Антитіло проти n3pglu бета-амілоїдного пептиду та його застосування

Реферат: Винахід належить до антитіл проти N3pGlu Α або їх антигензв'язувальних фрагментів та до застосування вказаних антитіл проти N3pGlu Α або їх антигензв'язувальних фрагментів для лікування хвороби Альцгеймера. UA 107600 C2 (12) UA 107600 C2 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується антитіл, які селективно зв'язують N3pGlu бета-амілоїдний пептид і які застосовують при лікуванні захворювань, пов'язаних з бета-амілоїдним пептидом (Αβ, який також називають бета-амілоїдом). Αβ пептид у циркулюючій формі складається з 38-43 амінокислот (переважно, з 38, 40 або 42 амінокислот) і є результатом розщеплення білка-попередника, попередника бета-амілоїду (АРР). Перетворення Αβ з розчинних форм на нерозчинні форми, що мають високий вміст βскладок, і відкладення цих нерозчинних форм у вигляді нейритних та цереброваскулярних бляшок у головному мозку пов'язується з рядом станів та захворювань, у тому числі з хворобою Альцгеймера (AD), синдромом Дауна та церебральною амілоїдною ангіопатією (САА). Вказані відкладення, що знаходяться у бляшках, складаються головним чином з однорідної суміші Αβ пептидів. N3pGlu Αβ, який також позначають як Ν3ρΕ або Αβp3-42, являє собою скорочену форму Αβ пептиду, що знаходиться лише у бляшках. N3pGlu Αβ бракує перших двох амінокислотних залишків на N-кінці Αβ, і до його складу входить піроглутамат, що є похідною глутамінової кислоти у третьому положенні амінокислотної послідовності. Незважаючи на те, що N3pGlu Αβ пептид являє собою другорядну складову відкладеного Αβ у головному мозку, результати досліджень показали, що N3pGlu Αβ пептид має агресивні агрегаційні властивості і накопичується на ранніх стадіях утворення відкладень. Незважаючи на те, що поліклональні та моноклональні антитіла, мішенню для яких є N3pGlu Αβ пептид, були описані раніше (патент США № 7,122,374 та WO2010/009987), все ще існує потреба у високоспоріднених моноклональних антитілах проти N3pGlu Αβ для взаємодії з мішенню in vivo (тобто зв'язування бляшок) і зниження рівня бляшок, що є результатом цієї взаємодії. Крім того, приймаючи до уваги те, що результатом застосування амінокінцевих та карбоксикінцевих антитіл проти Αβ є збільшення кількості мікрокровотеч, пов'язаних з церебральною амілоїдною ангіопатією (САА), існує потреба у антитілах проти N3pGlu Αβ, які не спричинюють збільшення кількості мікрокровотеч, незважаючи навіть на те, що наслідком тривалого лікування є значне зменшення відкладених бляшок. Антитіла, охоплені обсягом цього винаходу, являють собою терапевтично придатні антагоністи N3pGlu Αβ пептиду, що мають ряд бажаних властивостей. Антитіла за цим винаходом зв'язують людський N3pGlu Αβ пептид з високою спорідненістю і демонструють in vivo дозозалежне зниження кількості бляшок без підвищення кількості мікрокровотеч, пов'язаних з церебральною амілоїдною ангіопатією (САА). Цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до людського N3pGlu Αβ -9 пептиду при температурі 25 °C є меншим ніж 110 M. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до людського N3pGlu -10 Αβ пептиду при температурі 25 °C є меншим ніж 910 Μ. За іншим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до -10 людського N3pGlu Αβ пептиду при температурі 25 °C є меншим ніж 7×10 Μ. За іншим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генноінженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до людського N3pGlu Αβ пептиду при температурі 25 °C знаходиться у межах -10 -10 від 910 Μ до 110 M. За іншим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до людського N3pGlu Αβ пептиду при температурі 25 °C -10 -10 знаходиться у межах від 910 Μ до 110 Μ. Цим винаходом також запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до людського N3pGlu -9 -10 Αβ пептиду при температурі 25 °C є меншим ніж 110 М, або меншим ніж 910 Μ, або -10 -10 -10 меншим ніж 710 Μ, або знаходиться у межах від 910 Μ до 110 Μ і яке зменшує рівень бляшок in vivo. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, значення Kd якого у відношенні до людського N3pGlu Αβ -9 -10 пептиду при температурі 25 °C є меншим ніж 110 М, або меншим ніж 910 Μ, або меншим -10 -10 -10 ніж 710 Μ, або знаходиться у межах від 910 Μ до 110 Μ і яке зменшує рівень бляшок in vivo без підвищення кількості мікрокровотеч, пов'язаних з церебральною амілоцщою ангіопатією (САА). Цим винаходом також запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR та HCVR, де LCDR1 являє собою 1 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (послідовність SEQ ID NO:51), LCDR2 являє собою послідовність AVSKUQS (послідовність SEQ ID NO:52), LCDR3 являє собою послідовність VQGTHYPFT (послідовність SEQ ID NO:5) і HCDR1 являє собою послідовність GYX5FTX6YYIN (послідовність SEQ ID NO:53), HCDR2 являє собою послідовність WINPGSGNTKYNEKFKG (послідовність SEQ ID NO:8) і HCDR3 являє собою послідовність EGX7TVY (послідовність SEQ ID NO:54), де Χ1 - S або Τ; Χ2-Q або R, X3-G або S, X4-D або G, X5-D або Т, Х6 - R або D і Х7 - Ι, Τ, Ε або V. Цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку легкого ланцюгу (LCVR) і варіабельну ділянку важкого ланцюгу (HCVR), де згадана LCVR містить поліпептиди LCDR1, LCDR2, LCDR3, а HCVR містить поліпептиди HCDR1, HCDR2, HCDR3, які вибрані з групи, яку