Антидот антикоагулянта

Реферат: Винахід належить до молекули антитіла до антикоагулянта до дабігатрану, і її застосування як антидоту такого антикоагулянта. UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до галузі медицини, насамперед до галузі антикоагулянтної терапії. Інформація про існуючий рівень техніки Антикоагулянти представляють собою субстанції, які попереджають коагуляцію; тобто вони припиняють зсідання крові. Антикоагулянти знайшли широке застосування в терапії людини як лікарський засіб для пов'язаних з тромбоутворенням порушень, наприклад, для попередження первинного й вторинного тромбозу глибоких вен, емболії легеневої артерії, різних видів інфаркту міокарда й "удару" у схильних до таких порушень індивідуумів. Одним з важних класів, призначених для орального введення антикоагулянтів, є сполуки, які діють як антагоністи вітаміну K, до них відносяться, наприклад, кумарини, включаючи варфарин. До другого класу відносяться сполуки, які мають непрямий інгібуючий вплив на коагуляцію, за допомогою кофактора, такого як антитромбін III або кофактор гепарину II. До них відноситься ряд низькомолекулярних похідних гепарину, які каталізують інгібування переважно фактора Xa (і в меншому ступені тромбіну) за допомогою антитромбіну III (беміпарин, сертопарин, далтепарин, еноксапарин, надропарин, парнапарин, ревіпарин, тинзапарин). Олігосахариди з меншою довжиною ланцюга (фондапаринукс, ідрапаринукс) інгібують тільки фактор Xa за допомогою антитромбіну III. Гепариноїди (данапароїд, сулодексид, дерматану сульфат) діють за допомогою обох кофакторів і інгібують як фактор Xa, так і тромбін. Третій клас включає інгібітори коагуляції прямої дії. До інгібіторів фактора Xa прямої дії відносяться апіксабан, едоксабан, отаміксабан, ривароксабан, а до інгібіторів тромбіну прямої дії відносяться двовалентні гірудини (бівалірудин, лепірудин, дезирудин) і одновалентні сполуки аргатробан і дабігатран. Зсідання крові представляє собою біологічний механізм, за допомогою якого припиняється кровотеча, побічною дією антикоагулянтної терапії можуть бути небажані кровотечі. Тому існує необхідність у розробці антидоту, який має здатність припиняти такі пов'язані з застосуванням антикоагулянтів кровотечі у випадку їх виникнення (Zikria і Ansell, Current Opinion in Hematology, 16(5), 2009, сс. 347-356). Одним із шляхів досягнення цього є нейтралізація активності сполукиантикоагулянту, яка є присутньою в організмі пацієнта після його введення. До застосовних у наш час антидотів антикоагулянтів відносяться протамін (для нейтралізації гепарину) і вітамін K, який використовують для нейтралізації антагоністів вітаміну K типу варфарину. Як антидоти, які мають неспецифічну дію застосовували також свіжозаморожену плазму і рекомбінантний фактор VIIa для пацієнтів, які страждають від великої травми або серйозного крововиливу, яких піддавали лікуванню низькомолекулярним гепарином (Lauritzen B. та інш., Blood, 2005, сс. 607A-608A). Існують дані також про використання фрагментів протаміну (патент США № 6624141) і низькомолекулярних синтетичних пептидів (патент США № 6200955) як антидотів гепарину або низькомолекулярного гепарину; і мутеїнів тромбіну (патент США № 6060300) як антидотів інгібітору тромбіну. Опубліковані дані про застосування протромбінових проміжних продуктів і похідних як антидотів гірудину і синтетичних інгібіторів тромбіну (патенти США №№ 5817309 і 6086871). Для прямих інгібіторів фактора Xa були запропоновані як антидоти неактивні аналоги фактора Xa (WO 2009/042962). Крім того, застосовували рекомбінантний фактор VIIa для реверсування впливу непрямих інгібіторів антитромбін III-залежного фактора Xa, таких як фондапаринукс і ідрапаринукс (Bijsterveld N.R. та інш., Circulation, 106, 2002, сс. 2550-2554; Bijsterveld N.R. та інш., British J. of Haematology (124), 2004, сс. 653-658). Обзор методів здійснення реверсії антикоагулянтної дії наведений у Schulman і Bijsterveld, Transfusion Medicine Reviews, 21(1), 2007, сс. 37-48. Таким чином, існує необхідність у розробці покращених антидотів для антикоагулянтної терапії і насамперед у розробці антидотів прямих інгібіторів тромбіну типу дабігатрану, для якого до теперішнього часу не описані специфічні антидоти. Коротке викладення суті винаходу Один з об'єктів даного винаходу відноситься до молекули антитіла, що має здатність нейтралізувати активність антикоагулянту. Згідно з іншим об'єктом винаходу молекула антитіла має здатність специфічно зв'язуватися з антикоагулянтом. Згідно з наступним об'єктом винаходу антикоагулянт представляє собою прямий інгібітор тромбіну, інгібітор фактора Xa або антагоніст вітаміну K. Згідно з наступним об'єктом винаходу антикоагулянт представляє собою дабігатран, аргатробан, мелагатран, ксимелагатран, гірудин, бівалірудин, лепірудин, дезирудин, апіксабан, отаміксабан, едоксабан, ривароксабан, дефібротид, раматробан, антитромбін III або дротрекогін альфа. 1 UA 110470 C2 В наступному варіанті здійснення винаходу антикоагулянт представляє собою дизаміщений біциклічний гетероцикл загальної формули 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 в якій A означає карбонільну або сульфонільну групу, зв'язану з бензогрупою, піридогрупою або тієногрупою групи Het, B означає етиленову групу, в якій метиленова група, зв'язана з групою Ar, може бути заміщена атомом кисню або сірки або -NR1-групою, в якій R1 означає атом водню або C1-С4алкільну групу, E означає RbNH-C(=NH)-групу, в якій Rb означає атом водню, гідроксигрупу, С1-С9алкоксикарбонільну, циклогексилоксикарбонільну, феніл-C1-С3алкоксикарбонільну, бензоїльну, пара-C1С3алкілбензоїльну або піридиноїльну групу, при цьому етоксигрупа в положенні 2 в зазначеній вище С1-С9алкоксикарбонільній групі може бути додатково заміщена C 1-С3алкілсульфонільною або 2-(C1-С3алкокси)етильною групою, Ar означає a 1,4-феніленову групу, необов'язково заміщену атомом хлору або метилом, етилом або метоксигрупою, або означає 2,5-тієніленову групу, Het означає 1-(C1-С3алкіл)-2,5-бензімідазоліленову, 1-циклопропіл-2,5-бензімідазоліленову, 2,5-бензотіазоліленову, 1-(C1-С3алкіл)-2,5-індоліленову, 1-(C1-С3алкіл)-2,5-імідазо[4,5b]піридиніленову, 3-(C1-С3алкіл)-2,7-імідазо[1,2-a]піридиніленову або 1-(C1-С3алкіл)-2,5-тієно[2,3d]імідазоліленову групу і Ra означає R2NR3-групу, в якій R2 означає C1-С4алкільну групу, яка може бути заміщена карбоксигрупою, C 1С6алкілоксикарбонільною, бензилоксикарбонільною, C1-С3алкілсульфоніламінокарбонільною або 1H-тетразол-5-ільною групою, C2-С2алкільну групу, заміщену гідроксигрупою, бензилоксигрупою, карбокси-C1С3алкіламіногрупою, C1-С3алкоксикарбоніл-C1-С3алкіламіногрупою, N-(C1-С3алкіл)карбокси-C1С3алкіламіногрупою або N-(C1-С3алкіл)-C1-С3алкоксикарбоніл-C1-С3алкіламіногрупою, при цьому у вищезазначених групах атом вуглецю в α-положенні по відношенню до сусіднього атому азоту може бути незаміщеним, R3 означає C3-С7циклоалкільну групу, пропаргільну групу, в якій ненасичений фрагмент може бути не зв'язаний безпосередньо з атомом азоту R2NR3-групи, фенільну групу, необов'язково заміщену атомом фтору або хлору, або метильною або метоксигрупою, піразолільну, пиридазолільну або піридинільну групу, необов'язково заміщену метильною групою, або R2 і R3 разом з атомом азоту, що знаходиться між ними, означають 5-7-членну циклоалкіленіміногрупу, необов'язково заміщену карбоксигрупу або C 1-С4алкоксикарбонільну групу, з якій додатково може бути злитим фенільне кільце, його таутомери, стереоізомери і солі. В наступному варіанті здійснення винаходу антикоагулянт представляє собою сполуку, вибрану з групи, яка включає (а) N-феніл-N-(2-карбоксіетил)амід 2-[N-(4-амідинофеніл)амінометил]бензтіазол-5карбонової кислоти, (б) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензтіазол-5-ілкарбонової кислоти, (в) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (г) N-феніл-N-(3-гідроксикарбонілпропіл)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (д) N-(2-піридил)-N-(гідроксикарбонілметил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (е) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[2-(2-амідинотіофен-5іл)етил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ж) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (з) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[2-(4амідинофеніл)етил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (і) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[2-(4-амідинофеніл)етил]бензімідазол5-ілкарбонової кислоти, 2 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (к) N-феніл-N-[2-(1H-тетразол-5-іл)етил]амід 1-метил-2-[2-(4амідинофеніл)етил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (л) N-феніл-N-[2-(1H-тетразол-5-іл)етил]амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (м) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (н) N-(3-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (о) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (п) N-феніл-N-[(N-гідроксикарбонілетил-N-метил)-2-аміноетил]амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (р) N-(3-фторфеніл)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, с) N-(4-фторфеніл)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (т) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідино-2метоксифеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (у) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідино-2метоксифеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ф) N-феніл-N-(2-метоксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]індол-5-ілкарбонової кислоти, (х) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]тієно[2.3-d]імідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ц) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ч) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ш) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідино-2метоксифеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (щ) N-(2-піридил)-N-(2-етоксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-[4-(N-nгексилоксикарбоніламідино)феніл]амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти і їх таутомери, стереоізомери і солі. Наступний об'єкт даного винаходу відноситься до молекули антитіла до дабігатрану, етексилату дабігатрану і/або O-ацилглюкуроніду дабігатрану. Згідно з наступним об'єктом молекула антитіла представляє собою поліклонально антитіло, моноклональне антитіло, людське антитіло, гуманізоване антитіло, химерне антитіло, фрагмент антитіла, насамперед Fab-, Fab’- або F(ab")2-фрагмент, одноланцюгове антитіло, насамперед одноланцюговий варіабельний фрагмент (scFv), доменне антитіло, нанотіло, димерне антитіло (діабоді) або сконструйований білок з анкіриновим повторенням (Designed Ankyrin Repeat Protein, DARPin). Наступний об'єкт даного винаходу відноситься до описаної вище молекули антитіла, призначеної для застосування в медицині. Наступний об'єкт даного винаходу відноситься до описаної вище молекули антитіла, призначеної для застосування в терапії або для попередження побічних дій антикоагулянтної терапії. Згідно з ще одним об'єктом винаходу побічна дія представляє собою випадок кровотечі. Наступний об'єкт даного винаходу відноситься до способу лікування або попередження побічних дій антикоагулянтної терапії, який полягає в тому, що пацієнту, який потребує цього, вводять в ефективній кількості описану вище молекулу антитіла. Наступний об'єкт даного винаходу відноситься до набору, що містить описану вище молекулу антитіла разом з контейнером і етикеткою. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на фіг. 1 – дані, одержані при аналізі на час зсідання, які свідчать про те, що при збільшенні концентрацій дабігатрану відбувається зростання часу зсідання. При використанні концентрації 200нМ час зсідання зростав приблизно у 5 разів у порівнянні з вихідним рівнем, зазначену концентрацію застосовували у першій і другій серії експериментів. В останній серії експериментів застосовували концентрацію 500нМ (надтерапевтична концентрація); на фіг. 2 – дані про те, що всі чотири різних антитіла до дабігатрану (А-Г) нейтралізували 3 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зумовлене дабігатраном збільшення часу зсідання в людській плазмі. Вихідний час зсідання в людській плазмі складав 10,9 с, після попередньої інкубації дабігатрану, узятого в концентрації 200нМ, з плазмою час зсідання зростав до 51 с. Кожне з антитіл додавали до плазми, попередньо інкубованої з дабігатраном, взятим в концентрації 200нМ, і додатково інкубували протягом 5 хв. Потім шляхом додавання тромбіну ініціювали зсідання для визначення тромбінового часу. Кожне антитіло мало різну здатність викликати реверсію впливу дабігатрану на час зсідання. Розчин з найбільшою концентрацією приводив до найбільшої реверсії антикоагулянтної активності; на фіг. 3 – результати вимірювань впливу зростаючих концентрацій поліклонального антитіла (антитіло Г), яке додавали до людської плазми, попередньо інкубованої з дабігатраном, взятим в концентрації 200нМ. Вихідний час зсідання складав 11 с, додавання дабігатрану подовжувало час зсідання до 63,7 с. Потім тестували вплив підвищення ступеня розведення антитіла на зумовлене дабігатраном подовження тромбінового часу зсідання. Найменша концентрація знижувала тромбіновий час зсідання до 43,9 с. Більш високі концентрації викликали повне зниження тромбінового часу зсідання аж до вихідних рівнів і приводили до повної нейтралізації антикоагулянтної дії дабігатрану. Додавання неспецифічного кролячого поліклонального антитіла (позначено квадратом) не мало впливу, який приводить до реверсії антикоагулянтної дії дабігатрану; на фіг. 4 – результати вимірювань впливу зростаючих концентрацій поліклонального антитіла (антитіло Г), доданого до людської плазми, яку попередньо інкубували з дабігатраном, взятим в концентрації 500нМ. Вихідний час зсідання складав 10,9 с, додавання дабігатрану в зазначеній більш високій концентрації подовжувало час зсідання до 111,7 с (~10-кратне збільшення). Застосування антитіла в розведенні 1:2 або у вигляді маточного розчину приводило до реверсії зумовленого дабігатраном подовження тромбінового часу зсідання, ступінь якої залежала від концентрації. Найбільша концентрація також викликала повне зниження тромбінового часу зсідання аж до вихідних рівнів і приводила до повної нейтралізації антикоагулянтної дії навіть при надтерапевтичних концентраціях дабігатрану; на фіг. 5 – послідовності варіабельних областей важких ланцюгів молекули антитіла до дабігатрану; на фіг. 6 - послідовності варіабельних областей легких ланцюгів молекули антитіла до дабігатрану; на фіг. 7 – дані, які демонструють, що мишаче моноклональне антитіло (клон 22) приводить до реверсії антикоагулянтної дії дабігатрану в людській плазмі й людській цілісній крові. Мишаче антитіло додавали в зростаючих концентраціях до людської плазми або цілісної крові, яку попередньо інкубували з дабігатраном, взятим в концентрації 30нМ. Аналіз починали, додаючи 1,5 – 2 од./мл тромбіну і вимірювали час зсідання. Різницю між часом зсідання в присутності сполуки й при його відсутності приймали за 100 % активності дабігатрану. Антитіло інгібувало залежно від дози опосередковане дабігатраном подовження часу зсідання; на фіг. 8 – дані, що демонструють, що мишачий Fab-фрагмент, одержаний з клону 22 антитіла, приводило до реверсії антикоагулянтної дії дабігатрану в людській плазмі. Мишачий Fab-фрагмент додавали в зростаючих концентраціях до людської плазми, яку попередньо інкубували з дабігатраном, взятим в концентрації 7нМ. Як позитивний контроль тестували також інтактне антитіло. Аналіз починали, додаючи 0,4 од./мл тромбіну і вимірювали час зсідання. За 100 %-ний рівень інгібування приймали повну блокаду опосередкованого дабігатраном збільшення часу зсідання. Fab-фрагмент інгібував залежно від дози подовження часу зсідання в людській плазмі, яке індукує дабігатран; на фіг. 9 – дані, що демонструють, що мишаче моноклональне антитіло (клон 22) приводить до реверсії антикоагулянтної дії ацилглюкуроніду дабігатрану в людській плазмі. Мишаче антитіло додавали в зростаючих концентраціях до людської плазми, яку попередньо інкубували з ацилглюкуронідом дабігатрану або дабігатраном, взятими в концентрації 7нМ. Аналіз починали, додаючи 0,4 од./мл тромбіну й вимірювали час зсідання. За 100 %-ний рівень інгібування приймали повну блокаду опосередкованого сполукою збільшення часу зсідання. Антитіло інгібувало залежно від дози подовження часу зсідання в людській плазмі, яке індукує ацилглюкуронід дабігатрану; на фіг. 10 – дані, що демонструють, що гуманізований Fab-фрагмент (Fab 18/15) приводить до реверсії антикоагулянтної дії дабігатрану в людській плазмі. Fab 18/15 додавали в зростаючих концентраціях до людської плазми, яку попередньо інкубували з дабігатраном, взятим в концентрації 7нМ. Аналіз починали, додаючи 0,4 од./мл тромбіну і вимірювали час зсідання. За 100 %-ний рівень інгібування приймали повну блокаду опосередкованого дабігатраном збільшення часу зсідання. Fab-фрагмент інгібував залежно від дози подовження 4 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 часу зсідання в людській плазмі, яке індукує дабігатран; на фіг. 11 – виміряний ex vivo тромбіновий час зсідання цілісної крові (3,0 од./мл тромбіну), взятої у щурів, яким вводили дабігатран шляхом безперервної інфузії і Fab-фрагмент, взятий в еквімолярній кількості, у вигляді болюсної ін'єкції в момент часу t=0. Лінія з суцільними кружками відповідає обробці наповнювачем без лікарського засобу. Лінія з суцільними квадратами відповідає антикоагулянтній активності дабігатрану за відсутності Fab-фрагмента. Лінія з суцільними трикутниками відповідає антикоагулянтній активності після введення Fabфрагмента. Дані представлені у вигляді середніх значень ± С.К.О., n=4 тварин на групу обробки; на фіг. 12 – виміряний ex vivo частковий активований тромбопластиновий час (aPTT) цілісної крові, взятої у щурів, яким вводили дабігатран шляхом безперервної інфузії і Fab-фрагмент, взятий в еквімолярній кількості, у вигляді болюсної ін'єкції в момент часу t=0. Лінія з суцільними кружками відповідає обробці наповнювачем без лікарського засобу. Лінія з суцільними квадратами відповідає антикоагулянтній активності дабігатрану за відсутності Fab-фрагмента. Лінія з суцільними трикутниками відповідає антикоагулянтній активності після введення Fabфрагмента. Дані представлені у вигляді середніх значень ± С.К.О., n=4 тварин на групу обробки; на фіг. 13 – виміряний ex vivo тромбіновий час зсідання цілісної крові (3,0 од./мл тромбіну), взятої у щурів, яким вводили дабігатран шляхом безперервної інфузії і Fab-фрагмент в зростаючих дозах у вигляді болюсної ін'єкції в момент часу t=0. Лінія з суцільними кружками відповідає обробці наповнювачем без лікарського засобу. Лінія з суцільними квадратами відповідає антикоагулянтній активності дабігатрану за відсутності Fab-фрагмента. Лінія з суцільними трикутниками відповідає антикоагулянтній активності після введення Fab-фрагмента в еквімолярній кількості, а штрихова лінія – після введення Fab-фрагмента в кількості, що складає 50 % від еквімолярної дози. Дані представлені у вигляді середніх значень ± С.К.О., n=4 тварин на групу обробки; на фіг. 14 – виміряний ex vivo aPTT цілісної крові, взятої у щурів, яким вводили дабігатран шляхом безперервної інфузії і Fab-фрагмент у зростаючих дозах у вигляді болюсної ін'єкції у момент часу t=0. Лінія з суцільними кружками відповідає обробці наповнювачем без лікарського засобу. Лінія з суцільними квадратами відповідає антикоагулянтній активності дабігатрану за відсутності Fab-фрагмента. Лінія з суцільними трикутниками відповідає антикоагулянтній активності після введення Fab-фрагмента в еквімолярній кількості, а штрихова лінія – після введення Fab-фрагмента в кількості, що складає 50 % від еквімолярної дози. Дані представлені у вигляді середніх значень ± С.К.О., n=4 тварин на групу обробки. Докладний опис винаходу Одним з об'єктів даного винаходу є молекула антитіла, що має здатність нейтралізувати активність антикоагулянту. Антитіла (які називають також імуноглобулінами, скорочено Ig) представляють собою білки з класу гама-глобулінів, які присутні в крові або інших рідинах організму хребетних, вони використовуються імунною системою для ідентифікації й нейтралізації сторонніх об'єктів, таких як бактерії і віруси. Як правило, вони складаються з основних структурних елементів, кожний з яких містить два великі важкі ланцюги й два невеликі легкі ланцюги, які утворюють, наприклад, мономери, що включають один елемент, димери, що включають два елементи, або пентамери, що включають п'ять елементів. Антитіла можуть зв'язуватися за допомогою нековалентної взаємодії з іншими молекулами або структурами, відомими як антигени. Таке зв'язування є специфічним в тому сенсі, що антитіло зв'язується з високою афінністю тільки з певною структурою. Унікальну ділянку антигену, розпізнаваний антитілом, називають епітопом або антигенною детермінантою. Ділянку антитіла, що зв'язується з епітопом, іноді називають паратопом, і він розташований в так званому варіабельному домені або варіабельній області (Fv) антитіла. Варіабельний домен містить три так званих гіперваріабельних ділянки (CDR), розділених каркасними ділянками (FR). В контексті даного винаходу при згадуванні CDR мають на увазі їх визначення, запропоноване Хотіа (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196, 1987, сс. 901–917), а також Кеботом (E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller і H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, вид-во National Institutes of Health, Bethesda, 1983). Крім того, в даній галузі були розроблені інші види антитіл, які стали універсальними "інструментами" в медицині і технології. Так, в контексті даного винаходу поняття "молекула антитіла" і "антитіло" (в даному описі зазначені поняття використовуються взаємозамінними) включають не тільки антитіла, які зустрічаються в природних умовах, які містять, наприклад, два легкі ланцюги і два важкі ланцюги, або тільки два важкі ланцюги, як у представників верблюдячих, але також і всі молекули, що містять щонайменше один паратоп, що має здатність специфічно зв'язуватися з антигеном і структурну схожість з варіабельним доменом 5 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліну. Так, молекула антитіла, що пропонується у винаході, може представляти собою поліклональне антитіло, моноклональне антитіло, людське антитіло, гуманізоване антитіло, химерне антитіло,фрагмент антитіла, зокрема, Fv-, Fab-, Fab’- або F(ab")2-фрагмент, одноланцюгове антитіло, зокрема, одноланцюговий варіабельний фрагмент (scFv), мале модульне імунофармацевтичний засіб (Small Modular Immunopharmaceutical, SMIP), доменне антитіло, нанотіло, димерне антитіло. Поліклональні антитіла представляють собою сукупність молекул антитіл, що мають різні амінокислотні послідовності, і їх можна виділяти з крові хребетних після імунізації антигеном за допомогою добре відомих в даній галузі методів. Моноклональні антитіла (МАт або МоАт) представляють собою моноспецифічні антитіла, що мають ідентичну амінокислотну послідовність. Їх можна одержувати за допомогою технології, яка базується на використанні гібридом з гібридної клітинної лінії (яку називають гібридомою), що представляє собою клон злиття B-клітини, що продукує специфічне антитіло з клітиною мієломи (B-клітинний рак) (Kohler G., Milstein C., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256, 1975, сс. 495-497). В альтернативному варіанті моноклональні антитіла можна створювати шляхом рекомбінантної експресії в клітинах-хазяїнах (Norderhaug L., Olafsen T., Michaelsen T.E., Sandlie I., "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells", J Immunol Methods 204 (1), травень 1997, сс. 77–87; див. також нижче). Для застосування на людині часто бажано знижувати імуногенність антитіл, які мають походження з інших видів, наприклад, з миші. Це можна здійснювати шляхом конструювання химерних антитіл або за допомогою процесу, який називають "гуманізацією". В цьому контексті під "химерним антитілом" мають на увазі антитіло, яке містить частину послідовності (наприклад, варіабельний домен), виведену з одного виду (наприклад, з миші), злиту з частиною послідовності (наприклад, з константними доменами), виведеної з інших видів (наприклад, з людини). Поняття "гуманізоване антитіло" означає антитіло, яке містить варіабельний домен, первинно виведений з виду крім людини, в якому певні амінокислоти піддали мутації для того, щоб вся послідовність зазначеного варіабельного домену стала більш схожою з послідовністю людського варіабельного домену. Методи химерізації і методи гуманізації антитіл є добре відомими в даній галузі (Billetta R, . Lobuglio A.F., "Chimeric antibody", Int Rev Immunol., 10(2-3), 1993, сс. 165-176; Riechmann L., Clark M., Waldmann H., Winter G., "Reshaping human antibody for therapy", Nature, 332, 1988, стор. 323). Крім того, були розроблені технології створення антитіл на основі послідовностей, виведених з людського геному, наприклад, за допомогою фагового дисплею або з використанням трансгенних тварин (WO 90/05144; D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths і G. Winter, "By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage", J.Mol.Biol., 222, 1991, сс. 581-597; Knappik та інш., J. Mol. Biol. 296, 2000, сс. 57-86; S. Carmen і L. Jermutus, "Concepts in antibody phage display", Briefings in Functional Genomics and Proteomics 1(2), 2002, сс. 189-203; Lonberg N, Huszar D., "Human antibodies from transgenic mice". Int Rev Immunol. 