Рослини пшениці з підвищеною толерантністю до імідазолінонових гербіцидів

1. Рослина пшениці, яка містить принаймні одну мутовану, рекомбінантну або створену методом генетичної інженерії нуклеїнову кислоту IMI, вибрану із групи, яка включає: (а) нуклеїнові кислоти Imi 2, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1; (б) нуклеїнові кислоти Imi 3, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; (в) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вказану в будь-якій SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; (г) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, де поліпептид IMI містить мутацію в домені Е, що приводить до заміни серину на аспарагін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; (д) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24, де поліпептид IMI містить мутацію в домені С, що приводить до заміни аланіну на треонін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; 2 (19) 1 3 ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинову кислоту й суміш метил-6-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-мета-толуату й метил-2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-паратолуату. 14. Рослина пшениці за п. 1, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту. 15. Рослина пшениці за п. 1, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту. 16. Частина рослини пшениці за п. 1, де частина рослини містить принаймні одну нуклеїнову кислоту IMI. 17. Рослинна клітина рослини пшениці за п. 1, де рослинна клітина містить принаймні одну нуклеїнову кислоту IMI. 18. Насінина, яка утворилася на рослині пшениці за п. 1, де насінина містить принаймні одну нуклеїнову кислоту IMI. 19. Насінина за п. 18, де насінину піддають розведенню гомозигот для одержання підвищеної толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з насіниною рослини пшениці сорту дикого типу. 20. Рослина пшениці, яка має толерантність до гербіцидів, характерні для рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC (Американська колекція типових культур) для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA4923 або PTA-4960, де (а) рослина пшениці є рослинною лінією, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA4923 або PTA-4960; (б) рослина пшениці є рекомбінантним або створеним за допомогою генетичної інженерії похідним рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 або PTA-4960; (в) рослина пшениці є будь-яким потомством рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA4921, РТА-4922, PTA-4923 й PTA-4960; або 92716 4 (г) рослина пшениці є нащадком будь-якої з рослин, вказаних в (а)-(в). 21. Рослина пшениці за п. 20, де рослина пшениці являє собою рослину пшениці виду Triticum turgidum. 22. Рослина пшениці за п. 20, де рослина має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. 23. Рослина пшениці за п. 22, де імідазоліноновий гербіцид вибирають із групи, яка включає 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинову кислоту й суміш метил-6-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-мета-толуату й метил-2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-паратолуату. 24. Рослина пшениці за п. 22, де імідазоліноновий гербіцидявляє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту. 25. Рослина пшениці за п. 22, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту. 26. Частина рослини пшениці за п. 20, де частина рослини має ознаки толерантності до гербіцидів. 27. Рослинна клітина рослини пшениці за п. 20, де рослинна клітина має ознаки толерантності до гербіцидів. 28. Насінина, яка утворилася на рослині пшениці за п. 20, де насінина має ознаки толерантності до гербіцидів. 29. Насінина за п. 28, де насінину використовують для одержання гомозигот для підвищення толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з насіниною рослини пшениці сорту дикого типу. 30. Рослина тритикале, яка містить принаймні одну мутовану, рекомбінантну або створену методом генетичної інженерії нуклеїнову кислоту IMI, вибрану із групи, яка включає: (а) нуклеїнові кислоти Imi 2, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1; (б) нуклеїнові кислоти Imi 3, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; (в) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вказану в будь-якій SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; (г) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, де поліпептид IMI містить мутацію в домені Е, що приводить до заміни серину на аспарагін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; (д) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:6 або 5 SEQ ID NO:24, де поліпептид IMI містить мутацію в домені С, що приводить до заміни аланіну на треонін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; де нуклеїнова кислота IMI обумовлює підвищену толерантність рослини до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу, де рослина тритикале є мутованою, рекомбінантною або створеною методом генетичної інженерії рослиною. 31. Рослина тритикале за п. 30, де нуклеїнова кислота IMI містить полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид IMI, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO:2. 32. Рослина тритикале п. 30, рослина додатково містить полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:3, або полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид IMI, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO:4. 33. Рослина тритикале п. 30, де нуклеїнова кислота IMI містить полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид IMI, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24. 34. Рослина тритикале п. 30, де рослина містить першу нуклеїнову кислоту IMI і другу нуклеїнову кислоту IMI, причому перша нуклеїнова кислота IMI містить полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид IMI, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO:2, і друга нуклеїнова кислота IMI містить полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид IMI, який має послідовність, вказану в SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24. 35. Рослина тритикале п. 30, де нуклеїнова кислота Imi 2 містить полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1. 36. Рослина тритикале п. 30, де нуклеїнова кислота Imi 3 містить полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:3. 37. Рослина тритикале п. 30, де нуклеїнова кислота Imi 3 містить полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. 38. Рослина тритикале п. 30, яка містить дві нуклеїнові кислоти IMI. 39. Частина рослини тритикале п. 30, де частина рослини містить принаймні одну нуклеїнову кислоту IMI. 40. Рослинна клітина рослини тритикале за п. 30, де рослинна клітина містить принаймні одну нуклеїнову кислоту IMI. 41. Насінина, яка утворилася на рослині тритикале за п. 30, де насінина містить принаймні одну нуклеїнову кислоту IMI. 42. Насінина за п. 41, де насінину використовують для одержання гомозигот для підвищення толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з насіниною рослини тритикале сорту дикого типу. 43. Рослина тритикале п. 30, де рослина є трансгенною. 44. Рослина тритикале п. 30, де рослина є нетрансгенною. 45. Рослина тритикале, яка має толерантність до гербіцидів, характерні для рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером 92716 6 PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA4923 або PTA-4960, де (а) рослина тритикале є рекомбінантним або створеним за допомогою генетичної інженерії похідним рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 або PTA-4960; (б) рослина тритикале є будь-яким потомством рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 й PTA-4960; або (в) рослина тритикале є нащадком будь-якої з рослин, вказаних в (а)-(б). 46. Рослина тритикале за п. 45, де рослина має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. 47. Частина рослини тритикале п. 45, де частина рослини має ознаки толерантності до гербіцидів. 48. Рослинна клітина рослини тритикале за п. 45, де рослинна клітина має ознаки толерантності до гербіцидів. 49. Насінина, яка утворилася на рослині тритикале за п. 45, де насінина має ознаки толерантності до гербіцидів. 50. Насінина за п. 49, де насінину використовують для одержання гомозигот для підвищення толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з насіниною рослини тритикале сорту дикого типу. 51. Виділена нуклеїнова кислота IMI, де нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, вибраний із групи, яка включає: (а) нуклеїнові кислоти Imi 2, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1; (б) нуклеїнові кислоти Imi 3, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; (в) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпетид, який має амінокислотну послідовність, вказану в будь-якій SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; (г) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, де поліпептид IMI містить мутацію в домені Е, що приводить до заміни серину на аспарагін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; (д) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24, де поліпептид IMI містить мутацію в домені С, що приводить до заміни аланіну на треонін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; 7 (е) полінуклеотиди, комплементарні до будь-якого з полінуклеотидів (а)-(д) вище. 52. Виділена нуклеїнова кислота IMI за п. 51, де нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, представлений в SEQ ID NO:1. 53. Виділена нуклеїнова кислота IMI за п. 51, де нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, представлений в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. 54. Виділена нуклеїнова кислота IMI за п. 51, де нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, який кодує поліпептид, який представлений в SEQ ID NO:2. 55. Виділена нуклеїнова кислота IMI за п. 51, де нуклеїнова кислота містить полінуклеотид, який кодує поліпептид, який представлений в SEQ ID NO:6 або 24. 56. Спосіб боротьби з бур'янами поблизу рослини, який полягає в тому, що імідазоліноновий гербіцид наносять на бур'яни й на рослину, де рослина має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу й де рослина містить принаймні одну мутовану, рекомбінантну або створену методом генетичної інженерії нуклеїнову кислоту IMI, вибрану із групи, яка включає: (а) нуклеїнові кислоти Imi 2, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1; (б) нуклеїнові кислоти Imi 3, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; (в) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вказану в будь-якій SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; (г) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, де поліпептид IMI містить мутацію в домені Е, що приводить до заміни серину на аспарагін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; (д) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24, де поліпептид IMI містить мутацію в домені С, що приводить до заміни аланіну на треонін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу. 57. Спосіб за п. 56, де рослина містить дві нуклеїнові кислоти IMI. 58. Спосіб за п. 56, де рослина містить нуклеїнову кислоту Imi 2 і нуклеїнову кислоту Imi 3. 59. Спосіб за п. 56, де імідазоліноновий гербіцид вибирають із групи, яка включає 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинову кислоту й суміш метил-6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-мета 92716 8 толуату й метил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-пара-толуату. 