вказуються за допомогою таких позначень, як hVEGF для VEGF людини, mVEGF для VEGF миші і т. д. Термін "VEGF" також використовують для позначення укорочених форм поліпептиду, що містять амінокислоти з 8 по 109 або з 1 по 109 судинно-ендотеліального фактора росту людини з 165 амінокислот. Вказування на будь-які такі форми VEGF може бути приведене в даній заявці, наприклад, як "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" або "VEGF165". Амінокислотні положення для "укороченого" нативного VEGF пронумеровані, як зазначено в послідовності нативного VEGF. Наприклад, положення амінокислоти 17 (метіонін) в укороченому нативному VEGF також являє собою положення 17 (метіонін) у нативному VEGF. Укорочений нативний VEGF має афінність зв'язування відносно рецепторів KDR і Flt-1, порівнянної з нативним VEGF. Відповідно до одного варіанта здійснення VEGF являє собою VEGF людини. "Антагоніст VEGF" стосується молекули, здатної нейтралізувати, блокувати, інгібувати, усувати, знижувати активність VEGF або перешкоджати їй, включаючи його зв'язування з VEGF або одним або декількома рецепторами VEGF або нуклеїновими кислотами, що кодують їх. Переважно антагоніст VEGF зв'язує VEGF або рецептор VEGF. Антагоністи VEGF включають антитіла проти VEGF і їх антигензв’язувальні фрагменти, поліпептиди, що зв'язують VEGF і рецептори VEGF і блокують взаємодію ліганд-рецептор (наприклад, імуноадгезини, пептидні антитіла), антитіла проти рецептора VEGF і антагоністи рецептора VEGF, такі як низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ VEGFR, аптамери, що зв'язують VEGF, і нуклеїнові кислоти, які гібридизуються в суворих умовах з послідовностями нуклеїнових кислот, що кодують VEGF або рецептор VEGF (наприклад, RNAi). Відповідно до одного варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF і інгібує індуковану VEGF проліферацію ендотеліальних клітин in vitro. Відповідно до одного варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з більшою афінністю, ніж не з VEGF або з рецептором не VEGF. Відповідно до одного варіанта здійснення антагоніст VEG зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з Kd від 1 мкм до 1 пМ. Відповідно до іншого варіанта здійснення антагоніст VEGF зв'язується з VEGF або рецептором VEGF з Kd від 500 нМ до 1 пМ. Відповідно до одного варіанта здійснення антагоніст VEGF вибраний із групи, яка складається з поліпептиду, такого як антитіло, пептидне антитіло, імуноадгезин, низькомолекулярна сполука або аптамер. В одному варіанті здійснення антитіло являє собою антитіло проти VEGF, таке як антитіло AVASTIN® або антитіло проти рецептора VEGF, таке як антитіло проти VEGFR2 або антитіло проти VEGFR3. Інші приклади антагоністів VEGF включають: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (сорафеніб), ZD6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 і KRN-633. 5 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Антитіло проти VEGF" являє собою антитіло, що зв'язується з VEGF з достатньою афінністю і специфічністю. Переважно, антитіло проти VEGF за винаходом можна використовувати як лікарський засіб при націлюванні на захворювання або стани, у які залучена активність VEGF, і перешкоджанні їм. Антитіло проти VEGF звичайно не зв'язується з іншими гомологами VEGF, такими як VEGF-B або VEGF-C, а також з іншими факторами росту, такими як P1GF, PDGF або bFGF. Антитіло проти VEGF являє собою моноклональне антитіло, що зв'язується з тим же епітопом, що і моноклональне антитіло проти VEGF A4.6.1, продуковане гібридомою ATCC HB 10709. Більш переважно антитіло проти VEGF являє собою рекомбінантне гуманізоване моноклональне антитіло проти VEGF, отримане згідно з Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599, включаючи, але не обмежуючи ними, антитіло, відоме як бевацизумаб (BV; Avastin®). Відповідно до іншого варіанта здійснення, антитіла проти VEGF, які можна використовувати, включають, але не обмежуються ними, антитіла, описані в WO 2005/012359. Відповідно до одного варіанта здійснення, антитіло проти VEGF містить варіабельну область важкого ланцюга і варіабельну область легкого ланцюга кожного з антитіл, представлених на фігурах 24, 25, 26, 27 і 29 WO 2005/012359 (наприклад, G6, G6-23, G6-31, G623.1, G6-23.2, B20, B20-4 і B20.4.1). В іншому варіанті здійснення антитіло проти VEGF, відоме як ранібізумаб, являє собою антагоніст VEGF, що уводиться від захворювання очей, такого як діабетична ретинопатія і волога AMD. Антитіло проти VEGF "бевацизумаб (BV)", також відоме як "rhuMAb VEGF" або "Avastin®", являє собою рекомбінантне гуманізоване моноклональне антитіло проти VEGF, отримане згідно з Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599. Воно містить мутантні каркасні області Ig1 людини і антигензв’язувальні визначаючі комплементарність області з моноклонального антитіла проти hVEGF миші A.4.6.1, що блокує зв'язування VEGF людини з його рецепторами. Приблизно 93 % амінокислотної послідовності бевацизумабу, включаючи велику частину каркасних областей, походить з Ig1 людини, і приблизно 7 % послідовності походить з антитіла миші A4.6.1. Бевацизумаб має молекулярну масу приблизно 149000 дальтон і є глікозилованим. Інші антитіла проти VEGF включають антитіла, описані в патенті США No. 6884879 і WO 2005/044853. Антитіло проти VEGF ранібізумаб або антитіло LUCENTIS® або rhuFab V2 являє собою гуманізований підданий дозріванню афінності Fab-фрагмент проти VEGF людини. Ранібізумаб одержують стандартними способами рекомбінантної технології в експресуючому векторі E. coli і ферментацією бактерій. Ранібізумаб не є глікозилованим і має молекулярну масу ~48000 дальтон. Див. WO98/45331 і U.S. 2003/0190317. Молекули, такі як антитіла, які характеризуються зв'язуванням із перекривними або подібними областями на мішені, можна ідентифікувати конкурентними аналізами інгібування/зв'язування. В одному варіанті здійснення в конкурентному аналізі інгібування використовують клітини HUVEC або інші клітини, які експресують α5β1, і для оцінки ділянок зв'язування двох антитіл проти α5β1 один відносно одного використовують FACS. Наприклад, клітини HUVEC можна промивати в конічній пробірці і центрифугувати протягом 5 хв при 1000 об./хв. Осад, як правило, промивають три рази. Потім клітини можна ресуспендувати, підраховувати і тримати на льоду до застосування. У ямку можна додавати 100 мкл першого антитіла проти α 5β1 (наприклад, починаючи з концентрації 1 мкг/мл або більше низької концентрації). Далі в кожну ямку можна 5 додавати 100 мкл клітин (наприклад, 20×10 клітин) і інкубувати на льоду протягом 30 хв. Далі в кожну ямку можна додавати 100 мкл біотинільованого антитіла проти α 5β1 (вихідний розчин 5 мкг/мл) і інкубувати на льоду протягом 30 хв. Потім клітини промивають і осаджують протягом 5 хв при 1000 об./хв. Супернатант аспірують. У ямки додають кон’югований з R-фікоеритрином стрептавідин (Jackson 016-110-084) (100 мкл при 1:1000). Далі планшет можна загортати у фольгу і інкубувати на льоду протягом 30 хв. Після інкубації осад можна промивати й осаджувати протягом 5 хв при 1000 об./хв. Осад можна ресуспендувати і переносити в мікропробірки для титрування для FACS-аналізу. "Ангіогенний фактор або агент" являє собою фактор росту або його рецептор, які залучені до стимуляції розвитку кровоносних судин, наприклад, стимулюють ангіогенез, ріст ендотеліальних клітин, стабільність кровоносних судин і/або утворення судин і т. д. Наприклад, ангіогенні фактори включають, але не обмежуються ними, наприклад, VEGF і представники сімейства VEGF і їхні рецептори (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 і VEGFR3), P1GF, сімейство PDGF, сімейство фібробластного фактора росту (FGF), ліганди TIE (ангіопоетини, ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, ефрини, Bv8, Delta-подібний ліганд 4 (DLL4), Del-I, фібробластні фактори росту: кислотний (aFGF) і основний (bFGF), FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, фолістатин, гранулоцитарний колонієстимулуючий фактор (G-CSF), GM-CSF, фактор росту 6 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гепатоцитів (HGF)/розсіюючий фактор (SF), інтерлейкін-8 (IL-8), CXCL12, лептин, Midkine, нейропіліни, NRP1, NRP2, плацентарний фактор росту, тромбоцитарний ендотеліальний фактор росту ендотеліальних клітин (PD-ECGF), тромбоцитарний фактор росту, особливо PDGF-BB, PDGFR-альфа або PDGFR-бета, плейотрофін (PTN), програнулін, проліферин, трансформуючий фактор росту-альфа (TGF-альфа), трансформуючий фактор росту-бета (TGFбета), фактор некрозу пухлина-альфа (TNF-альфа), Alk1, CXCR4, NotCH1, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4 і т. д. Крім того, вони включають фактори, що стимулюють ангіогенез, такі як ESM1 і перлекан. Також вони включають фактори, що прискорюють загоєння раней, такі як гормон росту, інсулін-подібний фактор росту-1 (IGF-1), VIGF, епідермальний фактор росту (EGF), EGF-подібний домен, multiple 7 (EGFL7), CTGF і представники його сімейства і TGFальфа і TGF-бета. Див., наприклад, Klagsbrun and D'амоrе (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (наприклад, таблиця 1, у якій приведені відомі ангіогенні фактори); і Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206. "Антиангіогенний засіб" або "інгібітор ангіогенезу" стосується низькомолекулярної речовини, полінуклеотиду (включаючи, наприклад, інгібіторну РНК (RNAi або siRNA)), поліпептиду, виділеного білка, рекомбінантного білка, антитіла або їх кон’югатів або злитих білків, які інгібують ангіогенез, утворення судин або небажану проникність судин, або прямо, або опосередковано. Варто розуміти, що антиангіогенний засіб, включає засоби, які зв'язують ангіогенний фактор або його рецептор або блокують його ангіогенну активність. Наприклад, антиангіогенний засіб являє собою антитіло або інший антагоніст ангіогенного засобу, як визначено вище, наприклад, антитіла до VEGF-A або до рецептора VEGF-A (наприклад, рецептора KDR або рецептора Flt-1), інгібітори PDGFR, низькомолекулярні сполуки, що блокують передачу сигналу рецептора VEGF (наприклад, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (сунитиніб малат), AMG706, або засоби, описані наприклад, у міжнародній патентній заявці WO 2004/113304). Антиангіогенні засоби включають, але не обмежуються ними, наступні засоби: інгібітори VEGF, такі як специфічний антагоніст VEGF, інгібітор EGF, інгібітори EGFR, Erbitux® (цетуксимаб, ImClone Systems, Inc., Branchburg, N. J.), Vectibix® (панітумумаб, Amgen, Thousand Oaks, CA), інгібітори TIE2, інгібітори IGF1R, інгібітори COX-II (циклооксигенази II), інгібітори MMP-2 (матриксної металопротеїнази 2), і інгібітори MMP-9 (матриксної металопротеїнази 9), CP-547,632 (Pfizer Inc., NY, USA), акситиніб (Pfizer Inc.; AG013736), ZD-6474 (AstraZeneca), AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis), ваталаніб (також відомий як PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering A G), Macugen (пегаптаніб октанатрій, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc./Gilead/Eyetech), IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash., США); і ангіозим, синтетичний рибозим від Rybozyme (Boulder, Colo.) і хірон (Emeryville, Calif.) і їхні комбінації. Інші інгібітори ангіогенезу включають тромбоспондин 1, тромбоспондин 2, колаген IV і колаген XVIII. Інгібітори VEGF описані в патентах США No. 6534524 і 6235764, обидва з яких включені в даний документ у повному об’ємі для всіх цілей. Антиангіогенні засоби також включають природні інгібітори ангіогенезу, наприклад, 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (наприклад, таблиця 3, у якій приведена антиангіогенна терапія при злоякісній меланомі); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (наприклад, таблиця 2, у якій приведені відомі антиангіогенні фактори); і Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (наприклад, таблиця 1, у якій приведені антиангіогенні засоби, використані в клінічних випробуваннях). Термін "антиангіогенна терапія" стосується терапії, придатної для інгібування ангіогенезу, що включає введення антиангіогенного засобу. "Kd" або "величину Kd" для антитіла проти VEGF відповідно до даного винаходу в одному варіанті здійснення вимірюють за допомогою аналізу зв'язування міченого радіоактивною міткою VEGF (RIA), проведеного з Fab-версією антитіла, що представляє інтерес, і VEGF, як описано для наступного аналізу, у якому вимірюють афінність зв'язування Fab з VEGF у розчині 125 шляхом зрівноважування Fab мінімальною концентрацією ( I)-міченого VEGF(109) у присутності серії титрів неміченого VEGF, з наступною фіксацією зв'язаного VEGF на планшеті, покритому антитілом проти Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol. Biol 293:865-881). Щоб установити умови для аналізу на мікропланшети для титрування (Dynex) наносять протягом ночі 5 мкг/мл фіксуючого антитіла проти Fab (Cappel Labs) у 50 мМ розчині карбонату натрію (рН 9,6), а потім блокують з використанням 2 % (мас./об.) бичачий сироватковий альбумін у PBS протягом від двох до п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 °С). У не адсорбуючому планшеті 125 (Nunc #269620) 100 пМ або 26 пМ [ I]VEGF(109) змішують із серійними розведеннями Fab, що представляє інтерес (наприклад, Fab-12, (Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599)). Потім Fab, що представляє інтерес, інкубують протягом ночі; однак інкубацію можна продовжувати 7 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 протягом 65 годин, щоб переконатися в тому, що рівновага досягнута. Після цього суміші переносять на фіксуючий планшет для інкубації при кімнатній температурі на 1 годину. Потім розчин видаляють, і планшет промивають вісім разів 0,1 % Tween-20 у PBS. Після того, як планшети висихають, додають 150 мкл/ямку сцинтилятору (MicroScint-20; Packard), і проводять підрахунок у планшетах з використанням лічильника гамма-імпульсів Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного з Fab, що забезпечують зв'язування, яке менше або дорівнює 20 % від максимального зв'язування, вибирають для використання в конкурентних аналізах зв'язування. Відповідно до іншого варіанта здійснення Kd або величину Kd вимірюють з використанням аналізу способом поверхневого плазмонного резонансу, використовуючи TM TM BIAcore -2000 або BIAcore -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25 °С з чипами CM5 з іммобілізованим на них hVEGF(8-109) при ~10 одиницях відповіді (RU). У короткому викладі, біосенсорні чипи з карбоксиметилованого декстрану (CM5, BIAcore Inc.) активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)карбодііміду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. VEGF людини розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, pН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед ін'єкцією зі швидкістю потоку 5 мкл/хвилину для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (RU) зв'язаного білка. Після ін'єкції VEGF людини ін’єктують 1 M етаноламін для блокування не вступили в реакцію груп. Для визначення показників кінетики дворазові серійні розведення зв’язувальної молекули (від 0,78 нМ до 500 нМ) ін’єктують у PBS з 