Спосіб радіоактивного мічення анти-cd20 антитіла

Даний винахід має відношення до аналізів зв'язування антитіл та комплектів введення радіоактивних ізотопів, приготування ліофілізованих клітин, реагентів та протоколів тестування клінічної ефективності терапевтичних антитіл для обробки/відображення пухлин та клітин пухлин. Більш конкретно, комплекти даного винаходу використовуються для створення і оцінки кон'югатів мічених антитіл, які будуть використані для обробки та відображення пухлин В-клітинної лімфоми методом цільового зв'язування поверхневого антигену В-клітин ВР35 ("CD20"). Всі наведені тут публікації та заявки на патенти включені як посилання в такому ж обсязі, як кожна індивідуальна публікація або заявка на патент була б конкретно та індивідуально включена як посилання. Імунна система хребетних (наприклад, приматів, включаючи людей, людиноподібних мавп, просто мавп та інших) складається з ряду органів та типіВ-клітин, які розвинулись для того, щоб: точно і специфічно розпізнавати чужорідні мікроорганізми ("антиген"), які вражають хребетну істоту - хазяїна; специфічно зв'язувати такі чужорідні мікроорганізми; та виводити/руйнувати такі чужорідні мікроорганізми. Лімфоцити виробляються в тимусі, селезінці та кістковому мозку (дорослих) і представляють близько 30% від всіх білих клітин крові, присутніх в кровоносній системі людини (дорослої). Існують дві основні субпопуляції лімфоцитів: Τ клітини та В-клітини. Τ клітини відповідають за клітинний імунітет, в той час як В-клітини відповідають за продукцію антитіл (гуморальний імунітет). Однак Τ клітини та В-клітини можна розглядати як взаємозалежні - в типовій імунній відповіді Τ клітини активуються, коли рецептор Τ клітини зв'язується з фрагментами антигену, які зв'язані з глікопротеїнами головного комплексу гістосумісності (ГКГ) на поверхні клітини, що представляє антиген; така активація є причиною вивільнення біологічних медіаторів ("інтерлейкінів"), які, власне кажучи, стимулюють В-клітини до диференціювання та продукування антитіла ("імуноглобулінів") проти антигену. Кожна В-клітина в організмі містить на своїй поверхні специфічне антитіло, таким чином, одна В-клітина буде містити антитіло, специфічне до одного антигену, в той час як інша В-клітина буде містити антитіло, специфічне до іншого антигену. Таким чином, В-клітини є досить різними і ця відмінність є критичною для імунної системи. У людини кожна В-клітина може виробляти величезну кількість молекул антитіл (близько 107-108). Таке продукування антитіл найчастіше типово припиняється (або значно зменшується), коли чужорідний антиген знищений. Однак іноді проліферація окремої В-клітини буде продовжуватись без послаблення; така проліферація може призводити до раку, який називають "В-клітинна лімфома". Як Τ клітини, так і В-клітини, містять клітинні поверхневі протеїни, які можуть бути використані як "маркери" для їх диференціювання та ідентифікації. Одним таким маркером В-клітини людини є рестриктований до В лімфоцитів антиген диференціювання людини Вр35, позначений як "CD20". CD20 з'являється під час раннього розвитку пре-В клітини і зберігається до стану диференціації плазматичної клітини. Більш конкретно, молекула CD20 може регулювати етап процесу активації, який є необхідним для ініціювання клітинного циклу та диференціювання, і зазвичай експресується в дуже великій кількості в неопластичних ("пухлинних") В-клітинах. CD20, за визначенням, є присутнім як в "нормальних" В-клітинах, так і в "злоякісних" В-клітинах, тобто в тих В-клітинах, чия неослаблена проліферація може призвести до Вклітинної лімфоми. Таким чином, поверхневий антиген CD20 є ймовірним кандидатом для цільового зв'язування В-клітинних лімфом. Власне кажучи, таке цільове зв'язування може бути узагальнено наступним чином: антитіла, специфічні до поверхневого