1995;13(1), сс. 65-93.; Brüggemann M, Taussig MJ. "Production of human antibody repertoires in transgenic mice", Curr Opin Biotechnol., 8(4), серпень 1997 г., сс. 455-458). В контексті даного винаходу такі антитіла розглядаються як "людські антитіла". Молекули антитіл, які пропонуються в даному винаході, включають також фрагменти імуноглобулінів, які зберігають здатності зв'язуватися з антигеном, такі як Fab-, Fab’- або F(ab")2фрагменти. Такі фрагменти можна одержувати шляхом фрагментації імуноглобулінів, наприклад, за допомогою протеолітичного розщеплення, або шляхом рекомбінантної експресії таких фрагментів. Наприклад, розщеплення імуноглобулінів можна здійснювати за допомогою стандартних методів, наприклад, з використанням папаїну або пепсину (WO 94/29348), або ендопротеїнази Lys-C (Kleemann та інш., Anal. Chem. 80, 2001-2009, 2008). Розщеплення антитіла за допомогою папаїну або Lys-C, як правило, приводить до утворення двох ідентичних антигензв'язувальних фрагментів, так званих Fab-фрагментів, кожний з яких має один антигензв'язувальний сайт, і остаточного Fc-фрагмента. Обробка пепсином приводить до одержання F(ab')2. Методи одержання молекул Fab за допомогою рекомбінантної експресії в клітинах-хазяїнах описані більш докладно нижче. Був розроблений цілий ряд технологій вбудовування варіабельних доменів імуноглобулінів або молекул, виведених з таких варіабельних доменів, в різні молекулярні конструкції. В контексті даного винаходу їх також слід розглядати як "молекули антитіл". В цілому, такі молекули антитіл мають менший розмір у порівнянні з імуноглобулінами, і вони можуть містити 6 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один амінокислотний ланцюг або можуть складатися з декількох амінокислотних ланцюгів. Наприклад, одноланцюговий варіабельний фрагмент (scFv) представляє собою злиття варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів імуноглобулінів, які пов'язані один з іншим за допомогою короткого лінкера, як правило, серину (S) або гліцину (G) (WO 88/01649; WO 91/17271; Huston та інш., International Reviews of Immunology, том 10, 1993, сс. 195-217). "Однодоменні антитіла" або "нанотіла" несуть антигензв'язувальний сайт в одному Ig-подібному домені (WO 94/04678; WO 03/050531, Ward та інш., Nature, 341(6242), 12 октября 1989 г., сс. 544-546; Revets та інш., Expert Opin Biol Ther. 5(1), 2005, сс. 111-124). Можна поєднувати разом одно або декілька однодоменних антитіл, що мають специфічність відносно зв'язування одного і того ж антигену або різних антигенів. Димерні антитіла представляють собою двохвалентні молекули антитіл, які складаються з двох амінокислотних ланцюгів, що містять два варіабельних домени (WO 94/13804, Holliger та інш., Proc Natl Acad Sci U S A., 90(14), 15 липня 1993 г., сс. 6444-6448). Іншими прикладами антитіло-подібних молекул є антитіла з суперродини імуноглобулінів (IgSF; Srinivasan і Roeske, Current Protein Pept. Sci., 6(2), 2005, сс. 185-196). Інша концепція приводить до одержання так званих малих модульних фармацевтичних засобів (SMIP), які містять Fv-домен, зв'язаний з одноланцюговими шарнірним і ефекторним доменами, без константного домену CH1 (WO 02/056910). Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла, що пропонується у винаході, може мати тільки віддалену структурну схожість з варіабельним доменом імуноглобуліну або зовсім не мати такої схожості, але при цьому мати певну специфічність й афінність зв'язування, порівняні з відповідними характеристиками варіабельного домену імуноглобуліну. Такі неімуноглобулінові "міметики антитіла", які іноді називають "каркасними білками", можуть базуватися на генах білка A, ліпокалинах, домені фібронектину, домені консенсусного анкіринового повторення й тіоредоксині (Skerra, Current Opinion in Biotechnology, 18(4), 2007, сс. 295-304). В контексті даного винаходу переважними є сконструйовані білки з анкіриновим повторенням (DARPin; Steiner та інш., J Mol Biol., 382(5), 24 октября 2008 г., сс. 1211-1227; Stumpp M.T., Amstutz P., Curr Opin Drug Discov Devel., 10(2), березень 2007 г., сс. 153-159). Молекула антитіла може бути злитою (у вигляді злитого білка) або іншим чином зв'язана (за допомогою ковалентних або нековалентних зв'язків) з іншими молекулярними конструкціями, які мають потрібний вплив на властивості молекули антитіла. Наприклад, може виявитися бажаним покращувати фармакокінетичні властивості молекул антитіла, стабільність, наприклад, в загальній воді організму, такої як кров, насамперед, у випадку одноланцюгових антитіл або доменних антитіл. З цією метою був розроблений цілий ряд технологій, призначених, зокрема, для подовження часу напівжиття таких молекул антитіл у кровотоці, наприклад, пегілування (WO 98/25971; WO 98/48837; WO 2004081026), злиття або в іншому варіанті ковалентне приєднання молекули антитіла до іншої молекули антитіла, яка має афінність до сироваткового білка, такого як альбумін (WO 2004041865; WO 2004003019), або експресія молекули антитіла у вигляді злитого білка, який включає цілком сироватковий білок, такий як альбумін або трансферин, або його частину (WO 01/79258). Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла має здатність специфічно зв'язуватися з антикоагулянтом. Поняття "специфічність зв'язування" означає, що молекула антитіла має істотно більшу афінність до зв'язування з антикоагулянтом, ніж зі структурно неспорідненими молекулами. Афінність представляє собою характеристику взаємодії між одним антигензв'язувальним сайтом на молекулі антитіла і одним епітопом. Її виражають у вигляді константи асоціації KA=kass/kdiss, або константи дисоціації KD=kdiss/kass. Відповідно до одного з об'єктів винаходу афінність зв'язування антитіла з антикоагулянтом, яку визначають, наприклад, методом поверхневого плазмонного резонансу (Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics", Curr Opin Immunol., 5(2), апрель 1993 г., сс. 282-286), характеризується величиною KD, яка складає від 0,1пМ до 100мкМ, переважно від 1пМ до 100мкМ, переважно від 1пМ до 1мкМ. Афінність антитіла можна оцінювати також за допомогою кінетичного аналізу виключення (Kinetic Exclusion Assay, KinExA, см. Darling R.J. і Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions", ASSAY and Drug Development Technologies, 2(6), декабрь 2004 г., сс. 647-657). Афінність зв'язування молекули антитіла можна підвищувати за допомогою процесу, відомого як дозрівання афінності (Marks та інш., Biotechnology 10, 1992, сс. 779-783; Barbas та інш., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91, 1994, сс. 3809-3813; Shier та інш., Gene 169, 1995, сс. 147155). Антитіла з дозрілою афінністю також підпадають під обсяг даного винаходу. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла має здатність нейтралізувати 7 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 активність антикоагулянту. Це означає, що після зв'язування з молекулою антитіла антикоагулянт втрачає здатність проявляти свою антикоагулянтну активність або проявляє зазначену активність в значно меншому ступені. Переважно після зв'язування з антитілом антикоагулянтна активність знижується щонайменше у 2, 5, 10 або 100 разів за даними аналізу активності, придатного для конкретного антикоагулянту, насамперед аналізу зсідання, чутливого до тромбіну, такого як аналіз екаринового часу зсідання або тромбінового часу зсідання (H. Bounameaux, Marbet G.A., Lammle B. та інш., "Monitoring of heparin treatment. Comparison thrombin time, activated partial thromboplastin time, and plasma heparin concentration, and analysis of the behavior of antithrombin III". American Journal of Clinical Pathology, 74(1), 1980, сс. 68-72). Для одержання молекул антитіл, що пропонуються у винаході, спеціаліст в даній галузі може вибрати будь-який з цілого ряду методів, відомих в даній галузі (Norderhaug та інш., J Immunol Methods, 204 (1), 1997, сс. 77–87; Kipriyanow and Le Gall, Molecular Biotechnology 26, 2004, сс. 39-60; Shukla і інш., J. Chromatography B, 848(1), 2007, сс. 28-39). Як зазначено вище, антикоагулянти є добре відомими в даній галузі. Згідно з ще одним об'єктом винаходу антикоагулянт представляє собою прямий інгібітор тромбіну, інгібітор фактору Xa або антагоністу вітаміну K. Прикладами антагоністів вітаміну K є кумарини, до яких відноситься варфарин. Прикладами непрямих інгібіторів переважно фактору Xa є субстанції гепаринової групи, які діють за допомогою активації антитромбіну III, вони включають низку низькомолекулярних гепаринових похідних (беміпарин, сертопарин, далтепарин, еноксапарин, надропарин, парнапарин, ревіпарин, тинзапарин), певні олігосахариди (фондапаринукс, ідрапаринукс), гепаринoїди (данапароїд, сулодексид, дерматан сульфат) і прямі інгібітори фактору Xa (апіксабан, отаміксабан, ривароксабан). Прикладами інгібіторів тромбіну є двохвалентні гірудини (бівалірудин, лепірудин, дезирудин) і одновалентні сполуки аргатробан і дабігатран. Так, згідно з наступним об'єктом винаходу антикоагулянт представляє собою дабігатран, аргатробан, мелагатран, ксимелагатран, гірудин, бівалірудин, лепірудин, дезирудин, апіксабан, едоксабан, отаміксабан, ривароксабан, дефібротид, раматробан, антитромбін III або дротрекогін альфа. В наступному варіанті здійснення винаходу антикоагулянт представляє собою дизаміщений біциклічний гетероцикл загальної формули в якій A означає карбонільну або сульфонільну групу, зв'язану з бензогрупою, піридогрупою або тієногрупою групи Het, B означає етиленову групу, в якій метиленова група, зв'язана з групою Ar, може бути заміщена атомом кисню або сірки або -NR1-групою, в якій R1 означає атом водню або C1-С4алкільну групу, E означає RbNH-C(=NH)-групу, в якій Rb означає атом водню, гідроксигрупу, С1-С9алкоксикарбонільну, циклогексилоксикарбонільну, феніл-C1-С3алкоксикарбонільну, бензоїльну, пара-C1С3алкілбензоїльну або піридиноїльну групу, при цьому етоксигрупа в положенні 2 в зазначеній вище С1-С9алкоксикарбонільній групі може бути додатково заміщена C 1-С3алкілсульфонільною або 2-(C1-С3алкокси)етильною групою, Ar означає 1,4-феніленову групу, необов'язково заміщену атомом хлору або метилом, етилом або метоксигрупою, або означає 2,5-тієніленову групу, Het означає 1-(C1-С3алкіл)-2,5-бензімідазоліленову, 1-циклопропіл-2,5-бензімідазоліленову, 2,5-бензотіазоліленову, 1-(C1-С3алкіл)-2,5-індоліленову, 1-(C1-С3алкіл)-2,5-імідазо[4,5b]піридиніленову, 3-(C1-С3алкіл)-2,7-імідазо[1,2-a]піридиніленову або 1-(C1-С3алкіл)-2,5-тієно[2,3d]імідазоліленову групу і Ra означає R2NR3-групу, в якій R2 означає C1-С4алкільну групу, яка може бути заміщена карбоксигрупою, C 1С6алкілоксикарбонільною, бензилоксикарбонільною, C1-С3алкілсульфоніламінокарбонільною або 1H-тетразол-5-ільною групою, C2-С2алкільну групу, заміщену гідроксигрупою, бензилоксигрупою, карбокси-C1С3алкіламіногрупою, C1-С3алкоксикарбоніл-C1-С3алкіламіногрупою, N-(C1-С3алкіл)карбокси-C1С3алкіламіногрупою або N-(C1-С3алкіл)-C1-С3алкоксикарбоніл-C1-С3алкіламіногрупою, при цьому в вищезазначених групах атом вуглецю в α-положенні по відношенню до сусіднього атому азоту може бути незаміщеним, 8 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 R3 означає C3-С7циклоалкільну групу, пропаргільну групу, в якій ненасичений фрагмент може бути не зв'язаний безпосередньо з атомом азоту R2NR3-групи, фенільну групу, необов'язково заміщену атомом фтору або хлору, або метильною або метоксигрупою, піразолільну, пиридазолільну або піридинільну групу, необов'язково заміщену метильною групою, або R2 і R3 разом з атомом азоту, що знаходиться між ними, означають 5-7-членну циклоалкіленіміногрупу, необов'язково заміщену карбоксигрупу або C 1-С4алкоксикарбонільну групу, з якій додатково може бути злитим фенільне кільце, його таутомери, стереоізомери і солі. Сполуки формули (I), їх одержання і застосування як антикоагулянтів описано в WO 98/37075. В наступному варіанті здійснення винаходу антикоагулянт представляє собою сполуку, вибрану з групи, яка включає (а) N-феніл-N-(2-карбоксіетил)амід 2-[N-(4-амідинофеніл)амінометил]бензтіазол-5карбонової кислоти, (б) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензтіазол-5-ілкарбонової кислоти, (в) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (г) N-феніл-N-(3-гідроксикарбонілпропіл)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (д) N-(2-піридил)-N-(гідроксикарбонілметил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (е) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[2-(2-амідинотіофен-5іл)етил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ж) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (з) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[2-(4амідинофеніл)етил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (і) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[2-(4-амідинофеніл)етил]бензімідазол5-ілкарбонової кислоти, (к) N-феніл-N-[2-(1H-тетразол-5-іл)етил]амід 1-метил-2-[2-(4амідинофеніл)етил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (л) N-феніл-N-[2-(1H-тетразол-5-іл)етил]амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (м) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (н) N-(3-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (о) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідинофеніл)-Nметиламінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (п) N-феніл-N-[(N-гідроксикарбонілетил-N-метил)-2-аміноетил]амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (р) N-(3-фторфеніл)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, с) N-(4-фторфеніл)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (т) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідино-2метоксифеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (у) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідино-2метоксифеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ф) N-феніл-N-(2-метоксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]індол-5-ілкарбонової