0,05 % Tween 20 (PBST) при 25 °С зі швидкістю потоку приблизно 25 мкл/хв. Константу асоціації (k on) і константу дисоціації (k off) обчислюють з використанням простої моделі зв'язування Ленгмюра "одна до одної" (BIAcore Evaluation Software версії 3.2) за допомогою одночасної апроксимації сенсограм асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) обчислюють як співвідношення k off/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al., (1999) J. 6 -1 1 Mol. Biol. 293:865-881. Якщо константа асоціації перевищує 10 M с- в аналізі способом поверхневого плазмонного резонансу, зазначеним вище, тоді константу асоціації можна визначати з використанням способу гасіння флуоресценції, у якому вимірюють підвищення або зниження інтенсивності випромінювання флуоресценції (збудження = 295 нМ; випромінювання = 340 нМ, смуга пропускання 16 нМ) при 25 °С 20 нМ антитіла проти VEGF (форма Fab) у PBS, pН 7,2, у присутності зростаючих концентрацій короткої форми (8-109) VEGF людини або VEGF миші при вимірюванні в спектрофотометрі, такому як спектрофотометр зі струменем, що зупиняється, (Aviv Instruments) або спектрофотометр SLM-Aminco серії 8000 (Thermo Spectronic) із перемішуваною кюветою. Подібні аналізи зв'язування можна проводити для визначення Kd Fab або антитіла проти α5β1 з використанням α5β1 як мішені. У даному документі індивідуумом, що підлягає лікуванню, є ссавець (наприклад, людина, примат, що не є людиною, щур, миша, корова, кінь, свиня, вівця, коза, собака, кішка і т. д.). Індивідуум може бути пацієнтом клініки, добровольцем клінічних випробувань, експериментальною твариною і т. д. В індивідуума може передбачатися наявність або він може бути підданий ризику наявності злоякісної пухлини, імунного захворювання або будь-якого іншого захворювання, яке має аномальний ангіогенез, у нього може бути діагностована злоякісна пухлина, імунне захворювання або будь-яке інше захворювання, яке має аномальний ангіогенез. У даній галузі відомі багато способів діагностики злоякісної пухлини, імунного захворювання або будь-якого іншого захворювання, що виявляє аномальний ангіогенез, і клінічна картина цих захворювань. Відповідно до одного варіанта здійснення індивідуумом, що підлягає лікуванню відповідно до винаходу, є людина. "Аномальний ангіогенез" відбувається, коли нові кровоносні судини ростуть або надлишково, або іншим неналежним чином (наприклад, розташування, час, ступінь або початок ангіогенезу, що є небажаними з медичної точки зору) при хворобливому стані, або так, що він викликає хворобливий стан. У деяких випадках надлишковий, неконтрольований або іншим способом неналежний ангіогенез виникає, коли відбувається ріст нових кровоносних судин, що приводить до погіршення хворобливого стану або викликає хворобливий стан, такий як злоякісна пухлина, особливо васкуляризовані солідні пухлини і метастатичні пухлини (включаючи рак товстого кишечнику, рак легені (особливо дрібноклітинний рак легені) або рак передміхурової залози, захворювання, які викликаються неоваскуляризацією ока, особливо діабетична сліпота, ретинопатії, первинна діабетична ретинопатія або стареча дегенерація жовтої плями, хоріоїдальна неоваскуляризація (CNV), діабетичний набряк жовтої плями, патологічна міопія, хвороба фон Гіппеля-Ліндау, гістоплазмоз ока, оклюзія центральної вени сітківки (CRVO), неоваскуляризація рогівки, неоваскуляризація сітківки і почервоніння райдужки; псоріаз, псоріатичний артрит, гемангіобластома, така як гемангіома; запальні захворювання нирок, такі як гломерулонефрит, особливо мезангіопроліферативний гломерулонефрит, гемолітичний уремічний синдром, діабетична нефропатія або гіпертензивний нефросклероз; 8 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 різні запальні захворювання, такі як артрит, особливо ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечнику, псоріаз, саркоїдоз, артеріальний артеріосклероз і захворювання, що виникають після трансплантації, ендометріоз або хронічна астма і більше 70 інших станів. Нові кровоносні судини можуть постачати уражені тканини, руйнувати нормальні тканини і, у випадку злоякісної пухлини, нові кровоносні судини можуть дозволяти пухлинним клітинам виходити в кровотік і залишитися в інших органах (метастази пухлини). Даний винахід передбачає лікування пацієнтів, що мають ризик розвитку зазначених вище захворювань. "Аномальна проникність судин" виникає, коли потік рідин, молекул (наприклад, іонів і поживних речовин) і клітин (наприклад, лімфоцитів) між судинними і позасудинними компартментами є надлишковим або іншим способом неналежним (наприклад, розташування, час, ступінь або виникнення проникності судин, небажані з медичної точки зору) при хворобливому стані або так, що він викликає хворобливий стан. Аномальна проникність судин може привести до надлишкового або інших способів неналежного "просочуванню" іонів, води, поживних речовин або клітин через судини. У деяких випадках, надлишкова, неконтрольована або іншим способом неналежна проникність судин або пропотівання рідини через судини підсилюють або індукують хворобливий стан, включаючи, наприклад, набряк, асоційований з пухлинами, включаючи, наприклад, пухлини головного мозку; асцити, асоційовані зі злоякісними пухлинами; синдром Мейгса; запалення легень; нефротичний синдром; перикардіальний випіт; плевральний випіт; проникність, асоційовану із серцево-судинними захворюваннями, такими як стан після інфаркту міокарда й інсульту і т.п. Даний винахід передбачає лікування пацієнтів, у яких розвилися захворювання і збудження, асоційовані з аномальною проникністю судин або пропотіванням рідини через судини, або мають ризик їхнього розвитку. Інші пацієнти, які є кандидатами для отримання антитіл або поліпептидів за даним винаходом, мають аномальну проліферацію судинно-волокнистої тканини, червоні вугри, синдром набутого імунодефіциту, оклюзію артерій, атопічний кератит, бактерійні виразки, синдром Бехчета, пухлини кровотворної системи, обструктивне захворювання сонної артерії, хоріоїдальну неоваскуляризацію, хронічне запалення, хронічне відшаровування сітківки, хронічний увеїт, хронічне запалення склистого тіла, переношування контактних лінз, відторгнення трансплантата рогівки, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію трансплантата рогівки, хворобу Крона, хворобу Ілза, епідемічний кератокон’юктивіт, грибкові виразки, інфекції вірусом простого герпесу, інфекції вірусом оперізувального герпесу, синдром підвищеної в'язкості крові, саркому Капоші, лейкоз, ліпідну дегенерацію, хворобу Лайма, крайовий кератоліз, виразку Морена, інфекції Mycobacteria, відмінні від лепри, міопію, неоваскулярне захворювання очей, ямки диска зорового нерва, синдром Ослера-Вебера (Ослера-Вебера-Рандю), остеоартрит, хворобу Педжета, запалення війкового кільця, пемфігоїд, фліктенульозний кон'юнктивіт, поліартеріїт, ускладнення після лазерного втручання, протозойні інфекції, еластичну псевдоксантому, птеригій сухий кератит, радіальну кератотомію, неоваскуляризацію сітківки, ретролентальну фіброплазію, ретролентальні фіброплазії, саркоїд, склерит, серповидноклітинну анемію, синдром Шегрена, солідні пухлини, хворобу Штаргардта, хворобу Стівена-Джонсона, верхній лімбальний кератит, сифіліс, системний вовчак, крайову дегенерацію Террьєна, токсоплазмоз, травму, пухлини саркоми Юїнга, пухлини нейробластоми, пухлини остеосаркоми, пухлини ретинобластоми, пухлини рабдоміосаркоми, виразковий коліт, оклюзію вен, дефіцит вітаміну А і саркоїдоз Вегенера, небажаний ангіогенез, асоційований з діабетом, паразитарні захворювання, аномальне загоєння ран, гіпертрофію після хірургічної операції, пошкодження або травм, інгібування росту волосся, інгібування овуляція і утворення жовтого тіла, інгібування імплантації і інгібування розвитку ембріона в матці, або мають ризик їх розвитку. Способи лікування, направлені проти ангіогенезу, придатні для загального лікування відторгнення трансплантата, запалення легень, нефротичного синдрому, прееклампсії, перикардіального випоту, такого як випіт, асоційований з перикардитом, і плеврального випоту, захворювань і порушень, що характеризуються небажаною проникністю судин або пропотіванням рідини через судини, наприклад, набряку, асоційованого з пухлинами, включаючи, наприклад, пухлини головного мозку, асцити, асоційовані зі злоякісними пухлинами, синдром Мейгса, запалення легень, нефротичний синдром, перикардіальний випіт, плевральний випіт, проникність, асоційовану з серцево-судинними захворюваннями, такими як стан після інфаркту міокарда і інсульту і т. п. Інші залежні від ангіогенезу захворювання згідно з винаходом включають ангіофіброму (аномальні кровоносні судини, які схильні до кровотечі), неоваскулярну глаукому (ріст кровоносних судин в оці), артеріовенозні мальформації (аномальне сполучення між артеріями і венами), незрослі переломи (переломи, які не заживають), атеросклеротичні бляшки 9 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (ущільнення артерій), піогенну гранульому (поширене пошкодження шкіри, що складається з кровоносних судин), склеродермію (форма захворювання сполучної тканини), гемангіому (пухлина, що складається з кровоносних судин), трахому (основна причина сліпоти в країнах, що розвиваються), гемартроз, зрощення судин і гіпертрофічні рубці (аномальне рубцювання). У цьому документі термін "лікування" (і його граматичні варіанти, такі як "лікувати" або "проведення лікування") стосується введення сполуки або фармацевтичної композиції для профілактичних і/або терапевтичних цілей. Терміни "лікувати захворювання" або застосовувати для "терапевтичного лікування" стосуються проведення лікування у індивідуума, який вже страждає на захворювання, для поліпшення стану індивідуума. Бажані ефекти лікування включають, але не обмежуються ними, попередження рецидиву захворювання, пом'якшення симптомів, зменшення будь-яких прямих або опосередкованих патологічних наслідків захворювання, попередження метастазів, зниження швидкості прогресування захворювання, пом'якшення або полегшення хворобливого стану, і ремісію або поліпшення прогнозу. У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом використовують для сповільнення розвитку захворювання або для сповільнення прогресування захворювання. Переважно, індивідуума діагностують як страждаючого на захворювання, що має аномальний ангіогенез, на основі виявлення будь-якого з характерних симптомів, описаних нижче, або застосування діагностичних способів, описаних в цьому документі. Термін "попереджати захворювання" стосується профілактичного лікування індивідуума, який ще не хворий, але який схильний до конкретного захворювання або іншим чином має ризик йогорозвитку. Переважно індивідуума визначають як маючого ризик розвитку захворювання, що має аномальний ангіогенез з використанням діагностичних способів, описаних в цьому документі. Під "лікуванням або пом'якшенням" мають на увазі пом'якшення стану або симптомів стану до або після його виникнення. У порівнянні з еквівалентним контролем без лікування, таке пом'якшення або ступінь лікування складає щонайменше 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % або 100 % при вимірюванні стандартним способом. Терміни "рецидив", "загострення" або "що загострився" стосується повернення злоякісної пухлини або захворювання після зникнення захворювання згідно з клінічною оцінкою. Діагноз видаленого метастазу або локального рецидиву можна вважати загостренням. "Рефрактерний" стосується стійкості або відсутності відповіді захворювання або стану на лікування (наприклад, число неопластичних плазматичних клітин зростає, навіть, незважаючи на проведення лікування). У певних варіантах здійснення, термін "рефрактерний" стосується стійкості або відсутності відповіді на яке-небудь з попередніх лікувань, включаючи, але не обмежуючись ними, антагоніст VEGF, антиангіогенні засоби і хіміотерапевтичне лікування. У певних варіантах здійснення термін "рефрактерний" стосується властивої захворюванню або стану відсутності відповіді на яке-небудь попереднє лікування, що включає антагоніст VEGF, антиангіогенні засоби і/або хіміотерапевтичне лікування. У певних варіантах здійснення антагоніст VEGF являє собою антитіло проти VEGF. "Який загострився" стосується повернення захворювання пацієнта до його попереднього хворобливого стану, особливо до повернення симптомів після видимого лікування або часткового лікування. У певних варіантах здійснення стан, що загострився, стосується процесу повернення або повернення до захворювання до попереднього лікування, включаючи, але не обмежуючись ними, антагоніст VEGF, антиангіогенні засоби і/або хіміотерапевтичне лікування. У певних варіантах здійснення стан, що загострився, стосується процесу повернення або повернення до захворювання після первинної сильної відповіді на терапію злоякісної пухлини, що включає антагоніст VEGF, антиангіогенні засоби і/або хіміотерапевтичне лікування. У певних варіантах здійснення антагоніст VEGF являє собою антитіло проти VEGF. Термін "допоміжна терапія" стосується лікування, що проводиться після первинного лікування, звичайно хірургічної операції. Допоміжна терапія від злоякісної пухлини або захворювання може включати імунну терапію, хіміотерапію, променеву терапію або гормональну терапію. Термін "підтримуюча терапія" стосується повторного лікування по розкладу, яке проводять для підтримки ефектів попереднього лікування. Підтримуючу терапію часто проводять для підтримки ремісії злоякісної пухлини або продовження відповіді на конкретну терапію, незалежно від прогресування захворювання. Термін "інвазивна злоякісна пухлина" стосується злоякісної пухлини, яка поширюється за шар тканини, в якій вона виникла, в нормальні оточуючі тканини. Інвазивні злоякісні пухлини можуть бути метастатичними або можуть не бути метастатичними. Термін "неінвазивна злоякісна пухлина" стосується дуже ранньої злоякісної пухлини і злоякісної пухлини, яка не поширилася за тканину, з якої вона походить. 