антигену CD20 В-клітин, наприклад, вводяться пацієнту. Ці анти-CD20 антитіла специфічно зв'язуються з клітинним поверхневим антигеном CD20 (очевидно) як нормальних, так і злоякісних В-клітин; анти-CD20 антитіла, зв'язані з поверхневим антигеном CD20, можуть привести до знищення та зменшення кількості неопластичних В-клітин. Додатково, хімічні реактиви або радіоактивні мітки, які мають можливість знищення пухлини, можуть бути кон'юговані з анти-CD20 антитілом таким чином, що агент специфічно доставляється в, наприклад, неопластичні В-клітини. Незалежно від підходу, головною метою є знищення пухлини: конкретний підхід може бути визначений окремим анти-СD20 антитілом, яке використовується, і, таким чином, можливі підходи до цільового зв'язування CD20 антигену можуть значно відрізнятись. Наприклад, спроби такого цільового зв'язування поверхневого антигену CD20 наведені в літературі. Як повідомлено в літературі, моноклональне антитіло 1F5 миші (антитіло проти анти-CD20) вводили хворим на В-клітинну лімфому способом безперервного внутрішньовенного введення. Як було повідомлено, надзвичайно високі рівні (>2 грамів) 1F5 були потрібні для того, щоб пухлині клітини в кровообігу вичерпалися, і результати були описані як "нестійкі". [Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas," Blood 69/2:584-591 (1987)]. Потенційною проблемою цього підходу є факт, що не людським моноклональним антитілам (наприклад, мишачим моноклональним антитілам) типово не вистачає людської ефекторної функціональності, тобто, вони не здатні, між іншим, опосередкувати комплемент-залежний лізис або руйнувати людські цільові клітини через антитіло-залежну клітинну токсичність або через фаготицоз, опосередкований Fcрецептором. Більш того, не людські моноклональні антитіла можуть бути розпізнані людським організмом як чужорідний білок; тому повторні ін'єкції таких чужорідних антитіл можуть призвести до індукції імунної відповіді, яка веде до шкідливої реакції гіперчутливості. У випадку мишачих моноклональних антитіл це часто називають Людською відповіддю на Анти-Мишачі Антитіла або "ЛАМА" відповіддю. На додаток, ці "чужорідні" антитіла можуть бути атаковані імунною системою організму таким чином, що вони дійсно нейтралізуються раніше, ніж досягають своїх цільових ділянок. Лімфоцити та клітини лімфоми по суті чутливі до радіотерапії. Тому злоякісні В-клітини є привабливими цілями для радіоімунотерапії (РМТ) з кількох причин: локальна емісія іонізуючої радіації мічених антитіл може вбивати клітини з або без цільового антигену (тобто CD20) в близькому сусідстві з антитілом, зв'язаним з антигеном; проникаюча радіація, тобто бета-випромінювачі, можуть усунути проблему обмеженого доступу антитіл в великі або поліваскуляризовані пухлини; і загальна кількість необхідних антитіл може бути зменшена. Радіонукліди емітують радіоактивні частинки, які можуть пошкодити клітинну ДНК до стану, коли клітинні відновлювальні механізми не можуть дозволити клітині продовжувати жити; тому, якщо цільовими клітинами є пухлини, то радіоактивні мітки успішно вбивають пухлинні клітини. Мічені антитіла, за визначенням, включають використання радіоактивних речовин, які можуть вимагати необхідність запобіжних заходів як для хворого (тобто можлива трансплантація кісткового мозку), так і для медичного працівника (тобто необхідність виконання суворих заходів безпеки при роботі з радіоактивними речовинами). Тому підхід до поліпшення здатності мишачих моноклональних антитіл здійснювати лікування захворювань В-клітин повинен включати кон'югацію радіоактивної мітки до антитіла так, щоб ця мітка або токсин були локалізовані в місці пухлини. Токсини (тобто хіміотерапевтичні агенти, такі як доксорубіцин або мітоміцин С) також повинні бути кон'юговані з антитілами. [Див., наприклад, опубліковану заявку РСТ WO 