складають: a) LCDR1, що являє собою послідовність KSSQSLLYSRGKTYLN (послідовність SEQ ID NO:3), LCDR2, що являє собою послідовність AVSKLDS (послідовність SEQ ID NO:4), LCDR3, що являє собою послідовність VQGTHYPFT (послідовність SEQ ID NO:5), HCDR1, що являє собою послідовність GYDFTRYYIN (послідовність SEQ ID NO:6), HCDR2, що являє собою послідовність WINPGSGNTKYNEKFKG (послідовність SEQ ID NO:8) і HCDR3, що являє собою послідовність EGITVY (послідовність SEQ ID NO:9); b) LCDR1, що являє собою послідовність KSSQSLLYSRGKTYLN (послідовність SEQ ID NO:3), LCDR2, що являє собою послідовність AVSKLDS (послідовність SEQ ID NO:4), LCDR3, що являє собою послідовність VQGTHYPFT (послідовність SEQ ID NO:5), HCDR1, що являє собою послідовність GYTFTRYYIN (послідовність SEQ ID NO:7), HCDR2, що являє собою послідовність WINPGSGNTKYNEKFKG (послідовність SEQ ID NO:8) і HCDR3, що являє собою послідовність EGTTVY (послідовність SEQ ID NO:10); c) LCDR1, що являє собою послідовність KSSQSLLYSRGKTYLN (послідовність SEQ ID NO:3), LCDR2, що являє собою послідовність AVSKLDS (послідовність SEQ ID NO:4), LCDR3, що являє собою послідовність VQGTHYPFT (послідовність SEQ ID NO:5), HCDR1, що являє собою послідовність GYTFTDYYIN (послідовність SEQ ID NO:40), HCDR2, що являє собою послідовність WINPGSGNTKYNEKFKG (послідовність SEQ ID NO:8) і HCDR3, що являє собою послідовність EGETVY (послідовність SEQ ID NO:41); d) LCDR1, що являє собою послідовність KSSQSLLYSRGKTYLN (послідовність SEQ ID NO:3), LCDR2, що являє собою послідовність AVSKLGS (послідовність SEQ ID NO:35), LCDR3, що являє собою послідовність VQGTHYPFT (послідовність SEQ ID NO:5), HCDR1, що являє собою послідовність GYTFTRYYIN (послідовність SEQ ID NO:7), HCDR2, що являє собою послідовність WINPGSGNTKYNEKFKG (послідовність SEQ ID NO:8) і HCDR3, що являє собою послідовність EGTTVY (послідовність SEQ ID NO:10); та e) LCDR1, що являє собою послідовність KSTRSLLYSRSKTYLN (послідовність SEQ ID NO:45), LCDR2, що являє собою послідовність AVSKLDS (послідовність SEQ ID NO:4), LCDR3, що являє собою послідовність VQGTHYPFT (послідовність SEQ ID NO:5), HCDR1, що являє собою послідовність GYTFTDYYIN (послідовність SEQ ID NO:40), HCDR2, що являє собою послідовність WINPGSGNTKYNEKFKG (послідовність SEQ ID NO:8) і HCDR3, що являє собою послідовність EGVTVY (послідовність SEQ ID NO:46). За одним з варіантів здійснення цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR та HCVR, де LCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:3, LCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:4, LCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:5, HCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:6, HCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:8 і HCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:9. За одним з варіантів здійснення цим винаходом запропоноване людське генноінженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR та HCVR, де LCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:3, LCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:4, LCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:5, HCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:7, HCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:8 і HCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:10. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR та HCVR, де LCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:3, LCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:4, LCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:5, HCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:40, HCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:8 і HCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:41. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генноінженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить 2 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 LCVR та HCVR, де LCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:3, LCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:35, LCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:5, HCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:7, HCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:8 і HCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:10. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR та HCVR, де LCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:45, LCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:4, LCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:5, HCDR1 являє собою послідовність SEQ ID NO:40, HCDR2 являє собою послідовність SEQ ID NO:8 і HCDR3 являє собою послідовність SEQ ID NO:46. За іншим варіантом здійснення цим винаходом запропоноване людське генно-інженерне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить варіабельну ділянку легкого ланцюгу (LCVR) і варіабельну ділянку важкого ланцюгу (HCVR), де згадані LCVR і HCVR являють собою поліпептиди, вибрані з групи, яку складають: a) LCVR послідовності SEQ ID NO:11 і HCVR послідовності SEQ ID NO:12; b) LCVR послідовності SEQ ID NO:11 і HCVR послідовності SEQ ID NO:13; c) LCVR послідовності SEQ ID NO:11 і HCVR послідовності SEQ ID NO:42; d) LCVR послідовності SEQ ID NO:36 і HCVR послідовності SEQ ID NO:37; та e) LCVR послідовності SEQ ID NO:47 і HCVR послідовності SEQ ID NO:48. За одним з варіантів здійснення цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR послідовності SEQ ID NO:11 та HCVR послідовності SEQ ID NO:12. За одним з варіантів здійснення цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR послідовності SEQ ID NO:11 та HCVR послідовності SEQ ID NO:13. За одним з варіантів здійснення, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR послідовності SEQ ID NO:11 та HCVR послідовності SEQ ID NO:42. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR послідовності SEQ ID NO:36 та HCVR послідовності SEQ ID NO:37. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LCVR послідовності SEQ ID NO:47 та HCVR послідовності SEQ ID NO:48. Цим винаходом також запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ, що містить легкий ланцюг (LC) і важкий ланцюг (НС), де згадані поліпептиди LC і НС вибрані з групи, яку складають: a) LC послідовності SEQ ID NO:14 і НС послідовності SEQ ID NO:15; b) LC послідовності SEQ ID NO:14 і НС послідовності SEQ ID NO:16; c) LC послідовності SEQ ID NO:14 і НС послідовності SEQ ID NO:44; d) LC послідовності SEQ ID NO:38 і НС послідовності SEQ ID NO:39; та e) LC послідовності SEQ ID NO:49 і НС послідовності SEQ ID NO:50. За одним з варіантів здійснення цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LC послідовності SEQ ID NO:14 і НС послідовності SEQ ID NO:15. За одним з варіантів здійснення цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LC послідовності SEQ ID NO:14 і НС послідовності SEQ ID NO:16. За одним з варіантів здійснення, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LC послідовності SEQ ID NO:14 і НС послідовності SEQ ID NO:44. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LC послідовності SEQ ID NO:38 і НС послідовності SEQ ID NO:39. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент, що містить LC послідовності SEQ ID NO:49 і НС послідовності SEQ ID NO:50. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадане моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, де кожен LC являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:14 і кожен НС являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:15. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадане моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, де кожен LC являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:14 і кожен НС являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:15. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадане моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, де кожен LC являє собою поліпептид 3 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності SEQ ID NO:14 і кожен НС являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:16. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадане моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, де кожен LC являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:14 і кожен НС являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:44. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадане моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, де кожен LC являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:38 і кожен НС являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:39. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадане моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ містить два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, де кожен LC являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:49 і кожен НС являє собою поліпептид послідовності SEQ ID NO:50. Цим винаходом запропонована також фармацевтична композиція, що містить моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ за цим винаходом або його антигензв'язувальний фрагмент. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадана фармацевтична композиція містить моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ за цим винаходом або його антигензв'язувальний фрагмент і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або допоміжну речовину. За іншим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, згадана фармацевтична композиція також містить один або декілька терапевтичних інгредієнтів. За одним з аспектів цим винаходом запропонований спосіб лікування стану, пов'язаного з активністю Αβ пептиду, що включає введення пацієнту-людині, який цього потребує, моноклонального антитіла проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувального фрагменту за цим винаходом. За іншим аспектом цим винаходом запропонований спосіб лікування стану, який вибирають з групи, яку складають клінічна або передклінічна форма хвороби Альцгеймера, продромальна стадія хвороби Альцгеймера, синдром Дауна та клінічна або передклінічна форма церебральної амілоїдної ангіопатії (САА), і згаданий спосіб включає введення людині, яка цього потребує, моноклонального антитіла проти N3pGlu Αβ за цим винаходом або його антигензв'язувального фрагменту. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропонований спосіб лікування хвороби Альцгеймера. За ще одним аспектом цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування у терапії. За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування при лікуванні стану, який вибирають з-посеред клінічної або передклінічної форми хвороби Альцгеймера, продромальної стадії хвороби Альцгеймера, синдрому Дауна та клінічної або передклінічної форми церебральної амілощної ангіопатії (САА). За варіантом здійснення, якому віддають більшу перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування при лікуванні хвороби Альцгеймера. За іншим варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування з метою запобігання стану, який вибирають з-посеред клінічної або передклінічної форми хвороби Альцгеймера, продромальної стадії хвороби Альцгеймера, клінічної або передклінічної форми церебральної амілоїдної ангіопатії (САА). За варіантом здійснення, якому віддають більшу перевагу, цим винаходом запропоноване моноклональне антитіло проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувальний фрагмент для застосування з метою запобігання хвороби Альцгеймера. За ще одним аспектом цим винаходом запропоноване застосування моноклонального антитіла проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувального фрагменту для виготовлення лікарського засобу для лікування стану, вибраного з групи, яку складають клінічна або передклінічна форма хвороби Альцгеймера, продромальна стадія хвороби Альцгеймера, синдром Дауна та клінічна або передклінічна форма церебральної амілоіщної ангіопатії (САА). За варіантом здійснення, якому віддають перевагу, цим винаходом запропоноване застосування моноклонального антитіла проти N3pGlu Αβ або його антигензв'язувального фрагменту для виготовлення лікарського засобу для лікування хвороби Альцгеймера. Непроцесоване антитіло представляє собою молекулу імуноглобуліну, що містить 2 важкі (Н) ланцюги і 2 легкі (L) ланцюги, взаємозв'язані дисульфідними зв'язками. Амінокінцева частина кожного ланцюгу включає варіабельну ділянку, довжина якої становить приблизно 100110 амінокислот, що відповідає головним чином за розпізнання антигену через посередництво гіперваріабельних ділянок (CDRs), що входять до її складу. Карбоксикінцева частина кожного ланцюгу представляє собою константну ділянку, що відповідає головним чином за ефекторну функцію. 4 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CDRs перемежовуються консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна варіабельна ділянка легкого ланцюгу (LCVR) і варіабельна ділянка важкого ланцюгу (HCVR) складається з 3 CDRs та 4 FRs, які розміщуються від аміно-кінця до карбоксильного кінця таким чином: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вказані 3 CDRs легкого ланцюгу позначають таким чином: "LCDR1, LCDR2 та LCDR3", а 3 CDRs важкого ланцюгу позначають таким чином: "HCDR1, HCDR2 та HCDR3". CDRs містять більшість залишків, що забезпечують специфічні взаємодії з антигеном. Нумерація та розміщення амінокислотних залишків CDRs у межах LCVR та HCVR відповідають добре відомій номенклатурі Кебота. Легкі ланцюги класифікуються як каппа або лямбда і відрізняються конкретною константною ділянкою, як відомо у цій галузі. Важкі ланцюги класифікуються як гамма, мю, альфа, делта або епсилон і визначають ізотип антитіла як IgG, IgM, IgA, IgD або IgE, відповідно. Антитіла IgG можуть додатково підрозділятись на підкласи, наприклад, IgGl, IgG2, IgG3 або IgG4. Важкий ланцюг кожного типу відрізняється конкретною константною ділянкою з послідовністю, добре відомою у цій галузі. Термін "моноклональне антитіло" (Mab), що вжитий у цьому описі, означає антитіло, яке походить або є ізольованим з однієї копії або клону, у тому числі, наприклад, будь-якого еукаріотного, прокаріотного або фагового клону, а не спосіб його одержання. Моноклональні антитіла (Mab) за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, існують у однорідній або у по суті однорідній популяції. Повні моноклональні антитіла (Mab) містять 2 важкі ланцюги і 2 легкі ланцюги. Словосполучення "антигензв'язувальні фрагменти" означає, наприклад, Fabфрагменти, Fab'-фрагменти, Р(аb')2-фрагменти та одноланцюгові Fv-фрагменти. Моноклональні антитіла за цим винаходом та їхні антигензв'язувальні фрагменти можна одержати, наприклад, за методами рекомбінантних ДНК, методами фагового дисплею, синтетичними методами, наприклад, CDR-пересадженням, або комбінаціями таких або інших методів, відомих у цій галузі. Наприклад, миші можуть бути імунізовані людським антитілом проти N3pGlu Αβ або його фрагментами, антитіла, які будуть одержані, можуть бути виділені і очищені, і визначення того, чи мають вони зв'язувальні та функціональні властивості такі самі або подібні до сполук, що посідають властивості антитіл за цим винаходом, може бути здійсненим за методами, розкритими по суті у наведених нижче Прикладах. Антигензв'язувальні фрагменти також можна одержати традиційними способами. Способи одержання та очищення антитіл і антигензв'язувальних фрагментів є добре відомими у цій галузі і можуть бути знайдені, наприклад, у Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 та 15, ISBN 0-87969-314-2. Словосполучення "людські генно-інженерні антитіла" означає моноклональні антитіла, що мають зв'язувальні та функціональні властивості за цим винаходом, і що мають каркасні ділянки, які є по суті людськими або повністю людськими, довкола гіперваріабельних ділянок, що походять з нелюдського антитіла. Словосполучення "антигензв'язувальні фрагменти" таких людських генно-інженерних антитіл охоплює, наприклад, Fab-фрагменти, Fab'-фрагменти, Р(аЬ')2-фрагменти