10 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "виживання без прогресування" в онкології стосується проміжку часу під час і після лікування, протягом якого злоякісна пухлина не росте. Виживання без прогресування включає кількість часу, протягом якого пацієнти зазнають повну відповідь або часткову відповідь, а також кількість часу, протягом якого пацієнти зазнають стабільне захворювання. Термін "прогресуюче захворювання" в онкології може стосуватися зростання пухлини більше ніж на 20 процентів після початку захворювання, внаслідок або збільшення маси, або поширення пухлини. "Порушення" являє собою будь-який стан, при якому може бути корисним лікування антитілом. Прикладом є ссавці, які страждають на аномальний ангіогенез (надмірний, неналежний або неконтрольований ангіогенезом) або аномальну проникність судин або пропотівання рідини через судини, або потребують його профілактики. Він включає хронічні і гострі порушення або захворювання, що включають патологічні стани, які роблять схильними ссавця до порушення, що розглядається. Необмежувальні приклади порушень, що підлягають лікуванню, описаному в цьому документі, включають злоякісні і доброякісні пухлини; нелейкозні і лімфоїднізлоякісні пухлини; нейрональні, гліальні, астроцитарні, гіпоталамічні і інші залозисті, макрофагальні, епітеліальні, стромальні порушення і порушення бластоцелю; і запальні, ангіогенні і імунологічні порушення. Терміни "злоякісна пухлина" і "злоякісний" стосуються фізіологічного стану у ссавців або описують фізіологічний стан у ссавців, який, як правило, характеризується нерегульованим зростанням клітин. Приклади злоякісної пухлини включають, але не обмежуються ними, карциному, лімфому, бластому, саркому і лейкоз. Більш конкретні приклади таких злоякісних пухлин включають плоскоклітинний рак, гліобластому, рак шийки матки, рак яєчника, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстого кишечнику, рак ободової і прямої кишки, карциному ендометрія, карциному слинної залози, рак нирки, ренальний рак, рак передміхурової залози, рак жіночих зовнішніх статевих органів, рак щитовидної залози, карциному печінки, рак голови і шиї, рак прямої кишки, рак ободової і прямої кишки, рак легені, включаючи дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені, аденокарциному легені і плоскоклітинну карциному легені, плоскоклітинний рак (наприклад, епітеліальний плоскоклітинний рак), рак передміхурової залози, злоякісну пухлину очеревини, печінковоклітинний рак, гастральний рак або рак шлунка, включаючи шлунково-кишковий рак, рак підшлункової залози, гліобластому, ретинобластому, астроцитому, текому, аренобластому, гепатому, гематологічні злоякісні пухлини, включаючи неходжкінську лімфому (NHL), множинну мієлому і гострі гематологічні злоякісні пухлини, карциному ендометрія або карциному матки, ендометріоз, фібросаркоми, хоріокарциному, карциному слинної залози, рак жіночих зовнішніх статевих органів, рак щитовидної залози, карциноми стравоходу, карциному печінки, анальну карциному, карциному статевого члена, носоглоткову карциному, карциноми гортані, саркому Капоші, меланому, карциноми шкіри, шваному, олігоденрогліому, нейробластоми, рабдоміосаркому, остеогенну саркому, лейоміосаркоми, карциноми сечовивідних шляхів, карциноми щитовидної залози, пухлину Вільмса, а також B-клітинну лімфому (включаючи низькозлоякісну/фолікулярну неходжскінську лімфому (NHL); NHL дрібних лімфоцитів (SL); NHL проміжної злоякісності/фолікулярну NHL; дифузну NHL проміжної злоякісності; високозлоякісну імунобластну NHL; високозлоякісну лімфобластну NHL; високозлоякісну NHL дрібних клітин з нерозщепленими ядрами; NHL з масивним ураженням; лімфому з клітин мантійної зони; СНІД-пов'язану лімфому; і макроглобулінемію Вальденстрема; хронічний лімфоцитарний лейкоз (CLL); гострий лімфобластний лейкоз (ALL); волосатоклітинний лейкоз; хронічний мієлобластний лейкоз; і лімфопроліферативне збудження після трансплантації (PTLD), а також аномальну проліферацію судин, асоційовану з факоматозами, і синдром Мейгса. "Пухлина" в цьому документі стосується будь-якого неопластичного росту і проліферації клітин, як злоякісних, так і доброякісних, і всіх передзлоякісних і злоякісних клітин і тканин. Термін "антинеопластична композиція" або "антинеопластичний засіб" стосується композиції, придатної для лікування злоякісної пухлини, що містить щонайменше одну активну лікарську речовину, наприклад, "засіб проти злоякісної пухлини". Приклади лікарських засобів (засобів проти злоякісної пухлини) включають, але не обмежуються ними, наприклад, хіміотерапевтичні засоби, інгібуючі ріст засоби, цитотоксичні засоби, засобу, що використовуються в променевій терапії, засоби проти ангіогенезу, апоптотичні засоби, засоби проти тубуліну, і інші засоби для лікування злоякісної пухлини, такі як антитіла проти HER-2, антитіла проти CD20, антагоніст рецептора епідермального фактора росту (EGFR) (наприклад, TM інгібітор тирозинкінази), інгібітор HER1/EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva ), інгібітори TM тромбоцитарного фактора росту (наприклад, Gleevec (іматинібу мезилат)), інгібітор COX-2 11 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, целекоксиб), інтерферони, цитокіни, антагоністи (наприклад, нейтралізуючі антитіла), які зв'язуються з однією або декількома з наступних мішеней: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BAFF, BR3, APRIL, BCMA або рецептор(и) VEGF, TRAIL/Apo2, і інші біоактивні і органічні хімічні засоби і т. д. Також винахід передбачає їх комбінації. "Інгібуючий ріст засіб", при застосуванні в цьому документі, стосується сполуки або композиції, які інгібують ріст або проліферацію клітини in vitro і/або in vivo. Таким чином, інгібуючий ріст засіб може являти собою засіб, який значно знижує процентну кількість клітин в S-фазі. Приклади інгібуючих ріст засобів включають засоби, які блокують прогресування клітинного циклу (в місці, відмінному від S-фази), такі як засоби, які індукують зупинку в G1-фазі і зупинку M-фазі. Класичні блокатори M-фази включають алкалоїди барвінку (вінкристин і вінбластин), TAXOL®, і інгібітори топоізомерази II, такі як доксорубіцин, епірубіцин, даунорубіцин, етопозид і блеоміцин. Ті засоби, які викликають зупинку в G1-фазі, також залучають зупинку в S-фазі, наприклад, алкілуючі ДНК засоби, такі як тамоксифен, преднізон, декарбазин, мехлоретамін, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил і ara-C. Додаткову інформацію можна знайти в The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., розділ 1, під назвою "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо р. 13. Термін "цитотоксичний засіб" в цьому документі стосується речовини, яка інгібує функціонування клітин, або перешкоджає йому, і/або спричиняє руйнування клітин. Мають на 131 125 90 186 увазі, що термін включає радіоактивні ізотопи (наприклад, I , I , Y і Re ), інгібуючі ріст засоби, хіміотерапевтичні засоби і токсини, такі як ферментативно активні токсини бактерій, грибів, рослин або тварин, або їх фрагменти. "Хіміотерапевтичний засіб" являє собою хімічну сполуку, корисну при лікуванні злоякісної пухлини. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають хімічну сполуку, корисну при лікуванні злоякісної пухлини. Приклади хіміотерапевтичних засобів включають алкілуючі засоби, такі як тіотепа і циклофосфамід CYTOXAN®; алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метиламеламіни, включаючи алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилолмеламін; ацетогініни (особливо булатацин і булатацинон); камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан); бріостатин; калістатин; CC-1065 (включаючи його синтетичні аналоги адозелезин, карзелезин і бізелезин); криптофіцини (зокрема криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги KW-2189 і CB1-TM1); елеутеробін; панкріастатин; саркодиктиїн; спонгістатин; азотистий іприт, такий як хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамід, естрамустин, іфосфамід, мехлоретамін, мехлоретаміну оксиду гідрохлорид, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднемустин, трофосфамід, урацильний іприт; нітрозосечовини, такі як кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, німустин і ранімустин; антибіотики, такі як ендиїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, особливо каліхеаміцин гамма1I і каліхеаміцин омегаI1 (див., наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)); динеміцин, включаючи динеміцин А; бісфосфонати, такі як клодронат; еспераміцин; а також хромофор неокарциностатин і схожі хромопротеїнові хромофори на основі ендиїнових антибіотиків), аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, сактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карцинофілін, хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, декторубіцин, 6-діазо5-оксо-L-норлейцин, доксорубіцин ADRIAMYCIN® (включаючи морфоліно-доксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2-піроліно-доксорубіцин і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марселоміцин, мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, оливоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, зиностатин, зорубіцин; антиметаболіти, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринів, такі як флударабін, 6меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідинів, такі як анцитабін, азацитидин, 6азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин; андрогени, такі як калустерон, дромостанолон пропіонат, епітіостанол, мепитіостан, тестолактон; антиадренальні засоби, такі як аміноглутетимід, мітотан, трилостан; засоби для заповнення фолієвої кислоти, такі як фролінова кислота; ацеглатон; альдофосфаміду глікозид; амінолевулінову кислоту; енілурацил; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демекольцин; діазиквон; ельфорнітин; еліптинію ацетат; епотилон; етоглуцид; нітрат галію; гідроксисечовину; лентинан; лонідаїнін; майтанзиноїди, такі як майтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопіданмол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; подофілінову кислоту; 2-етилгідразид; прокарбазин; 12 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полісахаридний комплекс PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофіран; спірогерманій; тенуазонову кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриетиламін; трихотецени (особливо токсин Т-2, веракурин А, роридин А і ангвідин); уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронитол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("AraC"); циклофосфамід; тіотепу; таксоїди, наприклад, паклітаксел TAXOL® (Bristol-Myers Squibb TM Oncology, Princeton, N. J.), який не містить кремофору ABRAXANE , сконструйований з альбуміном склад паклітакселу у вигляді частинок (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), і доксетаксел TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабін GEMZAR®; 6-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платину; етопозид (VP-16); іфосфамід; мітоксантрон; вінкристин; NAVELBINE® вінорелбін; новантрон; теніпозид; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселоду; ібандронат; іринотекан (Camptosar, CPT-11) (включаючи схему лікування з іринотекану з 5-FU і лейковорином); інгібітор топоізомерази RFS 2000; дифторметилорнітин (DMFO); ретиноїди, такі як ретиноєва кислота; капецитабін; комбретастатин; лейковорин (LV); оксаліплатин, включаючи схему лікування з оксаліплатином TM (FOLFOX); інгібітори PKC-альфа, Raf, H-Ras і EGFR (наприклад, ерлотиніб (Tarceva )), які знижують проліферацію клітин, і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-яких з вказаних вище. Хіміотерапевтичні засоби також включають антигормональні засоби, які діють, регулюючи або ингибируя дія гормонів на пухлини, такі як антиестрогени і селективні модулятори рецепторів естрогену (SERM), включаючи, наприклад, тамоксифен (включаючи тамоксифен NOLVADEX®), ралоксифен, дролоксифен, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон і тореміфен FARESTON; інгібітори ароматази, які інгібують фермент ароматазу, який регулює продукцію естрогенів в надниркових залозах, наприклад, такі як 4(5)імідазоли, аміноглутетімід, магестролу ацетат MEGASE®, екземестан AROMASIN®, форместан, фадрозол, ворозол RIVISOR®, лектрозол FEMARA® і анастрозол ARIMIDEX®; і антиандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, леупролід і гозерелін; а також троксацитабін (1,3-діоксолановий нуклеозидний аналог цитозину); антисмислові олігонуклеотиди, зокрема олігонуклеотиди, які інгібують експресію генів в каскадах передачі сигналу, залучених в порушену проліферацію клітин, наприклад, таких як PKC-альфа, Raf і HRas; рибозими, такі як інгібітор експресії VEGF (наприклад, рибозим ANGIOZYME®) і інгібітор експресії HER2; вакцини, такі як вакцини для генної терапії, наприклад, вакцина ALLOVECTIN®, вакцина LEUVECTIN® і вакцина VAXID®; PROTEUKIN® rIL-2; інгібітор топоізомерази 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; вінорелбін і еспераміцини (див. патент США No. 4675187) і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-яких з вказаних вище. Термін "проліки" в даній заявці стосується форми попередника або похідної фармацевтично активної речовини (наприклад, низькомолекулярної сполуки), яка є менше цитотоксичною для клітин в порівнянні з вихідним лікарським засобом і може бути ферментативно або гідролітично активована або перетворена в більш активну вихідну форму. Див., наприклад, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) і Stella et al., "Prodrugs: А Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Проліки за даним винаходом включають, але не обмежуються ними, проліки, що містять фосфат, проліки, що містять тіофосфат, проліки, що містять сульфат, проліки, що містять пептид, проліки з модифікованими D-амінокислотами, глікозиловані проліки, проліки, що містять β-лактам, проліки, що містять необов'язково заміщений феноксіацетамід, проліки, що містять необов'язково заміщений фенілацетамід, проліки з 5-фторцитозином і інші проліки з 5фторуридином, які можуть перетворюватися в більш активний цитотоксичний вільний лікарський засіб. Приклади цитотоксичних лікарських засобів, які можуть бути перетворені в форму проліків для застосування в даному винаході, включають, але не обмежуються ними, хіміотерапевтичні засоби, описані вище. "Виділений", при застосуванні для опису різних поліпептидів, описаних в цьому документі, означає поліпептид, який ідентифікований і відділений і/або витягнутий з клітини або клітинної культури, з яких він експресується. Забруднюючі компоненти його природного оточення являють собою матеріали, які, як правило, перешкоджають діагностичному і терапевтичному застосуванню поліпептиду, і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові або небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах здійснення такі поліпептиди очищають (1) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовою склянкою, або (2) до гомогенності при SDS-PAGE в відновних або невідновних умовах з використанням кумасі 13 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синього або, переважно, фарбування сріблом. Виділені поліпептиди включають поліпептиди в рекомбінантних клітинах in situ, оскільки в цьому випадку буде відсутнім щонайменше один компонент природного оточення поліпептиду. Однак, як правило, такі поліпептиди отримують за допомогою щонайменше однієї стадії очищення. "Виділена" нуклеїнова кислота, що кодує поліпептид, або нуклеїнова кислота, що кодує інший поліпептид, являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка ідентифікована і відділена щонайменше від однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно асоційована в природному джерелі кодуючої поліпептид нуклеїнової кислоти. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча поліпептид, знаходиться в іншій формі або умовах, ніж форма і умови, в яких вона зустрічається в природі. Таким чином, виділені молекули нуклеїнових кислот, що кодують поліпептид, відрізняються від конкретної молекули нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, яка існує в клітинах, що зустрічаються в природі. Однак виділена молекула нуклеїнової кислоти, кодуюча поліпептид, включає молекули нуклеїнових кислот, кодуючих поліпептиди, що містяться в клітинах, які звичайно експресують поліпептид, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в положенні на хромосомі, відмінному від положення на хромосомі клітин, що зустрічаються в природі. Термін "послідовності контролю" стосується послідовностей ДНК, необхідних для експресії функціонально зв’язаної кодуючої послідовності в конкретному організмі-хазяїні. Послідовності контролю, які придатні для прокаріот, включають, наприклад, промотор, необов'язково послідовність оператора і ділянку зв’язування рибосом. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, сигнали поліаденілування і енхансери. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли вона знаходиться в функціональному зв'язку з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для препослідовності або секреторної лідерної послідовності функціонально зв'язана з ДНК поліпептиду, якщо вона експресуються як пребілок, який бере участь в секреції поліпептиду; промотор або енхансер є функціонально зв’язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію послідовності; або ділянка зв’язування рибосом є функціонально зв’язаною з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, щоб полегшити трансляцію. Як правило, "функціонально зв’язаний" означає, що зв'язані послідовності ДНК є суміжними, і, у разі секреторної лідерної послідовності, є суміжними і знаходяться в рамці зчитування. Однак енхансери не повинні бути суміжними. Зв’язування здійснюють за допомогою лігування у відповідних ділянках рестрикції. Якщо таких ділянок немає, використовують синтетичні олігонуклеотидні з'єднувальні елементи або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики. "Суворі умови" або "умови високої суворості", як визначено в цьому документі, можна визначити як умови, в яких: (1) використовують низьку іонну силу і високу температуру промивання, наприклад 0,015 M хлорид натрію/0,0015 M цитрат натрію/0,1 % додецилсульфат натрію при 50 °С; (2) використовують в ході гібридизації денатуруючий засіб, такий як формамід, наприклад, 50 % (об./об.) формамід з 0,1 % бичачим сироватковим альбуміном/0,1 % Ficoll/0,1 % полівінілпіролідоном/50 мМ натрі-фосфатним буфером при pH 6,5 з 750 мМ хлоридом натрію, 75 мМ цитратом натрію при 42 °С; або (3) проводять гібридизацію протягом ночі в розчині, в якому використовується 50 % формамід, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (pH 6,8), 0,1 % пірофосфат натрію, 5× розчин Денхардта, опромінена ультразвуковим опроміненням ДНК сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1 % SDS і 10 % сульфат декстрану при 42 °С, з промиванням протягом 10 хвилин при 42 °С в 0,2 × SSC (хлорид натрію/цитрат натрію) з подальшим промиванням високої суворості протягом 10 хвилин, що складається з 0,1 × SSC, що містить EDTA, при 55 °С. Амінокислотні послідовності, описані в цьому документі, являють собою безперервні амінокислотні послідовності, якщо немає інших вказівок. У цьому документі, термін "імуноадгезин" означає подібні до антитіла молекули, які поєднують специфічність зв’язування гетерологічного білка ("адгезин") з ефекторними функціями константних доменів імуноглобулінів. Структурно імуноадгезини містять амінокислотну послідовність з необхідною специфічністю зв’язування, відмінну від ділянки розпізнавання антигену і ділянки зв’язування антитіла (тобто, що є "гетерологічною"), злиту з послідовністю константного домену імуноглобуліну. Частина адгезину в молекулі імуноадгезину, як правило, являє собою безперервну амінокислотну послідовність, що містить щонайменше ділянку зв’язування рецептора або ліганду - таких як VEGFR або фібронектиновий ліганд. Послідовність константного домену імуноглобуліну в імуноадгезині може бути отримана з будь-якого імуноглобуліну, такого як ізотипи IgG-1, IgG-2, IgG-3 або IgG4, IgA (включаючи IgA-1 і IgA-2), IgE, IgD або IgM. Пептидні антитіла, які часто містять 14 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовність, отриману селекцією за допомогою фагового дисплея послідовностей, які специфічно зв'язують мішень, злиту з Fc-частиною імуноглобуліну, в цьому документі можуть вважатися імуноадгезинами. Термін "антитіло" використовують в найбільш широкому значенні і, конкретно, він охоплює, наприклад, одиничні моноклональні антитіла (включаючи агоністичні, антагоністичні і нейтралізуючі антитіла), композиції антитіл з поліепітопною специфічністю, поліклональні антитіла, одноланцюжкові антитіла і фрагменти антитіл (див. нижче) за умови, що вони специфічно зв'язують нативний поліпептид і/або виявляють біологічну активність або імунологічну активність за даним винаходом. Згідно з одним варіантом здійснення, антитіло зв'язується з олігомерною формою білки-мішені, наприклад, з тривимірною формою. Згідно з іншим варіантом здійснення, антитіло специфічно зв'язується з білком, причому це зв’язування може інгібуватися моноклональним антитілом за даним винаходом (наприклад, депонованим антитілом за даним винаходом і т. д.). Вираз "функціональний фрагмент або аналог" антитіла означає сполуку, яка має якісну біологічну активність, подібну до біологічної активності антитіла, з яким його порівнюють. Наприклад, функціональний фрагмент або аналог антитіла за даним винаходом може являти собою фрагмент або аналог, який може специфічно зв'язуватися з VEGF або α5β1. У одному варіанті здійснення антитіло може перешкоджати здатності VEGF індукувати проліферацію клітин або по суті знижувати її. "Виділене антитіло" являє собою антитіло, яке ідентифіковане і відділене і/або витягнене з компонента його природних навколишніх умов. Забруднюючі компоненти його природних навколишніх умов являють собою речовини, які перешкоджають терапевтичному застосуванню антитіла, і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові або небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах здійснення антитіло є очищеним (1) до більш ніж 95 % по масі антитіла, як визначають способом Лоурі, і найбільш переважно до більш ніж 99 % по масі, (2) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовою склянкою, або (3) до гомогенності при SDS-PAGE в відновних або невідновних умовах з використанням кумасі синього або, переважно, фарбування сріблом. Виділене антитіло включає антитіло в рекомбінантних клітинах in situ, оскільки в цьому випадку відсутній щонайменше один компонент умов природного оточення антитіла. Однак, як правило, виділене антитіло отримують за допомогою щонайменше однієї стадії очищення. Основний елемент антитіла з 4-ланцюгів являє собою гетеротетрамерний глікопротеїн, що складається з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (Н) ланцюгів (антитіло IgM складається з 5 основних гетеротетрамерних елементів разом з додатковим поліпептидом, який називається J-ланцюгом, і, таким чином, воно містить 10 антигензв’язувальних ділянок, в той час як секретовані антитіла IgA можуть полімеризуватися з утворенням полівалентних систем, що містять 2-5 основних елементів з 4-ланцюгів разом з Jланцюгом). У випадку IgG, елемент з 4-ланцюгів, як правило, має масу 150000 дальтон. Кожний L-ланцюг зв'язаний з Н-ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, в той час як два Н-ланцюги пов'язані один з одним одним або декількома дисульфідними зв'язками, в залежності від ізотипу Н-ланцюга. Кожен Н- і L-ланцюг має розташовані з однаковими інтервалами міжланцюжкові дисульфідні містки. Кожний Н-ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VH), за яким йдуть три константних домени (CH) для кожного з α- і γ-ланцюгів і чотири СН-домени для ізотопів µ і ε. Кожний L-ланцюг має на N-кінці варіабельний домен (VL), за яким йде константний домен (CL) на його іншому кінці. VL вирівнюється з VH, і CL вирівнюється з першим константним доменом важкого ланцюга (CH1). Вважають, що конкретні амінокислотні залишки утворюють поверхню контакту між варіабельними доменами легкого ланцюга і важкого ланцюга. Утворення пари VH і VL формує одну антигензв’язувальну ділянку. Для структури і властивостей різних класів антитіл, див., наприклад, BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY, 8th edition, Daniel Р. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, стор. 71 і розділ 6. L-ланцюг будь-яких видів хребетних може бути віднесений до одного з двох чітко відмінних типів, які називаються каппа і лямбда, на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. У залежності від амінокислотної послідовності константного домену їх важких ланцюгів (CH), імуноглобуліни можна віднести до різних класів або ізотипів. Існує п'ять класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, що мають важкі ланцюги, які позначаються як α, δ, ε, γ і μ, відповідно. Класи γ і α далі поділяються на підкласи на основі відносно невеликих відмінностей в послідовності CH і функції, наприклад, у людини експресуються наступні підкласи: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. 15 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "варіабельний" стосується того факту, що послідовності певних сегментів варіабельних доменів значно відрізняються серед антитіл. V-домен опосередковує зв’язування антигену і визначає специфічність конкретного антитіла до його конкретного антигену. Однак варіабельність не є рівномірною протягом ділянки варіабельних доменів з 110 амінокислот. Замість цього, V-ділянки складаються з відносно інваріантних ділянок, які називаються каркасними областями (FR), з 15-30 амінокислот, розділених більш короткими ділянками високої варіабельності, які називаються "гіперваріабельними областями", довжина яких становить 9-12 амінокислот. Варіабельні домени нативних важких і легких ланцюгів містять чотири FR, головним чином, що приймають конфігурацію β-шарів, сполучених трьома гіперваріабельними ділянками, які формують петлі, що об’єднують структуру β-шарів, і, в деяких випадках, що формують її частину. Гіперваріабельні області в кожному ланцюгу розташовані разом в безпосередній близькості від FR і, спільно з гіперваріабельними областями іншого ланцюга, беруть участь в формуванні антигензв’язувального центра антитіл (див. Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEIN OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени не залучені безпосередньо в зв’язування антитіла з антигеном, але вони виявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіла в антитілозалежній клітинній цитотоксичності (ADCC). Термін "гіперваріабельна область" в цьому документі стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідають за зв’язування антигену. Гіперваріабельна область, як правило, містить амінокислотні залишки з "визначаючої комплементарність області" або "CDR" (наприклад, приблизно в області залишків 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) в VL, і приблизно в області 31-35B (H1), 50-65 (H2) і 95-102 (H3) в VH (в одному варіанті здійснення, H1 знаходиться приблизно в області 31-35); Kabat et al., вище і/або залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприклад залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) в VL, і 26-32 (H1), 53-55 (H2) і 96-101 (H3) в VH; Chothia and LeskJ. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Протягом даного опису і формули винаходу при вказівці на залишок у варіабельному домені (приблизно залишки 1-107 легкого ланцюга і залишки 1-113 важкого ланцюга) як правило, використовують систему нумерації по Kabat (наприклад, Kabat et al., вище (1991)). "Систему нумерації EU" або "індекс EU" звичайно використовують при вказівці на залишок в константній області важкого ланцюга імуноглобуліну (наприклад, індекс EU, вказаний в Kabat et al., вище (1991), включеної в цей документ як посилання в повному об'ємі). Якщо в цьому документі немає інших вказівок, вказівки на номери залишків у варіабельних доменах антитіл означають нумерацію залишків відповідно до системи нумерації Kabat. Якщо в цьому документі немає інших вказівок, вказівки на номери залишків в константному домені антитіл означають нумерацію залишків відповідно до системи нумерації EU. У цьому документі термін "моноклональне антитіло" стосується антитіла з сукупності по суті однорідних антитіл, тобто окремі антитіла, що складають сукупність, є ідентичними, за винятком можливих мутацій, наприклад, мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути представлені в невеликих кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними і направлені проти однієї антигенної ділянки. Більш того, на противагу препаратам поліклональних антитіл, які включають різні антитіла, направлені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло в препараті моноклонального антитіла направлене проти однієї детермінанти на антигені. У доповнення до їх специфічності, препарати моноклональних антитіл є переважними в тому, що їх можна синтезувати без домішок інших імуноглобулінів. Визначення "моноклональний" не має на увазі того, що антитіло повинне бути отримане яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, призначені для застосування відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані способом гібридом, уперше описаним Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або вони можуть бути отримані способами рекомбінантних ДНК (див., наприклад, патент США No. 4816567). "Моноклональні антитіла" також можуть бути отримані з фагових бібліотек антитіл з використанням способів, описаних, наприклад, в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) або з використанням способів, вказаних в розділі "Приклади" нижче. Моноклональні антитіла в цьому документі конкретно включають "химерні" антитіла, в яких ділянка важкого і/або легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, які отримані з конкретного виду або належать до конкретного класу або підкласу антитіл, в той час як решта частини ланцюга(ів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, які отримані з іншого виду або належать іншому класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, за умови, що вони виявляють необхідну біологічну активність (патент США No 4816567; і Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 81:6851-6855 (1984)). Химерні антитіла, які представляють інтерес в рамках даної заявки, включають 16 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "приматизовані" антитіла, що містять антигензв’язувальні послідовності варіабельного домену примату, що не належить до людини (наприклад, Old World Monkey, мавпи і т. д.) і послідовності константного домену людини. Антитіло, отримане "дозріванням афінності" являє собою антитіло з однією або декількома змінами в одній або декількох її CDR, які приводять до збільшення афінності антитіла до антигену, в порівнянні з вихідним антитілом, яке не має цієї зміни(змін). Переважні антитіла, отримані "дозріванням афінності", мають наномолярну або навіть пікомолярну афінність до антигену-мішені. Антитіла, отримані дозріванням афінності, отримують способами, відомими в даній галузі. У Marks et al., Bio. Technology 10:779-783 (1992) описано дозрівання афінності способом "перетасовування" VH- і VL-доменів. Випадковий мутагенез CDR і/або каркасних залишків