92/07466 (опубліковано 14 Травня 1992)]. "Химерні" антитіла, тобто антитіла, які містять частини з двох або більше різних видів (наприклад, миші та людини), були розроблені як альтернатива "кон'югованим" антитілам. Були створені химерні антитіла миша/людина і показано, що вони проявляють характеристики зв'язування вихідних мишачих антитіл і ефекторні функції, асоційовані з константною ділянкою людських антитіл. [Див., наприклад, Cabilly et al., U.S. Patent 4,816,567; Shoemaker et al., U.S. Patent 4,978,745; Beavers et al., U.S. Patent 4,975,369; та Boss et al., U.S. Patent 4,816,397, які всі включені тут як посилання]. Загалом, ці химерні антитіла конструюють шляхом приготування геномної генної бібліотеки з ДНК екстрагованої з існуючої мишачої гібридоми, [Nishimura et al. (1987) Cancer Research 47: 999]. Після цього бібліотека перевіряється на наявність варіабельних ділянок генів важких та легких ланцюгів, які проявляють правильні типи перебудови фрагментів антитіл. Після цього клоновані варіабельні ділянки генів вшиваються у вектор експресії, який містить клоновані касети людського гену константної ділянки відповідного важкого або легкого ланцюгу. Потім химерні гени експресують в обрану клітинну лінію, звичайно в лінію мишачої мієломи. Наприклад, [Liu, A.Y., et al., "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity", J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987)], описує химерне антитіло людина/миша, спрямоване проти антигену CD20, [Див. також РСТ Publication No. WO 88/04936]. Однак це посилання не забезпечує інформацією щодо здатності, ефективності або практичних сторін використання химерних антитіл Liu для лікування В-клітинних захворювань. Необхідно помітити, що функціональні аналізи in vitro (наприклад, комплемент-залежний лізис ("КЗЛ"); антитіло-залежна клітинна цитотоксичність ("АЗКЦ")) не можуть, по суті, пророкувати здатність будь-якого антитіла in vivo руйнувати або вичерпувати цільові клітини, що експресують специфічний антиген. [Див., наприклад, Robinson, R.D., et al., "Chimeric mouse-human anti-carcinoma antibodies that mediate different antitumor cell biological activities," Hum. Antibod. Hybridomas, 2:84-93 (1991)] (химерні антитіла людина-миша, які мають АЗКЦ активність, що не виявляється). Тому потенційна терапевтична ефективність антитіл може бути, безсумнівно, оцінена тільки експериментом in vivo. З цією метою заявки, що розглядаються, [08/475,813, 08/475,815 та 08/478,967], наведені тут як посилання в усій повноті, описують мічені анти-СD20 кон'югати для діагностичного "відображення" пухлин В-клітинної лімфоми перед використанням терапевтичних антитіл. "Іп2В8" кон'югат містить мишаче моноклональне антитіло 2В8, специфічне до людського антигену CD20, яке приєднане до індію [111] (111Іn) через біфункціональний комплексон, тобто МХ-ДТПК (діетилентриамінпентаоцтова кислота), який містить суміш 1:1 1-ізотіоціанатобензил-3-метил-ДТПК і 1-метил-3-ізотіоціанатобензил-ДТПК. Індій-[111] вибраний як діагностичний радіонуклід тому, що він випромінює гамма-випромінювання і знаходить першочергове використання як агент, що проявляє. Патенти, які мають відношення до комплексонів і кон'югатів комплексонів, відомі в галузі. Наприклад, [U.S. Patent No. 4,831,175, Gansow], направлений на хелати полізаміщеної діетилентриамінпентаоцтової кислоти та білкові кон'югати, які містять цю кислоту, та способи їх приготування. [U.S. Patent Nos. 