60. Спосіб за п. 56, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту. 61. Спосіб за п. 56, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту. 62. Спосіб одержання трансгенної рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, який полягає в тому, що: (а) трансформують рослинну клітину одним або декількома експресійними векторами, які містять принаймні одну мутовану, рекомбінантну або створену методом генетичної інженерії нуклеїнову кислоту IMI; і (б) одержують із рослинної клітини трансгенну рослину, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу; де нуклеїнова кислота IMI вибрана із групи, яка включає: (і) нуклеїнові кислоти Imi 2, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1; (іі) нуклеїнові кислоти Imi 3, які містять полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; (ііі) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, який має амінокислотну послідовність, вказану в будь-якій SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; (іv) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, де поліпептид IMI містить мутацію в домені Е, що приводить до заміни серину на аспарагін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу; (v) полінуклеотиди, які кодують будь-який IMI поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична принаймні на 95 % до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24, де поліпептид IMI містить мутацію в домені С, що приводить до заміни аланіну на треонін у білку IMI у порівнянні з білком AHAS дикого типу. 63. Спосіб боротьби з бур'янами поблизу рослини, який полягає в тому, що імідазоліноновий гербіцид наносять на бур'яни й на рослину, де рослина має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу й де рослина має толерантність до гербіцидів, характерні для рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 або PTA-4960, де (а) рослина пшениці є рослинною лінією, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, 9 92716 10 РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA4923 або PTA-4960; (б) рослина пшениці є рекомбінантним або створеним за допомогою генетичної інженерії похідним рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 або PTA-4960; (в) рослина пшениці є будь-яким потомством рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA4921, РТА-4922, PTA-4923 й PTA-4960; або (г) рослина є рослиною тритикале, яка є рекомбінантним або створеним за допомогою генетичної інженерії похідним рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 або PTA-4960; (д) рослина є рослиною тритикале, яка є будьяким потомством рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA-4923 й PTA-4960; або (е) рослина є нащадком будь-якої з рослин, вказаних в (а)-(д). 64. Спосіб за п. 63, де імідазоліноновий гербіцид вибирають із групи, яка включає 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинову кислоту й суміш метил-6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-метатолуату й метил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-пара-толуату. 65. Спосіб за п. 63, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту. 66. Спосіб за п. 63, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту. 67. Рослина пшениці за пунктом 1, де: (а) рослина пшениці є рослинною лінією, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA-4913, PTA4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА-4922, PTA4923 або PTA-4960; або (б) рослина пшениці є похідним рослинної лінії, типовий зразок насіння цієї лінії задепоновано в ATCC для цілей патентування під реєстраційним номером PTA-4910, PTA-4911, PTA-4912, PTA4913, PTA-4914, PTA-4915, РТА-4916, PTA-4917, PTA-4918, РТА-4919, PTA-4920, PTA-4921, РТА4922, PTA-4923 або PTA-4960. Даний винахід загалом стосується рослин, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. Більш конкретно даний винахід стосується рослин пшениці, отриманих шляхом мутагенезу й кросбрідингу й трансформації, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. Синтаза ацетогідроксикислот (AHAS; КФ 4.1.3.18, ацетолактатасинтаза (ALS)), яка кодується нуклеїновою кислотою Als, являє собою перший фермент, який каталізує біохімічний синтез амінокислот з розгалуженими ланцюгами, таких як валін, лейцин й ізолейцин (Singh В.K. «Biosynthesis of valine, leucine й isoleucine» в: Plant amino acids, під ред. Singh В.K., вид-во Marcel Dekker Inc. New York, New York, 1999, cтop.227-247). AHAS є мішенню дії чотирьох структурно різних сімейств гербіцидів, таких як сульфонілсечовини (LaRossa R.А. і Faico S.С, Trends Biotechnol 2, 1984, стор.158-161), імідазолінони (Shaner й ін., Plant Physiol 76, 1984, стор.545-546), триазолопіримідини (Subramanian й Gerwick, Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines в: Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, під ред. Whitaker J.R., Sonnet P.E., вид-во American Chemical Sodety. Washington, D.C., 1989, стор.277288) і піримідилоксибензоати (Subramanian й ін., Plant Physiol 94, 1990, стор.239-244.). Гербіциди із сімейства імідазолінонів і сульфонілсечовин широко використовують у сучасному сільському господарстві завдяки їх ефективності в дуже невеликих нормах витрати й відносно низькій токсичності для тварин. Шляхом інгібування активності AEAS представники цих сімейств гербіцидів перешкоджають подальшому росту й розвитку чутливих до них рослин, включаючи багато видів бур'янів. Як деякі приклади імідазолінонових гербіцидів, які надходять у продаж, можна навести PURSUIT® (імізетапір), SCEPTER® (імазахін), і ARSENAL® (імазапір). Прикладами гербіцидів із сімейства сульфонілсечовин є хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфурон-метил, хлоримурон-етил, трифенсульфурон-метил, трибенурон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, етаметсульфурон-метил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примісульфурон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфу 11 рон, імазосульфурон, піразосульфурон-етил і галосульфурон. Завдяки їх високій ефективності й низькій токсичності, імідазолінонові гербіциди є переважними для обприскування верхніх частин рослин на великій площі їх виростання. Можливість здійснювати гербіцидом обприскування верхніх частин рослин на великій площі їх виростання знижує вартість, пов'язану зі створенням і підтримкою плантацій, і знижує необхідність у підготовці місць виростання перед обробкою такими хімічними засобами захисту рослин. Обприскування верхніх частин необхідних толерантних видів приводить також до можливості досягнення максимального потенційного врожаю необхідних видів через відсутність видів-конкурентів. Однак можливість застосування таких методів обприскування верхніх частин рослини залежить від присутності толерантних до імідазолінону видів необхідної рослинності в ділянці проведення обробок. З основних сільськогосподарських культур деякі види бобових, такі як соя, мають природну толерантність до імідазолінонових гербіцидів завдяки їх здатності швидко метаболізувати гербіциди (Shaner й Robson, Weed Sci. 33, 1985, сс.469-471). Інші культурні рослини, такі як кукурудза (Newhouse й ін. Plant Physiol. 100, 1992, стор.882886) і рис. (Barrett й ін., Crop Safeners for Herbicides, вид-во Academic Press, New York, 1989, стор.195-220), чутливі до дії імідазолінонових гербіцидів. Різний рівень чутливості до імідазолінонових гербіцидів залежить від хімічної природи конкретного гербіциду й різного метаболізму конкретної сполуки в кожній рослині, що приводить до перетворення токсичної форми в нетоксичну (Shaner й ін., Plant Physiol. 76, 1984, стор.545-546; Brown й ін., Pestic. Biochm. Physiol, 27, 1987, стор.24-29). Чутливість залежить також більшою мірою від інших фізіологічних відмінностей рослин, таких як абсорбція й транслокація (Shaner й Robson, Weed Sci. 33, 1985, стор.469-471). Сорти культурних рослин, які мають толерантність до імідазолінонів, сульфонілсечовин і триазолопіримідинів, були успішно отримані з використанням мутагенезу насіння, мікроспори, пилку й калюсу таких рослин, як Zea mays, Brassica napus, Glycine max й Nicotiana tabacum (Sebastian й ін., Crop Sci 29, 1989, стор.1403-1408; Swanson й ін., Theor. Appl. Genet 78, 1989, стор.525-530; Newhouse й ін., Theor. Appl. Genet 83, 1991, стор.65-70; Sathasivan й ін., Plant Physiol. 97, 1991, cтop.1044-1050; Mourand й ін., J. Heredity 84, 1993, стор.91-96). У всіх випадках толерантність була обумовлена індивідуальним частково домінантним ядерним геном. Раніше за допомогою мутагенезу насіння були отримані також толерантні до імідазолінонів чотири лінії рослин пшениці Triticum aestivum L. cv Rdel (Newhouse й ін., Plant Physiol. 100, 1992, стор.882-886). Досліди з оцінки особливостей успадкування підтвердили, що толерантність обумовлена індивідуальним частково домінантним геном. Ґрунтуючись на вивченні алелів, автори зробили висновок про те, що мутації в чотирьох ідентифікованих лініях локалізовані в тому самому локусі. Один з генів, що обумовлюють то 92716 12 лерантність культивару Fidel, був позначений як FS-4 (Newhouse й ін., Plant Physiol. 100, 1992, стор.882-886). Комп'ютерне моделювання тривимірної конформації комплексу AHAS-інгібітор дозволило передбачити декілька амінокислот у передбачуваній «кишені», що зв'язується з інгібітором, як сайти, у яких індуковані мутації, очевидно, обумовлювали вибірну толерантність до імідазолінонів (Ott й ін., J. Моl. Віоl. 263, 1996, стор.359-368). Дійсно рослини тютюну, отримані з використанням деяких таких навмисно створених мутацій у передбачуваних сайтах зв'язування ферменту AHAS, мали специфічну толерантність до одного класу гербіцидів (Ott й ін., J. Моl. Віоl. 263, 1996, стор.359368). Толерантність рослин до імідазолінонових гербіцидів описана також у багатьох патентах. В U.S. 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439 й 6222100 описано в цілому застосування змінених нуклеїнових кислот Als для створення толерантності до гербіцидів у рослин й, зокрема, описані толерантні до деяких імідазолінонів лінії кукурудзи. В U.S. 5013659 описані рослини, що мають мутації, які зумовлюють толерантність до гербіцидів, які зачіпають принаймні одну амінокислоту в одній або декількох консервативних ділянках. Описані мутації кодують або перехресну толерантність до імідазолінонів й сульфонілсечовин, або специфічну толерантність до сульфонілсечовин, однак специфічна толерантність до імідазолінонів до теперішнього часу не описана. Крім того, в U.S. 5731180 й U.S. 5767361 описаний виділений ген, який кодує одну амінокислотну заміну в амінокислотній послідовності AHAS дикого типу однодольних рослин, яка обумовлює специфічну толерантність до імідазолінонів. У відомому дотепер рівні техніки не описані толерантні до імідазолінонів рослини пшениці Triticum turgidum або толерантні до імідазолінонів рослини тритікале. Дотепер не описані також толерантні до імідазолінонів рослини, які містять принаймні одну змінену нуклеїнову кислоту Als Triticum turgidum. He описані також толерантні до імідазолінонів рослини пшениці, які несуть мутації в геномах, відмінних від геному, з якого виведений ген FS-4. Таким чином, у даній галузі техніки зберігається необхідність в ідентифікації генів, які обумовлюють толерантність до імідазолінонів, з інших геномів і видів. У даній галузі техніки існує також необхідність у створенні рослин пшениці й рослин тритікале, які мають підвищену толерантність до гербіцидів, таких як імідазолінон, і які містять принаймні одну змінену нуклеїнову кислоту Als. Потрібні також методи боротьби з бур'янами, які виростають поблизу таких рослин пшениці або рослин тритікале. Ці композиції й способи повинні дозволяти здійснювати обприскування верхніх частин рослин як метод застосування гербіцидів у місцях виростання рослин пшениці або рослин тритікале. У даному винаході запропоновані рослини пшениці, які несуть нуклеїнові кислоти ІМІ, де рослина пшениці має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. Рослини пшениці можуть 13 містити один, два, три або більшу кількість ІМІалелів. Відповідно до одного варіанта здійснення винаходу рослина пшениці містить принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу нуклеїнову кислоту ІМІ вибирають із групи, яка включає нуклеїнову кислоту Imi 1, нуклеїнову кислоту Imi 2 і нуклеїнову кислоту Imi 3. Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу принаймні одна нуклеїнова кислота ІМІ являє собою нуклеїнову кислоту ІМІ Triticum turgidum. Згідно із ще одним варіантом здійснення винаходу принаймні одна нуклеїнова кислота ІМІ являє собою нуклеїнову кислоту ІМІ підвидів дурум (пшениця тверда, пшениця класу II за стандартами США). Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу рослина пшениці містить декілька нуклеїнових кислот ІМІ, локалізованих у різних геномах. Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу декілька нуклеїнових кислот ІМІ містять нуклеїнову кислоту Imi 2 Triticum turgidum і нуклеїнову кислоту Imi 3 Triticum turgidum. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу декілька нуклеїнових кислот ІМІ містять нуклеїнову кислоту Imi 2 підвидів дурум і нуклеїнову кислоту Imi 3 підвидів дурум. Переважно нуклеїнові кислоти ІМІ кодують білки, які містять мутацію в консервативній амінокислотній послідовності, вибраній із групи, яка включає домен А, домен В, домен С, домен D і домен Е. Більш переважно мутація знаходиться в консервативному домені Е. Винахід стосується також частин рослин і насіння рослин, отриманих із представлених в описі рослин пшениці. Даний винахід стосується також рослин тритікале, які містять нуклеїнові кислоти ІМІ, де рослини тритікале мають підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослин тритікале дикого типу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу рослина тритікале містить принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ вибирають із групи, яка включає нуклеїнову кислоту Imi 1, нуклеїнову кислоту Imi 2 і нуклеїнову кислоту Imi 3. Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу принаймні одна нуклеїнова кислота ІМІ являє собою нуклеїнову кислоту ІМІ Triticum turgidum. Згідно із ще одним варіантом здійснення винаходу принаймні одна нуклеїнова кислота ІМІ являє собою нуклеїнову кислоту ІМІ підвидів дурум. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу рослина тритікале містить декілька нуклеїнових кислот ІМІ, локалізованих у різних геномах. Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу декілька нуклеїнових кислот ІМІ містять нуклеїнову кислоту Imi 2 Triticum turgidum і нуклеїнову кислоту Imi 3 Triticum turgidum. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу декілька нуклеїнових кислот ІМІ містять нуклеїнову кислоту Imi 2 підвидів дурум і нуклеїнову кислоту Imi 3 підвидів дурум. Відповідно до наступного варіанта здійснення винаходу нуклеїнові кислоти ІМІ кодують білки, які містять мутацію в консервативній амінокислотній послідовності, вибраній із групи, яка 92716 14 включає домен А, домен В, домен С, домен D і домен Е. Винахід стосується також частин рослин і насіння рослин, отриманих із представлених в описі рослин тритікале. Нуклеїнові кислоти ІМІ, запропоновані в даному винаході, можуть містити нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає: полінуклеотид, який має послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5. або SEQ ID NO:23; полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; полінуклеотид, який містить принаймні 60 послідовних нуклеотидів будь-якого із вказаних вище полінуклеотидів; і полінуклеотид, комплементарний до будь-якого із вказаних вище полінуклеотидів. Рослини, запропоновані в даному винаході, можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Приклади нетрансгенних рослин пшениці, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів, включають рослини пшениці, які депоновані в АТСС (Американська колекція типових культур) під реєстраційним номером для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА-4912, РТА4913, РТА-4914, РТА-4915, РТА-4916, РТА-4917. РТА-4918, РТА-4919, РТА-4920, РТА-4921. РТА4922, РТА-4923 або РТА-4960; або мутант, рекомбінант або створене за допомогою генної інженерії похідне рослини, депонованої в АТСС під реєстраційним номером для мети патентування РТА4910, РТА-4911, РТА-4912, РТА-4913. РОТА-4914, РТА-4915, РТА-4916, РТА-4917, РТА-4918, РТА4919, РТА-4920, РТА-4921, РТА-4922, РТА-4923 або РТА-4960; або будь-яке потомство рослини, депонованої в АТСС під реєстраційним номером для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА4912, РТА-4913, РТА-4914, РТА-4915, РТА-4916, РТА-4917, РТА-4918, РТА-4919, РТА-4920, РТА4921, РТА-4922, РТА-4923 або РТА-4960; або рослина, яка є нащадком будь-якої із вказаних рослин. Крім композицій, запропонованих у даному винаході, у винаході запропоновано також декілька способів. Запропоновані у винаході способи стосуються способів модифікації толерантності рослин до імідазолінонових гербіцидів, які полягають у тому, що модифікують експресію нуклеїнової кислоти ІМІ у рослині. Описані також способи одержання трансгенної рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, які полягають у тому, трансформують рослинну клітину експресійним вектором, який містить одну або декілька нуклеїнових кислот ІМІ, і одержують рослину з рослинної клітини. Винахід стосується також способу боротьби з бур'янами поблизу рослини, який полягає в тому, що імідазоліноновий гербіцид наносять на бур'яни й на рослину, де рослина має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з популяцією рослин дикого типу й де рослина містить одну або декілька нуклеїнових кислот ІМІ. У деяких переважних варіантах цих способів рослини містять декілька нуклеїнових кислот ІМІ, локалізованих у різних геномах пшениці. 15 На кресленнях показано: на Фіг.1 - порівняльний аналіз послідовності ДНК гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Сіссо (SEQ ID NО:11), гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Colosseo (SEQ ID NO:14), гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Utopia (SEQ ID NO:16) і консенсусної послідовності гена Als 2 пшениці підвиду дурум (SEQ ID NO:19). Серед сортів не виявлено поліморфізму; на Фіг.2 - порівняльний аналіз послідовності ДНК гена Als 3, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Ciccio (SEQ ID NO:13), гена Als 3, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Colosseo (SEQ ID NO:15), гена Als 3, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Utopia (SEQ ID NO:17) і консенсусної послідовності гена Als 3 пшениці підвиду дурум (SEQ ID NO:21). Серед сортів не виявлено поліморфізму; на Фіг.3 - порівняльний аналіз послідовності ДНК гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК пшениці підвиду дурум сорту Сіссо (SEQ ID NO:11), гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК толерантної до імідазолінону лінії СІ19 (SEQ ID NO:1), гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК толерантної до імідазолінону лінії UT15 (SEQ ID NO:7), гена Als 2, ампліфікованого з геномної ДНК толерантної до імідазолінону лінії UT19 (SEQ ID NO:9) і консенсусної послідовності гена Als 2 пшениці підвиду дурум (SEQ ID NО:19). Виявлений нуклеотидний поліморфізм, який обумовлює толерантність до імідазолінону лінії СІ19, позначений жирним шрифтом; на Фіг.4 - порівняльний аналіз виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 2 із сорту Сіссо (SEQ ID NO:12), виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 2 з толерантної до імідазолінону лінії СІ 19 (SEQ ID NO:2), виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 2 з толерантної до імідазолінону лінії UT15 (SEQ ID NO:8), виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 2 з толерантної до імідазолінону лінії UT19 (SEQ ID NO:10) і консенсусної послідовності Als 2 пшениці підвиду дурум (SEQ ID NO:20). Поліморфізм, який обумовлює толерантність до імідазолінону лінії СІ 19, позначений жирним шрифтом; на Фіг.5 - порівняльний аналіз послідовності ДНК гена Als 3, ампліфікованого з геномної ДНК сорту Utopia (SEQ ID NO:17), часткової полінуклеотидної послідовності Als 3, ампліфікованої з геномної ДНК толерантної до імідазолінону лінії UT12 (SEQ ID NO:3), гена Als 3, ампліфікованого з геномної ДНК толерантної до імідазолінону лінії UT15 (SEQ ID NO:5), гена Als 3, ампліфікованого з геномної ДНК толерантної до імідазолінону лінії UT19 (SEQ ID NO:23), і консенсусної послідовності гена Als 3 пшениці підвиду дурум (SEQ ID NO:21). Нуклеотидні поліморфізми, які обумовлюють толерантність ліній до імідазолінону, позначені жирним шрифтом; 92716 16 на Фіг.6 - порівняльний аналіз виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 3 із сорту Utopia (SEQ ID NO:18), виведеної амінокислотної послідовності поліпептиду, який кодується частковою полінуклеотидною послідовністю Als 3 з толерантної до імідазолінону лінії UT12 (SEQ ID NO:4), виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 3 з толерантної до імідазолінону лінії UT15 (SEQ ID NO:6), виведеної амінокислотної послідовності білка, який кодується геном Als 3 з толерантної до імідазолінону лінії UT19 (SEQ ID NO:24) і консенсусної послідовності Als 3 пшениці підвиду дурум (SEQ ID NO:22). Нуклеотидний поліморфізм, який обумовлює толерантність лінії UT12 до імідазолінону, позначений жирним шрифтом; на Фіг.7 - схематичне зображення консервативних амінокислотних послідовностей, які кодуються генами AHAS, які беруть участь у наданні толерантності до різних інгібіторів AHAS. Специфічні амінокислотні сайти, відповідальні за толерантність, підкреслені (використані зі змінами дані, отримані Devine Μ. D. і Eberiein С. V. «Physiological, biochemical й molecular aspects of herbicide толерантність based on altered target sites» в: Herbicid Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, вид-во IOS Press, Амстердам, 1997, стор.159-185). Даний винахід стосується рослин пшениці, частин рослин пшениці й клітин рослин пшениці, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. Під обсяг даного винаходу підпадає також насіння, отримане на вказаних рослинах пшениці, і способи боротьби з бур'янами поблизу рослин пшениці, вказаних в описі. Слід розуміти, що в описі й формулі винаходу застосування іменника в однині може мати на увазі також його застосування в множині, залежно від контексту, у якому він використовується. Наприклад, при посиланні на «клітину» слід розуміти, що можна використовувати принаймні одну клітину. У контексті даного опису поняття «рослина пшениці» стосується рослини, яка є представником роду Triticum. Рослини пшениці, запропоновані в даному винаході, можуть бути представниками роду Triticum, який включає (але, не обмежуючись ними). Т. aestivum, Т. turgidum, Т. timopheevii, Т. monococcum, Т. zhukovskyi й Т. urartu, а також їх гібриди. Прикладами підвидів Т. aestivum, що підпадають під обсяг даного винаходу, є aestivum (пшениця звичайна), compactum (пшениця карликова), macha (пшениця Маху), vavilovi (пшениця Вавілова), spelta (пшениця спельта) і sphaecrococcum (пшениця коротка). Прикладами підвидів Т. turgidum, які підпадають під обсяг даного винаходу, є turgidum, carthlicum, dicoccom, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum й dicoccoides. Прикладами підвидів Т. monococcum s ubspedes, які підпадають під обсяг даного винаходу, є mоnососсum (полба, пшениця однозернянка) і aegilopoides. Відповідно до одного з варіантів здійснення даного винаходу рослина пшениці є представником підвидів Triticum turgidum; і насамперед представником підвидів дурум, наприклад 17 представників культиварів Сіссіо, Colosseo або Utopia. Під поняття «рослина пшениці» підпадають рослини пшениці на будь-якій фазі дозрівання або розвитку, а також будь-які тканини або органи (частини рослини), взяті або виведені з такої рослини, якщо інше не випливає з контексту. Частини рослини включають (але, не обмежуючись ними) стебла, корінь, квітки, насінні зачатки, тичинки, листя, зародки, ділянки меристеми, тканину калюсу, культури пиляка, гаметофіти, спорофіти, пилок, мікроспори, протопласти й т.