та одноланцюгові Fv-фрагменти. Словосполучення "каркасна ділянка" або "каркасна послідовність" означає будь-яку з каркасних ділянок 1-4. До людських генноінженерних антитіл та їх антигензв'язувальних фрагментів, які охоплені цим винаходом, належать молекули, де будь-яка одна або декілька з каркасних ділянок 1-4 є по суті або повністю людськими, тобто де є присутньою будь-яка з можливих комбінацій окремих по суті або повністю людських каркасних ділянок 1-4. Наприклад, сюди входять молекули, у яких каркасна ділянка 1 і каркасна ділянка 2, каркасна ділянка 1 і каркасна ділянка 3, каркасна ділянка 1, каркасна ділянка 2 і каркасна ділянка 3 тощо, є по суті або повністю людськими. По суті людськими каркасними ділянками є каркасні ділянки, послідовність яких є щонайменше на приблизно 80 % ідентичною до відомої людської зародкової каркасної послідовності. За варіантом, якому віддають перевагу, по суті людські каркасні ділянки мають послідовність, що є щонайменше на приблизно 85 %, на приблизно 90 %, на приблизно 95 % або на приблизно 99 % ідентичною до відомої людської зародкової каркасної послідовності. Повністю людськими каркасними ділянками є каркасні ділянки, послідовність яких є ідентичною до відомої людської зародкової каркасної послідовності. Людські каркасні зародкові послідовності можна одержати від ImMunoGeneTics (IMGT) через веб-сайт http://imgt.cines.fr або з The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Наприклад, зародкові каркасні ділянки легкого ланцюгу можуть бути обрані з групи, яку складають: All, A17, А18, А19, А20, А27, А30, LI, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, О12, О2 та О8, а зародкові каркасні ділянки важкого ланцюгу можуть бути обрані з групи, яку складають: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59 та VH5-5I. 5 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Людські генно-інженерні антитіла, які так само, як антитіла, розкриті у цьому описі, демонструють подібні функціональні властивості, що відповідають цьому винаходу, можна одержати за допомогою декількох різних способів. Конкретні антитіла, розкриті у цьому описі, можуть бути застосовані як матриці або вихідні антитіла для одержання додаткових антитіл. За^ одним з варіантів підходу гіперваріабельні ділянки вихідного антитіла переносять на людську каркасну ділянку, що має високий рівень ідентичності послідовності з послідовністю каркасної ділянки вихідного антитіла. Послідовність нової каркасної ділянки буде загалом щонайменше на приблизно 80 %, щонайменше на приблизно 85 %, щонайменше на приблизно 90 %, щонайменше на приблизно 95 % або щонайменше на приблизно 99 % ідентичною до послідовності відповідної каркасної ділянки вихідного антитіла. Результатом цього перенесення може бути зменшення зв'язувальної спорідненості, порівняно зі зв'язувальною спорідненістю вихідного антитіла. У такому випадку, згадана каркасна ділянка може бути піддана зворотній мутації до вихідної каркасної ділянки у певних положеннях, виходячи із специфічних критеріїв, розкритих Queen et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869. Додаткові посилання з описом методів, придатних для одержання гуманізованих мишачих антитіл, охоплюють патенти США №№ 4,816,397; 5,225,539 та 5,693,761; комп'ютерні програми ABMOD та ENCAD, як описано у Levitt (1983) J. Mol. Віоl. 168:595-620; та метод Winter та співробітників (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; та Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536. Ідентифікація залишків для розгляду можливості зворотної мутації може здійснюватись таким чином: У випадку, коли амінокислота належить до наведеної нижче категорії, каркасну амінокислоту людської зародкової послідовності, що застосовується ("каркас-акцептор"), замінюють на каркасну амінокислоту з каркаса вихідного антитіла ("каркас-донор"): (a) амінокислота на людській каркасній ділянці каркаса-акцептора є незвичайною для людських каркасів у цьому положенні, у той час як відповідна амінокислота імуноглобулінадонора є типовою для людських каркасів у цьому положенні; (b) положення амінокислоти є безпосередньо прилеглим до однієї з CDRs; або с) будь-який атом бічного ланцюгу каркасної амінокислоти знаходиться на відстані приблизно 5-6 А (міжцентрова відстань) від будь-якого атому амінокислоти CDR у тривимірній моделі імуноглобуліну. У разі, коли кожна з амінокислот людської каркасної ділянки каркаса-акцептора та відповідна амінокислота у каркасі-донорі є загалом незвичайною для людських каркасів у цьому положенні, така амінокислота може бути заміненою на амінокислоту, типову для людських каркасів у цьому положенні. Цей критерій зворотної мутації надає можливість відновлення активності вихідного антитіла. Інший підхід до одержання людських генно-інженерних антитіл, які демонструють функціональні властивості, подібні до антитіл, розкритих у цьому описі, залучає неспецифічну мутацію амінокислот у межах перенесених CDRs без зміни каркаса і відбір молекул, що одержують, за зв'язувальною спорідненістю та іншими функціональними властивостями, які є такими самими або кращими ніж відповідні властивості вихідних антитіл. До кожного амінокислотного положення у межах кожної CDR також можуть вводитись одиночні мутації з подальшим визначенням впливу таких мутацій на зв'язувальну спорідненість та інші