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850, and 5,124,471, Gansow] також відносяться до хелатів полізаміщеної ДТПК. Ці патенти наведені тут в їх повноті. Специфічний біфункціональний комплексон, використаний для полегшення хелатоутворення в заявках [08/475,813, 08/475,815 та 08/478,967], був вибраний тому, що він має високу спорідненість до тривалентних металів і забезпечує підвищене значення співвідношення пухлина-не пухлина, зменшене поглинання кісткою та велике втримання радіонукліду in vivo на цільових ділянках, тобто ділянках пухлини В-клітинної лімфоми. Однак в галузі відомі інші біфункціональні комплексони, і вони можуть бути успішно використані в терапії пухлин. Мічені терапевтичні антитіла для цільового зв'язування і руйнування В-клітинних лімфом та пухлинних клітин описані також в заявках [08/475,813, 08/475,815 та 08/478,967], Зокрема, Y2B8 кон'югат містить таке ж мишаче моноклональне антитіло 2В8 проти CD20 людини, приєднане до ітрію-[90] (90Y) за допомогою такого ж біфункціонального комплексону. Цей радіонуклід був вибраний для терапії з деяких причин. Період напіврозпаду 90Υ, 64 години, є достатньо довгим для акумуляції антитіла пухлиною і, на відміну, наприклад, від 1311, він є чистим бета-випромінювачем високої енергії, яка не супроводжується гаммавипромінюванням при його розпаді в області від 100 до 1000 діаметрів клітини. Мінімальна кількість проникаючого випромінювання дозволяє амбулаторне використання 90Y-мічених антитіл. Більш того, інтерналізація мічених антитіл не є необхідною для того, щоб вбити клітину, і локальна емісія іонізуючої радіації буде летальною для сусідніх пухлинних клітин, які мають нестачу цільового антигену. Тому що 90Y радіонуклід був приєднаний до антитіла 2В8 з використанням такої ж молекули МХ-ДТПК біфункціонального комплексону, кон'югат Υ2Β8 має такі ж самі переваги, як розглянуті вище, наприклад, підвищене утримання радіонукліду в цільовій ділянці (пухлині). Однак, на відміну від 111Іn, він не може бути використаний для цілей відображення з-за відсутності гамма-випромінювання, асоційованого з цим процесом. Таким чином, діагностичний радіонуклід "відображення", такий як 111Іn, може бути використаний для визначення розташування і відносного розміру пухлини до і/або наступного використання терапевтичних химерних або 90Y-мічених антитіл з метою зменшення пухлини. На додаток, індій-мічені антитіла дають можливість виконати дозиметричну оцінку. В залежності від запланованого використання антитіл, тобто як діагностичного або терапевтичного реагенту, в галузі відомі і використовуються для схожих цілей інші радіомітки. Наприклад, радіонукліди, які використовують в клінічному діагнозі, включають 1311, 1251, 1231, 99Тс, 67Ga, так само як 111Іn. Антитіла також мітять різними радіонуклідами для потенційного використання в цільовій імунотерапії [Peirersz et al. (1987) The use of monoclonal antibody conjugates for the diagnosis and treatment of cancer. Immunol. Cell Biol. 65: 111125]. Ці радіонукліди включають 188Re і 186Re, а також 90Y, і в меншій мірі 199Аu і 67Сu. I-[131] також використовують для терапевтичних цілей. У [Патенті США No. 5,460,785], наведеному тут як посилання, надано перелік таких радіоізотопів. Як повідомлено в заявках, що розглядаються, [08/475,813, 08/475,815 і 08/478,967], використання міченого кон'югату Y2B8, так само як неміченого химерного анти-CD20 антитіла, приводило до значного зменшення пухлини у мишей, які мали В-клітинну лімфобластну пухлину. Крім того, клінічні випробування на людині показали значне зменшення В-клітин у хворих на лімфому, яким вводили химерні анти-СD20 антитіла. Фактично, химерне 2В8 нещодавно було оголошено першим національним затвердженим FDA анти-раковим моноклональним антитілом з найменуванням RituxanÒ. Таким чином, було показано, що принаймні одне химерне анти-СD20 антитіло продемонструвало терапевтичну ефективність в лікуванні Вклітинної лімфоми. На додаток, [у заявці США, серійний No. 08/475,813], наведеній тут як посилання, описується послідовне використання RituxanÒ, химерного анти-CD20, з обома або з кожним індій-міченим або ітрійміченим мишачими моноклональними антитілами. Хоча мічені антитіла, використані в цій комбінованій