п. Під обсяг даного винаходу підпадає також насіння, яке утворилося на рослинах пшениці, запропонованих у даному винаході. В одному з об'єктів винаходу насіння використовують для розмноження в чистоті (розведення гомозигот) для одержання підвищеної толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з насіннями сорту рослини пшениці дикого типу. Даний винахід стосується також рослин тритікале, частин рослин тритікале й клітин рослин тритікале, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. У контексті даного опису поняття «рослина тритікале» стосується рослини, створеної шляхом схрещування рослини жита (Secale ccreale) або з тетраплоїдною рослиною пшениці (наприклад Triticum turgidum), або з гексаплоїдною рослиною пшениці (наприклад Triticum aestivum). Під обсяг даного винаходу підпадає також насіння, яке утворилося на вказаних в даному описі рослинах тритікале, і способи боротьби з бур'янами поблизу вказаних рослин тритікале. У даному винаході описана рослина пшениці, яка містить принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ, де рослина пшениці має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом цієї рослини дикого типу. Рослини пшениці, запропоновані в даному винаході, можуть мати декілька нуклеїнових кислот ІМІ з різних геномів, оскільки ці рослини можуть нести більше одного геному. Наприклад рослина пшениці Triticum turgidum несе два геноми, які звичайно позначають як геноми А та Б. Оскільки AHAS являє собою необхідний для метаболізму фермент, можна припустити, що кожен геном має принаймні один ген, який кодує фермент AHAS (тобто принаймні один ген Als), як правило, у сполученні з іншими метаболічними ферментами, які наведені на відомих генетичних картах тетраплоїдної пшениці. У контексті даного опису поняття «локус гена Als» стосується положення гена Als у геномі, а поняття «ген Als» й «нуклеїнова кислота Als» стосуються нуклеїнової кислоти, яка кодує фермент AHAS. Нуклеїнова кислота Als у кожному геномі відрізняється за нуклеотидною послідовністю від нуклеїнової кислоти Als в іншому геномі. Фахівець у даній галузі може визначити початковий геном кожної нуклеїнової кислоти Als з використанням методів генетичного схрещування й/або секвенування або шляхом розщеплення екзонуклеазою, ці методи добре відомі фахівцеві в даній галузі. У контексті даного опису поняття «нуклеїнова кислота Als 1», «нуклеїнова кислота Als 2» й «нуклеїнова кислота Als 3» стосується нуклеїнових кислот 92716 18 Als, локалізованих у трьох різних геномах. У контексті даного опису мається на увазі, що локус гена Als 3 локалізований у геномі А, а локус гена Als 2 локалізований у геномі Б. У контексті даного опису мається на увазі також, що нуклеїнові кислоти ІМІ, отримані з геному А або Б, є різними і їх позначають як нуклеїнові кислоти Imi 3 або Іmі 2 відповідно. У контексті даного опису поняття «нуклеїнова кислота ІМІ» стосується нуклеїнової кислоти Als, яка має послідовність, що несе мутацію в порівнянні з нуклеїновою кислотою Als дикого типу, яка надає підвищену толерантність до імідазолінону рослині, у якій відбувається її експресія. У контексті даного опису поняття «нуклеїнова кислота Іmі 1», «нуклеїнова кислота Іmі 2» й «нуклеїнова кислота Іmі 3» стосується нуклеїнових кислот ІМІ, які позначають алелі генів Als I, Als 2 й Als 3 відповідно, які зумовлюють толерантність до імідазолінону. Оскільки рослини пшениці мають по 2 копії кожного геному, то рослини пшениці несуть по дві копії кожної конкретної нуклеїнової кислоти Als. Наприклад, рослина пшениці Triticum turgidum несе по дві копії геномів А та Б й отже по дві копії кожного з генів Als 3 й Als 2. У контексті даного опису поняття «алель ІМІ» стосується однієї копії конкретної нуклеїнової кислоти ІМІ. Таким чином, у контексті даного опису мається на увазі, що рослина пшениці може мати дві копії алелів Imi 2, по одній з кожної двох копій геному Б. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу рослина пшениці містить декілька нуклеїнових кислот ІМІ. У контексті даного опису при посиланні на рослину, яка містить «декілька нуклеїнових кислот ІМІ», фраза «декілька нуклеїнових кислот ІМІ» означає присутність різних нуклеїнових кислот ІМІ у рослині й не залежить від того, чи є рослина гомозиготною або гетерозиготною, зокрема за локусом Als. Наприклад, рослина, яка містить декілька нуклеїнових кислот ІМІ, може містити нуклеїнову кислоту Imi 2 й Imi 3, на відміну від рослини, що несе дві копії нуклеїнової кислоти Imi 2. Клас нуклеїнових кислот Imi 2 включає нуклеїнову кислоту Imi 2 з описаних нижче ліній СІ19, UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17 й UT20. Клас нуклеїнових кислот Imi 3 включає нуклеїнові кислоти Imi 3 з описаних нижче ліній UT12, UT15 й UT19. Кожен клас Imi може включати представників, отриманих з різних видів пшениці. Таким чином, кожен клас Imi включає нуклеїнові кислоти ІМІ, які відрізняються за нуклеотидною послідовністю, але для яких проте встановлено з використанням аналізів успадковування, відомих звичайним фахівцям у даній галузі, що вони отримані з того самого геному пшениці або локалізовані в тому самому геномі. Таким чином, під обсяг даного винаходу підпадає рослина пшениці, яка містить принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ, де рослина пшениці має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу й де принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ вибирають із групи, яка включає нуклеїнову кислоту Imi 1, нуклеїнову кислоту Imi 2 і нуклеїнову кислоту Imi 3. Відповідно до одного з варіантів здійс 19 нення винаходу рослина містить як нуклеїнову кислоту Imi 2, так і нуклеїнову кислоту Imi 3. У переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота Imi 2 має полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота Imi 3 має полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. Під обсяг даного винаходу підпадає толерантна до імідазолінону рослина тритікале. У контексті даного опису поняття «рослина тритікале» стосується рослини, створеної шляхом схрещування рослини жита (Secale czreale) або з тетраплоїдною рослиною пшениці (наприклад Triticum turgidum), або з гексаплоїдною рослиною пшениці (наприклад Triticum aestivum). У контексті даного опису мається на увазі, що толерантна до імідазолінону рослина тритікале містить принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ, де рослина тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу й де принаймні одну нуклеїнову кислоту ІМІ вибирають із групи, яка включає нуклеїнову кислоту Imi 1, нуклеїнову кислоту Imi 2 і нуклеїнову кислоту Imi 3. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу рослина містить як нуклеїнову кислоту Imi 2, так і нуклеїнову кислоту Imi 3. У переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота Imi 2 має полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота Imi 3 має полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. У контексті даного опису відносно нуклеїнових кислот поняття «з» стосується нуклеїнової кислоти «локалізованої» у конкретному геномі або «виведеної» з конкретного геному. Поняття «локалізована в» стосується нуклеїнової кислоти, яка входить у конкретний геном. У контексті даного опису поняття «виведена з» стосується нуклеїнової кислоти, яка була вилучена або виділена з геному. Поняття «виділена» більш докладно буде описано нижче. Під обсяг даного винаходу підпадають рослини пшениці, які несуть 1, 2 або 3 алелі ІМІ, де рослина пшениці має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. Алелі ІМІ можуть містити нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає полінуклеотид, вказаний в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; полінуклеотид, який містить принаймні 60 послідовних нуклеотидів будьякого з вищевказаних полінуклеотидів; і полінуклеотид, комплементарний до будь-якого з вищевказаних полінуклеотидів. Під обсяг даного винаходу підпадають рослини тритікале, які несуть 1, 2 або 3 алелі ІМІ, де рослина тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. Алелі ІМІ можуть містити нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає полінуклеотид, вказаний в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID 92716 20 NO:5 або SEQ ID NO:23; полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; полінуклеотид, який містить принаймні 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з вищевказаних полінуклеотидів; і полінуклеотид, комплементарний до будь-якого з вищевказаних полінуклеотидів. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу рослина пшениці або рослина тритікале містить дві різні нуклеїнові кислоти ІМІ, де нуклеїнові кислоти виведені або локалізовані в різних геномах пшениці. Переважно дві нуклеїнові кислоти являють собою нуклеїнову кислоту Іmі 2 і нуклеїнову кислоту Іmі 3. Більш переважно нуклеїнова кислота Іmі 2 містить полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, а нуклеїнова кислота Іmі 3 містить полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. В іншому варіанті здійснення рослина пшениці або рослина тритікале містить нуклеїнову кислоту ІМІ, де нуклеїнова кислота має полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. Згідно із ще одним варіантом здійснення винаходу рослина пшениці містить більше двох нуклеїнових кислот ІМІ, де кожна нуклеїнова кислота ІМІ виведена з різних геномів. Переважно принаймні одна з нуклеїнових кислот ІМІ містить полінуклеотидну послідовність, вибрану із групи, яка включає SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. У переважному варіанті здійснення даного винаходу виділена нуклеїнова кислота ІМІ кодує амінокислотну послідовність, яка несе мутацію в домені, який є консервативним для декількох білків AHAS. Ці консервативні домени позначені в контексті даного опису як домен А, домен В, домен С, домен D і домен Е. На Фіг.7 показана загальна локалізація кожного домену в білку AHAS. Домен А містить амінокислотну послідовність AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:25). Домен В містить амінокислотну послідовність QWED (SEQ ID NO:26). Домен С містить амінокислотну послідовність VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:27). Домен D містить амінокислотну послідовність AFQETP (SEQ ID NO:28). Домен Ε містить амінокислотну послідовність IPSGG (SEQ ID NO:29). У даному винаході мається на увазі також, що в консервативних доменах можуть бути зроблені невеликі варіації, наприклад, у рослинах нетреби залишок серину в домені замінений залишком аланіну. Таким чином, даний винахід стосується рослини пшениці, яка несе нуклеїнову кислоту ІМІ, яка кодує амінокислотну послідовність, яка має мутацію в консервативному домені, вибраному із групи, яка включає домен А, домен В, домен С, домен D і домен Е. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу рослина пшениці містить нуклеїнову кислоту ІМІ, яка кодує амінокислотну послідовність, яка має мутацію в домені Е. Відповідно до переважних варіантів здійснення винаходу мутації в консервативних доменах відбуваються в положеннях, які позначені шляхом підкреслення: AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:25); QVVED (SEQ ID NO:26); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID 21 NJ:27); AFQETP (SEQ ID NO:28) і IPSGG (SEQ ID NO:29). Однією із переважних замін є аспарагіну на серин у домені Е. Імідазолінонові гербіциди можна вибирати із групи, яка включає (але, не обмежуючись ними) PURSUIT® (імізетапір), CADRE® (імазапік), RAPTOR® (імазамокс), SCEPTER® (імазахін), ASSERT® (імазетабенз) ARSENAL® (імазапір), похідне будь-якого з вищевказаних гербіцидів або суміш двох або більшої кількості вищевказаних гербіцидів, наприклад, імазапір/імазамокс (ODYSSEY®). Більш переважно імідазоліноновий гербіцид може бути вибраний із групи, яка включає (але не обмежуючись ними) 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонову кислоту, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)нікотинову кислоту, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинову кислоту й суміш метил-6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-мтолуату й метил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-п-толуату. Переважним є застосування 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти й 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)нікотинової кислоти. Особливо переважним є застосування 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)нікотинової кислоти. Рослини пшениці, запропоновані в даному винаході, можуть являти собою або трансгенні рослини пшениці, або нетрансгенні рослини пшениці. Аналогічно до цього рослини тритікале, запропоновані в даному винаході, можуть являти собою або трансгенні рослини тритікале, або нетрансгенні рослини тритікале. У