кислоти, (х) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]тієно[2.3-d]імідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ц) N-феніл-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ч) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, (ш) N-(2-піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4-амідино-2метоксифеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти, 9 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 (щ) N-(2-піридил)-N-(2-етоксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-[4-(N-nгексилоксикарбоніламідино)феніл]амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти і їх таутомери, стереоізомери і солі, які всі описані в WO 98/37075. В контексті даного винаходу переважним антикоагулянтом є дабігатран (CAS 211914-51-1, N-[2-(4-амідинофеніламінометил)-1-метил-1H-бензімідазол-5-ілкарбоніл]-N-(2-піридил)бетааланін), який має хімічну формулу (II): Дабігатран описаний у WO 98/37075, в якій заявлені сполуки, що мають інгібуючу дію відносно тромбіну і дію, яка призводить до збільшення тромбінового часу, під назвою N-(2піридил)-N-(2-гідроксикарбонілетил)амід 1-метил-2-[N-(4амідинофеніл)амінометил]бензімідазол-5-ілкарбонової кислоти (див. також Hauel та інш., J Med Chem, 45 (9), 2002, сс. 1757-1766. Дабігатран застосовують у вигляді проліків формули (III): Сполука формули III (яку називають дабігатрану етексилатом, CAS 211915-06-9; етил-3-[(2{[4-(гексилоксикарбоніламіноімінометил)феніламіно]метил}-1-метил-1H-бензімідазол-5карбоніл)піридин-2-іламіно]пропіонат) перетворюється на активну сполуку (II) після надходження до організму. Переважним поліморфом дабігатрану етексилату є мезилат дабігатрану етексилату. Основними показниками для застосування дабігатрану є післяопераційне попередження тромбозу глибоких вен, лікування розвинутого тромбозу глибоких вен і попередження "ударів" у пацієнтів, які страждають на миготливу аритмію (Eriksson та інш., Lancet, 370 (9591), 2007, сс. 949-956; Schulman S. та інш., N Engl J Med, 361 (24), 2009, сс. 2342-2352; Connolly S. та інш., N Engl J Med, 361 (12), 2009, сс. 1139-1151; Wallentin та інш., Lancet, 376 (9745), 2010, сс. 975-983). В організмі людини основним характерним для людини шляхом метаболізму дабігатрану є глюкуронування карбоксилатного фрагмента (Ebner та інш., Drug Metab. Dispos., 38(9), 2010, сс. 1567-1575). Вона приводить до утворення 1-O-ацилглюкуроніду (бета-аномер). 1-Oацилглюкуронід крім того, що він в невеликих кількостях перетворюється в результаті гідролізу на аглікон, може піддаватися ацільній міграції в результаті неферментативної реакції у водному розчині, в результаті чого відбувається утворення 2-O-, 3-O- і 4-O-ацилглюкуронідів. Експерименти з очищеним 1-O-ацилглюкуронідом і його одержаними шляхом перегрупування ізомерними похідними дозволили встановити, що вони викликають приблизно однакове подовження часткового активованого тромбопластинового часу у порівнянні з подовженням, яке викликається дабігатраном. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла зв'язується і з дабігатраном, і з дабігатрану етексилатом. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла зв'язується і з дабігатраном, і з Oацилглюкуронідами дабігатрану, насамперед з 1-O-ацилглюкуронідом дабігатрану. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла зв'язується також і з 2-O-, 3-O- і 4O-ацилглюкуронідами дабігатрану. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла має здатність нейтралізувати активність дабігатрану і O-ацилглюкуронідов дабігатрану, насамперед 1-O-ацилглюкуроніду дабігатрану. 10 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла молекула має здатність специфічно зв'язуватися з дабігатраном і містить послідовності CDR, представлені на фіг. 5 і фіг. 6. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність CDR важкого ланцюга, представлену на фіг. 5, і послідовність CDR легкого ланцюга, представлену на фіг. 6. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням DBG 13 VH, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням DBG 13 VK. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням DBG 14 VH, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням DBG 14 VK. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням DBG 22 VH, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням DBG 22 VK. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням Eng VH№ 14, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням Eng VK№ 11. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням Eng VH№ 15, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням Eng VK№ 17. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням Eng VH№ 15, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням Eng VK№ 18. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить послідовність варіабельної області важкого ланцюга, представлену на фіг. 5 під позначенням Eng VH№ 31, і послідовність варіабельної області легкого ланцюга, представлену на фіг. 6 під позначенням Eng VK№ 18. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла має здатність специфічно зв'язуватися з дабігатраном і містить варіабельну область важкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 2, CDR2 має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, і CDR3 має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10, і варіабельну область легкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 і SEQ ID NO: 13, CDR2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14, і CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 15. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, CDR2 має послідовність, вибрану з SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8, CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 10, і варіабельну область легкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 13, CDR2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14, і CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 15. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, CDR2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 7, CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 10, і варіабельну область легкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 13, CDR2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14, і CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 15. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 1, CDR2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 5, CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 10, і варіабельну область легкого ланцюга, в якій CDR1 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 11, CDR2 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 14, і CDR3 має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 15. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, що має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NO: 16, 18, 20, 22, 24 і 26, варіабельну область легкого ланцюга, що має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NО: 17, 19, 21, 23, 25 і 27. 11 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 16, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 17. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 18, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 19. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 20, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 21. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 22, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 23. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 24, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 25. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 24, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 27. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NO: 26, і варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якого представлена в SEQ ID NО: 27. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою молекулу scFv. В молекулі цього формату варіабельні області, заявлені в даному описі, можуть бути злитими одна з іншою за допомогою придатного лінкерного пептиду, наприклад, який має послідовність, вибрану з групи, яка включає SEQ ID NО: 28, 29, 30 і 31. Конструкція може містити зазначені елементи, розташовані в напрямку від N-кінця до C-кінця в наступному порядку: (варіабельна область важкого ланцюга)-(лінкерний пептид)-(варіабельна область легкого ланцюга), або (варіабельна область легкого ланцюга)-(лінкерний пептид)-(варіабельна область важкого ланцюга). Згідно з іншим об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою молекулу scFv, яка містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 32 або SEQ ID NO: 33. Згідно з іншим об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою молекулу scFv, що має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 32 або SEQ ID NO: 33. В даній галузі є відомими методи, за допомогою яких можна здійснювати рекомбінантну експресію нуклеїнових кислот, що кодують scFv-конструкції, в клітинах-хазяїнах (таких як клітини E. coli, Pichia pastoris або лінії клітин ссавців, наприклад, CHO або NS0), з одержанням функціональних молекул scFv (см., наприклад, Rippmann та інш., Applied and Environmental Microbiology, 64(12), 1998, сс. 4862-4869; Yamawaki та інш., J. Biosci. Bioeng., 104(5), 2007, сс. 403-407; Sonoda та інш., Protein Expr. Purif., 70(2), 2010, сс. 248-253). Зокрема, пропоновані у винаході молекули антитіла в форматі scFv можна одержувати наступним чином. Можна здійснювати експресію конструкцій в різних штамах E. coli, таких як W3110, TG1, BL21, BL21(DE3), HMS174, HMS174(DE3), MM294, під контролем індуцибельного промотору. Такий промотор можна вибирати з групи, яка включає lacUV5, tac, T7, trp, trc, T5, araB. Переважними середовищами для культивування є середовища, докладно описані у Wilms з співавторами, 2001 (Wilms та інш., Biotechnology and Bioengineering, 73(2), 2001, сс. 95-103), DeLisa з співавторами, 1999 (DeLisa та інш., Biotechnology and Bioengineering, 65(1), 1999, сс. 54-64), або еквівалентні до них середовища. Однак може виявитися доцільним вносити в партії середовища і/або в підживлювальне середовище добавки у вигляді амінокислот, таких як ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, треонін, триптофан і валін, або складні компоненти середовища, такі як соєвий пептон або дріжджовий екстракт. Процес ферментації здійснюють в режимі періодичної дії з підживленням. Умови: температура 20 – 40 °C, pH 5,5 – 7,5, DO підтримують на рівні вище 20 %. Після поглинання вихідного джерела вуглецю культуру підживлюють зазначеними вище підживлювальними середовищами (або еквівалентними середовищами). Коли концентрація сухої клітинної маси в ферментері досягає 40-100 г/л, культуру індукують за допомогою придатного індуктора, який відповідає використовуваній системі промоторів (наприклад, ІПТГ, лактоза, арабіноза). Індукцію можна здійснювати або у вигляді імпульсної повної індукції, або у вигляді часткової індукції, підживлюючи ферментер відповідним індуктором протягом тривалого періоду часу, або можна використовувати комбінацію обох підходів. Фаза виробництва повинна тривати протягом щонайменше 4 ч. Клітини виділяють центрифугуванням з використанням роторних центрифуг, трубчастих 12 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 роторних центрифуг або центрифуг з конічними переділами в роторі, клітинний супернатант відкидають. Клітинну масу E. coli ресуспендують у взятому в 4-8-кратній кількості буфері для лізису (фосфатний або Трис-буфер, pH 7-8,5). Лізис клітин переважно здійснюють шляхом гомогенізації при підвищеному тиску, після чого дебрис виділяють центрифугуванням з використанням роторних центрифуг, трубчастих роторних центрифуг або центрифуг з конічними переділами в роторі. Дебрис, який включає тільця включення, що містять scFv, відмивають 2-3 рази за допомогою 20мМ Трис, 150мМ NaCl, 5 мМ ЕДТК, 2М сечовини, 0,5 % Тритон X-100, pH 8,0, після чого здійснюють дві стадії відмивання за допомогою 20мМ Трис, 150мМ NaCl, 5 мМ ЕДТК, pH 8,0. На завершення виділяють тільця включення, що містять scFv, шляхом центрифугування з використанням роторних, трубчастих роторних центрифуг або центрифуг з конічними переділами в роторі. Солюбілізацію тілець включення, що містять scFv, можна здійснювати в суміші, що містить 100мМ гліцин/NaOH, 5 мМ ЕДТК, 20мМ дитіотреїтол, pH 9,510,5, яка включає хаотропні агенти, такі як 6М гуанідин-HCl або 8-10мМ сечовина. Після інкубації протягом 30-60 хв розчин центрифугують і виділяють супернатант, який містить цільовий білок, для здійснення наступного рефолдингу. Рефолдінг переважно здійснюють в режимі періодичного завантаження з підживленням шляхом розведення розчину білка у співвідношенні 1:10-1:50 в буфері для рефолдингу до досягнення кінцевої концентрації білка, що складає 0,1-0,5 мг/мл. Буфер для рефолдингу може містити 50-100мМ Трис і/або 50-100мМ гліцин, 50-150мМ NaCl, 1-3M сечовину, 0,5-1M аргінін, 2-6мМ редокс-систему, таку, наприклад, як пара цистеїн/цистин або окиснений/відновлений глутатіон, pH 9,5-10,5. Після інкубації протягом 24-72 год. при 4 °C розчин для рефолдингу необов'язково фільтрують з використанням 0,22 мкм фільтру, розводять і доводять значення pH до pH 7,0-8,0. Білок виділяють за допомогою катіонообмінної хроматографії в режимі зв'язування (наприклад, з TM використанням Toyopearl GigaCap S-650M, SP сефарози FF або S HyperCel ) при pH 7,0-8,5. Елюцію здійснюють з використанням лінійно зростаючого градієнта NaCl. Фракції, що містять цільовий білок, об'єднують і потім розділяють на аніонообмінній колонці в незв'язувальному TM режимі (наприклад, з використанням Toyopearl GigaCap Q-650M, Q-сефарози FF, Q HyperCel ), після чого здійснюють стадію катіонообмінної доочищення (личкування) (наприклад, з використанням SP сефарози HP). Фракції, які містять цільовий білок з рівнем чистоти, що складає як мінімум 90 %, об'єднують і піддають діафільтрації або гель-фільтрації в ЗФР. Ідентичність і якість продукту, що представляє собою одержану молекулу scFv, аналізують за допомогою ДСН-ПААГ у відновлювальних умовах, при цьому scFv можна виявляти в основній смузі, відповідній приблизно 26 кДа. Додатковий аналіз з метою характеризації scFv можна здійснювати за допомогою мас-спектрометрії, °F-РХВР і ГФ-РХВР. Згідно з наступним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою імуноглобулін, переважно імуноглобулін ізотипу IgG1 або його варіант з "вимкненою" ефекторною функцією, або ізотипу IgG4. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою імуноглобулін, важкий ланцюг якого містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40 або SEQ ID NO: 42, і легкий ланцюг містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 35 або SEQ ID NO: 43. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою імуноглобулін, важкий ланцюг якого містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 34, і легкий ланцюг містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 35, або важкий ланцюг містить послідовність, представлену SEQ ID NO: 40, і легкий ланцюг містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 35. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою імуноглобулін, важкий ланцюг якого містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 42, і легкий ланцюг містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 43. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою імуноглобулін, важкий ланцюг якого складається з послідовності, представленої в SEQ ID NO: 34, і легкий ланцюг складається з послідовності, представленої в SEQ ID NO: 35, або важкий ланцюг складається з послідовності, представленої в SEQ ID NO: 40, і легкий ланцюг складається з послідовності, представленої в SEQ ID NO: 35. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою імуноглобулін, важкий ланцюг якого складається з послідовності, представленої в SEQ ID NO: 42, і легкий ланцюг складається з послідовності, представленої в SEQ ID NO: 43. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab. В конструкції такого формату кожна з описаних вище варіабельних областей може бути злитою з константною областю імуноглобуліну, переважно людського походження. Так, варіабельна область важкого ланцюга може бути злитою з CH1-доменом (так званий Fd-фрагмент), а 13 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіабельна область легкого ланцюга може бути злитою з CL-доменом. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, яка має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 36 або SEQ ID NO: 38, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37 або SEQ ID NO: 39. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, який має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 36, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, який має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 38, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 39. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, який має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 41, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, який має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 36, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, який має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 38, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 39. Згідно з ще одним об'єктом винаходу молекула антитіла представляє молекулу Fab, який має Fd-фрагмент, який містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 41, і легкий ланцюг, що містить послідовність, представлену в SEQ ID NO: 37. Нуклеїнові кислоти, які кодують Fab-конструкції, можна застосовувати для експресії як важких, так і легких ланцюгів в клітинах-хазяїнах, таких як клітини E. coli, Pichia pastoris або лінії клітин ссавців (наприклад, CHO або NS0). В даній галузі є відомими методи, які дозволяють здійснювати правильне укладання, асоціацію і дисульфідне зв'язування зазначених ланцюгів з одержанням функціональних Fab-молекул, що містять Fd-фрагмент і легкий ланцюг (Burtet та інш., J. Biochem., 142(6), 2007, сс. 665-669; Ning та інш., Biochem. Mol. Biol., 38, 2005, сс. 204299; Quintero-Hernandez та інш., Mol. Immunol., 44, 2007, сс. 1307-1315; Willems та інш., J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.,786, 2003, сс. 161-176). Зокрема, Fab-молекули, пропоновані у винаході, можна одержувати в CHO-клітинах наступним чином. CHO-DG44-клітини (Urlaub G., Kas E., Carothers A.M. і Chasin L.A., Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locus from cultured mammalian cells, Cell 33, 1983, сс. 405-412), вирощені у вигляді суспензійної культури в безсироватковому середовищі, трансфектують експресійними конструкціями, що кодують важкий і легкий ланцюги Fab-молекули, з використанням реагенту Lipofectamine™ і Plus™ (фірма Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. Через 48 год. здійснюють селекцію клітин в середовищі, що містить антибіотик G418 в концентрації 200 мкг/мл і що не містить гипоксантин і тимідин, одержуючи популяції стабільно трансфектованих клітин. Потім здійснюють ампліфікацію генів зазначених стабільних трансфектантів шляхом додавання в культуральне середовище метотрексату (MTX) в зростаючих концентраціях (аж до 100 або 400 нМ). Після адаптації клітин їх піддають ферментації в режимі періодичного процесу з підживленням протягом 10-11 днів, в результаті чого одержують білковий продукт у форматі Fab. Суспензійні культури CHO-DG44-клітин і їх стабільні трансфектанти інкубують в безсироваткових середовищах для культивування, які мають певний хімічний склад. Здійснюють пересівання зародкових маточних культур через кожні 2-3 дні з густинами посіву, що складають 5 5 3 ×10 –2 × 10 клітин/мл відповідно. Клітини вирощують у струшуваних колбах в інкубаторах типу Multitron HT (фірма Infors) в атмосфері, що містить 5 % CO2, при 37 °C і 120 об./хв. Для експериментів, що проводять в режимі періодичного процесу з підживленням, клітини 5 висівають в концентрації 3 × 10 клітин/мл у струшувані колби у середовище для одержання продукту, ке є власністю фірми BI, яке не містить антибіотики або MTX. Культури перемішують при 120 об./хв. при 37 °C в атмосфері, що містить 5 % CO2, потім у міру збільшення кількості клітин його концентрацію знижують до 2 %. Параметри культури, що включають кількість клітин, життєздатність, значення pH, концентрації глюкози і лактату, визначають щодня і при необхідності регулюють за допомогою карбонату значення pH, підтримуючи його на рівні pH 7,0. Через кожні 24 год. додають підживлювальний розчин, що є власністю фірми BI. В різні моменти часу беруть зразки супернатанту для визначення методом ELISA концентрації продукту, що представляє собою Fab. Через 10-11 днів рідину, що містить клітинну культуру збирають центрифугуванням і передають до лабораторії, які займаються очищенням. Fab-молекулу очищують від супернатанту культур, вирощених в режимі періодичного процесу з підживленням, за допомогою хроматографії і фільтрації. Як первинну захоплюючу стадію застосовують афінну хроматографію, наприклад, на білку G або білку L. В 14 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 альтернативному варіанті, у випадку низьких афінностей зв'язування і невеликих масштабів виробництва, захоплення Fab здійснюють за допомогою катіонообмінної хроматографії (CEX) на основі величини pI молекули. Білки, що походять з клітин-хазяїв, і домішки, наприклад, ДНК або віруси, видаляють за допомогою додаткових ортогональних стадій очищення. Ідентичність і якість продукту, що представляє собою одержану Fab-молекулу, аналізують за допомогою електрофоретичних методів, наприклад, ДСН-ПААГ, за допомогою яких Fab можна виявляти у вигляді однієї основної смуги, яка відповідає приблизно 50 кДа. Іншими методами аналізу, які можна застосовувати для характеризації продукту, що представляє собою Fab, можуть служити мас-спектрометрія, ізоелектричне фокусування і гель-фільтрація. Зв'язувальну активність визначають за допомогою BIAcore-аналізу. Кількісне визначення Fab або повнорозмірних молекул IgG в супернатанті клітинних культур здійснюють за допомогою сендвич-варіанту твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Повнорозмірний IgG можна виявляти з використанням антитіл до людського Fc-фрагменту (фірма Jackson Immuno Research Laboratories) і до людського легкого капа-ланцюга (кон'югованих з пероксидазою, фірма Sigma). Fab-фрагмент імобілізують за допомогою козиного поліклонального антитіла до людського IgG (H і L, фірма Novus) і виявляють за допомогою овечих поліклональних антитіл до людського IgG (кон'югованих з пероксидазою, фірма The Binding Site). Fab-молекули можна створювати також з повнорозмірних молекул антитіл шляхом ферментативного розщеплення. Перевага такого підходу полягає в тому, що в цьому випадку можна застосовувати процеси надійної та ефективної ферментації й очищення, які служать придатною платформою для підвищення масштабу виробництва і досягнення високих виходів при потрібній якості продукту. Для очищення можна застосовувати афінну хроматографію з використанням смоли, що містить рекомбінантний білок A, як первинну захоплювальну стадію, яка, як правило, дозволяє досягати високого ступеня чистоти. Для цієї мети Fab послідовності, які кодують важкий ланцюг зливають з Fc-областю молекули людського антитіла у вигляді IgG. Потім утвореними експресійними конструкціями трансфектують CHO-DG44-клітини, які вирощують у вигляді суспензійної культури в безсироватковому середовищі, за допомогою ліпофекції. Через 48 год. здійснюють селекцію клітин в середовищі, яке містить антибіотик G418 в концентрації 200 мкг/мл, і не яке містить гипоксантин і тимідин, в результаті чого одержують популяції стабільно трансфектованих клітин. Потім здійснюють ампліфікацію генів зазначених стабільних трансфектантів шляхом додавання в культуральне середовище метотрексату (MTX) в зростаючих концентраціях (аж до 100 або 400нМ). Після адаптації клітин їх піддають ферментації в режимі періодичного процесу з підживленням протягом 10-11 днів, в результаті чого одержують білковий продукт у форматі IgG. Білок IgG очищують з супернатанту культури за допомогою афінної хроматографії з використанням рекомбінантного білка A. Потім для одержання потрібного Fab-фрагмента, який має нейтралізуючу здатність, здійснюють інкубацію повнорозмірного IgG в присутності папаїну, який розщеплює IgG в шарнірній області, в результаті чого вивільняються два Fab-фрагменти і Fc-фрагмент. Прикладом Fab-молекули, яку можна одержувати шляхом розщеплення папаїном повнорозмірного білка IgG, може служити Fab-молекула, яка містить Fd-ланцюг, послідовність якої представлена в SEQ ID NO: 41. Fab-молекулу виділяють за допомогою афінної хроматографії, наприклад, з використанням білка G або білка L. В альтернативному варіанті, у випадку низьких афінностей зв'язування і невеликих масштабів виробництва, захоплення Fab здійснюють за допомогою катіонообмінної хроматографії (CEX) на основі величини pI молекули. Білки, які походять з клітин-хазяїв, і домішки, наприклад, папаїн, ДНК або віруси, видаляють за допомогою додаткових ортогональних стадій очищення. Згідно з іншим об'єктом винаходу молекула антитіла представляє собою варіант зазначений в даному описі молекули антитіла зі зміненою амінокислотною послідовністю. Варіанти антитіл зі зміненою амінокислотною послідовністю можна одержувати шляхом здійснення відповідних змін нуклеотидів в ДНК антитіла або шляхом пептидного синтезу. Такі варіанти одержують, наприклад, видаляючи шляхом делеції і/або вбудовуючи шляхом інсерції, і/або замінюючи залишки в амінокислотних послідовностях антитіл, які представлені в прикладах, наведених в даному описі. Для одержання кінцевої конструкції можна здійснювати будь-яку комбінацію делецій, інсерцій і замін при тій умові, що кінцева конструкція буде мати потрібні характеристики. Амінокислотні зміни можуть приводити також до зміни посттрансляційних процесів, яким піддається гуманізоване антитіло або варіант антитіла, наприклад, до зміни кількості або положення сайтів глікозилювання. 