терапії, є мишачими антитілами, початкова обробка химерними анти-CD20 значно зменшує популяцію Вклітин так, що ЛАМА відповідь знижується, таким чином сприяючи комбінованому терапевтичному і діагностичному режиму. Таким чином, в цьому контексті комбінованої імунотерапії, мишачі антитіла можуть знайти використання як діагностичні реагенти. Крім того, в [Заявці США 08/475,813] було показано, що терапевтично ефективне дозування ітрій-міченого анти-СD20 антитіла, яке слідує за використанням RituxanÒ, є достатнім для (а) очистки будь-яких В-клітин периферійної крові, які залишились не очищеними химерним анти-СD20 антитілом; (б) початку спустошення лімфовузлів щодо В-клітин; або (в) початку спустошення інших тканин щодо В-клітин. Таким чином, сполучення радіоміток з раковими терапевтичними антитілами забезпечує цінний клінічний інструмент, який може бути використаний для оцінки потенційної терапевтичної ефективності таких антитіл, для створення діагностичних реагентів для контролю прогресу лікування, і для розробки додаткових терапевтичних реагентів, які можуть бути використані для посилення початкового потенціалу химерного антитіла до знищення пухлини. За умов доведеної ефективності анти-CD20 антитіла в лікуванні лімфоми, що не є лімфомою Ходжкіна, і відомої чутливості лімфоцитів до радіоактивності, було б великою перевагою, щоб такі терапевтичні антитіла стали комерційно доступними у вигляді комплекту, за допомогою якого вони можуть бути легко модифіковані радіомітками і використані прямо для хворого в клінічних умовах. Хоча існує багато методів та реагентів для виконання радіомічення антитіл, в галузі все ж не вистачає зручних носіїв для розміщення цих реагентів в клінічних умовах таким шляхом, щоб вони могли бути легко отримані і введені хворому до того, як відбудеться значний розпад радіомітки або значне руйнування антитіла з-за радіомітки. Нестача таких зручних засобів комерціалізації цієї цінної технології можлива завдяки поганій ефективності зв'язування, яку продемонстрували деякі відомі протоколи мічення і необхідність наступної очистки реагентів на колонці після процедури радіомічення. Затримка в розробці таких комплектів також може частково спричинятися завдяки недоступності у минулому чистих комерційних радіоізотопів, які могли бути використані для створення ефективно мічених продуктів, що не потребують наступної очистки. Альтернативно, можливою причиною загальної недоступності таких комплектів є недостатня кількість антитіл, що були здатні досягти визнання або ефективності, якої RituxanÒ досяг в лікуванні лімфоми у хворих людей. Наприклад, як описано в [Патенті США 4,636,380], який наведений тут як посилання, в науковому товаристві існувала загальна думка, що для клінічного використання радіопрепарату він повинен бути підданий тривалому та кропіткому процесу розділення та очищення. Дійсно, введення хворому незв'язаного радіоміченого препарату було б не бажаним. Необхідність додаткового етапу очищення робить процес радіомічення антитіл в клінічних умовах неможливим, особливо для лікарів, які не мають ні обладнання, ні часу очищати їх власні ліки. Більш того, радіомічені білки, по суті, можуть бути нестабільними, особливо мічені радіолітичними ізотопами, такими як 90Y, які мають тенденцію викликати пошкодження антитіла тим більше, чим довше вони знаходяться з ним в близькому сусідстві. В свою чергу, такий радіоліз стає причиною ненадійної ефективності препарату через втрати радіомітки і/або зменшеного зв'язку з цільовим антигеном і може призвести до небажаної імунної відповіді, спрямованої до денатурованого білку. Дотепер, клініцисти без обладнання для мічення і очищення антитіл на місці не мають іншого вибору, аніж замовляти вже мічені терапевтичні антитіла, або мітити їх поза клінікою на відповідному обладнанні і транспортувати