описаний: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); і Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). "Блокуюче антитіло" або "антитіло-антагоніст" являє собою антитіло, яке інгібує або знижує біологічну активність антигену, який воно зв'язує. Переважні блокуючі антитіла або антитілаантагоністи проти α5β1 частково або повністю інгібують ангіогенез за допомогою зв’язування α5β1. "Антитіло-агонист" являє собою антитіло, яке посилює або збільшує біологічну активність антигену, який воно зв'язує. Наприклад, антитіла-агоністи проти α5β1 посилюють ангіогенез за допомогою зв’язування α5β1. "Інтактне" антитіло являє собою антитіло, яке містить антигензв’язувальний центр, а також CL і щонайменше константні домени важкого ланцюга, CH1, CH2 і CH3. Константні домени можуть являти собою константну домени з нативною послідовністю (наприклад, константні домени людини з нативною послідовністю) або їх варіант по амінокислотній послідовності. Переважно, інтактне антитіло має одну або декілька ефекторних функцій. "Фрагменти антитіла" містять частину інтактного антитіла, переважно антигензв’язувальну або варіабельну область інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають Fab-, Fab'-, F(ab')2- і Fv-фрагменти, діантитіла, лінійні антитіла (див., наприклад, патент США No. 5641870, приклад 2, Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 [1995]); молекули одноланцюжкових антитіл; і поліспецифичні антитіла, утворені фрагментами антитіл. Вираз "лінійні антитіла", головним чином, стосується антитіл, описаних в Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995). В короткому викладі, ці антитіла містять пару тандемно розташованих Fd-сегментів (VH-CH1-VH-CH1), які разом з комплементарними поліпептидами легкого ланцюга утворюють пару антигензв’язувальних областей. Лінійні антитіла можуть бути біспецифичними або моноспецифічними. Розщеплення антитіл папаїном приводить до утворення двох ідентичних антигензв’язувальних фрагментів, які називаються "Fab"-фрагментами, і залишкового "Fc"фрагмента, назва якого відображає його здатність легко кристалізуватися. Fab-фрагмент складається з цілого L-ланцюга разом з доменом варіабельної ділянки Н-ланцюга (VH), і першим константним доменом одного важкого ланцюга (CH1). Кожний Fab-фрагмент є одновалентним відносно зв’язування антигену, тобто, він має одну антигензв’язувальну ділянку. Обробка антитіла пепсином приводить до одного великого F(ab')2-фрагмента, який приблизно відповідає двом зв'язаним дисульфідом Fab-фрагментам, що мають двовалентну антигензв’язувальну активність, і, крім того, здатний до перехресного зв’язування антигену. Fab'-фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів наявністю додаткових декількох залишків на С-кінці домену CH1, включаючи один або декілька цистеїнів з шарнірної області антитіла. Fab'SH являє собою позначення для Fab', в якому залишок(ки) цистеїну константних доменів має вільну тіольну групу. F(ab')2-фрагменти антитіла початково були отримані як пари Fab'фрагментів, які мають шарнірні цистеїни між ними. Також відомі інші способи хімічного зв’язування фрагментів антитіл. Fc-фрагмент містить С-кінцеві частини обох Н-ланцюгів, що втримуються разом дисульфідами. Ефекторні функції антитіл визначаються послідовностями Fc-ділянки, яка також є частиною, розпізнаваною Fc-рецепторами (FcR), які зустрічаються на певних типах клітин. "Варіант Fc-області" містить амінокислотну послідовність, яка відрізняється від Fc-області з нативною послідовністю щонайменше однією "амінокислотною модифікацією", як визначено в цьому документі. Переважно, варіант Fc-області має щонайменше одну амінокислотну заміну в порівнянні з Fc-областю з нативною послідовністю або з Fc-областю вихідного поліпептиду, наприклад від приблизно однієї до приблизно десяти амінокислотних замін, і переважно від приблизно однієї до приблизно п'яти амінокислотних замін в Fc-області з нативною послідовністю або в Fc-області вихідного поліпептиду. У одному варіанті здійснення варіант Fc 17 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 області, представлений в цьому документі, має щонайменше приблизно 80 % гомологію, щонайменше приблизно 85 % гомологію, щонайменше приблизно 90 % гомологію, щонайменше приблизно 95 % гомологію або щонайменше приблизно 99 % гомологію з Fcобластю з нативною послідовністю. Згідно з іншим варіантом здійснення варіант Fc-області, представлений в цьому документі, має щонайменше приблизно 80 % гомологію, щонайменше приблизно 85 % гомологію, щонайменше приблизно 90 % гомологію, щонайменше приблизно 95 % гомологію або щонайменше приблизно 99 % гомологію з Fc-областю вихідного поліпептиду. Термін "поліпептид, що містить Fc-область," стосується поліпептиду, такого як антитіло або імуноадгезин (див. визначення нижче), який містить Fc-область. С-кінцевий лізин (залишок 447 згідно з системою нумерації EU) Fc-області може бути видалений, наприклад, в процесі очищення поліпептиду або за допомогою рекомбінантної інженерії нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид. Таким чином, композиція, що містить поліпептиди, включаючи антитіла, які мають Fc-область, за даним винаходом, може містити сукупності поліпептидів, у всіх з яких видалені залишки K447, сукупності поліпептидів, в яких залишки K447 не видалені, або сукупності поліпептидів, які мають суміш поліпептидів із залишком K447 або без нього. "Fv" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить повний антигенрозпізнавальний і антигензв’язувальний центр. Цей фрагмент складається з димера, що складається з одного варіабельного домену важкого ланцюга і одного варіабельного домену легкого ланцюга, пов'язаних міцним нековалентним зв'язком. Згортання цих двох доменів утворює шість гіперваріабельних петель (3 петлі в кожному з Н- і L-ланцюгів), які надають амінокислотні залишки для зв’язування антигену і забезпечують специфічність зв’язування антигену антитілом. Однак, навіть один варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три CDR, специфічних до антигену) має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоч і з більш низькою афінністю, ніж ціла ділянка зв’язування. "Одноланцюжкові Fv", що також скорочуються як "sFv" або "scFv", являють собою фрагменти антитіл, які містять VH і VL-домени антитіла, сполучені в єдиний поліпептидний ланцюг. Переважно, поліпептид sFv також необов'язково містить поліпептидний лінкер між VH і VL-доменами, який забезпечують можливість формування в sFv структури, необхідної для зв’язування антигену. Для огляду sFv, див. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, нижче. Термін "діантитіла" стосується невеликих фрагментів антитіла, отриманих конструюванням sFv-фрагментів (див. попередній абзац) з короткими лінкерами (приблизно 5-10 залишків) між VHі VL-доменами, з тим, щоб забезпечувалося міжланцюжкове, але не внутрішньоланцюжкове, утворення пар V-доменів, що приводить до двовалентного фрагмента, тобто, фрагменту, який має два антигензв’язувальні центри. Біспецифічні діантитіла являють собою гетеродимери з двох "пересічних" sFv-фрагментів, в яких VH- і VL-домени двох антитіл знаходяться на різних поліпептидних ланцюгах. Діантитіла описані більш детально, наприклад, в EP 404097; WO93/1161; Hudson et al., (2003) Nat. Med. 9:129-134; і Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). "Гуманізовані" антитіла являють собою форми антитіл не людини (наприклад, гризунів), які є химерними антитілами, які містять мінімальну послідовність, утворену з антитіла не людини. Головним чином, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципієнтне антитіло), в яких залишки з гіперваріабельної області реципієнта замінені залишками гіперваріабельної області виду (донорне антитіло), який не належить до людини, такого як миша, щур або кролик, що мають необхідну специфічність, афінність і місткість. У деяких випадках залишки каркасної області (FR) імуноглобуліну людини замінені відповідними залишками не людини. Більш того, гуманізовані антитіла також можуть містити залишки, які не зустрічаються ні в реципієнтному антитілі, ні в донорному антитілі. Ці модифікації вносять для додаткового поліпшення характеристик антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло містить по суті всі щонайменше один, і як правило, два, варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі гіперваріабельні петлі відповідають гіперваріабельним петлям імуноглобуліну не людини, і всі або по суті всі з областей FR являють собою області FR послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло також необов'язково містить щонайменше частину константної області (Fc) імуноглобуліну, як правило, константної області імуноглобуліну людини. Для додаткових деталей, див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). "Залежне від виду антитіло" являє собою антитіло, яке має більш високу афінність зв’язування з антигеном із зразка першого виду ссавця, відносно афінності зв’язування з 18 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гомологом вказаного антигену із зразка другого виду ссавця. Звичайно залежне від виду антитіло "специфічно зв'язується" з антигеном людини (тобто, має величину афінності -7 -8 зв’язування (Kd) не більшу ніж приблизно 1×10 M, переважно не більше ніж приблизно 1×10 і -9 найбільш переважно не більше ніж приблизно 1×10 M), але має афінність зв’язування з гомологом антигену з другого виду ссавця, що не стосується людини, яка щонайменше приблизно в 50 разів, або щонайменше приблизно в 500 разів або щонайменше приблизно в 1000 разі слабше, ніж його афінність зв’язування з антигеном людини. Залежно від виду антитіло може бути будь-яким з різних типів антитіл, як визначено вище, але, переважно, є гуманізованим антитілом або антитілом людини. У таких варіантах здійснення ступінь зв’язування поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції з білком-"не мішенню" складає менше 10 % від зв’язування поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції з його конкретним білком-мішенню, як визначають в аналізі сортування активованих флуоресценцією клітин (FACS) або за допомогою радіоімунної преципітації (RIA). Що стосується зв’язування поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції з молекулою-мішенню, терміни "специфічне зв’язування" або "специфічно зв'язується з" або є "специфічним до" конкретного поліпептиду або епітопу на конкретному поліпептиді-мішені, означають зв’язування, яке на рівні, що піддається вимірюванню, відрізняється від неспецифічної взаємодії. Специфічне зв’язування можна виміряти, наприклад, шляхом визначення зв’язування молекули в порівнянні зі зв’язуванням контрольної молекули, яка звичайно являє собою молекулу зі схожою структурою, яка не має активності зв’язування. Наприклад, специфічне зв’язування можна визначити по конкуренції з контрольною молекулою, яка є схожою з мішенню, наприклад, з надлишком неміченої мішені. У цьому випадку на специфічне зв’язування вказує те, що зв’язування міченої мішені із зондом конкурентно інгібується надлишком неміченої мішені. Терміни "специфічне зв’язування" або "специфічно зв'язується з" або є "специфічним до" конкретного поліпептиду або епітопу на конкретному поліпептиді-мішені в цьому документі можуть бути проілюстровані, наприклад, молекулою, що -4 -5 має Kd для мішені щонайменше приблизно 10 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 -6 -7 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 -8 -9 M, альтернативно, щонайменше приблизно 10 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 -10 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 11 -12 M, альтернативно щонайменше приблизно 10 M, або більше. У одному варіанті здійснення термін "специфічне зв’язування" стосується зв’язування, коли молекула зв'язується з конкретним поліпептидом або епітопом на конкретному поліпептиді без зв’язування на суттєвому рівні з яким-небудь іншим поліпептидом або епітопом поліпептиду. "Ефекторні функції" антитіла стосуються таких видів біологічної активності, які є властивими Fc-області (Fc-області з нативною послідовністю або варіанту Fc-ділянки по амінокислотній послідовності) антитіла, і варіюють в залежності від ізотипу антитіла. Приклади ефекторних функцій антитіла включають: зв’язування C1q і комплементзалежну цитотоксичність; зв’язування Fc-рецептора; антитілозалежну клітино-опосередковувану цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні і активацію В-клітин. "Fc-область з нативною послідовністю" містить амінокислотну послідовність, ідентичну амінокислотній послідовності Fc-області, що зустрічається в природі. Приклади послідовностей Fc описані, наприклад, але не обмежуючись ними, в Kabat et al., вище (1991). "Процентну ( %) ідентичність амінокислотних послідовностей" або "гомологічність" відносно послідовностей поліпептиду і антитіла, ідентифікованих в цьому документі, визначають як процент амінокислотних залишків в послідовності-кандидаті, які ідентичні амінокислотним залишкам в порівнюваному поліпептиді, після вирівнювання послідовностей і внесення пропусків, якщо необхідно, для досягнення максимальної процентної ідентичності послідовностей, і не враховуючи які-небудь консервативні заміни частиною ідентичності послідовностей. Вирівнювання для цілей визначення процентної ідентичності амінокислотних послідовностей можна проводити різними способами, які знаходяться в межах спеціальних знань, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Фахівці в даній галузі можуть визначити відповідні параметри для проведення вирівнювання, включаючи будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання протягом всієї довжини порівнюваних послідовностей. Однак для цілей, представлених в цьому документі, значення % ідентичності амінокислотних послідовностей отримують з використанням комп'ютерної програми для порівняння послідовностей ALIGN-2. Комп'ютерна програма для порівняння послідовностей ALIGN-2 була складена в Genentech, Inc. і початковий текст був представлений з користувацькою документацією в U.S. Copyright Office, 19 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Washington D.C., 20559, де він зареєстрований під U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Програма ALIGN-2 є загальнодоступною через Genentech, Inc., South San Francisco, California. Програма ALIGN-2 повинна бути складена для застосування на операційній системі UNIX, переважно цифровий UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння послідовностей встановлені програмою ALIGN-2 і не змінюються. Терміни "Fc-рецептор" або "FcR" використовують для опису рецептора, який зв'язується з Fc-областю антитіла. У одному варіанті здійснення FcR за даним винаходом являє собою FcR, який зв'язує IgG-антитіло (гамма-рецептор) і включає рецептори підкласів FcγRI, FcγRII і FcγRIII, в тому числі алельні варіанти і альтернативно-сплайсовані форми цих рецепторів. Рецептори FcγRII включають FcγRIIA ("активучий рецептор") і FcγRIIB ("інгібуючий рецептор"), які мають схожі амінокислотні послідовності, відмінні, головним чином, своїми цитоплазматичними доменами. Активучий рецептор FcγRIIA в