контексті даного опису поняття «трансгенний» стосується будь-якої рослини, рослинної клітини, калюсу, рослинної тканини або частини рослини, які містять весь рекомбінантний полінуклеотид або принаймні його частину. У багатьох випадках весь рекомбінантний полінуклеотид або його частина стабільно інтегровані в хромосому або являють собою стабільний позахромосомний елемент, внаслідок чого він переноситься в наступні покоління. У контексті даного опису поняття «рекомбінантний полінуклеотид» стосується полінуклеотиду, який був змінений, перегрупований або модифікований за допомогою генної інженерії. Прикладами є будь-які клоновані полінуклеотиди або полінуклеотиди, які зв'язані або зчленовані з гетерологічними послідовностями. Поняття «рекомбінантний» не стосується змін полінуклеотидів, які є результатом подій, які зустрічаються в природних умовах, таких як спонтанні мутації, або результатом неспонтанного мутагенезу з наступною вибірною селекцією. Рослини, що містять мутації, які виникли в результаті неспонтанного мутагенезу й вибірної селекції, позначені в контексті даного опису як нетрансгенні рослини, і вони підпадають під обсяг даного винаходу. У тих варіантах здійснення винаходу, у яких рослина пшениці є трансгенною і містить декілька 92716 22 нуклеїнових кислот ІМІ, нуклеїнові кислоти можуть бути отримані з різних геномів або з того самого геному. В альтернативних варіантах здійснення винаходу, у яких рослина пшениці є нетрансгенною і містить декілька нуклеїнових кислот ІМІ, нуклеїнові кислоти локалізовані в різних геномах або в тому самому геномі. Прикладом нетрансгенної лінії рослин пшениці, які містять одну нуклеїнову кислоту ІМІ, є лінія рослин, депонована в АТСС під реєстраційним номером для мети патентування РТА-4960 і позначена в даному описі як лінія пшениці СІ19. Лінія пшениці СІ 19 містить нуклеїнову кислоту Imi 2. Нуклеотидна послідовність, яка відповідає локусу гена Als 2 лінії СІ19, представлена в SEQ ID NO:1. Іншими прикладами нетрансгенних ліній рослин пшениці, які містять одну нуклеїнову кислоту ІМІ, є лінії рослин, депонованих в АТСС під реєстраційними номерами для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА-4912, РТА-4913, РТА-4914, РТА4915, РТА-4917, РТА-4918. РТА-4920, РТА-4921, РТА-4923 й РТА-4960; і вони позначені в даному описі як лінії UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10. UT13, UT14, UT16, UT17 й UT20 відповідно. Нуклеотидна послідовність, яка відповідає локусу гена Als 2 у лініях UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17 й UT20, ідентична до полінуклеотидної послідовності, наведеної в SEQ ID NO:1. Ще одним прикладом нетрансгенної лінії рослин пшениці, які містять одну нуклеїнову кислоту ІМІ, є лінія рослин, депонована в АТСС під реєстраційним номером для мети патентування РТА4916 і позначена в даному описі як лінія пшениці UT12. Лінія пшениці UT12 містить нуклеїнову кислоту Imi 3. Нуклеотидна послідовність, що відповідає локусу гена Als 3 у лінії UT12, представлена в SEQ ID NO:3. Наступним прикладом нетрансгенної лінії рослин пшениці, які містять одну нуклеїнову кислоту ІМІ, є лінія рослин, депонована в АТСС під реєстраційним номером для мети патентування РТА4919 і позначена в даному описі як лінія пшениці UT15. Лінія пшениці UT15 містить нуклеїнову кислоту Imi 3. Нуклеотидна послідовність, яка відповідає локусу гена Als 3 у лінії UT15, представлена в SEQ ID NO:5. Ще одним прикладом нетрансгенної лінії рослин пшениці, які містять одну нуклеїнову кислоту ІМІ, є лінія рослин, депонована в АТСС під реєстраційним номером для мети патентування РТА-4922 і позначена в даному описі як лінія пшениці UT12. Лінія пшениці UT12 містить нуклеїнову кислоту Imi 3. Нуклеотидна послідовність, яка відповідає локусу гена Als 3 у лінії UT12, представлена в SEQ ID NO:23. Декілька депозитів приблизно по 2500 у кожній з толерантних до імідазолінону ліній пшениці були поміщені в Американську колекцію типових культур, Манассас, шт. Віргінія, 7 січня 2003р. й 28 січня 2003р. Ці депозити зроблені у відповідності зі строками й умовами Будапештського договору, який стосується депонування мікроорганізмів. Депозити повинні зберігатися протягом принаймні 30 років і принаймні протягом 5 років після останньої вимоги про їх надання, отриманого АТСС. Депоно 23 ваному насінню присвоєні реєстраційні номери для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА4912, РТА-4913. РТА-4914, РТА-4915, РТА-4916. РТА-4917, РТА-4918. РТА-4919, РТА-4920, РТА4921, РТА-4922, РТА-4923 й РТА-4960. Даний винахід стосується рослини пшениці, яка має реєстраційний номер для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА-4912, РТА-4913, РТА-4914, РТА-4915, РТА-4916, РТА-4917, РТА4918, РТА-4919, РТА-4920, РТА-4921, РТА-4922, РТА-4923 або РТА-4960; мутанту, рекомбінанту або створеному за допомогою генної інженерії похідному рослини, що має реєстраційний номер для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА4912, РТА-4913, РОТА-4914, РОТА-4915, РОТА4916, РОТА-4917, РОТА4918. РОТА-4919, РОТА4920, РОТА-4921. РОТА-4922, РОТА-4923 або РТА-4960; будь-якому нащадкові рослини, який має реєстраційний номер для мети патентування РТА-4910, РТА-4911, РТА-4912, РТА-4913, РОТА4914, РТА-4915. РОТА-4916, РОТА-4917, РТА4918, РОТА-4919, РТА-4920, РТА-4921, РОТА4922. РОТА-4923 або РТА-4960; і рослині, яка є нащадком будь-яких цих рослин. Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу рослина пшениці, запропонована в даному винаході, додатково має ознаки толерантності до гербіцидів, характерні для рослини, яка має реєстраційний номер для мети патентування РТА-4910, РТА4911, РТА-4912, РТА-4913, РТА-4914, РТА-4915, РОТА-4916. РТА-4917, РТА-4918, РОТА-4919, РТА-4920, РТА-4921, РОТА-4922, РТА-4923 й РТА4960. Даний винахід стосується також гібридів рослин пшениці, представлених у даному описі, з іншою рослиною пшениці. Інша рослина пшениці являє собою (але не обмежуючись ними) Т. aestivum cv Fidel і будь-яку іншу рослину пшениці, яка несе мутантний ген FS-1, FS-2. FS-3 або FS-4 (див. U.S. 6339184 і заявку на U.S. No.08/474832). Переважні гібриди містять комбінацію нуклеїнових кислот Imi 1, Іmі 2 й/або Іmі 3. Поняття «культивар» й «сорт» стосуються групи рослин всередині одного виду, які несуть загальний набір характеристик або ознак, який розглядається фахівцями в даній галузі як достатній для того, щоб відрізняти один культивар або сорт від іншого культивару або сорту. Ні для одного із вказаних понять не мається на увазі, що всі рослини будь-якого конкретного культивару або сорту повинні бути генетично ідентичними або на рівні всього гена, або молекули, або що вказана конкретна рослина повинна бути гомозиготною у всіх локусах. Культивар або сорт вважаються отриманими в результаті «розведення гомозигот» за конкретною ознакою, якщо при самозапиленні отриманого «розведенням гомозигот» культивару або сорту все потомство несе вказану ознаку. Поняття «лінійне розведення (розведення гомозигот)» або «лінія» стосуються групи рослин культивару, які несуть загальний набір характеристик або ознак, який розглядається фахівцями в даній галузі як достатній для того, щоб відрізняти одне лінійне розведення або лінію від іншого лінійного розведення або лінії. Ні для одного із вказаних понять 92716 24 не мається на увазі, що всі рослини будь-якої конкретної лінії розведення або лінії повинні бути генетично ідентичними або на рівні всього гена, або на молекулярному рівні, або що вказана конкретна рослина повинна бути гомозиготною у всіх локусах. Лінія розведення або лінія вважаються отриманою у результаті «розведення гомозигот» за конкретною ознакою, якщо при самозапиленні отриманої «розведенням гомозигот» лінії розведення або лінії все потомство несе вказану ознаку. У контексті даного опису мається на увазі, що ознака виникає в результаті мутації в гені Als рослини або насінні пшениці або тритікале. Слід розуміти також, що рослина пшениці або тритікале, запропонована в даному винаході, може містити нуклеїнову кислоту Als дикого типу крім нуклеїнової кислоти ІМІ. Мається на увазі, що толерантні до імідазолінону лінії можуть мати мутацію тільки в одному з багатьох ізоферментів AHAS. Таким чином, даний винахід стосується рослини пшениці або тритікале, яка містить одну або декілька нуклеїнових кислот ІМІ додатково до однієї або декількох нуклеїнових кислот Als дикого типу. Крім рослин пшениці й тритікале даний винахід стосується також виділених білків і нуклеїнових кислот ІМІ. Нуклеїнові кислоти містять полінуклеотид, вибраний із групи, яка включає полінуклеотид, який має послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23; полінуклеотид, який кодує поліпептид, який має послідовність SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24; полінуклеотид, який містить принаймні 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з вищевказаних полінуклеотидів; і полінуклеотид, комплементарний до будь-якого з вищевказаних полінуклеотидів. Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу нуклеїнова кислота ІМІ містить полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. Відповідно до іншого переважного варіанта здійснення винаходу нуклеїнова кислота ІМІ містить полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:3. Згідно із ще одним переважним варіантом здійснення винаходу нуклеїнова кислота ІМІ містить полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:5. Поняття «білок AHAS» або «поліпептид AHAS» стосується білка синтази ацетогідроксикислот, а поняття «білок ІМІ» стосується будь-якого білка AHAS, який є мутантом білка AHAS дикого типу і який надає підвищену толерантність до імідазолінону рослині, рослинній клітині, частині рослини, насінню рослини або рослинній тканині при експресії в них. У переважному варіанті здійснення винаходу білок ІМІ містить поліпептид, який кодується полінуклеотидною послідовністю, яка містить SEQ ID NO:1. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу білок ІМІ містить поліпептид, який кодується полінуклеотидною послідовністю, яка містить SEQ ID NO:3. Ще в одному переважному варіанті здійснення винаходу білок ІМІ містить поліпептид, який кодується полінуклеотидною послідовністю, яка містить SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. У контексті даного опису також поняття «нуклеїнова кислота» й «полінуклеотид» стосуються РНК або ДНК, яка може бути лінійною або 25 розгалуженою, одноланцюговою або дволанцюговою, або її гібриду. Під поняття підпадають також гібриди РНК/ДНК. Під ці поняття підпадає також нетрансльована послідовність, локалізована як на 3'-, так і на 5'-кінцях кодувальної ділянки гена: на відстані принаймні приблизно 1000 нуклеотидів вказаної послідовності проти ходу транскрипції від 5'-кінця кодувальної ділянки і принаймні приблизно 200 нуклеотидів вказаної послідовності по ходу транскрипції від 3'-кінці кодувальної ділянки гена. Більш рідкі основи, такі як інозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенін, гіпоксантин й інші, можна застосовувати також у випадку антисмислової дволанцюгової (ds)PHK і для спарювання рибозимів. Наприклад, встановлено, що полінуклеотиди, які містять С-5 пропіонові аналоги уридину й цитидину, зв'язуються із РНК із високою афінністю і є ефективними антисмисловими інгібіторами експресії гена. Можна здійснювати також інші модифікації, такі як модифікація фосфодіефірного каркасу або 2'гідроксигрупи в залишку цукру рибози в РНК. Антисмислові полінуклеотиди й рибозими можуть повністю складатися з рибонуклеотидів або можуть містити суміш рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів. Полінуклеотиди, запропоновані у винаході, можна одержувати будь-якими методами, у тому числі за допомогою геномних препаратів, препаратів кДНК, синтезу in vitro, ЗТ-ПЛР і транскрипції in vitro або in vivo. Поняття «виділена молекула нуклеїнової кислоти» стосується молекули, яка практично відділена від інших молекул нуклеїнових кислот, які присутні в джерелі нуклеїнової кислоти, що зустрічається в природних умовах, (тобто послідовностей, які кодують інші поліпептиди). Переважно «виділена» нуклеїнова кислота не містить деяких послідовностей, які в природних умовах фланкують нуклеїнову кислоту (тобто послідовностей, локалізованих на 5'- і 3 і-кінцях нуклеїнової кислоти) у її репліконі, який зустрічається в природних умовах. Наприклад, клонована нуклеїнова кислота вважається виділеною. Відповідно до різних варіантів здійснення винаходу виділена молекула нуклеїнової кислоти ІМІ може містити менше приблизно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 або 0,1 т.