для введення пацієнту. Всі ці маніпуляції додають дорогоцінний час до періоду між міченням та введенням препарату, таким чином сприяючи нестабільності препарату, і насправді зменшуючи корисність комплектів для радіомічення в клінічних умовах. Інші безуспішно намагались розробити комплекти для радіомічення антитіл, які були б достатньо досконалими, щоб відмовитись від окремого етапу очищення антитіл. Наприклад, Cytogen нещодавно випустив комерційний комплект для радіомічення мишачих моноклональних антитіл, спрямований на пухлина-асоційований глікопротеїн TAG-72, Однак антитіло Cytogen в певній мірі не відповідає рецептурі комплекту через тенденцію до створення мікрочастинок під час зберігання повинні бути видалені на етапі додаткової фільтрації. Більш того, антитіло Cytogen викликало у пацієнтів шкідливу реакцію через ЛАМА відповідь. Інші заявили про розробку протоколів радіомічення, які можливо перетворити в формат комплекту, в якому окремий етап очистки буде непотрібний [Richardson et al. (1987) Optimization and batch production of DTPA-labeled antibody kits for routine use in 111ln immunoscintography. Nuc. Med. Commun. 8: 347-356; Chinol and Hnatowich (1987) Generator-produced yttrium-[90] for radioimmunotherapy. J. Nucl. Med. 28(9): 1465-1470]. Однак у таких протоколах не було досягнуто такого рівня зв'язування, якого автори винаходу досягли, використовуючи описані тут протоколи, які включають ефективність зв'язування принаймні 95%. Такий рівень зв'язування забезпечує додаткову перевагу щодо підвищення безпеки, яка полягає в тому, що завдяки низькому зв'язуванню радіонукліду незв'язана мітка фактично не буде введена пацієнту. Згідно з протоколами, включеними в комплекти даного винаходу, можна проводити швидке мічення, яке може бути проведено приблизно за півгодини або, в залежності від мітки, всього за 5 хвилин. Більш того, протоколи комплекту даного винаходу мають ефективність мічення більше 95%, таким чином, не виникає потреби в подальшому очищенні. Без необхідності подальшої очистки, період напіврозпаду радіомітки і неушкодженість антитіла зберігаються для досягнення тої терапевтичної мети, для якої воно було мічене. У даному винаході описані зручні комплекти і способи, за допомогою яких діагностичні і терапевтичні антитіла можуть бути мічені радіоактивною міткою і введені пацієнту відтворюваним, надійним і зручним способом. Комплекти даного винаходу трансформують процес радіомічення антитіл в безперешкодний, надійний, стандартизований процес, який значно полегшує протоколи лікування хворого. Даний комплект має переваги над попередніми, які полягають в тому, що були визначені оптимальні параметри мічення і терапевтичного та діагностичного введення, таким чином зменшуючи вартість виробів. Завдяки тому, що описаний тут комплект забезпечує оптимальні параметри, відповідні індивідуальній мітці, використання комплекту, розробленого для індивідуальної мітки, буде також зводити до мінімуму розукомплектування, яке відбувається, коли невідповідний комплект використовується для індивідуальної мітки. Уникнення розукомплектування, в свою чергу, також забезпечує оптимальну ефективність мічення. Більш того, протоколи і стерильні апірогенні речовини, включені в кожний комплект, сприяють зручнішому для використання процесу, тому що тестування стерильності, пірогенності та очищення реагентів після мічення непотрібні. Даний винахід включає комплект для мічення радіоактивною міткою діагностичних або терапевтичних антитіл перед їх введенням пацієнту, який містить принаймні (і) пляшечку, яка містить комплексонкон'юговане антитіло, (іі) пляшечку, яка містить підібраний буфер для стабілізації та введення радіоміченого антитіла, і (ііі) інструкції для мічення антитіла, де названі компоненти в пляшечках поставляються в таких кількостях і таких