функціональні властивості. Одиночні мутації, що забезпечують одержання поліпшених властивостей, можуть комбінуватись для визначення їх впливів у комбінації однієї з іншою. Крім того, можливою є комбінація обох вищезгаданих підходів. Після перенесення CDR, специфічні каркасні ділянки можуть піддаватись зворотній мутації на додаток до здійснення амінокислотних замін у CDRs. Ця методика описана у роботі Wu, et al, (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162. Із застосуванням ідей цього винаходу фахівець у цій галузі може за допомогою звичайних методів, наприклад, сайтспрямованого мутагенезу, здійснити заміну амінокислот у межах розкритої у цьому описі гіперваріабельної ділянки та каркасних послідовностей, і тим самим одержати додаткові амінокислотні послідовності варіабельної ділянки, що є похідними послідовностей, запропонованих цим винаходом. До конкретного сайту, на якому здійснюється заміна, легко можуть вводитись усі альтернативні амінокислоти. Методи, розкриті у цьому описі, можуть потім бути застосовані для перевірки цих додаткових амінокислотних послідовностей варіабельної ділянки для ідентифікації послідовностей, що мають вказані in vivo функції. Подібним чином можуть бути ідентифіковані додаткові послідовності, придатні для одержання людських генно-інженерних антитіл та їх антигензв'язувальних фрагментів за цим винаходом. За варіантом, якому віддають перевагу, амінокислотна заміна у межах каркасів обмежується 6 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 одним, двома або трьома положеннями у межах будь-якої однієї або декількох з 4 каркасних ділянок легкого ланцюгу та/або важкого ланцюгу, розкритих у цьому описі. За варіантом, якому віддають перевагу, амінокислотна заміна у межах CDRs обмежується одним, двома або трьома положеннями у межах будь-якої однієї або декількох з 3 CDRs легкого ланцюгу та/або важкого ланцюгу. Можливими також є комбінації різних описаних вище змін у межах цих каркасних ділянок та CDRs. Термін "лікування" (або "лікувати") означає процеси, що спричиняють уповільнення, переривання, зупинки, контролювання, припинення, зменшення або звертання розвитку або тяжкості існуючого симптому, розладу, стану або захворювання, але не обов'язково спричиняють повну ліквідацію усіх симптомів, станів або розладів, пов'язаних із захворюванням, які асоціюють з антитілом проти N3pGlu Αβ. Антитіла за цим винаходом можуть бути застосовані як лікарські засоби у медицині та вводитись різноманітними шляхами. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, такі композиції є призначеними для парентерального введення. Такі фармацевтичні композиції можуть бути одержані за методами, добре відомими у цій галузі (Дивись, наприклад, Remington: th The Science and Practice of Pharmacy, 19 ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.), і містити антитіло, розкрите у цьому описі, або його антигензв'язувальний фрагмент та фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або допоміжну речовину. Результати наведених нижче випробувань демонструють, що моноклональні антитіла та їх антигензв'язувальні фрагменти за цим винаходом є придатними для лікування стану, пов'язаного з активністю Αβ пептиду, такого як хвороба Альцгеймера, синдром Дауна та САА. Приклад 1: Продукування антитіл Початкове одержання антитіл: Трансгенних мишей лінії FVB імунізують скороченим на Nкінці модифікованим піроглутаматом людським бета-амілоїдним пептидом 3-42 (N3pGlu), попередньо обробленим при температурі 37 °C впродовж ночі для утворення агрегату. Клітини мишачої селезінки збирають, і Αβ1-40-реактивні В-клітини вичерпують за допомогою MACS (магнітно-активоване клітинне сортування). Залишкові клітини сортують для зв'язування з агрегованим N3pGlu Αβ пептидом. РНК виділяють з відібраних В-клітин, і перетворюють на кДНК за допомогою оліго-dT. Варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів антитіла одержують за допомогою ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) із застосуванням праймерів із сигнальною послідовністю антитіла і клонують у фаговому векторі шляхом мутагенезу за методом Кункеля з одержанням бібліотеки Fab. Згадану бібліотеку Fab піддають скринінгу на зв'язування з агрегованим N3pGlu пептидом за допомогою одноточкового імуноферментного твердофазного аналізу (SPE) з подальшим зворотним скринінгом проти ΑβΙ-40. Характеристики позитивних клонів визначають шляхом секвенування ДНК, експресії fab, зв'язування з N3pGlu Αβ пептидом і визначення відсутності зв'язування з розчинним Αβ1-40 або Αβ1-42 пептидом. Створюють бібліотеки одноамінокислотних мутантів з подальшим скринінгом засобами SPE на зв'язування з агрегованим N3pGlu Αβ, але не з Αβ1-42 пептидом. Необхідні мутації об'єднують у комбінаторні бібліотеки. Оптимізовані за спорідненістю комбінаторні варіанти відбирають і перетворюють на мишачий IgGl для визначення спорідненості за допомогою ® BIACORE та зв'язування Αβ бляшок засобами імуногістохімії. З ідентифікованого клону mAb білок одержують у формі обох мишачих ізотипів IgGl (ніЕ8) та IgG2a (mE8c) для проведення досліджень ефективності in vivo. mE8 не зв'язується ні з мишачою послідовністю N3pGlu Αβ (трЕ3-16), ні з людським Αβ1-42. Для початкової гуманізації застосовують каркаси людської зародкової лінії VH1-69/JH6 та Vk-A18/JK2. CDRs антитіла mE8 (з чотирма мутаціями