п.н. нуклеотидних послідовностей, які в природних умовах фланкують молекулу нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої нуклеїнова кислота отримана (наприклад клітини Triticum turgidum). Нуклеїнова кислота також вважається виділеною, якщо вона вже піддавалася обробці людиною або поміщена в локус або локалізована в сайті, який зустрічається в природних умовах, або її інтродукували в клітину шляхом зараження Agrobacterium, біобалістичним методом або за допомогою будь-якого іншого методу трансформації рослин. Крім того, «виділена» молекула нуклеїнової кислоти, така як молекула кДНК, може бути вільна від деякого іншого клітинного матеріалу, з яким вона зв'язана в природних умовах, або від клітинного середовища, при її одержанні за допомогою методів рекомбінації, або від хімічних попередників або інших хімічних речовин, коли її одержують хімічним синтезом. Конкретними виключеннями, які не підпадають поняття «виділені нуклеїнові кислоти», є: хромо 92716 26 соми, які зустрічаються в природних умовах (такі як хромосомні препарати), бібліотеки штучних хромосом, геномні бібліотеки й бібліотеки кДНК, які існують або у вигляді препарату нуклеїнової кислоти in vitro, або у вигляді препарату трансфектованих/трансформованих клітин-хазяїв, де клітини-хазяї або являють собою гетерогенний препарат in vitro, або культивуються у вигляді гетерологічної популяції індивідуальних колоній. Також конкретними прикладами виключень є вказані вище бібліотеки, у яких на частку конкретної нуклеїнової кислоти припадає менше 5% від загальної кількості нуклеїнових кислот, вбудованих у векторну молекулу. Крім того, конкретними виключеннями є препарати повної клітинної геномної ДНК або повної клітинної РНК (включаючи повні клітинні препарати, відділені механічним шляхом або розщеплені ферментативно). Також конкретними прикладами виключень є повні клітинні препарати, які входять до складу або препарату in vitro, або у вигляді гетерогенної суміші, розділеної за допомогою електрофорезу, у якій нуклеїнову кислоту, запропоновану у винаході, уже не можна додатково відокремити від гетерологічних нуклеїнових кислот, які присутні в електрофоретичному середовищі (наприклад, додатково відокремити шляхом вирізання індивідуальної смуги з гетерогенної популяції смуг в агарозному гелі або нейлоновому блоті). Молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану в даному винаході, наприклад молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, або її фрагмент, можна виділяти за допомогою стандартних методів молекулярної біології й інформації про послідовності, представленої в даному описі. Наприклад, кДНК ІМІ Т. turgidum можна виділяти з бібліотеки Т. turgidum з використанням всієї послідовності або фрагмента послідовності SEQ ID NО:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23. Крім того, молекулу нуклеїнової кислоти, яка включає всю послідовність або фрагмент SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, можна виділяти за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з використанням олігонуклеотидних праймерів, створених на основі, цієї послідовності. Наприклад, мРНК можна виділяти з рослинних клітин (наприклад, за допомогою процедури екстракції тіоціанатом гуанідинію, яка описана в Chirgwin й ін., Biochemistry 18, 1979, стор.5294-5299), а кДНК можна одержувати за допомогою зворотної транскриптази (наприклад, зворотної транскриптази вірусу мишиного лейкозу (MLV) Молоні, який надходить у продаж від фірми Gib-Gibco/BRL, Бетесда, шт. Мериленд; або зворотної транскриптази вірусу мієлобластозу птахів (AMV), яка надходить у продаж від фірми Seikagaku America, Inc., Сент-Пітерсберг, шт. Флорида). На основі нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, можна створювати синтетичні олігонуклеотидні праймери для ампліфікації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Молекулу нуклеїнової кислоти, запропоновану у винаході, можна ампліфікувати із викорис 27 танням кДНК або в альтернативному варіанті геномної ДНК як матриці й відповідних олігонуклеотидних праймерів за допомогою заснованих на застосуванні ПЛР стандартних методів ампліфікації. Ампліфіковану в такий спосіб молекулу нуклеїнової кислоти можна клонувати в прийнятному векторі й характеризувати за допомогою аналізу послідовності ДНК. Крім того, олігонуклеотиди, які відповідають нуклеотидній послідовності ІМІ, можна одержувати за допомогою стандартного синтезу, наприклад, з використанням автоматичного синтезатора ДНК. Нуклеїнові кислоти ІМІ, запропоновані в даному винаході, можуть містити послідовності, які кодують білок ІМІ (тобто «кодувальні ділянки»), а також 5'-нетрансльовані послідовності й 3'нетрансльовані послідовності. В альтернативному варіанті молекули нуклеїнових кислот, запропоновані в даному винаході, можуть містити тільки кодувальні ділянки гена ІМІ або можуть містити повні геномні фрагменти, виділені з геномної ДНК. Кодувальна ділянка цих послідовностей позначена як «положення відкритої рамки зчитування (ВРЗ)». Крім того, молекула нуклеїнової кислоти, запропонована у винаході, може містити частину кодувальної ділянки гена ІМІ, наприклад, фрагмент, який можна застосовувати як зонд або праймер. Нуклеотидні послідовності, отримані шляхом клонування генів ІМІ Т. turgidum, дозволяють створювати зонди й праймери, які можна застосовувати для ідентифікації й/або клонування гомологів ІМІ в інших типах клітин й організмах, а також гомологів ІМІ з інших рослин пшениці й споріднених видів. Частина кодувальної ділянки може кодувати також біологічно активний фрагмент білка ІМІ. В контексті даного опису під поняттям «біологічно активна частина (фрагмент)» білка ІМІ розуміють фрагмент, наприклад, домен/мотив білка ІМІ, який при виробництві в рослині підвищує толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом цієї рослини дикого типу. Методи кількісної оцінки підвищеної толерантності до імідазолінонових гербіцидів представлені нижче в прикладах. Біологічно активні фрагменти білка ІМІ включають пептиди, виведені з SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24, які складаються з меншої кількості амінокислот у порівнянні з повнорозмірним білком ІМІ і надають підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду при експресії в рослині. Як правило, біологічно активні фрагменти (наприклад пептиди, які складаються, наприклад з 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 або більшої кількості амінокислот) несуть домен або мотив, який має принаймні один вид активності білка ІМІ. Крім того, інші біологічно активні фрагменти, у яких інші ділянки поліпептиду вилучені шляхом делеції, можна одержувати за допомогою методів рекомбінації й оцінювати у відношенні одного або декількох видів активності, вказаних у даному описі. Переважно біологічно активні фрагменти білка ІМІ включають один або декілька консервативних доменів, вибраних із групи, яка включає домен А, домен В, домен С, домен D і домен Е, де консервативний домен несе мутацію. 92716 28 Винахід стосується також химерних або злитих поліпептидів ІМІ. У контексті даного опису поняття «химерний поліпептид ІМІ» або «злитий поліпептид» стосується поліпептиду ІМІ, функціонально зв'язаному з поліпептидом, який не належить до ІМІ. Поняття «поліпептид, який не належить до ІМІ» означає поліпептид, який має амінокислотну послідовність, яка не є практично ідентичною до поліпептиду ІМІ, наприклад, поліпептид, який не являє собою ізофермент ІМІ, цей пептид має функцію, відмінну від функції поліпептиду ІМІ. У контексті даного опису поняття «функціональний зв'язаний» відносно злитого пептиду призначене для позначення того факту, що поліпептид ІМІ і поліпептид, який не належить до поліпептиду ІМІ, злиті один з одним таким чином, що обидві послідовності виконують передбачувану функцію, властиву застосовуваній послідовності. Поліпептид, який не належить до ІМІ, можна зливати з N-кінцем або Скінцем поліпептиду ІМІ. Наприклад, в одному варіанті здійснення винаходу злитий поліпептид являє собою злитий поліпептид GST-IMI, у якому послідовність ІМІ злита із С-кінцем послідовності GST. Такі злиті поліпептиди можуть полегшувати очищення рекомбінантних поліпептидів ІМІ. В іншому варіанті здійснення винаходу злитий поліпептид являє собою поліпептид ІМІ, який містить гетерологічну сигнальну послідовність на N-кінці. У певних клітинах-хазяїнах (наприклад, у клітинаххазяїнах ссавців) експресія й/або секреція поліпептиду ІМІ може зростати завдяки застосуванню гетерологічної сигнальної послідовності. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид ІМІ, який має послідовність, ідентичну до послідовності поліпептиду, який кодується полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, можна створювати, здійснюючи одну або декілька нуклеотидних замін, додавань або делецій у нуклеотидній послідовності SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, так, щоб інтродукувати у кодований ι поліпептид одну або декілька амінокислотних замін, додавань або делецій. У послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23 можна інтродукувати мутації за допомогою стандартних методів, таких як сайтнаправленний мутагенез й опосередковуваний ПЛР мутагенез. Переважно здійснюють консервативні амінокислотні заміни одного або декількох вибраних залишків замінних амінокислот. «Консервативна амінокислотна заміна» являє собою заміну, при якій амінокислотний залишок заміняють амінокислотним залишком, який має подібний боковий ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, які мають подібні бокові ланцюги, відомі в даній галузі. Ці сімейства включають амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад лізин, аргінін, гістидин), кислотними боковими ланцюгами (наприклад аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, 29 метіонін, триптофан), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними боковими ланцюгами (наприклад тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, вибраний залишок замінної амінокислоти в поліпептиді ІМІ переважно заміняють іншим амінокислотним залишком із сімейства з подібними боковими ланцюгами. В іншому варіанті здійснення винаходу мутації можна інтродукувати випадково у всю або в частину кодувальної послідовності ІМІ, наприклад, за допомогою насичувального мутагенезу, а отримані мутанти можна піддавати скринінгу відносно активності ІМІ відповідно до представленого в даному описі методу для ідентифікації мутантів, які зберігають активність ІМІ. Після мутагенезу послідовностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23 кодований поліпептид можна експресувати рекомбінантно й активність поліпептиду можна визначати, аналізуючи толерантність до імідазолінону рослини, яка експресує поліпептид, відповідно до описаного нижче в прикладах методу. Для визначення відсотка ідентичності двох амінокислотних послідовностей послідовності лінеаризують для оптимізації порівняння (наприклад можна вводити проломи в послідовність одного поліпептиду для оптимального порівняльного аналізу первинної структури з іншим поліпептидом). Потім порівнюють амінокислотні залишки у відповідних положеннях амінокислотної послідовності. Коли в певному положенні в одній послідовності знаходиться та ж амінокислота, яка знаходиться у відповідному положенні в іншій послідовності, то молекули є ідентичними в цьому положенні. Такий же тип порівняльного аналізу можна застосовувати для двох нуклеотидних послідовностей. Відсоток ідентичності послідовностей двох послідовностей є функцією від кількості ідентичних положень, характерних для послідовностей (тобто