своєму цитоплазматичному домені містить імунорецепторний тирозин-зв'язувальний активуючий мотив (ITAM). Інгібуючий рецептор FcγRIIB в своєму цитоплазматичному домені містить імунорецепторний тирозинзв'язувальний інгібуючий мотив (ITIM), (див. огляд M. в Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Ці терміни включають алотипи, такі як алотипи FcγRIIIA: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIAVal158, FcγRIIA-R131 і/або FcγRIIA-H131. FcR описані в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); і de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). До терміну "FcR" в даному описі належать інші FcR, в тому числі FcR, які будуть виявлені в майбутньому. Термін також включає неонатальний рецептор, FcRn, який відповідає за перенесення материнських IgG плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) і Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Термін "FcRn" стосується неонатального Fc-рецептора (FcRn). FcRn структурно схожий з головним комплексом гістосумісності (MHC) і складається з α-ланцюга, нековалентно зв'язаного з β2-мікроглобуліном. Велика кількість функцій неонатального Fc-рецептора FcRn розглянуті в Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766. FcRn бере участь в пасивній доставці імуноглобулінів IgG від матері дитині і в регуляції сироваткових рівнів IgG. FcRn може діяти як рецептор порятунку, зв'язуючий і транспортуючий піддані піноцитозу IgG в цілій формі як в клітинах, так і поза клітинами, і що рятує їх від стандартного каскаду деградації. У WO 2000/42072 (Presta) і Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001) описані варіанти антитіл з підвищеним або зниженим зв’язуванням з FcR. Зміст цих публікацій конкретно включений в цей документ як посилання. "CH1-домен" Fc-області IgG людини (який також називається доменом "C1" в "H1") звичайно розташовується від приблизно амінокислоти 118 до приблизно амінокислоти 215 (система нумерації EU). "Шарнірну область", як правило, визначають як ділянку від Glu216 до Pro230 IgG1 людини (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). Шарнірні області інших ізотипів IgG можна вирівнювати з послідовністю IgG1, вміщуючи перший і останній залишки цистеїну, які утворюють зв'язки S-S між важкими ланцюгами, в однакові положення. "Нижню шарнірну область" Fc-області звичайно визначають як ділянку із залишків, безпосередньо С-кінцевих для шарнірної області, тобто залишків з 233 по 239 Fc-області. У попередніх літературних джерелах зв’язування FcR, як правило, приписували амінокислотним залишкам в нижній шарнірній області Fc-області IgG. "CH2-домен" Fc-області IgG людини (який також називається доменом "C2" в "H2") звичайно розташовується від приблизно амінокислоти 231 до приблизно амінокислоти 340. CH2-домен є унікальним тим, що він не тісно спарений з іншим доменом. Замість цього, між двома CH2доменами цілої нативної молекули IgG розташовані N-пов'язані розгалужені вуглеводневі ланцюги. Було передбачено, що вуглевод може забезпечити заміну для утворення пари домендомен і допомогти стабілізувати CH2-домен. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985). "CH3-домен" (який також називається доменом "C2" в "H3") включає ділянку із залишків, Скінцевих для CH2-домену в Fc-області (тобто від приблизно амінокислотного залишку 341 до Скінця послідовності антитіла, як правило, в амінокислотному залишку 446 або 447 IgG). "Функціональна Fc-область" має "ефекторну функцію" Fc-області з нативною послідовністю. Ілюстративні "ефекторні функції" включають зв’язування C1q; комплементзалежну цитотоксичність; зв’язування Fc-рецептора; антитілозалежну клітинно-опосередковувану цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; негативну регуляцію рецепторів клітинної поверхні (наприклад, В-клітинного рецептора; BCR) і т. д. Такі ефекторні функції, як правило, вимагають комбінування Fc-області зі зв'язувальним доменом (наприклад, варіабельним доменом антитіла) і їх можна оцінювати з використанням різних аналізів, наприклад, як описано в цьому документі. 20 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 "C1q" являє собою поліпептид, який включає ділянку зв’язування для Fc-області імуноглобуліну. C1q разом з двома сериновими протеазами, C1r і C1s, утворює комплекс C1, перший компонент каскаду комплементзалежної цитотоксичності (CDC). C1q людини можна комерційно придбати, наприклад, від Quidel, San Diego, CA. Термін "зв'язувальний домен" стосується області поліпептиду, яка зв'язується з іншою молекулою. У випадку FcR зв'язувальний домен може містити частину його поліпептидної ланцюга (наприклад, його альфа-ланцюга), який відповідає за зв’язування Fc-області. Одним придатним зв'язувальним доменом є позаклітинний домен альфа-ланцюга FcR. Антитіло або пептидне антитіло з варіантом Fc IgG із "зміненою" афінністю зв’язування або активністю відносно ADCC являє собою антитіло або пептидне антитіло, яке має або збільшену, або знижену активність зв’язування FcR (наприклад, FcγR або FcRn) і/або активність ADCC в порівнянні з вихідним поліпептидом або з поліпептидом, що містить Fc-область з нативною послідовністю. Варіант Fc, який "виявляє збільшене зв’язування" з FcR, зв'язує щонайменше один FcR з більш високою афінністю (наприклад, з більш низьким значенням уявної Kd або IC50), ніж вихідний поліпептид або Fc IgG з нативною послідовністю. Згідно з деякими варіантами здійснення, поліпшення зв’язування в порівнянні з вихідним поліпептидом являє собою поліпшення зв’язування приблизно в 3 рази, переважно приблизно в 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 разів, або приблизно на від 25 % до 1000 %. Поліпептидний варіант, який "виявляє знижене зв’язування" з FcR, зв'язує щонайменше один FcR з більш низькою афінністю (наприклад, з більш високим значенням уявної Kd або IC 50), ніж вихідний поліпептид. Зниження зв’язування в порівнянні з вихідним поліпептидом може являти собою зниження зв’язування приблизно на 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % або більше. "Антитілозалежна клітино-опосередковувана цитотоксичність" або "ADCC" стосується форми цитотоксичності, при якій секретовані Ig, пов'язані з Fc-рецепторами (FcR), що знаходяться на певних цитотоксичних клітинах (наприклад, природних кілерних (NK) клітинах, нейтрофілах і макрофагах), спричиняють специфічне для цих цитотоксичних ефекторних клітин зв’язування з несучою антиген клітиною-мішенню, а потім знищують клітини-мішені за допомогою цитотоксинів. Антитіла є "зброєю" цитотоксичних клітин, і вони абсолютно необхідні для такого знищення. Основні клітини для здійснення ADCC, NK-клітини, експресують тільки FcγRIII, в той час як моноцити експресують FcγRI, FcγRII і FcγRIII. Експресія FcR на кровотворних клітинах представлена в таблиці 3 на сторінці 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оцінки активності представляючої інтерес молекули відносно ADCC, можна проводити аналіз ADCC in vitro, такий як аналіз, описаний в патенті США No. 5500362 або 5821337. Придатні для таких аналізів ефекторні клітини включають периферичні мононуклеарні клітини крові (PBMC) і природні кілерні (NK) клітини. Альтернативно, або додатково, активність представляючої інтерес молекули відносно ADCC можна оцінювати in vivo, наприклад, в моделі на тваринах, такій як описана в Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Поліпептид, що містить варіант Fc-області, який "виявляє збільшену ADCC" або опосередковує антитілозалежну клітинно-опосередковувану цитотоксичність (ADCC) в присутності ефекторних клітин людини більш ефективно, ніж поліпептид, що має Fc IgG дикого типу або вихідний поліпептид, являє собою поліпептид, який in vitro або in vivo є по суті більш ефективним відносно опосередковування ADCC, коли кількості поліпептиду з варіантом Fcобласті і поліпептиду з Fc-областю дикого типу (або вихідного поліпептиду) в аналізі є по суті однаковими. Як правило, такі варіанти можна ідентифікувати з використанням аналізу ADCC in vitro, як описано в цьому документі, однак передбачаються і інші аналізи або способи для визначення активності ADCC, наприклад в моделях на тваринах і т. д. В одному варіанті здійснення переважний варіант в приблизно від 5 разів до приблизно 100 разів, наприклад у від приблизно 25 до приблизно 50 разів, більш ефективний відносно опосередковування ADCC, ніж Fc дикого типу (або вихідний поліпептид). "Комплементзалежна цитотоксичність" або "CDC" стосується лізису клітини-мішені в присутності комплементу. Активація класичного каскаду комплементу починається зі зв’язування першого компонента системи комплементу (C1q) з антитілами (відповідного підкласу), пов'язаними з розпізнаваним ним антигеном. Для оцінки активації комплементу можна проводити аналіз CDC, наприклад, як описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Варіанти поліпептидів із зміненими амінокислотними послідовностями Fc-області і підвищеною або зниженою здатністю зв'язувати C1q описані в патенті США No. 6194551 і 21 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 WO99/51642. Зміст цих патентних публікацій конкретно включений в цей документ як посилання. Див. також, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). "Ефекторні клітини людини" являють собою лейкоцити, які експресують один або декілька FcR і виконують ефекторні функції. Переважно, клітини експресують щонайменше FcγRIII і виконують ефекторну функцію ADCC. Приклади лейкоцитів людини, які здійснюють ADCC, включають периферичні мононуклеарні клітини крові (PBMC), природні кілерні (NK) клітини, моноцити, цитотоксичні Т-клітини і нейтрофіли; при цьому переважними є PBMC і NK-клітини. Ефекторні клітини можна виділяти з їх природних джерел, наприклад, з крові або PBMC, як описано в цьому документі. Способи вимірювання зв’язування з FcRn відомі (див., наприклад, Ghetie 1997, Hinton 2004). Зв’язування з FcRn людини in vivo і час півжиття в сироватці високоафінних зв'язуючих FcRn поліпептидів людини можна аналізувати, наприклад, у трансгенних мишей або в трансфікованих клітинних лініях людини, які експресують FcRn людини, або у приматів, яким вводили поліпептиди з варіантом Fc. У одному варіанті здійснення, конкретно, антитіла проти α5β1 за винаходом, що мають варіант Fc IgG, виявляють збільшену афінність зв’язування відносно FcRn людини відносно поліпептиду, що має Fc IgG дикого типу, щонайменше в 2 рази, щонайменше в 5 разів, щонайменше в 10 разів, щонайменше в 50 разів, щонайменше в 60 разів, щонайменше в 70 разів, щонайменше в 80 разів, щонайменше в 100 разів, щонайменше в 125 разів, щонайменше в 150 разів. У конкретному варіанті здійснення афінність зв’язування відносно FcRn людини зростає приблизно в 170 разів. У одному варіанті здійснення для афінності зв’язування з FcRn EC50 або уявна Kd (при pH 6,0) поліпептиду складає менше 1 мкм, більш переважно менша або дорівнює 100 нМ, більш переважно менша або дорівнює 10 нМ. У одному варіанті здійснення для збільшеної афінності зв’язування з FcγRIII (F158; тобто низькоафінний ізотип) EC50 або уявна Kd складає менше або дорівнює 10 нМ, і для FcγRIII (V158; високоафінний ізотип) EC50 або уявна Kd складає менше або дорівнює 3 нМ. Згідно з іншим варіантом здійснення зниження зв’язування антитіла з Fc® рецептором відносно контрольного антитіла (наприклад, антитіла Herceptin ) можна вважати значним відносно контрольного антитіла, якщо співвідношення величин поглинання в середині кривих зв’язування тестованого антитіла і контрольного антитіла (наприклад A450нм(антитіло)/A450нм(контрольне Ab)) становить менше або дорівнює 40 %. Згідно з іншим варіантом здійснення збільшення зв’язування антитіла з Fc-рецептором відносно контрольного антитіла ® (наприклад, антитіла Herceptin ) можна вважати значним відносно контрольного антитіла, якщо співвідношення величин поглинання в середині кривих зв’язування тестованого антитіла і контрольного антитіла (наприклад, A450нм(антитіло)/A450нм(контрольне Ab)) перевищує або дорівнює 125 %. "Вихідний поліпептид" або "вихідне антитіло" являє собою поліпептид або антитіло, що містять амінокислотну послідовність, з якої отриманий варіант поліпептиду або антитіла і відносно якого варіант поліпептиду або антитіла порівнюють. Як правило, вихідний поліпептид або вихідне антитіло позбавлені однієї або декількох з модифікацій Fc-області, описаних в цьому документі, і відрізняються по ефекторних функціях, в порівнянні з поліпептидним варіантом, описаним в цьому документі. Вихідний поліпептид може містити Fc-область з нативною послідовністю або Fc-область з переважними модифікаціями амінокислотної послідовності (такими як вставки, делеції і/або заміни). Антитіла за даним винаходом можна отримувати фаговим дисплеєм. У цьому документі "бібліотека" стосується множини послідовностей антитіл або фрагментів антитіл, або нуклеїнових кислот, які кодують ці послідовності, причому послідовності відрізняються комбінацією варіантних амінокислот, які внесені в ці послідовності способами за винаходом. "Фаговий дисплей" являє собою спосіб, за допомогою якого варіанти поліпептидів експонуються як білки, злиті щонайменше з частиною білка оболонки на поверхні частинок фагу, наприклад, нитчастого фагу. Застосовність фагового дисплея основана на тому факті, що великі бібліотеки рандомізованих варіантів білків можна швидко і ефективно сортувати відносно послідовностей, які зв'язуються з антигеном-мішенню з високою афінністю. Дисплей пептидних і білкових бібліотек на фагу використовують для скринінгу мільйонів поліпептидів у відношеннях поліпептидів з конкретними зв'язуючими властивостями. Для дисплея невеликих випадкових пептидів і невеликих білків за допомогою злиття або з геном III, або з геном VIII, нитчастого фагу, використовують способи полівалентного фагового дисплея. Wells and Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol, 3:355-362 (1992), і посилання, цитовані в ній. У одновалентному фаговому дисплеї бібліотеку білків або пептидів піддають злиттю з геном III або його частиною і експресують на низьких рівнях в присутності білка гена III дикого типу, з тим, щоб фагові частинки експонували одну копію злитих білків або не експонували злиті білки. Ефекти авідності 22 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 є зниженими відносно полівалентного фагу, так що сортування відбувається на основі властивої ліганду афінності, і використовують фагмідні вектори, які спрощують маніпуляції з ДНК. Lowman and Wells, Methods: А companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991). "Фагміда" являє собою плазмідний вектор, що має бактерійний оріджин реплікації, наприклад, Co1E1, і копію міжгенної області бактеріофага. Фагміду можна використовувати на основі будь-якого відомого бактеріофага, включаючи нитчастий бактеріофаг і лямбдоїдний бактеріофаг. Також плазміда, як правило, містить селективний маркер для стійкості до антибіотика. Сегменти ДНК, клоновані в ці вектори, можуть розмножуватися як плазміди. Коли клітини, що містять ці вектори, надають зі всіма генами, необхідними для продукції фагових частинок, спосіб реплікації плазміди змінюється на реплікацію по типу "кільця, що котиться" з утворенням копій одного ланцюга плазмідної ДНК і упакованих фагових частинок. Фагміда може утворювати інфекційні або неінфекційні фагові частинки. Цей термін включає фагміди, які містять ген білка оболонки фагу або його фрагмент, пов'язаний з гетерологічним поліпептидним геном у вигляді злитого гена, так щоб гетерологічний поліпептид експонувався на поверхні фагової частинки. Термін "фаговий вектор" означає дволанцюжкову форму бактеріофага, яка реплікується, що містить гетерологічний генів і здатна до реплікації. Фаговий вектор має фаговий оріджин реплікації, що дозволяє реплікацію фагу і утворення фагової частинки. Фаг переважно являє собою нитчастий бактеріофаг, такий як фаг M13, f1, fd, Pf3 або його похідне, або лямбдоїдний фаг, такий як лямбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 і т. д., або їх похідне. У об'єм даного винаходу включені ковалентні модифікації поліпептидів, таких як пептидні антитіла, імуноадгезини, антитіла і короткі пептиди. Один тип ковалентної модифікації включає проведення реакції заданих амінокислотних залишків поліпептиду з органічною утворюючою похідне речовиною, яка здатна реагувати з певними бічними ланцюгами або N- або С-кінцевими залишками поліпептиду. Придатним є перетворення біфункціональними речовинами, наприклад, для зшивання поліпептиду з нерозчинною у воді матрицею підкладки або поверхнею для застосування в очищенні антитіл і навпаки. Звичайно використовувані поперечно-зшиваючі речовини включають, наприклад, 1,1-біс(діазоацетил)-2-фенілетан, глутаральдегід, складний ефір N-гідроксисукциніміду, наприклад, складний ефір з 4азидосаліциловою кислотою, гомобіфункціональні складні імідоефіри, включаючи дисукцинімідилові складні ефіри, такі як 3,3'-дитіобіс(сукцинімідилпропіонат), біфункціональні малеїніміди, такі як біс-N-малеімідо-1,8-октан, і такі речовини, як метил-3-[(пазидофеніл)дитіо]пропіоімідат. Інші модифікації включають дезамідацію глутамінільних і аспарагінільних залишків до відповідних глутамільних і аспартильних залишків, відповідно, гідроксилування проліну і лізину, фосфорилування гідроксильних груп серильних і треонільних залишків, метилування αаміногруп бічних ланцюгів лізину, аргініну і гістидину [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], ацетилування Nкінцевого аміну і амідацію будь-якої С-кінцевої карбоксильної групи. Інші модифікації включають кон'югацію токсинів з антагоністами, такими як майтанзин і майтанзиноїди, каліхеаміцин і інші цитотоксичні засоби. Інший тип ковалентної модифікації поліпептиду включає зв'язування поліпептиду з одним з множини небілкових полімерів, наприклад поліетиленгліколем (PEG), поліпропіленгліколем або поліоксіалкіленами, так, як зазначено в патентах США No. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 або 4179337. Поліпептид за даним винаходом також може бути модифікований переважним чином для утворення химерної молекули, що містить поліпептид, злитий з іншим гетерологічним поліпептидом або амінокислотною послідовністю (наприклад, імуноадгезинами або пептидними антитілами). В одному варіанті здійснення така химерна молекула містить злиту конструкцію поліпептиду з доменом трансдукції білка, що націлює поліпептид на доставку в різні тканини і, більш конкретно, через гематоенцефалічний бар'єр, з використанням, наприклад, домену трансдукції білка TAT вірусу імунодефіциту людини (Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72). В іншому варіанті здійснення така химерна молекула містить злиту конструкцію поліпептиду з поліпептидом-міткою, що забезпечує епітоп, з яким селективно зв'язується антитіло проти мітки. Епітопну мітку, як правило, поміщають на N- або C-кінець поліпептиду. Присутність таких мічених епітопом форм поліпептиду можна виявляти з використанням антитіла проти поліпептиду-мітки. Також надання епітопної мітки забезпечує легке очищення поліпептиду способом афінного очищення з використанням антитіла проти мітки або будь-якого типу афінної матриці, що зв'язується з епітопною міткою. Різні поліпептиди-мітки і їхній відповідні антитіла 23 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 відомі в даній галузі. Їхні приклади включають полігістидинові (полі-His) або полігістидингліцинові (полі-His-gly) мітки; поліпептид-мітку flu-HA і антитіло проти нього 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; мітку c-myc і антитіла до неї 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 і 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; і мітку у вигляді глікопротеїну D (g) вірусу простого герпесу й антитіло до неї [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Інші поліпептиди-мітки включають Flag-пептид [Hopp et al., BioTechnologv, 6:1204-1210 (1988)]; пептид-епітоп KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; пептид-епітоп α-тубуліну [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266:15163-15166 (1991)]; і пептидну мітку білка гена 10 T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. В альтернативному варіанті здійснення химерна молекула може містити злиту конструкцію поліпептиду з або імуноглобуліном конкретною областю імуноглобуліну. Для двовалентної форми химерної молекули (також позначається як "імуноадгезин"), таке злиття може бути з Fcобластю молекули IgG. Злиті конструкції Ig за даним винаходом включають поліпептиди, що містять приблизно або тільки залишки 94-243, залишки 33-53 або залишки 33-52 людини замість щонайменше однієї варіабельної області в молекулі Ig. У конкретному варіанті здійснення злита конструкція імуноглобуліну включає шарнірну область, CH2 і CH3, або шарнірну область, CH1-, CH2- і CH3-області молекули IgG1. Для одержання злитих конструкцій імуноглобуліном див. також, патент США No. 5428130. Винахід стосується способів і композицій для інгібування або попередження рецидиву росту або пухлини рецидиву росту злоякісної пухлини. У різних варіантах здійснення злоякісна пухлина являє собою рецидив росту пухлини або рецидив росту злоякісних клітин, де кількість злоякісних клітин значно не знижується або збільшується, або розмір пухлини значно не знижується або збільшується, або відсутнє яке-небудь інше зниження розміру або кількості злоякісних клітин. Визначення того, чи є злоякісні клітини рецидивом росту або пухлини рецидивом росту злоякісних клітин, можна проводити або in vivo, або in vitro, з використанням будь-якого відомих у даній галузі способу оцінки ефективності лікування злоякісних клітин. Пухлина, стійка до лікування проти VEGF, являє приклад рецидиву росту пухлини. "Ефективна кількість" поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції, як описано в даному документі, являє собою кількість, достатню для здійснення конкретної поставленої мети. "Ефективну кількість" можна визначати емпірично і загальноприйнятими способами, залежно від поставленої мети. Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла, поліпептиду або антагоніста за даним винаходом, ефективної для "лікування" захворювання або збудження в ссавця (який також називається пацієнтом). У випадку злоякісної пухлини, терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може знижувати кількість злоякісних клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати (тобто, сповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) інфільтрацію злоякісних клітин у периферичні органи; інгібувати (тобто, сповільнювати до деякої міри і переважно зупиняти) метастазування пухлини; інгібувати, до деякої міри, ріст пухлини; і/або пом'якшувати до деякої міри один або декілька симптомів, асоційованих зі злоякісною пухлиною. У залежності від того, чи може лікарський засіб перешкоджати росту і/або знищувати існуючі злоякісні клітини, він може бути цитостатичним і/або цитотоксичним. В одному варіанті здійснення терапевтично ефективна кількість являє собою кількість, що продовжує виживання пацієнта. В іншому варіанті здійснення терапевтично ефективна кількість являє собою кількість, яка збільшує виживання пацієнта без прогресування. У випадку загоєння раней термін "ефективна кількість" або "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості лікарського засобу, ефективної для прискорення або поліпшення загоєння ран в індивідуума. Терапевтична доза являє собою дозу, що чинить терапевтичний ефект на пацієнта, і субтерапевтична доза являє собою дозу, що не чинить терапевтичного ефекту на пацієнта, що піддається лікуванню. "Хронічна рана" стосується рани, яка не гоїться. Див., наприклад, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93 (1994). Хронічні рани включають, але не обмежуються ними, наприклад, артеріальні виразки, діабетичні виразки, пролежневі виразки, венозні виразки і т. д. Гостра рана може розвиватися в хронічну рану. Гострі рани включають, але не обмежуються ними, рани, які викликаються, наприклад, термічним ушкодженням, травмою, хірургічним ушкодженням, видаленням обширного раку шкіри, глибокими грибковими і бактеріальними інфекціями, васкулітом, склеродермією, пемфігусом, токсичним епідермальним некролізом і т. д. Див., наприклад, Buford, Wound Healing and Pressure Sores, Healing Well.com, опубліковану 24 жовтня 2001 року. "Нормальна рана" стосується рани, яка зазнає нормальну регенерацію при загоюванні рани. 24 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Інгібуюча ріст кількість" поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції за даним винаходом являє собою кількість, здатну інгібувати ріст клітини, особливо пухлинної, наприклад, злоякісної клітини, або in vitro, або in vivo. "Інгібуючу ріст кількість" поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції за даним винаходом для цілей інгібування неопластичного клітинного росту можна визначати емпірично і загальноприйнятими способами. "Цитотоксична кількість" поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції за даним винаходом являє собою кількість, здатну викликати руйнування клітини, особливо пухлинної, наприклад, злоякісної клітини, або in vitro, або in vivo. "Цитотоксичну кількість" поліпептиду, антитіла, антагоніста або композиції за даним винаходом для цілей інгібування неопластичного росту клітин можна визначати емпірично і загальноприйнятими способами. У даному описі "аутоімунне захворювання" являє собою захворювання або збудження, що виникає у власних тканинах індивідуума і спрямоване проти них, або окрему його ознаку або його прояв, або стан, що виникає як його внаслідок. Приклади аутоімунних захворювань або порушень включають, але не обмежуються ними, артрит (ревматоїдний артрит, такий як гострий артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагричний артрит, гострий подагричний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, інфекційний артрит, артрит Лайма, проліферативний артрит, псоріатичний артрит, артрит хребта і юнацький ревматоїдний артрит, остеоартрит, хронічний проградієнтний артрит, деформуючий артрит, первинний хронічний поліартрит, реактивний артрит і анкілозуючий спондиліт), запальні гіперпроліферативні захворювання шкіри, псоріаз, такий як бляшковий псоріаз, краплевидний псоріаз, пустульозний псоріаз, і псоріаз нігтів, дерматит, включаючи контактний дерматит, хронічний контактний дерматит, алергійний дерматит, алергійний контактний дерматит, герпетиформний дерматит і атопічний дерматит, x-зчеплений гіпер- IgM синдром, кропивницю, таку як хронічна алергійна кропивниця і хронічна ідіопатична кропивниця, включаючи хронічну аутоімунну кропивницю, поліміозит/дерматоміозит, ювенільний дерматоміозит, токсичний епідермальний некроліз, склеродермію (у тому числі системну склеродермію), склероз, такий як системна склеродермія, розсіяний склероз (MS), такий як спіно-оптичний MS, первинно-прогресуючий MS і ремітуючий MS, прогресуючу системну склеродермію, атеросклероз, артеріосклероз, множинний склероз і атаксичний склероз, запальне захворювання кишечнику (IBD) (наприклад, хвороба Крона, опосередковувані імунною системою захворювання шлунково-кишкового тракту, коліт, такий як виразковий коліт, colitis ulcerosa, мікроскопічний коліт, колагенозний коліт, поліпозний коліт, некротизуючий ентероколвт, трансмуральний коліт і аутоімунне запальне захворювання кишечнику), гангренозну піодермію, вузлувату еритему, первинний склерозуючий холангіт, епісклерит), синдром гострої дихальної недостатності, у тому числі синдром дихальної недостатності в дорослих або синдром гострої дихальної недостатності (ARDS), менінгіт, запалення всієї або частини судинної оболонки ока, запалення райдужної оболонки ока, хоріоїдит, аутоімунне гематологічне збудження, ревматоїдний спондиліт, раптову втрату слуху, опосередковувані IgE захворювання, такі як анафілаксія й алергійний і атопічний риніт, енцефаліт, такий як енцефаліт Расмуссена і лімбічний енцефаліт і/або енцефаліт стовбура головного мозку, увеїт, такий як передній увеїт, гострий передній увеїт, гранульоматозний увеїт, негранульоматозний аутоімунний увеїт, факоантигенний увеїт, задній увеїт або аутоімунний увеїт, гломерулонефрит (GN) з нефротичним синдромом і без нього, такий як гострий або хронічний гломерулонефрит, такий як первинний GN, опосередковуваний імунною системою GN, мембранозний GN (мембранозна нефропатія), ідіопатичний мембранозний GN або ідіопатична мембранозна нефропатія, мембранний або мембранозно-проліферативний GN (MPGN), у тому числі I тип і II тип, і швидкопрогресуючий GN, алергійні стани і відповіді, алергійну реакцію, екзему, включаючи алергійну або атопічну екзему, астму, таку як asthma bronchiale, бронхіальна астма й аутоімунна астма, стани, у які залучена інфільтрація T-клітин і хронічна запальна відповідь, хронічне запальне захворювання легень, аутоімунний міокардит, збудження адгезії лейкоцитів, системний червоний вовчак (SLE) або systemic lupus erythematodes, таку як шкірна SLE, підгострий червоний вовчак, неонатальний вовчаковий синдром (NLE), дисемінований червоний вовчак, вовчак (у тому числі нефрит, церебрит, дитячу, неренальну, екстраренальну, дискоїдну, алопецію), юнацький цукровий діабет (I типу), у тому числі дитячий інсулінозалежний цукровий діабет (IDDM), цукровий діабет з початком у дорослому віці (діабет II типу), аутоімунний діабет, ідіопатичний нецукровий діабет, імунна відповідь, асоційована з гострою й уповільненою гіперчутливістю, опосередковуваною цитокінами і T-лімфоцитами, туберкульоз, саркоїдоз, гранульоматоз, у тому числі лімфоматоїдний гранульоматоз, гранульоматоз Вегенера, агранулоцитоз, васкуліт, включаючи васкуліт (у тому числі васкуліт великих судин (у тому числі ревматичну поліміалгію і гігантоклітинний артериїт (Такаясу)), васкуліт судин середнього калібру (у тому числі хвороба 25 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Кавасакі/вузликовий періартериїт), мікроскопічний васкуліт у ЦНС, некротизуючий, шкірний васкуліт або васкуліт при гіперчутливості, системний некротизуючий васкуліт і асоційований з ANCA васкуліт, такий як васкуліт або синдром Черджа-Стросс (CSS), скроневий артериїт, апластичну анемію, аутоімунну апластичну анемію, Кумбс-позитивну анемію, анемію ДіамондаБлекфана, гемолітичну анемію або імунну гемолітичну