спорідненості) пересаджують на людські каркаси з одержанням антитіла hE8-C6. Подальшу оптимізацію спорідненості здійснюють на каркасі hE8-C6, і необхідні мутації об'єднують з одержанням високоспоріднених гуманізованих варіантів R5, R17, R24 та 2420. Другий цикл оптимізації для поліпшення розробки лікарського засобу: Два гуманізовані варіанти, hE8-C6 і R17, вибирають як каркас для другого циклу оптимізації з метою збільшення часу половини життя антитіла у кров'яному руслі шляхом зменшення неспецифічного зв'язування з клітинами та підвищення спорідненості антитіла до розчинного N3pGlu Αβ пептиду. Синтезують біотинілований розчинний пептид, який складають 14 N-кінцевих амінокислот N3pGlu Αβ (рЕ3-16В), і оцінюють його як еквівалент N3pGlu Αβ пептиду стосовно зв'язування антитіла mЕ8. Розробляють дослідження з підняттям високопродуктивного фільтру із застосуванням рЕ3-16В, яке використовують в усіх подальших скринінгах бібліотек. Усі влучення під час скринінгу з підняттям фільтру підтверджують шляхом зв'язування з агрегованим N3pGlu Αβ. 7 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Бібліотеки варіантів hЕ8-С6 піддають повторному скринінгу із застосуванням дослідження з підняттям фільтру з ідентифікуванням необхідних мутацій. Субпопуляцію цих мутацій застосовують для створення комбінаторної бібліотеки. За допомогою цього підходу вибирають чотири комбінаторні варіанти (СоІІ-Е10, CoII-G2, CoII-G8 та СоІІ-Е2). Для створення структурних моделей варіабельних ділянок hE8-C6, R17, R24 та інших варіантів вдаються до комп'ютерного моделювання. Шляхом дослідження структурних моделей ідентифікують позитивні заряди, введені для оптимізації спорідненості, які утворюють кластери в активних центрах антитіла, що є потенційною причиною неспецифічного зв'язування антитіл з клітинами. На підставі результатів моделювання декілька позицій вибирають для введення змін з метою зрівноважування поверхневого електростатичного потенціалу. Комбінаторну бібліотеку синтезують шляхом об'єднання певних необхідних мутацій, визначених шляхом скринінгу бібліотек, і змін, визначених завдяки структурному моделюванню. За результами цієї роботи три варіанти (R17m-B4, R17m-A12 та R17m-B12) вибрані для подальшого дослідження. Дослідження структурних моделей також виявляє стеричне зіткнення між залишком Y36 каркаса легкого ланцюгу і залишками CDR3 важкого ланцюгу. До легкого ланцюгу hE8-C6 вводять мутацію Y36L з одержанням варіанту hE8L. Встановлено, що лише ця зміна каркаса справляє значний вплив як на підвищення спорідненості антитіла, так і на зменшення неспецифічного зв'язування клітин. Іншою дослідницькою роботою було випробування можливостей гуманізації різних людських каркасів. CDRs антитіла mЕ8 пересаджували на каркаси VH5-51/VKO2 та VH3-23/VKA2. Встановили, що гуманізований Fab з VH5-51/VKO2 (hE8-51O2) виявився еквівалентним, якщо не кращим, за hE8-C6 при зв'язуванні N3pGlu Αβ. Шляхом введення до hE8-51O2 додаткових відповідних прийнятних мутацій одержали комбіновані варіанти СІ-А1, СІ-В6, СІ-С7 та СІ-В8. Після проведення in vitro усіх досліджень, у тому числі ELISA (імуноферментного ® твердофазного аналізу) та BIACORE , на специфічність та спорідненість антитіл, на неспецифічне зв'язування клітин та імуногістохімічне забарвлення відібрали п'ять варіантів mAbs, B12L, СІ-С7, hE8L, R17L та R17. Антитіла можна одержати і очистити по суті наведеним нижче способом. Відповідні клітинихазяї, наприклад, НЕК 293 EBNA або СНО, тимчасово або стабільно трансфекують експресійною системою для секретування антитіл із застосуванням оптимального попередньо визначеного відношення векторів HC:LC або одновекторної системи, що кодує як НС, наприклад, послідовність SEQ ID NO:56 і послідовність SEQ ID NO:43, так і LC, наприклад, послідовність SEQ ID NO:55. Просвітлене середовище, до якого секретують антитіло, очищають за допомогою будь-якої з багатьох загальнозастосовуваних методик. Наприклад, середовище може бути зручним чином завантажене до колонки Sepharose FF з протеїном А або G, яка була зрівноважена сумісним буфером, таким як фізіологічний розчин, забуферений фосфатом (рН 7,4). Вказану колонку промивають для видалення неспецифічних зв'язувальних компонентів. Зв'язане антитіло елююють, наприклад, градієнтом рН (таким як 0,1 Μ натрій-фосфатний буфер (рН 6,8):0,1 Μ натрій-цитратний буфер (рН 2,5)). Фракції антитіла виявляють, наприклад, за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), після чого змішують. Додаткове очищення є факультативним, у залежності від передбачуваного застосування. Антитіло може бути сконцентроване та/або відфільтроване за стерильних умов за традиційними методиками. Розчинний агрегат і мультимери можуть бути ефективно видалені за традиційними методиками, у тому числі шляхом гель-хроматографії за розміром молекул, гідрофобної хроматографії, іонообмінної хроматографії або хроматографії на гідроксилапатитній адсорбційній колонці. Чистота антитіла після цих хроматографічних стадій є більшою ніж 99 %. Згаданий продукт може бути негайно заморожений при температурі 70 °C або ліофілізований. Нижче наведені амінокислотні послідовності для цих антитіл за цим винаходом. 