відсоток ідентичності послідовностей = кількості ідентичних положень/загальна кількість положень 100). У контексті даного опису відсоток ідентичності послідовностей двох нуклеотидних або поліпептидних послідовностей визначають за допомогою програмного забезпечення Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Бетезда, шт. Мериленд 20814). Для визначення відсотка ідентичності двох нуклеїнових кислот використовують штраф за відкриття пролому 15 і штраф за подовження пролому 6,66. Для визначення відсотка ідентичності двох поліпептидів використовують штраф за відкриття пролому 10 і штраф за подовження пролому 0,1. Всі інші параметри задаються за замовчуванням. Слід розуміти, що для визначення ідентичності послідовностей при порівнянні послідовності ДНК із послідовністю РНК, тимідиновий нуклеотид еквівалентний до урацилового нуклеотиду. Виділені поліпептиди ІМІ, запропоновані в даному винаході, переважно принаймні приблизно на 50-60%, переважно принаймні приблизно на 60-70% і більш переважно принаймні приблизно на 70-75%, 7580%, 80-85%, 85-90% або 90-95% і найбільш переважно принаймні приблизно на 96%, 97%, 98%, 92716 30 99% або більше ідентичні до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24. В іншому варіанті здійснення винаходу виділені поліпептиди ІМІ, запропоновані в даному винаході, принаймні приблизно на 50-60%, переважно принаймні приблизно на 60-70% і найбільш переважно принаймні приблизно на 70-75%; 75-80%, 8085%, 85-90% або 90-95% і найбільш переважно принаймні приблизно на 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичні до повної амінокислотної послідовності, представленої в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24. Крім того, можна створювати оптимізовані нуклеїнові кислоти ІМІ. Переважно оптимізована нуклеїнова кислота ІМІ кодує поліпептид ІМІ, який модулює толерантність рослин до імідазолінонових гербіцидів, і більш переважно підвищує толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду при її понадекспресії в рослині. У контексті даного опису поняття «оптимізована» стосується нуклеїнової кислоти, яку за допомогою методів генної інженерії створюють так, щоб підвищувати її рівень експресії в даній рослині або організмі тварини. Для створення рослинних оптимізованих нуклеїнових кислот ІМІ послідовність ДНК гена можна модифікувати так, щоб вона: 1) містила кодони, переважні для генів, що характеризуються високим рівнем експресії в рослинах; 2) мала практично такий же вміст А+Т у складі нуклеотидних основ, який характерний для рослин; 3) мала форму рослинної ініціюючої послідовності; 4) з неї були вилучені послідовності, що викликають дестабілізацію, невідповідне поліаденілування, розщеплення й термінацію РНК, або утворюючі вторинну структуру «шпильок» або сайти сплайсингу РНК. Підвищений рівень експресії нуклеїнових кислот ІМІ у рослинах можна одержувати, використовуючи частоту розподілу кодонів, які найбільш часто зустрічаються (найбільш переважних), яка характерна для рослин у цілому або для конкретної рослини. Методи оптимізації експресії нуклеїнових кислот у рослинах описані в ЕРА 0359472; ЕРА 0385962; заявці РСТ W0 91/16432; U.S 5380831; U.S. 5436391; в Perlack й ін., Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, стор.3324-3328; і Murray й ін., Nucleic Acids Res. 17, 1989, стор.477-498. У контексті даного опису поняття «частота переважного кодону, який найбільш часто зустрічається», означає перевагу, яка проявляється конкретною клітиною-хазяїном відносно зустрічальності нуклеотидних кодонів, специфічних для конкретної амінокислоти. Для визначення частоти зустрічальності конкретного кодону в гені, кількість даного кодону в гені ділять на загальну кількість всіх кодонів, специфічних для однієї й тієї ж амінокислоти, у гені. Аналогічно до цього частоту переважного кодону, який найбільш часто зустрічається, характерну для клітини-хазяїна, можна розраховувати за середньою частотою переважного кодону, який найбільш часто зустрічається у великій кількості генів, які експресуються клітиною-хазяїном. Переважно, щоб такий аналіз був обмежений генами з високим рівнем експресії в клітині-хазяїні. Відсоток відхилення частот пере 31 важного кодону, який найбільш часто зустрічається, в синтетичному гені в порівнянні з геном, який зустрічається в клітині-хазяїні в природних умовах, розраховують, визначаючи спочатку відсоток відхилення частот зустрічальності індивідуального кодону від характерного для клітини-хазяїна в природних умовах, після чого визначають середнє відхилення для всіх кодонів. Як вказано вище, у цьому розрахунку враховуються унікальні ко дони (тобто ATG й TGG). У цілому, загальне середнє відхилення кодонів, які найбільш часто зустрічаються, в оптимізованому гені в порівнянні з геном, характерним для клітини-хазяїна, розраховують із рівняння 1А: n=1Ζ Χn - Υn Χn 100Ζ, де Хn означає частоту зустрічальності кодону n у клітині-хазяїні; Υn означає частоту зустрічальності кодону n у синтетичному гені; n означає індивідуальний кодон, специфічний для амінокислоти; a Z означає загальну кількість кодонів. Загальне відхилення частоти зустрічальності кодону, А, для всіх амінокислот переважно повинно не перевищувати приблизно 25%, і більш переважно становити менше приблизно 10%. Отже, нуклеїнову кислоту ІМІ можна оптимізувати таким чином, щоб розподіл частоти зустрічальності кодонів відхилявся переважно не більше ніж на 25% від частоти зустрічальності в генах, для яких характерний високий рівень експресії в рослинах, більш переважно не більше ніж приблизно на 10%. Крім того, враховується процентний вміст G+C виродженої третьої основи (для однодольних рослин переважна наявність у цьому положенні G+C, а для дводольних це не є переважним). Встановлено також, що нуклеотид XCG (де X означає А, Т, С або G) являє собою найменш переважний кодон у дводольних, а кодон ХТА відсутній як в однодольних, так і дводольних рослин. Оптимізовані нуклеїнові кислоти ІМІ, запропоновані в даному винаході, переважно також мають індекси виключення дуплету CG і ТА, дуже близькі до індексів в вибраній рослині-хазяїні (тобто Triticum turgidum). Більш переважно ці індекси відхиляються від індексів хазяїна не більше ніж приблизно на 10-15%. Крім молекул нуклеїнових кислот, які кодують описані вище поліпептиди ІМІ, іншим об'єктом винаходу є молекули нуклеїнових кислот, антисмислові по відношенню до них. Вважається, що антисмислові нуклеотиди інгібують експресію гена полінуклеотиду-мішені в результаті специфічного зв'язування з полінуклеотидом-мішенню й впливу на транскрипцію, сплайсинг, транспорт, трансляцію й/або стабільність полінуклеотиду-мішені. Із прототипів відомі методи спрямованого переносу антисмислового полінуклеотиду в хромосомну ДІЖ, у первинний транскрипт РНК або в процесовану мРНК. Переважно галузі-мішені являють собою сайти сплайсингу, кодони ініціації трансляції, кодони термінації трансляції й інші послідовності всередині відкритої рамки зчитування. Поняття «антисмисловий» у контексті даного опису стосується нуклеїнової кислоти, яка містить полінуклеотид, який комплементарний до всього гену або його частини, первинного транскрипту або процесованої мРНК у тому ступені, щоб впли 92716 32 вати на експресію ендогенного гена. Поняття «комплементарні полінуклеотиди» стосується полінуклеотидів, які здатні до спарювання основ відповідно до стандартних правил комплементарності Ватсона-Кріка. Зокрема, пурини утворюють пару основ з піримідинами з формуванням комбінації гуаніну, спареного із цитозином (G:C), і аденіну, спареного або з тиміном (А:Т), у випадку ДНК, або аденіну, спареного з урацилом (A:U), у випадку РНК. Слід розуміти, що два полінуклеотиди можуть гібридизуватися один з одним, навіть якщо вони не повністю комплементарні один до одного, за умови, що кожний має принаймні одну ділянку, практично комплементарну до іншої. Поняття «антисмислова нуклеїнова кислота» стосується касет експресії одноланцюгової РНК, а також дволанцюгової ДНК, які можуть транскрибуватися з утворенням антисмислової РНК. «Активні» антисмислові нуклеїнові кислоти являють собою антисмислові молекули РНК, які можуть вибірково гібридизуватися з первинним транскриптом або мРНК, що кодує поліпептид, послідовність якого принаймні на 80% ідентична до поліпептидної послідовності SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:24. Крім описаних вище нуклеїнових кислот і поліпептидів ІМl даний винахід стосується також цих нуклеїнових кислот і поліпептидів, зв'язаних із фрагментом. Ці фрагменти включають (але не обмежуючись ними) фрагменти для виявлення, фрагменти для гібридизації, фрагменти для очищення, фрагменти для введення, фрагменти для здійснення реакції, фрагменти для зв'язування й т.п. Типовою групою нуклеїнових кислот із приєднаними фрагментами є зонди й праймери. Зонди й праймери, як правило, містять практично виділений олігонуклеотид. Олігонуклеотид, як правило, містить ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується в строгих умовах принаймні приблизно з 12, переважно приблизно з 25, більш переважно приблизно з 40, 50 або 75 послідовними нуклеотидами смислового ланцюга послідовності, представленої в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, антисмислової послідовності послідовності, представленої в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, або з їх мутантами, які зустрічаються в природних умовах. Праймери, основою яких є нуклеотидна послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, можна використовувати в реакціях ПЛР для клонування гомологів ІМІ. Зонди, основою яких є нуклеотидні послідовності ІМІ, можна застосовувати для виявлення транскриптів або геномних послідовностей, які кодують той же самий поліпептид або гомологічні поліпептиди. У переважних варіантах здійснення винаходу зонд додатково містить приєднану до нього групу, яка служить як мітка, наприклад, мітка може являти собою радіоактивний ізотоп, флуоресцентну сполуку, фермент або кофактор ферменту. Такі зонди можна застосовувати як компонент набору для аналізу, який включає геномні маркери, для ідентифікації клітин, які експресують поліпептид ІМІ, зокрема, шляхом вимірювання рівня нуклеїнової кислоти, яка кодує ІМІ, в зразку клітин, 33 наприклад, шляхом визначення рівнів мРНК ІМІ або визначення того, чи є геномний ген ІМІ мутантним або вилучений шляхом делеції. Винахід стосується також виділеного рекомбінантного експресійного вектору, який містить описану вище нуклеїнову кислоту, де експресія вектора в клітині-хазяїні приводить до підвищеної толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із клітиною-хазяїном сорту дикого типу. У контексті даного опису поняття «вектор» стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка має здатність транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою вона зв'язана. Одним з типів вектора є «плазміда», це поняття стосується кільцевого дволанцюгового ланцюга ДНК, у який вбудовані шляхом лігування додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, у вірусний геном якого можуть бути вбудовані шляхом лігування додаткові сегменти ДНК. Певні вектори мають здатність до автономної реплікації в клітині-хазяїні, у яку вони інтродуковані (наприклад бактеріальні вектори, які мають бактеріальний сайт ініціації реплікації, і епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад неепісомальні вектори ссавців) інтегрують у геном клітини-хазяїна шляхом інтродукції в клітину-хазяїна, де вони реплікуються разом з геномом хазяїна. Крім того, певні вектори мають здатність забезпечувати експресію генів, з якими вони функціонально зв'язані. Такі вектори позначені в контексті даного опису як «експресійні вектори». У цілому, експресійні вектори, які застосовують в методах рекомбінантної ДНК, часто мають форму плазмід. У контексті даного опису поняття «плазміда» й «вектор» можна застосовувати взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найбільш широко застосовувану форму вектора. Однак у даному винаході мається на увазі, що можна застосовувати такі інші форми експресійних векторів, як вірусні вектори (наприклад ретровіруси з дефіцитом реплікації, аденовіруси й аденоасоційовані віруси), які мають еквівалентні функції. Рекомбінантні експресійні вектори, запропоновані у винаході, містять нуклеїнову кислоту, запропоновану у винаході, у формі, придатній для експресії нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні, це означає, що рекомбінантні експресійні вектори несуть одну або декілька регуляторних послідовностей, вибраних на основі послідовностей, які використовуються в клітині-хазяїні для експресії, які функціонально зв'язані з нуклеотидною послідовністю, яка підлягає експресії. Поняття «функціонально зв'язаний» відносно рекомбінантного експресійного вектора означає, що нуклеотидна послідовність, яка представляє інтерес, зв'язана з регуляторною(ими) послідовністю(ями) таким чином, щоб відбувалася експресія нуклеотидної послідовності (наприклад in vitro у системі транскрипції/трансляції або в клітині-хазяїні, коли вектор інтродукують у клітину-хазяїна). Поняття «регуляторна послідовність» включає промотори, енхансери й інші контролюючі експресію елементи (наприклад сигнали поліаденілування).