концентраціях, що коли вони поєднуються з радіоактивною міткою достатньої чистоти і активності, відповідно до інструкцій комплекту, то подальша очистка міченого антитіла не потрібна перед введенням названому пацієнту. Більш того, коли антитіло мітили відповідно до інструкцій комплекту і з радіоізотопом достатньої чистоти і активності, то таке зв'язування ізотопу може сягати рівнів вище, ніж 95% і навіть до 98% або вище. Найкраще, якщо антитіло, включене в комплект, є анти-СD20 антитілом. Антитіло поставляється в формі, де воно є приєднаним до біфункціонального комплексону. Краще, коли антитіло зв'язано з МХ-ДТПК, але можуть бути використані інші комплексони, такі як феніл- або бензил-кон'юговані ДТПК, циклогексилДТПК, похідні EDTA і DOTA. Згідно з даним винаходом, комплексоном може бути будь-який комплексон, який є принаймні біфункціональним, тобто який має принаймні два місця зв'язування (принаймні одне місце для утворення комплексу з іоном металу і принаймні одне місце для з'єднання з білковим лігандом). В залежності від використаного антитіла, кон'юговане антитіло типово поставляється в концентрації від 0,5 до 30мг/мл, найкраще 2мг/мл. Об'єм кон'югованого антитіла буде залежати від концентрації і кількості, які необхідні для оптимального мічення в залежності від радіомітки. Однак кон'юговане антитіло повинно поставлятись в такому об'ємі і концентрації, щоб весь об'єм був доданий до реакційної пляшечки, використовуючи стерильний шприц і асептичну техніку. Це буде передбачати підвищену відтворюваність і легкість використання. Всі реагенти комплекту, описані тут, є стерильними, апірогенними і спеціально спроектовані для простоти і швидкості в просуванні прямо від тестування антитіла до введення. З деякими мітками необхідність тестування ефективності мічення може бути непотрібною. Особливо сприятливим компонентом комплекту є підібраний буфер для стабілізації проти ефектів радіолізу і введення мічених кон'югованих антитіл пацієнту. Підібраний буфер є фармацевтично прийнятним носієм, який служить як розчинником для міченого антитіла, так і буфером введення. Хоча будь-який фармацевтично прийнятний розчинник може бути використаний для введення терапевтичних або діагностичних антитіл пацієнту, підібраний буфер даного винаходу є особливо підходящим для введення мічених радіоактивною міткою антитіл. Наприклад, підібраний буфер даного винаходу містить радіопротектор, такий як людський сироватковий альбумін (ЛСА) або аскорбат, який мінімізує радіоліз від ітрію і в меншій мірі від індію. Інші радіопротектори, відомі в галузі, тобто поглиначі вільних радикалів (феноли, сульфіти, глутатіон, цистеїн, гентизинова кислота, нікотинова кислота, аскорбіл пальмітат, НОР(:О)Н2, гліцерин, натрій формальдегід сульфоксилат, Nа2S2О5, Nа2S2О3, і SO2, та інше) також можуть бути використані в підібраному буфері даного винаходу. Слід зазначити, що в той час, як радіопротектори звичайно використовуються в підібраному буфері для захисту антитіл від радіолізу, можливо, що можна буде впливати на подальший захист включенням радіопротектору також в реакційний буфер. Взагалі цього раніше не робили, наприклад, з ЛСА, через присутність металів, які будуть перешкоджати процесу мічення. Однак використовуючи хелатні смоли, можливо "очистити" ЛСА так, щоб ЛСА міг би бути включеним також і в реакційний буфер. Аскорбат або інші радіопротектори можуть також потребувати обробки для видалення забруднюючих металів. Підібраний буфер даного винаходу також містить надлишок некон'югованого комплексону. Метою включення некон'югованого комплексону є те, що цей комплексон служить для поглинання будь-яких не зв'язаних с білком радіоміток у пацієнта і впливати на виділення радіоміток, таким чином зменшуючи накопичення у кістках пацієнта "остеотропних" ізотопів, тобто 90Y. Наприклад, коли антитіло