50 8 UA 107600 C2 Таблиця 1 Послідовності (SEQ ID Nos) антитіл Антитіло І (B12L) II (R17L) III (hE8L) IV (R17) V (СІ-С7) VI (mE8) VII (mE8c) 5 10 Легкий ланцюг 14 14 14 38 49 22 22 Важкий ланцюг 15 16 44 39 50 23 24 LCVR 11 11 11 36 47 20 HCVR 12 13 42 37 48 21 Приклад 2: Зв'язувальна спорідненість до розчинного N3pGIo ® Поверхневий плазмонний резонанс, виміряний за допомогою приладу BIACORE , застосовують для характеристики зв'язування N3pGlu Αβ та антитіл проти N3pGlu. За ® виключенням вказаного, усі реактиви та матеріали походять від компанії BIACORE AB (Upsala, Швеція). Всі вимірювання здійснюють при температурі 25 °C. Зразки розчиняють у HBS-EP буфері (150 мМ розчин хлориду натрію, 3 мМ розчин EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), 0,005 % (маса/об'єм) поверхнево-активної речовини Р-20 і 10 мМ розчин HEPES-буферу (N-2гідроксиетилпіперазин-N'-2-сульфонової кислоти), рН 7,4). Ряд Αβ пептидів з позиційними змінами (гліцинові мутанти) синтезують для визначення впливу даного залишку на зв'язування з антитілом і ідентифікування у такий спосіб характеристик та послідовності, необхідної для розпізнавання антитіла: Назва пептиду рЕ3-16 Е3-16 pEG4 mpE3-16 pEG6 pEG7 pEG8 pEF10 Послідовність Αβ 3-16 Pyr-EFRHDSGYEVHHQK-біотин EFRHDSGYEVHHQK-біотин Pyr-EGRHDSGYEVHHQK-біотин Pyr-EFGHDSGFEVHHQK-бioтин(гризун) Pyr-EFRGDSGYEVHHQK-біотин Pyr-EFRHGSGYEVHHQK-біотин Pyr-EFRHDGGYEVHHQK-біотин Pyr-EFRHDSGFEVHHQK-біотин SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39 15 20 25 30 35 Значення скороченої (дез-1,2) і модифікованої форми глутамінової кислоти (3 пір-Ε або 3 пір-Glu) визначають шляхом порівняння зв'язування Αβ 1-42 у зіставленні з Αβ 3-16 та у зіставленні з рЕ3-16 (послідовність SEQ ID NO:1 у зіставленні з послідовністю SEQ ID NO:26 та у зіставленні з послідовністю SEQ ID NO:25, відповідно). Пептиди розчиняють у PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин) (5 мг/мл) перед розбавленням для проведення експериментів із зв'язуванням. Зв'язування визначають за допомогою множини аналітичних циклів захоплення антитіла, впорскування/асоціації пептиду, тривалого потоку буферу для дисоціації та регенерації поверхні. Для стадії захоплення антитіла, у залежності від типу антитіла для захоплення, чіп СМ5 іммобілізують протеїном А або козячим антимишачим Fc. За виключенням мишачих антитіл, кожен цикл складається з: введення -5-7 мкл (10 мкг/мл) антитіла проти N3pGlu (5 мкл/хв) (захоплення приблизно 3,000 одиниць відгуку), введення 100 мкл пептиду (50 мкл/хв) (1000 нМ-62,5 нМ у двократних серійних розведеннях для кожного циклу) з подальшою 10 хв дисоціацією. Для мишачого антитіла швидкість потоку становить 50 мкл/хв з введенням 20 мкл мишачого антитіла (50 мкг/мл). У обох випадках поверхню чипу регенерують за допомогою 20 мкл 10 мМ розчину гліцину гідрохлориду, рН 1,5. Після цього визначають зв'язувальну спорідненість (КD) за швидкістю асоціації та дисоціації для кожного циклу із застосуванням моделі зв'язування (1:1) за аналітичною програмою BIAevaluation. Антитіла проти N3pGlu, B12L і R17L та вихідне мишаче антитіло (тЕ8С) специфічно розпізнають N3pGlu Αβ зі значенням KD, меншим ніж 1 нМ. Антитіла проти N3pGlu, B12L і R17L та вихідне мишаче антитіло (тЕ8С) також зв'язуються з рЕ3-16 з подібною спорідненістю, вказуючи на те, що антигенна детермінанта знаходиться у межах цієї ділянки пептидів. Дослідження зв'язування антитіл з гліциновими пептидами-мутантами показує, що залишками, критичними для зв'язування, були залишки від 3 9 UA 107600 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до 7: піроЕ у положенні 3, F у положенні 4, R у положенні 5, Η у положенні 6, D у положенні 7. Для антитіл за цим винаходом виявлюваного зв'язування з Αβ1-40 встановлено не було. Приклад 3: Зв'язувальна спорідненість до агрегованого N3pGIu ® Експерименти з BIACORE також проводять для моніторингу зв'язування антитіл проти N3pGlu з агрегованим N3pGlu Αβ. При проведенні цього експерименту, N3pGlu Αβ пептид іммобілізують при різній густині у проточних кюветах 2 (низька густина, LD), 3 (середня густина, MD) та 4 (висока густина, HD) на чипі СМ-5 за допомогою хімічної взаємодії аміногруп. Різні рівні N3pGlu Αβ пептиду іммобілізують для визначення впливу поверхневої густини на зв'язування антитіл проти N3pGlu. Після іммобілізації більша частина N3pGlu Αβ агрегується на поверхні, на що вказує відсутність зв'язування контрольного Mab, яке лише розпізнає мономерний пептид. Ця агрегована форма пептиду імітує властивість агрегованого Αβ пептиду у фібрилярній або амілоїдній формі, де N-кінцева ділянка пептидів є відкритою і може слугувати мішенню для антитіл. Зв'язування визначають за допомогою множини аналітичних циклів при температурі 25 °C. Кожен цикл, який проводять при швидкості потоку 50 мкл/хв, складається з таких стадій: введення 250 мкл розчину антитіла проти N3pGlu (розпочинаючи з 500 нМ, із застосуванням двократних серійних розведень для кожного циклу) з подальшими 20 хв для дисоціації, і регенерація за допомогою ~30 мкл 10 мМ розчину гліцину гідрохлориду, рН 1,5. Швидкість асоціації і дисоціації для кожного циклу визначають за допомогою моделі різнорідних лігандів із застосуванням програми BIAevaluation. Оскільки модель зв'язування 1:1 не відповідає даним, різнорідна підгонка видає два показники зв'язувальної спорідненості (низька і висока спорідненість). Антитіла R17L і B12L та вихідне мишаче антитіло mЕ8с зв'язуються з агрегованим N3pGlu Αβ з високою спорідненістю КD.1