15 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 Придатним методом ідентифікації конкретних залишків або областей антитіла, які знаходяться в переважних з точки зори здійснення мутагенезу положеннях, є метод, який називають "мутагенезом на основі сканування аланіном", описаний у Cunningham and Wells (Science, 244, 1989, сс. 1081-1085). Згідно з цим методом ідентифікують цільовий залишок або групу цільових залишків (наприклад, заряджених залишків, таких як arg, asp, his, lys і glu) і замінюють на нейтральну амінокислоту або амінокислоту, яка несе негативний заряд (як правило, на аланін) для того, щоб вплинути на взаємодію амінокислот з антигеном. Потім уточнюють положення амінокислот, для яких виявлена функціональна чутливість до замін, шляхом введення додаткових або інших варіантів у сайти, в яких здійснювали заміни, або перед ними. При цьому, хоча сайт, призначений для здійснення інтродукції варіації амінокислотної послідовності, визначений заздалегідь, сама по собі природа мутації не повинна бути заздалегідь визначеною. Наприклад, для того, щоб проаналізувати вплив мутації в конкретному сайті, здійснюють аланін-скануючий або випадковий (неспецифічний) мутагенез в цільовому кодоні або цільовій області й проводять скринінг експресованих варіантів антитіла відносно потрібної активності. Інсерції в амінокислотну послідовність включають аміно- і/або карбокси-кінцеві злиття, довжина яких може складати від одного залишку до поліпептиду, що містить сто або більшу кількість залишків, а також інсерції одного або декількох амінокислотних залишків всередину послідовності. Прикладами кінцевих інсерцій є злиття антитіла з епітопною міткою. До інших одержаних шляхом інсерції варіантів молекули антитіла відносяться варіанти, одержані шляхом злиття з N- або C-кінцем антитіла ферменту або поліпептиду, який збільшує час напівжиття антитіла в сироватці. Іншим типом варіанту є варіант, одержаний шляхом амінокислотної заміни. Для одержання таких варіантів видаляють щонайменше один амінокислотний залишок з молекули антитіла і на його місце вбудовують інший залишок. До сайтів, які представляють найбільший інтерес з точки зору основаного на заміні мутагенезу відносяться гіперваріабельні ділянки, але можна розглядати також зміни у FR. В представленій нижче таблиці під заголовком "Переважні заміни" наведені консервативні заміни. Якщо такі заміни приводять до зміни біологічної активності, то можна інтродукувати більш істотні заміни, які перераховані під заголовком "Приклади замін" або більш докладно описані нижче з посиланням на класи амінокислот, і здійснювати скринінг одержаних продуктів. 16 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 В хімії білків є загальновизнаним, що біологічні властивості антитіла можна удосконалювати шляхом вибору замін, які істотно різняться своїм впливом на підтримання (a) структури поліпептидного каркаса в області заміни, наприклад, пласкої або спіральної конформації, (б) заряду або гідрофобності молекули в сайті-мішені, або (в) розміру бокового ланцюга. Залишки, які зустрічаються в природних умовах підрозділяють на групи на основі загальних властивостей їх бокових ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофильні: cys, ser, thr; (3) кислотні: asp, glu; (4) оснóвні: asn, gin, his, lys, arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; and (6) ароматичні: trp, tyr, phe. Неконсервативні заміни представляють собою заміну представника одного з зазначених класів на представника іншого класу. Будь-який залишок цистеїну, який не бере участі у підтриманні правильної конформації гуманізованого антитіла або варіанту антитіла, також можна замінювати, як правило на серин, для покращення стійкості молекули до окиснення, попередження аномального перехресного зшивання або для забезпечення загальноприйнятих сайтів кон'югації з цитотоксичною або цитостатичною сполукою. І навпаки, цистеїновий(і) зв'язок(и) можна вводити в антитіло для покращення його стабільності (насамперед в тому випадку, коли антитіло представляє собою фрагмент антитіла, такий як Fv-фрагмент). Одним з типів варіанту, одержаного в результаті заміни, є варіант, в якому замінені один або декілька гіперваріабельних ділянок батьківського антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Як правило, вибраний(і) для подальшого удосконалення варіант(и), одержаний(і) таким шляхом, повинний(і) мати покращені біологічні властивості у порівнянні з батьківським антитілом, на основі якого вони створені. Зручним підходом до створення таких одержаних шляхом заміни варіантів є метод дозрівання афінності, оснований на використанні 17 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фагового дисплея. В цілому метод полягає в наступному: декілька сайтів у гіперваріабельних ділянках (наприклад, 6-7 сайтів) піддають мутації, здійснюючи всі можливі амінокислотні заміни в кожному сайті. Створені таким чином варіанти антитіла експонують методом одновалентного дисплея на частинках нитчастого фага у вигляді злиття з продуктом гена III фага M13, запакованим всередині кожної частинки. Потім одержані методом фагового дисплея варіанти піддають скринінгу відносно їх біологічної активності (наприклад, афінності зв'язування). Для того, щоб виявити перспективні з точки зору модифікації сайти у гіперваріабельних ділянках, можна здійснювати мутагенез на основі сканування аланіном, який дозволяє ідентифікувати залишки в гіперваріабельних ділянках, які вносять найбільший внесок у зв'язування з антигеном. В альтернативному варіанті або додатково може виявитися доцільним проаналізувати кристалічну структуру комплексу антиген-антитіло з метою ідентифікації точок контакту між антитілом і застосовним для людини дабігатраном. Такі залишки, які беруть участь у контакті і сусідні з ними залишки є кандидатами для заміни за допомогою викладених в даному описі методів. Після створення зазначених варіантів панель варіантів піддають скринінгу відповідно до представлених в даному описі методів, після чого антитіла, що мають найкращі властивості за даними одного або декількох придатних для даної мети аналізів, можна відбирати для подальшого удосконалення. Інший тип варіації амінокислот антитіла приводить до зміни вихідної схеми глікозилювання антитіла. Під "зміною" в даному випадку слід розуміти видалення шляхом делеції одного або декількох вуглеводних фрагментів, які присутні в антитілі, і/або додавання одного або декількох сайтів глікозилювання, які були відсутніми в антитілі. В деяких варіантах здійснення винаходу може виявитися доцільним модифікувати антитіла, пропоновані у винаході, шляхом додавання сайтів глікозилювання. Глікозилювання антитіл, як правило, є або N-зв'язаним, або O-зв'язаним. N-зв'язане глікозилювання представляє собою приєднання вуглеводного фрагмента до бокового ланцюга на залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-X-серин і аспарагін-X-треонін, де X означає будь-яку амінокислоту за виключенням проліну, представляють собою розпізнавані послідовності, які потрібні для ферментативного приєднання вуглеводного фрагмента до бокового ланцюга аспарагіна. Таким чином, наявність будь-який з зазначених трипептидних послідовностей в поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. O-зв'язане глікозилювання представляє собою приєднання одного з таких цукрів, як N-ацетилгалактозамін, галактоза або ксилоза, до гідроксіамінокислоти, як правило, до серину або треоніну, хоча можна використовувати також 5-гідроксипролін або 5гідроксилізин. Таким чином, для глікозилювання розглядуваного білка, наприклад, антитіла, модифікують амінокислотну послідовність білка таким чином, щоб вона містила одну або декілька з зазначених вище трипептидних послідовностей (для створення сайтів N-зв'язаного глікозилювання). Зміну можна здійснювати також шляхом додавання одного або декількох залишків серину або треоніну в послідовність вихідного антитіла або шляхом заміни існуючих залишків на зазначені залишки (для створення сайтів O-зв'язаного глікозилювання). Молекули нуклеїнових кислот, які кодують варіанти антитіла зі зміненою амінокислотно. послідовністю, можна одержувати різними методами, відомими в даній галузі. Такі методи включають (але, не обмежуються тільки ними) виділення з природного джерела (у випадку варіантів, що містять амінокислотні послідовності, які зустрічаються в природних умовах) або одержання за допомогою олігонуклеотид-опосередкованого (або сайт-спрямованого) мутагенезу, ПЦР-опосередкованого мутагенезу і касетного мутагенезу одержаного раніше варіанту або не підданій варіації версії молекули антитіла, представленого в даному описі. Як зазначено вище, антиген для молекули антитіла, пропонованої у винаході, представляє собою антикоагулянт. Антиген використовують для одержання молекули антитіла або шляхом імунізації тварини, або шляхом відбору послідовностей антитіла з бібліотек послідовностей, а також за допомогою методів фагового дисплея. Протоколи імунізації тварин є добре відомими в даній галузі. Для досягнення потрібної імунної відповіді може виявитися необхідним об'єднувати антиген з ад'ювантом, таким як фосфат алюмінію, гідроксид алюмінію, сквален або повний/неповний ад'ювант Фрейнда. В контексті даного винаходу антигени, такі як дабігатран, в основному представляють собою порівняно невеликі органічні молекули, які іноді не стимулюють утворення антитіла після їх введення тварині. Тому може виявитися необхідним приєднувати антиген до макромолекули, такої як гаптен. Наступним об'єктом даного винаходу є описана вище молекула антитіла, призначена для застосування в медицині. Наступним об'єктом даного винаходу є фармацевтична композиція, яка містить описану вище молекулу антитіла і фармацевтичний носій. 18 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для застосування в терапії молекулу антитіла включають до складу фармацевтичних композицій, які дозволяють полегшувати введення тваринам або людині. Загальноприйнятні препаративні форми, що містять молекулу антитіла, можна готувати шляхом змішування молекули антитіла з фізіологічно прийнятними носіями, ексципієнтами або стабілізаторами, у вигляді ліофілізованих або іншим методом висушених препаратів або водних розчинів, або водних або неводних суспензій. Носії, ексципієнти, модифікатори або стабілізатори повинні бути нетоксичними в застосовних дозах і концентраціях. Вони включають буферні системи, такі як фосфат, цитрат, ацетат і інші неорганічні або органічні кислоти і їх солі; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонин; консерванти, такі як октадецилдиметилбензиламонію хлорид; гексаметонію хлорид; бензалконію хлорид, бензетонію хлорид; фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метил- або пропілпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; і мета-крезол; білки, такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон або поліетиленгліколь (ПЕГ); амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди, олігосахариди або полісахариди і інші вуглеводи, включаючи глюкозу, манозу, цукрозу, трегалозу, декстрини або декстрани; хелатуючі агенти, такі як ЕДТК; цукрові спирти, такі як маніт або сорбіт; солеутворюючі протиіони, такі як іон натрію; металовмісні комплекси (наприклад, комплекси Zn-білок); і/або іоногенні або неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN™ (полісорбати), PLURONICS™ або ефіри жирних кислот, прості ефіри жирних кислот або складні ефіри цукрів. Препаративні форми антитіл можуть містити також органічні розчинники, такі як етанол або ізопропанол. Ексципієнти можуть також мати функцією, яка модифікує вивільнення або модифікує абсорбцію. Відповідно до одного з об'єктів винаходу фармацевтична композиція містить молекулу антитіла у водному забуференому розчині в концентрації 10-20 мг/мл, або ліофілізат, приготовлений з такого розчину. Переважним шляхом введення є парентеральний шлях введення, введення шляхом інфузії або ін'єкції (внутрішньовенної, внутрішньом'язової, підшкірної, внутрішньочеревної, внутрішньошкірної), але можна використовувати також і інші шляхи введення, такі як введення, за допомогою інгаляції, трансдермальне, інтраназальне, трансбукальне, оральне введення. Іншим об'єктом даного винаходу є описана вище молекула антитіла, призначена для застосування в терапії або для попередження побічних дій антикоагулянтної терапії, насамперед випадків кровотечі. Іншим об'єктом даного винаходу є описана вище молекула антитіла, призначена для застосування з метою реверсії впливу передозування антикоагулянту, насамперед дабігатрану або дабігатрану етексилату. Іншим об'єктом даного винаходу є описана вище молекула антитіла, призначена для застосування як антидота антикоагулянту, насамперед дабігатрану або дабігатрану етексилату. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб лікування або попередження побічних дій антикоагулянтної терапії, який полягає в тому, що вводять пацієнту, який потребує цього, в ефективній кількості описану вище молекулу антитіла. Іншим об'єктом даного винаходу є спосіб лікування випадку передозування при здійсненні антикоагулянтної терапії, який полягає в тому, що вводять пацієнту, який потребує цього, в ефективній кількості описану вище молекулу антитіла. "Терапевтично ефективна кількість" антитіла, яке підлягає введенню, представляє собою мінімальну кількість, необхідну для попередження, полегшення або лікування побічних дій антикоагулянтної терапії, насамперед, мінімальну кількість, ефективну стосовно припинення кровотечі. Цього можна досягти при використанні молекули антитіла в стехіометричних кількостях. Наприклад, концентрація дабігатрану в плазмі при його введенні в рекомендованій дозі може досягати величини 200нМ. У випадку застосування одновалентної молекули антитіла з молекулярною масою приблизно 50 кДа нейтралізацію можна забезпечити, наприклад, шляхом внутрішньовенного введення у вигляді болюса дози, що складає приблизно 1 мг/кг. В іншому варіанті здійснення винаходу доза молекули Fab, яка вводиться хворій людині, може складати 50-1000 мг на одно введення, наприклад вона може складати 100, 200, 500, 750 або 1000 мг. Залежно від ситуації, наприклад, у випадку передозування дабігатрану при введенні пацієнту, може виявитися доцільним вводити навіть ще більш високі дози, які складають, наприклад, 1250, 1500, 1750 або 2000 мг на одно введення. Потрібна доза може бути різною залежно від типу і дози введеного антикоагулянту; часу, який пройшов з моменту такого введення, природи молекули антигену, стану пацієнта й інших факторів. Спеціалісту в даній галузі є відомими методи визначення доз, які є як терапевтично ефективними, так і безпечними. 19 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наступним об'єктом даного винаходу є молекула антитіла, що має афінність до зв'язування з дабігатраном і/або дабігатрану етексилатом. Переважно афінність до зв'язування молекули антитіла з дабігатраном і/або дабігатрану етексилатом, яку можна оцінювати, наприклад, методом поверхневого плазмонного резонансу (Malmqvist M., "Surface plasmon resonance for detection and measurement of antibody-antigen affinity and kinetics", Curr Opin Immunol., 5(2), квітень 1993 г., сс. 282-286) або за допомогою кінетичного аналізу виключення (KinExAтехнологія) (Darling R.J. і Brault P-A., "Kinetic exclusion assay technology: Characterization of Molecular Interactions", ASSAY and Drug Development Technologies, 2(6), грудень 2004 г., сс. 647657), величиною KD, що складає від 0,1пМ до 100мкМ, переважно від 1пМ до 100мкМ, більш переважно від 1пМ до 1мкМ. Молекулу антитіла, пропоновану у винаході, можна застосовувати також для аналітичних і діагностичних процедур, наприклад, для визначення концентрації антигену у зразках, таких як плазма, сироватка або інші рідини організму. Наприклад, молекули антитіла можна застосовувати в твердофазному імуноферментному аналізі (ELISA), як це описано в прикладах. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є аналітичні і діагностичні набори, що містять описані вище молекули антитіла, і відповідні аналітичні і діагностичні способи. Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання молекули антитіла, зазначеної в будь-якому з попередніх розділів, який полягає в тому, що (а) створюють клітину-хазяїна, яка містить одну або декілька нуклеїнових кислот, що кодують зазначену молекулу антитіла, які функціонально зв'язані з послідовністю, яка контролює експресію, (б) культивують клітину-хазяїна і (в) виділяють молекулу антитіла з клітинної культури. У винаході запропоновані також виріб і набір, що містять продукти, які можна застосовувати для нейтралізації антикоагулянтів, які вводять оральним шляхом, насамперед прямі інгібітори тромбіну. Виріб містить контейнер, забезпечений етикеткою. Придатними контейнерами можуть служити, наприклад, бутилі, пляшечки і лабораторні пробірки. Контейнери можна виготовляти з різноподібних матеріалів, таких як скло, метал, пластик або їх комбінації. Контейнер містить фармацевтичну композицію, що включає представлене в даному описі антитіло або дабігатран, дабігатрану етексилат, проліки дабігатрану або його фармацевтично прийнятну сіль. Діюча речовина в фармацевтичній композиції представляє собою конкретне антитіло або дабігатран, дабігатрану етексилат, проліки дабігатрану або його фармацевтично прийнятну сіль. На етикетці на контейнері, що містить антитіло, зазначено, що фармацевтичну композицію застосовують для нейтралізації або часткової нейтралізації дабігатрану, дабігатрану етексилату, проліків дабігатрану або його фармацевтично прийнятної солі in vivo. Набір, що пропонується у винаході, включає один або декілька зазначених вище контейнерів. Крім того, він може включати інші матеріали, корисні з комерційної і споживчої точки зору, в тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприці і вкладки в упаковку з інструкціями з застосування. В одному з варіантів здійснення винаходу набір містить будь-яке антитіло з ряду представлених в даному описі антитіл або фармацевтичну композицію, яка його включає. Наприклад, набір може містити (1) будь-яке з описаних вище антитіл або фармацевтичну композицію, яка його включає, (2) контейнер і (3) етикетку. В іншому варіанті здійснення винаходу набір містить будь-яке антитіло з ряду представлених в даному описі антитіл або фармацевтичну композицію, яка його включає і дабігатран, дабігатрану етексилат, проліки дабігатрану або його фармацевтично прийнятну сіль. Дабігатран, дабігатрану етексилат, проліки дабігатрану або його фармацевтично прийнятна сіль може знаходитися в формі твердої речовини, рідини або гелю. В переважному варіанті здійснення винаходу фармацевтично прийнятна сіль дабігатрану етексилату представляє собою мезилат. В ще одному переважному варіанті здійснення винаходу кількість дабігатрану, дабігатрану етексилату, проліків дабігатрану або його фармацевтично прийнятної солі на стандартну дозу складає від приблизно 50 до приблизно 400 мг, від приблизно 75 до приблизно 300 мг, від приблизно 75 до приблизно 150 мг або від приблизно 110 до приблизно 150 мг, і його вводять один раз на день (QD) або двічі на день (BID). Наприклад, набір може містити (1) будь-яке з представлених в даному описі антитіл або фармацевтичну композицію, яка його включає, (2) фармацевтичну композицію, яка включає дабігатран, дабігатрану етексилат, проліки дабігатрану або його фармацевтично прийнятну сіль, (3) контейнер і (4) етикетку. В іншому варіанті здійснення винаходу набір містить (1) першу фармацевтичну композицію, яка включає дабігатран, дабігатрану етексилат, проліки дабігатрану або його фармацевтично 20 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 прийнятну сіль, (2) другу фармацевтичну композицію, яка включає будь-яке з представлених в даному описі антитіл або їх комбінацію, (3) інструкції з роздільного введення першої і другої фармацевтичних композицій пацієнту, де перша і друга фармацевтичні композиції містяться в окремих контейнерах і другу фармацевтичну композицію вводять пацієнту, який потребує нейтралізації або часткової нейтралізації дабігатрану або 1-O-ацилглюкуроніду дабігатрану. В винаході також пропонується діагностичний спосіб нейтралізації або часткової нейтралізації дабігатрану або 1-O-ацилглюкуроніду дабігатрану в організмі пацієнта, якого піддають лікуванню дабігатраном, дабігатрану етексилатом, проліками дабігатрану або його фармацевтично прийнятною сіллю який полягає в тому, що вводять будь-яке з представлених в даному описі антитіл, їх комбінацію або фармацевтичну композицію, яка включає їх. Більш конкретно, у винаході пропонується спосіб нейтралізації або часткової нейтралізації дабігатрану або 1-O-ацилглюкуроніду дабігатрану в організмі пацієнта, який полягає в тому, що здійснюють стадії, на яких (a) підтверджують, що пацієнта піддавали лікуванню дабігатраном, дабігатрану етексилатом, проліками дабігатрану або його фармацевтично прийнятною сіллю і встановлюють їх кількість, введену пацієнту; (б) нейтралізують дабігатран або 1-Oацилглюкуронід за допомогою будь-якого з представлених в даному описі антитіл або їх комбінації до здійснення тесту або аналізу на зсілість або коагуляцію, при цьому наявність дабігатрану або 1-O-ацилглюкуроніду дабігатрану може впливати на точні дані тесту або результати аналізу; (в) проводять тест або аналіз на зсілість або коагуляцію на зразку, взятому з організму пацієнта, для визначення рівня згусткоутворення при відсутності дабігатрану або 1O-ацилглюкуроніду дабігатрану; і (г) регулюють кількість дабігатрану, дабігатрану етексилату, проліків дабігатрану або його фармацевтично прийнятної солі, яку вводять пацієнту, з метою досягнення потрібного балансу між утворенням і деградацією згустку в організмі пацієнта. Молярне співвідношення антитіла і дабігатрану або 1-O-ацилглюкуроніду дабігатрану складає від 0,1 до 100, переважно від 0,1 до 10. Точні покази тесту або результати аналізу можуть представляти собою точні дані при рівні фібриногену, стійкості до дії активованого білка C або результати споріднених тестів. Приклади I. Одержання поліклональних антитіл до дабігатрану Для одержання поліклональних антитіл до дабігатрану були створені 3 різних імуногени з використанням двох різних гаптенів і різних вношуваних молярних співвідношень гаптену і білка-носія (БСА). Для здійснення скринінгу був створений кон'югат, який містить фермент пероксидазу з хріну (HRP), і розроблений твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA). Додаткове очищення поліклональних антитіл здійснювали за допомогою афінної хроматографії на сорбенті білок A/сефароза FF. 1. Матеріали й методи Сполука, яка підлягає тестуванню (дабігатран) 1.1. Гаптен, застосовний при синтезі імуногену і трейсер 21 UA 110470 C2 5 1.2 Синтез гаптенів Гаптени Hapten1 і Hapten2 синтезували наступним чином: Hapten1 [2-(4-амінобутилкарбамоїл)етил]феніламід 2-[(4-карбамімідоїлфеніламіно)метил]-1метил-1H-бензімідазол-5-карбонової кислоти 1a Метиловий ефір 3-[(4-метиламіно-3-нітробензоїл)феніламіно]пропіонової кислоти 10 15 До розчину, що містить хлорангідрид 4-метиламіно-3-нітробензойної кислоти (23,3 ммолі) і метиловий ефір 3-феніламінопропіонової кислоти (23,3 ммолі) в 80 мл безводного тетрагідрофурану (ТГФ) додавали по краплях при перемішуванні при кімнатній температурі тріетиламін (50,2 ммолі). Через 3 год. реакційну суміш упарювали досуха, твердий продукт, що залишився розтирали з водою і твердий продукт виділяли фільтрацією. Вихід: 99 % C18H19N3O5 (357,36) ТСХ (силікагель; дихлорметан/етанол 19:1): Rf=0,48 1б Метиловий ефір 3-[(3-аміно-4-метиламінобензоїл)феніламіно]пропіонової кислоти 22 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 Нітрогрупу продукту 1a відновлювали шляхом гідрування при кімнатній температурі в етанолі в присутності Pd (10 % на вугіллі) як каталізатор. Вихід: 99 % C18H21N3O3 (327,38) ТСХ (силікагель; дихлорметан/етанол 9:1): Rf=0,23 + Мас-спектр (ESI): [M+H] = 328 1в Метиловий ефір 3-({3-[2-(4-ціанфеніламіно)ацетиламіно]-4метиламінобензоїл}феніламіно)пропіонової кислоти Продукт 1б (23,2 ммолі) і N-(4-ціанфеніл)гліцин (23,2 ммолі) піддавали реакції сполучення з карбодіімідом (КДІ) (23,2 ммолі) в безводному ТГФ при кімнатній температурі. Після завершення реакції суміш упарювали досуха і неочищений продукт використовували без додаткового очищення. Вихід: 97 % C27H27N5O4 (485,54) + Мас-спектр (ESI): [M+H] = 486 1г Метиловий ефір 3-({2-[(4-ціанфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензімідазол-5карбоніл}феніламіно)пропіонової кислоти Розчин, який містить продукт 1в (22,6 ммолі) у 100 мл концентрованої оцтової кислоти, витримували при температурі дефлегмації протягом 1 год. Потім розчин упарювали досуха, твердий продукт, що залишився розтирали з водою і при перемішуванні доводили значення pH приблизно до 8-9. Неочищений продукт виділяли шляхом екстракції етилацетатом і очищували за допомогою хроматографії на силікагелі (елюент: дихлорметан/етанол 1:1). Вихід: 58 % C27H25N5O3 (467,52) ТСХ (силікагель; дихлорметан/етанол 9:1): Rf=0,71 + Мас-спектр (ESI): [M+H] = 468 1д 3-({2-[(4-Ціанфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензімідазол-5карбоніл}феніламіно)пропіонова кислота До розчину, що містить продукт 1г (13,0 ммолів) в 100 мл метанолу додавали гідроксид 23 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 натрію (20,0 ммолів). Суміш перемішували протягом 2,5 год. при 40 °C і потім упарювали досуха. Твердий продукт, що залишився перемішували з 100 мл води і значення pH доводили приблизно до 6 за допомогою концентрованої оцтової кислоти. Осаджений продукт виділяли фільтрацією, промивали водою і сушили при 60 °C. Вихід: 88 % C26H23N5O3 (453,49) ТСХ (силікагель; дихлорметан/етанол 9:1): Rf=0,33 + Мас-спектр (ESI): [M+H] = 454 1е Трет-бутиловий ефір {4-[3-({2-[(4-ціанфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензімідазол-5карбоніл}феніламіно)пропіоніламіно]бутил}карбамінової кислоти Розчин, який містить продукт 1д (5,23 ммолі), тетрафторборат 2-(1H-бензотріазол-1-іл)1,1,3,3-тетраметилуронію (ТБТУ, 5,23 ммолі) і N-метилморфолін (5,23 ммолі) в 20 мл ДМФ, перемішували при кімнатній температурі протягом 30 хв. Потім додавали трет-бутиловий ефір (4-амінобутил)карбамінової кислоти (5,23 ммолі) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ще 24 год. Потім суміш розводили водою (100 мл) і продукт виділяли шляхом екстракції етилацетатом. Вихід: 92 % C35H41N7O4 (623,75) ТСХ (силікагель; дихлорметан/етанол 9:1): Rf=0,51 1ж [2-(4-Амінобутилкарбамоїл)етил]феніламід 2-[(4-карбамімідоїлфеніламіно)метил]-1метил-1H-бензоімідазол-5-карбонової кислоти Продукт 1е (4,81 ммолі) розчиняли в насиченому розчині HCl в етанолі (250 мл), суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі і потім упарювали досуха при 30 °C. Неочищений продукт, що залишився розчиняли в 200 мл безводного етанолу, потім додавали карбонат амонію (48,1 ммолі) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Після випарювання розчинника неочищений продукт, що залишився розтирали з приблизно 5 мл етанолу, продукт, який не розчинився відокремлювали фільтрацією і розчинник випарювали при 30 °C. Потім продукт розчиняли в 30 мл води, розчин перемішували з приблизно 2 г вугілля, фільтрували і упарювали досуха. Вихід: 90 % C30H36N8O2 (540,67) ТСХ (обернена фаза RP-8; метанол/5 %-ний водний розчин NaCl, 9:1): Rf=0,79 + Мас-спектр (ESI): [M+H] = 541 [M+Cl] = 575/7 Hapten 2 [2-(2-Аміноетилкарбамоїл)етил]піридин-2-іламід 2-[(4карбамімідоїлфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензімідазол-5-карбонової кислоти 24 UA 110470 C2 2a 3-({2-[(4-Ціанфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензоімідазол-5-карбоніл}піридин-2іламіно)пропіонова кислота 5 10 15 20 25 30 35 40 До розчину, що містить гідроксид натрію (50,0 ммолів) в 500 мл етанолу і 50 мл води, додавали етиловий ефір 3-({2-[(4-ціанфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензоімідазол-5карбоніл}піридин-2-іламіно)пропіонової кислоти (41,4 ммолі). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 3 год., потім видаляли шляхом дистиляції приблизно 350 мл етанолу, додавали приблизно 100 мл води і значення pH доводили до 6. Потім додавали діетиловий ефір (50 мл) і суміш перемішували протягом ночі. Продукт виділяли фільтрацією і застосовували без додаткового очищення. Вихід: 78 % C25H22N6O3 (454,48) 2б Трет-бутиловий ефір {2-[3-({2-[(4-ціанфеніламіно)метил]-1-метил-1H-бензоімідазол-5карбоніл}піридин-2-іламіно)пропіоніламіно]етил}карбамінової кислоти Розчин, який містить продукт 2a (2,20 ммолі), тетрафторборат 2-(1H-бензтріазол-1-іл)1,1,3,3-тетраметилуронію (ТБТУ, 2,20 ммолі) і N-метилморфолін (2,20 ммолі) в безводному тетрагідрофурані (100 мл), перемішували при кімнатній температурі протягом 15 хв. Потім додавали трет-бутиловий ефір (2-аміноетил)карбамінової кислоти (2,20 ммолі) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ще 24 год. Потім суміш розводили з використанням 40 мл води, продукт виділяли шляхом екстракції етилацетатом і очищували за допомогою хроматографії (силікагель; дихлорметан/метанол 15:1). Вихід: 61 % C32H36N8O4 (596,68) + Мас-спектр (ESI): [M+H] = 597 [M+H] = 595 2в [2-(2-Аміноетилкарбамоїл)етил]піридин-2-іламід 2-[(4-карбамімідоїлфеніламіно)метил]-1метил-1H-бензоімідазол-5-карбонової кислоти Продукт 2б (1,34 ммолі) додавали до насиченого розчину HCl у безводному етанолі (30 мл). Розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 5 год., потім упарювали досуха при 30 °C. Додавали етанол (30 мл) ікарбонат амонію (13,0 ммолів) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Потім розчинник випарювали, продукт, що залишився розтирали 5 разів з приблизно 4 мл суміші дихлорметан/метанол (30:1), фільтрували і випарювали для виділення продукту з неорганічної солі. Вихід: 27 % C27H31N9O2 (513,61) Мас-спектр (ESI): [M+Cl] = 548/50 [M+HCl+Cl] = 584/6 + [M+H] = 514 25 UA 110470 C2 2. Хімічні речовини 2.1 Хімічні речовини, застосовні при синтезі реагентів Назва 1,4-бензохінон бичачий сироватковий альбумін (БСА) 1,1’-карбонілди(1,2,4-тріазол) лимонна кислота аналітично чиста чистота, придатна N, N-диметилформамід (ДМФ) синтезу етанол аналітично чистий ад'ювант Фрейнда (CFA) повний ад'ювант Фрейнда (IFA) неповний гліцерин чистий пероксидаза з хріну (HRP) 25000 ед./100 мг H2SO4 KH2PO4 NaHCO3 Na2CO3 (NH4)2SO4 орто-фенілендіамін перборат натрію тимол 5 Fluka аналітично чиста аналітично чистий аналітично чистий аналітично чистий аналітично чистий таблетка 30 мг чистий чистий Каталожний номер 12309 Serva 11920 Fluka Riedel-De Haen Специфікація 21861 33114 Merck 822275 Baker Sigma Sigma Merck Boehringer Mannheim Riedel-De Haen Merck Merck Merck Merck Sigma Riedel-De Haen Merck 806 F-5881 F-5506 104093 Постачальник для 108090 30743 4873 106329 106392 101217 P8412 11621 8167 2.2. Хімічні речовини для ELISA Назва лимонна кислота H2SO4 KH2PO4 NaHPO2·2H2O NaCl NaOH орто-фенілендіамін перборат натрію Твін 20 Специфікація аналітично чиста аналітично чиста аналітично чистий аналітично чистий аналітично чистий аналітично чистий таблетка 30 мг чистий чистий Постачальник Riedel-De Haen Riedel-De Haen Merck Merck Merck Merck Sigma Riedel-De Haen Serva Каталожний номер 33114 30743 4873 6580 6404 6498 P8412 11621 37470 2.3. Буфери для ELISA Назва буфер 1 стабільність: буфер 2 стабільність: буфер 3 стабільність: буфер 4 стабільність: Інгредієнти 0,05М Na2HPO4/KH2PO4 0,15M NaCl, рН=7,4 4 тижні при приблизно +4ºС ті ж самі, що і для буфера 1, з додаванням 5 г/л БСА 10 днів при приблизно +4ºС ті ж самі, що і для буфера 1, з додаванням 5 г/л БСА і 0,1 г/л тимеросалу 4 тижні при приблизно +4ºС 0,1М лимонна кислота, значення рН доведене до рН 5,0 за допомогою NaOH, 6,5 ммолі/л перборату натрію лимонна кислота: 6 місяців при приблизно +4ºС, з перборатом: 10 днів при приблизно +4ºС 26 Застосування сенсибілізація буфер для аналізу блокування мікропланшетів; зберігання субстратний буфер для ортофенілендіаміну UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для приготовлення буферних розчинів використовували воду з системи для ультрачистої обробки води Elgastat Maxima-РХВР. 3. Синтез імуногенів Для стимуляції імунної системи кроликів з метою продукування поліклональних антитіл до дабігатрану були синтезовані три імуногени (номера лотів GL256, GL258 і GL262) за допомогою сполучення гаптенів HAPTEN1 і HAPTEN2 з білком-носієм, який представляє собою бичачий сироватковий альбумін (БСА), з використанням 1,4-бензохінону або 1,1’-карбонілди(1,2,4тріазолу) як реагенту для сполучення. Для синтезу GL256 як гомобіфункціональну сполуку з двома реакційноздатними сайтами застосовували 1,4-бензохінон. Спочатку при кислих значеннях pH вона вступає у взаємодію з аміногрупами тільки в одному з двох сайтів, а при лужному значенні pH – в іншому сайті при мінімальному рівні полімеризації. GL258 і GL262 синтезували, застосовуючи як реагент для сполучення 1,1’-карбонілди(1,2,4тріазол) з різними вихідними співвідношеннями гаптену і білка-носія. 3.1 Синтез GL256 До розчину, що містить 0,75 мкМ БСА в 8,5 мл 0,1M KH 2PO4-буфера (pH=4,5), додавали 0,416мМ 1,4-бензохінону (в 1,5 мл етанолу) й інкубували протягом 1,5 год. в темряві при кімнатній температурі. Після цього розчин пропускали через заповнену сефадексом G25 колонку, урівноважену в 0,15M NaCl, для видалення надлишку 1,4-бензохінону (кінцевий об'єм 12,5 мл). До розчину, що містить 525 мкМ гаптен HAPTEN1, розчинений в 2 мл 0,1M NaHCO 3//Na2CO3буфера (pH=8,5), повільно додавали при перемішуванні 2,5 мл (0,15 мкМ) розчину очищеного БСА. В процесі додавання розчину БСА значення pH доводили до приблизно 8,0. Вихідне молярне співвідношення гаптену й білка-носія складало 3500:1. Після інкубації протягом ночі при кімнатній температурі імуноген 6-кратно піддавали діалізу в протитечії 1 л дистильованої води. Результати аналізу за допомогою тонкошарової хроматографії продемонстрували відсутність плям, які відповідають незв'язаному гаптену, який міг бути присутнім в кон'югатах гаптен-носій. Аліквоти імуногену зберігали у замороженому стані при -20 °C. За даними спектрометричних вимірювань УФ-абсорбції при 302 нм ступінь заміщення БСА гаптеном в супернатанті імуногену складала приблизно 1:18. Вміст імуногену в кінцевому розчині складав 0,75 мг GL256/мл. 3.2. Синтез GL258 Розчин, який містить 158мкМ HAPTEN2 в 6,3 мл N, N-диметилформаміду (ДМФ), готували при кімнатній температурі. Додавали 158 мкМ 1,1’-карбонілди(1,2,4-тріазол) й інкубували спочатку протягом 4 год. при 10 °C, а потім протягом 30 хв. при кімнатній температурі. Вихід продукту хімічної реакції перевіряли за допомогою тонкошарової хроматографії, було встановлено, що він складав приблизно 20-25 %. Після цього розчиняли 0,75 мкМ БСА в 2 мл 0,13M NaHCO 3 і додавали по краплях при перемішуванні 1 мл N, N-диметилформаміду (ДМФ). Значення pH доводили до рівня приблизно 8,3. Після цього до розчину БСА додавали по краплях при перемішуванні розчин гаптену (6,3 мл) і 4 мл 0,13M NaHCO3 і значення pH доводили до 8,4. Вихідне молярне співвідношення гаптену і білка-носія для імуногену GL258 складало 210:1. Після інкубації протягом ночі при кімнатній температурі при перемішуванні імуноген 6-кратно піддавали діалізу в протитечії 1 л дистильованої води. Результати аналізу за допомогою тонкошарової хроматографії продемонстрували відсутність плям, які відповідають незв'язаному гаптену, який міг бути присутнім в кон'югатах гаптен-носій. Аліквоти імуногену зберігали в замороженому стані при -20 °C. За даними спектрометричних вимірювань УФ-абсорбції при 302 нм ступінь заміщення БСА гаптеном в супернатанті імуногену складала приблизно 1:5. Вміст імуногену в кінцевому розчині складав 0,28 мг GL258/мл. 3.3 Синтез GL262 Розчин, який містить 225 мкМ HAPTEN2 в 8,75 мл N, N-диметилформаміду (ДМФ), готували при кімнатній температурі. Додавали 225 мкМ 1,1’-карбонілди(1,2,4-тріазолу) й інкубували протягом 4 год. при 10 °C. Вихід продукту хімічної реакції перевіряли за допомогою тонкошарової хроматографії, було встановлено, що він складав приблизно 20-25 %. Після цього розчиняли 0,49 мкМ БСА в 2 мл 0,13M NaHCO3 і додавали по краплях при перемішуванні 1 мл N, N-диметилформаміду (ДМФ). Значення pH доводили до рівня приблизно 8,2. Після цього до розчину БСА додавали по краплях при перемішуванні розчин гаптену (8,75 мл) і 6 мл 0,13M NaHCO3 і значення pH доводили до 8,3. Вихідне молярне співвідношення гаптену і білка-носія для імуногену GL262 складало 460:1. 27 UA 110470 C2 5 10 15 20 25 30 35 Після інкубації протягом ночі при кімнатній температурі при перемішуванні імуноген 6-кратно піддавали діалізу в протитечії 1 л дистильованої води. Результати аналізу за допомогою тонкошарової хроматографії продемонстрували відсутність плям, які відповідають незв'язаному гаптену, який міг бути присутнім в кон'югатах гаптен-носій. Аліквоти імуногену зберігали в замороженому стані при -20 °C. За даними спектрометричних вимірювань УФ-абсорбції при 302 нм ступінь заміщення БСА гаптеном в супернатанті імуногену складала приблизно 1:32. Вміст імуногену в кінцевому розчині складав 0,71 мг GL262/мл. 4. Синтез кон'югатів 4.1 Синтез GL261 Розчин, який містить 37,4мкМ HAPTEN2 в 1,5 мл N, N-диметилформаміду (ДМФ), готували при кімнатній температурі. Додавали 37,5 мкМ 1,1’-карбонілди(1,2,4-тріазолу) й інкубували спочатку протягом 4 год. при 10 °C, а потім протягом 30 хв. при кімнатній температурі. Вихід продукту хімічної реакції перевіряли за допомогою тонкошарової хроматографії, було встановлено, що він складав приблизно 20-25 %. Потім розчиняли 1,125 мкМ фермент пероксидазу з хріну (HRP) в 0,4 мл 0,13M NaHCO 3 і додавали по краплях при перемішуванні 0,267 мл N, N-диметилформаміду (ДМФ). Значення pH доводили до приблизно 8,2. Після цього до розчину HRP додавали по краплях при перемішуванні 0,9 мл розчину гаптену (22,5 мкМ) і 0,57 мл 0,13M NaHCO 3 і значення pH доводили до 8,4. Вихідне співвідношення гаптену і HRP в кон'югаті GL261, що містить HRP, складав 20:1. Після інкубації при кімнатній температурі протягом ночі при перемішуванні кон'югат, який містить HRP відокремлювали від органічних розчинників і надлишку гаптену за допомогою гельхроматографії. Розчин пропускали через заповнену сефадексом G25 колонку, урівноважену 0,1M фосфатним буфером, pH 7,0. Для одержання кінцевої концентрації кон'югата гаптен-HRP (трейсер, 5,64 мг/мл) швидко вносили БСА, одержуючи концентрацію приблизно 10 мг/л, рівний об'єм гліцерину для попередження заморожування і кристал тимолу для попередження бактеріального росту. Розчин трейсера позначали як лот № GL261 і зберігали у вигляді аліквот при -20 °C. За даними УФ-спектроскопії при 302 нм ступінь заміщення HRP гаптеном складала 1:0,2. Питому активність трейсера вимірювали в блокованих за допомогою БСА титраційних мікропланшетах з використанням орто-фенілендіаміну (ОФД) як субстрату і нативної HRP як еталонного продукту. Суміш, що містить розведені HRP-стандарти або кон'югат гаптен-HRP і розчин субстрату, інкубували протягом 30 хв. в темряві, реакцію припиняли шляхом додавання сірчаної кислоти і вимірювали абсорбцію при 490 нм. Залишкова активність складала 94 % від активності нативної HRP, а питома активність препарату кон'югата в гліцерині складала 611 од./мл. Узагальнення характеристик трейсера: Тип вміст білка питома активність зберігання робоче розведення 40 45 50 HAPTEN2-пероксидаза з хріну (лот № GL 261) 5,64 мг/мл 108 од./мг 611 од./мл (субстрат Guajacol і H2O2, 25 °C) при приблизно -20ºС 1:40000 5. Імунізація і одержання антитіл 5.1 Імунізація кроликів Дванадцять самиць кроликів породи шиншила віком 3 місяці імунізували емульсією, що містить 100 мкг імуногену GL256, GL258 і GL262 в 0,5 мл 0,9 % розчину NaCl і 0,5 мл повного ад'юванта Фрейнда (CFA). Через місяць здійснювали декілька бустерних імунізацій. Для третьої імунізації використовували 0,5 мл неповного ад'юванта Фрейнда (IFA). Кожну імунізацію здійснювали в чотири підшкірні і чотири внутрішньом'язові області. Група A – імуноген GL256 Кролик 1 № 50 Кролик 2 № 51 Кролик 3 № 52 Кролик 4 № 53 Группа Б – імуноген GL258 Кролик 5 № 54 28