анемію, у тому числі аутоімунну гемолітичну анемію (AIHA), перніціозну анемію (anemia perniciosa), хворобу Аддісона, істинну еритроцитарну анемію або аплазію (PRCA), дефіцит фактора VIII, гемофілію A, аутоімунну нейтропенію, панцитопенію, лейкопенію, захворювання, у які залучений діапедез лейкоцитів, запальні збудження в ЦНС, синдром множинного ураження органів, такий як вторинні синдроми при септицемії, травмі або геморагії, захворювання, опосередковувані комплексами антигенантитіло, захворювання, позв'язане з антитілами проти клубочкової базальної мембрани, антифосфоліпідний синдром, алергійний неврит, хвороба Бечета або Бехчета, синдром Кастельмана, синдром Гудпасчера, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром СтівенсаДжонсона, пемфігоїд, такий як бульозний пемфігоїд і шкірний пемфігоїд, пемфігус (у тому числі звичайний пемфігус, листоподібний пемфігус, пемфігоїд слизової оболонки і еритематозний пемфігоїд), аутоімунні поліендокринопатії, хворобу або синдром Рейтера, імунокомплексний нефрит, опосередковуваний антитілами нефрит, хронічну невропатію, таку як IgMполіневропатії або опосередковувана IgM невропатія, тромбоцитопенію (наприклад, така як розвивається в пацієнтів з інфарктом міокарда), у тому числі тромботичну тромбоцитопеничну пурпуру (TTP), посттрансфузійну пурпуру (PTP), індуковану гепарином тромбоцитопенію й аутоімунну або імуноопосередковувану тромбоцитопенію, таку як ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ITP), у тому числі хронічна або гостра ITP, аутоімунне захворювання яєчок і яєчників, у тому числі аутоімунний орхіт і оофорит, первинний гіпотиреоз, гіпопаратиреоз, аутоімунні ендокринні захворювання, у тому числі тиреоїдит, такий як аутоімунний тиреоїдит, хвороба Хашімото, хронічний тиреоїдит (тиреоїдит Хашімото), або підгострий тиреоїдит, аутоімунне захворювання щитовидної залози, ідіопатичний гіпотиреоз, хворобу Грейвса, полігландулярні синдроми, такі як аутоімунні полігландулярні синдроми (або полігландулярні ендокринопатичні синдроми), паранеопластичні синдроми, у тому числі неврологічні паранеопластичні синдроми, такі як міастенічний синдром Ламберта-Ітона або Ітона-Ламберта, синдром "негнучкої людини" або синдром ригідності м'язів, енцефаломієліт, такий як алергійний енцефаломієліт або encephalomyelitis allergica і експериментальний алергійний енцефаломієліт, міастенію, церебелярну дегенерацію, нейроміотонію, опсоклонус або опсоклонус-міоклонус синдром (OMS), і сенсорну невропатію, синдром Шихана, аутоімунний гепатит, хронічний гепатит, вовчаковий гепатит, гігантоклітинний гепатит, хронічний активний гепатит або аутоімунний хронічний активний гепатит, лімфоїдний інтерстиціальний пневмоніт, облітеруючий бронхіоліт (не залежний від трансплантата) на противагу NSIP, синдром Гійєна-Барре, хворобу Бергера (IgA-нефропатія), ідіопатичну IgA-нефропатію, лінійний IgA-дерматоз, первинний біліарний цироз, пневмоцироз, синдром аутоімунної ентеропатії, глютеїнову хворобу, целіакію, черевні афти (глютенову ентеропатію), рефрактерні афти, ідіопатичні афти, кріоглобулінемію, бічний аміотрофічний склероз (ALS; хвороба Лу Геринга), хворобу коронарних артерій, аутоімунне захворювання вуха, таке як аутоімунне захворювання внутрішнього вуха (AIED), аутоімунну втрату слуху, опсоклонус-міоклонус синдром (OMS), поліхондрит, такий як рефрактерний поліхондрит, легенево-альвеолярний протеїноз, амілоїдоз, склерит, незлоякісний лімфоцитоз, первинний лімфоцитоз, що включає моноклональний Bклітинний лімфоцитоз (наприклад, доброякісну моноклональну гаммапатію і моноклональну гаммапатію неясного значення, MGUS), периферичну невропатію, паранеопластичний синдром, каналопатії, такі як епілепсія, мігрень, аритмія, м'язові збудження, глухота, сліпота, пароксизмальний параліч, і каналопатії ЦНС, аутизм, запальну міопатію, фокальний сегментний гломерулосклероз (FSGS), ендокринну офтальмопатію, увеоретиніт, хоріоретиніт, аутоімунне гепатологічне збудження, фіброміалгію, множинну ендокринну недостатність, синдром Шмідта, адреналіт, атрофію шлунка, пресенільну деменцію, демієлінізуючі захворювання, такі як аутоімунні демієлінізуючі захворювання і хронічна демієлінізуюча поліневропатія, діабетичну невропатію, синдром Дресслера, осередкову алопецію, синдром CREST (кальциноз, синдром Рейно, збудження моторики стравоходу, склеродактилія і телеангієктозія), чоловічу і жіночу аутоімунну безплідність, змішане захворювання сполучної тканини, хворобу Чагаса, ревматичну атаку, рецидивний викидень, альвеоліт у сільськогосподарських робітників, поліформну еритему, посткардіотомічний синдром, синдром Кушинга, легеневу алергію птахоловів, алергійний гранульоматозний ангіїт, доброякісний лімфоцитарний ангіїт, синдром Альпорта, альвеоліт, такий як алергійний і фіброзний альвеоліт, інтерстиціальне захворювання легені, трансфузійну реакцію, лепру, малярію, лейшманіоз, кіпаносоміоз, шистосомоз, аскаріоз, 26 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аспергільоз, синдром Самптера, синдром Каплана, денге, ендокардит, ендоміокардіальний фіброз, дифузійний інтерстиціальний фіброз легень, інтерстиціальний фіброз легень, ідіопатичний фіброз легень, кістозний фіброз, ендофтальміт, підвищену стійку еритему, гемолітичну хворобу немовлят, еозинофільний фасциїт, синдром Шульмана, синдром Фелті, філаріоз, цикліт, такий як хронічний цикліт, гетерохронічний цикліт, або іридоцикліт цикліт Фуксу, пурпуру Геноха-Шенлейна, інфекцію вірусом імунодефіциту людини (HIV), інфекцію еховірусом, кардіоміопатію, хворобу Альцгеймера, інфекцію парвовірусом, інфекцію вірусом краснухи, поствакцинальний синдром, уроджену інфекцію вірусом краснухи, інфекцію вірусом ЕпштейнаБарр, паротит, синдром Еванса, аутоімунну гонадну недостатність, хорею Сиденгама, постстрептококовий нефрит, облітеруючий тромбоангіїт, тиреотоксикоз, сухотку спинного мозку, хоріоїдит, гігантоклітинну поліміалгію, ендокринну офтальмопатію, хронічний пневмоніт з гіперчутливістю, сухий кератокон’юктивіт, епідемічний кератокон’юктивіт, ідіопатичний нефритичний синдром, нефропатію з мінімальними змінами, доброякісне сімейне ушкодження й ушкодження при ішемії-реперфузії, аутоімунну реакцію в сітківці, запалення суглоба, бронхіт, хронічне обструктивне захворювання повітряних шляхів, силікоз, афти, афтозний стоматит, артеріосклеротичні збудження, асперматогенез, аутоімунний гемоліз, хворобу Бека, кріоглобулінемію, контрактуру Дюпюїтрена, факоанафілактичний ендофтальміт, алергійний ентерит, вузлувату лепрозну еритему, ідіопатичний параліч лицьового нерва, синдром хронічної утоми, ревматичну лихоманку, хворобу Хеммена-Річа, сенсоневральну втрату слуху, пароксизмальну гемоглобінурію, гіпогонадизм, регіонарний ілеїт, лейкопенію, інфекційний мононуклеоз, поперечний мієліт, первинну ідіопатичну мікседему, нефроз, симпатичну офтальмію, гранульоматозний орхіт, панкреатит, гострий полірадикуліт, гангренозну піодермію, тиреоїдит Кервена, набуту атрофію селезінки, безплідність внаслідок антитіл проти сперматозоїдів, незлоякісну тимому, вітиліго, захворювання, SCID і асоційовані з вірусом Епштейна-Барр захворювання, синдром набутого імундефіциту (СНІД), паразитарні захворювання, такі як лейшманіоз, синдром токсичного шоку, харчове отруєння, стани, які залучають інфільтрацію T-клітин, дефект адгезії лейкоцитів, імунні відповіді, асоційовані з гострою й уповільненою гіперчутливістю, опосередковуваною цитокінами і T-лімфоцитами, захворювання, які залучають діапедез лейкоцитів, синдром поліорганного ураження, захворювання, опосередковувані комплексами антиген-антитіло, захворювання, спрямовані проти мембрани клубочків, алергійний неврит, аутоімунні поліневропатії, оофорит, первинну мікседему, аутоімунний атрофічний гастрит, симпатичну офтальмію, ревматичні захворювання, змішане захворювання сполучної тканини, нефротичний синдром, інсуліт, поліендокринну недостатність, периферичну невропатію,аутоімунний полігландулярний синдром I типу, ідіопатичний гіпопаратиреоз дорослих (AOIH), тотальну алопецію, кардіоміопатію з дилятацією, набутий бульозний епідермоліз (EBA), гемохромацитоз, міокардит, нефротичний синдром, первинний склерозуючий холангіт, гнійний або негнійний синусит, гострий або хронічний синусит, синсут ґратчастої кістки, лобової кістки, верхньої щелепи або клиноподібної кістки, пов'язане з еозинофілами збудження, таке як еозинофілія, еозинофілія з інфільтрацією в легені, синдром еозинофілії-міалгії, синдром Леффлера, хронічну еозинофільну пневмонію, тропічну легеневу еозинофілію, бронхолегеневий аспергільоз, аспергілому, або гранульоми, які містять еозинофіли, анафілаксію, серонегативний спондилоартрит, поліендокринне аутоімунне захворювання, склерозуючий холангіт, хронічний шкірно-слизовий кандидоз склери і епісклери, синдром Брутона, транзиторну гаммаглобулінемію немовлят, синдром Віскотта-Олдрича, атаксію-телеангієктазію, аутоімунні збудження, асоційовані з колагеновими захворюваннями, ревматизм, неврологічне захворювання, лімфаденіт, ішемічне реперфузійне збудження, зниження відповіді кров'яного тиску, судинну дисфункцію, ангієктаз, тканинне ушкодження, серцево-судинну ішемію, гіперальгезію, церебральну ішемію і захворювання, що супроводжує васкуляризацію, алергійні збудження, пов'язані з гіперчутливістю, гломерулонефрит, реперфузійне ушкодження міокарда й інших тканин, дерматоз з гострими запальними компонентами, гострий гнійний менінгіт або інші запальні збудження центральної нервової системи, синдроми, асоційовані з трансфузією гранулоцитів, індуковану цитокінами токсичність, гостре тяжке запалення, хронічне некупіруване запалення, пієліт, пневмоцироз, діабетичну ретинопатію, діабетичне збудження великих артерій, ендартеріальнну гіперплазію, виразку шлунка, вальвуліт і ендометріоз. Термін "детекція" включає визначення присутності або відсутності речовини або кількісне визначення речовини. Таким чином, термін стосується застосування матеріалів, композицій і способів за даним винаходом для кількісного і якісного визначення. Як правило, для детекції використовують конкретний спосіб, якщо це не є критичним для практики винаходу. 27 UA 108199 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Наприклад, "детекція" відповідно до винаходу може включати: виявлення присутності або відсутності продукту гена α5, продукту гена β1 (наприклад, молекул мРНК), або поліпептиду α5 або α5β1; зміни рівнів поліпептиду α5 або α5β1 або кількості, яка зв’язались з мішенню; зміни біологічної функції/активності поліпептиду α5 або α 5β1. У деяких варіантах здійснення "детекція" може включати детекцію рівнів α5 або α5β1 дикого типу (наприклад, рівнів мРНК або поліпептиду). Детекція може включати кількісне визначення зміни (наприклад, збільшення або зниження) будь-якої величини щонайменше приблизно на 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 % або більше у порівнянні з контролем. Детекція може включати кількісне визначення зміни будь-якої величини щонайменше приблизно в 2 рази, 3 рази, 4 рази, 5 разів, 6 разів, 7 разів, 8 разів, 9 разів, 10 або разів більш наприклад, у 20 разів, 30 разів, 40 разів, 50 разів, 60 разів, 70 разів, 80 разів, 90 разів, 100 або разів більше. "Мітка", при використанні в даному документі, стосується детектованої сполуки або композиції, які кон’юговані прямо або опосередковувано з антитілом. Мітка сама може бути детектованою (наприклад, радіоізотопні мітки або флуоресцентні мітки) або, у випадку ферментної мітки, вона може каталізувати хімічну зміну сполуки або композиції субстрату, які є детектованими. III. Антитіла проти α5β1 У даному документі представлені антитіла, що можуть зв'язувати α 5β1 людини і конкурентно інгібувати зв'язування антитіла проти α5β1 18C12 з α5β1. Таким чином, один варіант здійснення винаходу стосується антитіл, що містять послідовність варіабельної області легкого ланцюга (VL), зазначену в будь-якому з SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8, і послідовність варіабельної області важкого ланцюга (VH), зазначену в будь-якому з SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 або 14. Також передбачаються людські або химерні (включаючи, наприклад, гуманізовані) форми антитіл проти α5β1, описаних у даному документі. Відповідно до одного варіанта здійснення антитіло зв'язує α5β1 людини з Kd від 500 нМ і 1 пМ. У визначених варіантах здійснення антитіло, представлене в даному документі, має константу дисоціації (Kd) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ або ≤0,001 нМ -8 -13 -9 -13 (наприклад, 10-8 M або менш, наприклад від 10 M до 10 M, наприклад, від 10 M до 10 M). Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло не зв'язує αVβ3 або αVβ5 або αVβ1. Відповідно до іншого варіанта здійснення антитіло містить послідовність Fc IgG людини, наприклад, IgG1 або людини IgG4 людини. В іншому варіанті здійснення послідовність Fc перетворена або іншим способом змінена так, щоб вона була позбавлена ефекторної функції антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC), часто зв'язаної з її зв'язуванням з Fcрецепторами (FcR). Існує багато прикладів змін або мутацій послідовностей Fc, які можуть змінювати ефекторну функцію. Наприклад, у WO 00/42072 і Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) описані варіанти антитіл зі збільшеним або зниженим зв'язуванням з FcR. Зміст цих публікацій конкретно включений в даний документ як посилання. Антитіло може бути у формі Fab, Fab', F(ab)'2, одноланцюжкового Fv (scFv), Fv-фрагмента; діантитіла і лінійного антитіла. Також антитіло може являти собою поліспецифічне антитіло, що зв'язується з α 5β1 і являє собою антагоніст α5β1, але також зв'язує одну або декілька інших мішеней і інгібує їхню функцію (наприклад, VEGF) або поліспецифічне антитіло, що зв'язується з двома або більше різними ділянками на α5β1. Антитіло може бути кон’юговане з лікарським засобом (наприклад, цитотоксичним засобом, радіоізотопом і хіміотерапевтичним засобом) або міткою для детекції α5β1 у зразках або пацієнта in vivo за допомогою візуалізації (наприклад, радіоізотоп, флуоресцентний барвник і фермент). Також передбачаються молекули нуклеїнових кислот, що кодують антитіла проти α5β1, експресуючі вектори, що містять молекули нуклеїнових кислот, що кодують один або обидва варіабельні домени, і клітини, що містять молекули нуклеїнових кислот. Ці антитіла можна використовувати для способів лікування, описаних у даному документі і для детекції білка α5β1 у зразках пацієнта (наприклад, з використанням аналізів FACS, імуногістохімії (IHC), ELISA) або у пацієнтів. A. Моноклональні антитіла Моноклональні антитіла можна одержувати з використанням способів гібридом, таких як способи, описані Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975), або їх можна одержувати способами рекомбінантних ДНК (патент США No. 4816567), або їх можна одержати способами, описаними нижче в прикладах. У способі гібридом хом'яка, миші або іншої придатної тварини-хазяїна звичайно імунізують імунізуючим агентом (наприклад, поліпептидом α5, β1 або α 5β1 окремо або в комбінації з придатним носієм) для одержання лімфоцитів, які продукують або здатні 28