комплекту кон'юговане з ДТПК комплексоном, надлишок ДТПК або будь-якого іншого комплексону може бути включений в підібраний буфер. Підібраний буфер також найкраще поставляти в такому об'ємі, щоб весь вміст був перенесений в реакційну пляшечку. Як обговорювалось вище, це призводить до підвищеної легкості використання і відтворюваності через те, що точні об'єми не треба відмірювати і переносити. Найкращій підібраний буфер містить забуферений фосфатом або фізіологічний сольовий розчин, людський сироватковий альбумін і ДТПК. Кращою концентрацією людського сироваткового альбуміну є від приблизно 1% до 25% (вага/об'єм), і найкращою - приблизно 7,5% (вага/об'єм). Найкращою концентрацією ДТПК є приблизно 1мМ. Аскорбат може бути використаний як альтернатива людському сироватковому альбуміну і типово використовується в концентрації приблизно від 1 до 100мг/мл. Хоча може бути використаний більш широкий діапазон концентрацій без компромісу щодо безпеки пацієнта. Антитіло комплекту радіомічення легко мітиться обраним радіоактивним ізотопом за допомогою біфункціонального комплексону відповідно до способів даного винаходу. В цьому контексті, для подальшого спрощення комплект даного винаходу може також включати пляшечку, яка містить буфер для регулювання рН розчину радіоізотопу, і стерильну скляну реакційну пляшечку для виконання мічення і після цього для поміщення остаточно міченого антитіла в підібраний буфер. Типово достатньо реакційної пляшечки об'ємом 10мл, але також можуть бути використані пляшечки, які вміщають від 5 до 20мл. Найкращій буфер - це розчин ацетату натрію з низьким вмістом металу в концентрації від 10 до 1000мМ, найкраще 50мМ. Конкретний комплект даного винаходу містить антитіло, кон'юговане з МХ-ДТПК, 2В8-МХ-ДТПК. 2В8 це анти-СD20 антитіло, яке виявило вплив на вичерпання В-клітин при введенні хворим на лімфому. Однак, спеціалісту повинно бути очевидним те, що комплект радіомічення даного винаходу може бути оптимізований для радіомічення інших анти-СD20 антитіл або будь-якого іншого антитіла, яке було кон'юговано з ДТПК або іншим полівалентним комплексоном. Найкращий комплект даного винаходу може містити принаймні (і) пляшечку, яка містить МХ-ДТПК-кон'юговане 2В8 антитіло, в розчині або ліофілізоване (потребує розведення); і (іі) пляшечку, яка містить підібраний буфер для введення радіоміченого антитіла пацієнту. Найкращий комплект буде також містити (ііі) буфер для регулювання рН ізотопу і (iv) реакційну пляшечку. Альтернативно, ще краще, якщо буфер поставляється в реакційній пляшечці, таким чином уникаючи етапу відмірювання і переносу буферу і підвищуючи простоту, послідовність і стерильність компонентів комплекту. Однак, можна собі уявити інші втілення винаходу, тобто де буфер спочатку додають до ізотопної пляшечки і тоді ізотоп з буфером переноситься до реакційної пляшечки. В цьому випадку реакційна пляшечка може бути поставлена з необхідним об'ємом антитіла. Альтернативно, пляшечка ізотоп/буфер може бути зроблена достатньо великою для того, щоб постачати додаток кон'югату антитіла, тобто прямо до пляшечки постачальника. Це дозволило би виключити необхідність реакційної пляшечки. Як описано вище, інша найкраща конфігурація комплекту здійснюється так, що реакційна пляшечка сама по собі містить необхідний об'єм кон'югованого антитіла (тобто, 1 або 1,5мл для 111Іn і 90Y, відповідно). Антитіло може бути поставлено в буфері, що забезпечує підходяще рН радіомічення відповідно до індивідуального бажаного ізотопу (тобто, рН 3-6 для 111Іn, рН 3-5 для 90Υ). В залежності від ізотопу, можуть бути використані різні буфери (тобто, ацетат натрію для 90Υ, цитрат натрію для 111Іn). Склад і рН буферу можуть також змінюватись в залежності від природи ліганду зв'язування, в який необхідно ввести мітку (тобто, мічення пептидів може дозволяти використання