Такі регуляторні послідовності описані, наприклад в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, вид-во Academic Press, San 92716 34 Diego, CA, 1990 й в Gruber й Crosby в: Methods in Plant Molecular Biology й Biotechnology, під ред. Glick й Thompson, частина 7, стор.89-108, вид-во CRC Press: Boca Raton. Florida, які включені в даний опис як посилання. До регуляторних послідовностей належать послідовності, які забезпечують конститутивну експресію нуклеотидної послідовності в багатьох типах клітин-хазяїв, і послідовності, які забезпечують експресію нуклеотидної послідовності тільки в певних клітинах-хазяїнах або тільки в певних умовах. Як повинно бути очевидно фахівцям у даній галузі, конструкція експресійного вектора може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна, який підлягає трансформації, необхідний рівень експресії поліпептиду й т.д. Експресійні вектори, запропоновані у винаході, можна інтродукувати у клітини-хазяї для того, щоб вони продукували поліпептиди або пептиди, включаючи злиті поліпептиди або пептиди, які кодуються нуклеїновими кислотами, вказаними в контексті даного опису (наприклад, поліпептиди ІМІ, злиті поліпептиди й т.буд.). В переважному варіанті здійснення даного винаходу поліпептиди ІМІ експресуються в рослинах і клітинах рослин, таких як одноклітинні рослинні клітини (наприклад водорості) (див. Falciatore й ін., Marine Biotechnology, 1(3), 1999, стор.239-251 і наведені в цій публікації посилання) і рослинні клітини вищих рослин (наприклад сперматофіти, такі як хлібні злаки). Полінуклеотид ІМІ можна інтродукувати у рослинну клітину будь-якими методами, такими як трансфекція, трансформація або трансдукція, електропорація, бомбардування частинками, зараження Agrobacterium, біобалістика й т.п. Прийнятні методи трансформації або трансфекції клітин-хазяїв, включаючи рослинні клітини, описані в Sambrook й ін. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е видання, Cold Spring Harbor Laboratory, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) і в інших посібниках для лабораторних досліджень, таких як Methods in Molecular Biology, тoм 44, 1995, Agrobacterium protocols, під ред. Gartland й Davey, вид-во Humana Press, Totowa, New Jersey. Оскільки підвищена толерантність до імідазолінонових гербіцидів є загальною ознакою, успадковування якої є бажаним для багатьох рослин, таких як кукурудза, пшениця, жито, овес, тритікале, рис, ячмінь, соя, арахіс, бавовник, насінний рапс і канола, маніок, перець, соняшник і чорнобривці, пасльонові культури, такі як картопля, тютюн, баклажан і томат, види роду Vicia (вика), горох, люцерна, рунисті рослини (кава, какао, чай), види сімейства вербових (Salix), дерева (олійна пальма, кокос), багаторічні трави й кормові культури, ці корисні рослини також є переважними рослинамимішенями для генетичної інженерії згідно із ще одним варіантом здійснення даного винаходу. Відповідно до переважного варіанта рослина являє собою рослину пшениці. Кормові культури включають (але не обмежуючись ними) пирій, канарник канарський, бромус, дике жито, тонконіг, грястицю збірню, люцерну, салфойн (Salfoin), лядвинець 35 рогатий, конюшину червоно-білу, конюшину червону й солодку конюшина. Відповідно до одного з варіантів здійснення даного винаходу рослину трансфектують полінуклеотидом ІМІ за допомогою опосередковуваного Agrobacterium перенесення гена. Одним з відомих фахівцям у даній галузі методів трансформації є занурення квітучої рослини в розчин представників р. Agrobacteria, де Agrobacteria містить нуклеїнову кислоту ІМІ, з наступним розмноженням трансформованих гамет. Опосередковувану Agrobacterium трансформацію рослин можна здійснювати, використовуючи, наприклад, штам GV3101(pMP90) (Koncz й Schell, Моl. Gen. Genet. 204, 1986, стор.383-396) або штам LBA4404 (фірма Clontech) Agrobacterium tumefaciens. Трансформацію можна здійснювати стандартними методами трансформації й регенерації (Deblaere й ін, Nucl. Acids. Res. 13, 1994, стор.4777-4788; Gelvin Stanton В. і Schilperoort Robert Α., Plant Molecular Biology Manual, 2-е вид. під ред. Dordrecht, вид-во Kluwer Academic Pub, 1995, в: Sect, Ringbuc Zentrale Signatur BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick Bernard R. і Thompson John E., Methods in Plant Molecular Biotogy and Biotechnology, Boca Raton: вид-во CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Наприклад, насінний рапс можна трансформувати, використовуючи трансформацію сім'ядолі або гіпокотиля (Moloney й ін., Plant Cell Report 8, 1989, стор.238-242; De Block й ін., Plant Physiol., 91, 1989, стор.694-701). Застосування антибіотиків для селекції Agrobacterium і рослин залежить від бінарного вектора й штаму Agrobacterium, які застосовували для трансформації. Селекцію олійного рапсу, як правило, здійснюють за допомогою канаміцину як селектованого маркера для рослини. Опосередковуване Agrobacterium перенесення гена в рослину льону можна здійснювати, наприклад, за допомогою методу, описаного в Mlynarova й ін., Plant Cell Report 13, 1994, стор.282-285. Крім того, трансформацію сої можна здійснювати, наприклад, за допомогою методу, описаного в ЕР 0424047, U.S. 5322783, ЕР 0397687. U.S. 5376543 або U.S. 5169770. Трансформацію кукурудзи можна здійснювати за допомогою бомбардування частками, опосередковуваного поліетиленгліколем поглинання ДІЖ або методом, заснованим на застосуванні волокна з карбіду кремнію (див., наприклад Freeling й Walbot «The maize handbook», видво Springer, New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Конкретний приклад трансформації кукурудзи описаний в U.S. 5990387, а конкретний приклад трансформації пшениці описаний у заявці РСТ WO 93/07256. Згідно із даним винаходом інтродукований полінуклеотид ІМІ можна стабільно підтримувати в рослинній клітині, якщо він включений у нехромосомний автономний реплікон або інтегрований у хромосоми рослини. В альтернативному варіанті інтродукований полінуклеотид ІМІ може бути присутній у позахромосомному нереплікуючомуся векторі й короткочасно експресуватися або проявляти короткочасну активність. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу можна створювати гомологічний рекомбінантний мікроорганізм, у 92716 36 якому полінуклеотид ІМІ інтегрований у хромосому, при цьому одержують вектор, який містить принаймні частину гена AHAS, який несе делецію, додавання або заміну, для того щоб змінювати, наприклад порушувати функцію ендогенного гена AHAS і створювати ген ІМІ. Для створення точкової мутації за допомогою гомологічної рекомбінації можна застосовувати гібриди ДНК-РНК для методу, відомого як химера пластику (chimeraplasty) (Cole-Strauss й ін., Nucleic Acids Research 27(5), 1997, стор.1323-1330 й Kmiec, Gene therapy American Scientist 87(3), 1999, стор.240-247). У даній галузі добре відомі також інші методи гомологічної рекомбінації видів Triticum й їх можна застосовувати згідно із даним винаходом. У векторі для гомологічної рекомбінації ген ІМІ може бути фланкований на 5'- і 3'-кінцях додатковою молекулою нуклеїнової кислоти гена AHAS для того, щоб дозволяти здійснювати гомологічну рекомбінацію між екзогенним геном ІМІ, який несе вектор, і ендогенним геном AHAS, у мікроорганізмі або рослині. Додаткова фланкуюча молекула нуклеїнової кислоти AHAS має довжину, достатню для успішної гомологічної рекомбінації з ендогенним геном. Як правило, у вектор інтродукують фланкуючу ДНК (як на 5'-, так і на 3'-кінець), яка має довжину від декількох сотень пар основ аж до тисячі пар основ (див., наприклад, в Thomas K.R. і Capecchi M.R., Cell 51, 1987, стор.503 опис векторів для гомологічної рекомбінації або в Strepp й ін., PNAS, 95(8), 1998, стор.4368-4373 опис методу рекомбінації, заснованого на застосуванні кДНК, у патентах на ім'я Physcomitrella). Однак через те, що ген ІМІ у нормі відрізняється від гена AHAS дуже невеликою кількістю амінокислот, фланкуюча послідовність не завжди є необхідною. Вектор для гомологічної рекомбінації інтродукують у мікроорганізм або рослинну клітину (наприклад за допомогою опосередковуваного поліетиленгліколем перенесення ДНК) і клітини, у яких відбулася гомологічна рекомбінація інтродукованого гена ІМІ з ендогенним геном AHAS, відбирають за допомогою відомих у даній галузі методів. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу можна одержувати рекомбінантні мікроорганізми, які містять вибрані системи, що дозволяють регулювати експресію інтродукованого гена. Наприклад, включення гена ІМІ у вектор, де він знаходиться під контролем оперону 1ac, забезпечує експресію гена ІМІ тільки в присутності ІПТГ (ізопропілтіогалактозид). Такі регуляторні системи добре відомі в даній галузі. Незалежно від того, чи знаходиться він у позахромосомному нереплікуючомуся векторі або у векторі, інтегрованому в хромосому, полінуклеотид ІМІ переважно знаходиться в рослинній касеті експресії. Рослинна касета експресія переважно містить регуляторні послідовності, які забезпечують експресію гена в клітинах рослин, які функціонально зв'язані так, щоб кожна послідовність могла проявляти свою функцію, наприклад, термінацію транскрипції за допомогою сигналів поліаденілування. Переважними сигналами поліаденілування є сигнали, отримані із тДНК Agrobacterium tumefaciens, наприклад, ген 3, який 37 відомий як ген октопінсинтази Ті-плазміди рТіАСН5 (Gielen й ін., ЕМВО J. 3, 1984, с.835), або їх функціональні еквіваленти, але також можна використовувати всіх інші термінатори, які мають функціональну активність в рослинах. Оскільки експресія гена в рослині дуже часто не обмежена тільки рівнями транскрипції, рослинна касета експресії переважно містить інші функціонально зв'язані послідовності типу енхансерів трансляції, такі як, послідовність, що перекривається, яка містить 5'нетрансльовану лідерну послідовність із вірусу мозаїки тютюну, яка підвищує співвідношення поліпептиду й РНК (Gallic й ін., Nucl. Acids Research 15, 1987, стор.8693-8711). Приклади рослинних касет експресії включають касети, описані докладно в: Becker D. і ін., New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Моl. Biol. 20, 1992, стор.1195-1197; Bevan M.W., Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12, 1984, стор.87118721; і Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; в: Transgenic Plants, т.1, Engineering and Utilization, під ред. Kung й R. Wu, вид-во Academic Press, 1993, стор.15-38. Експресований у рослині ген повинен бути функціонально зв'язаний з відповідним промотором, який забезпечує своєчасну експресію гена переважним для певного типу клітин або типу тканин чином. Промотори, які можна використовувати в касетах експресії, запропонованих у винаході, являють собою будь-який промотор, який має здатність ініціювати транскрипцію в рослинній клітині. Такі промотори включають (але не обмежуючись ними) промотори, які можна одержувати з рослин, вірусів рослин і бактерій, які несуть гени, експресовані в рослинах, таких як Agrobacterium й Rhizobium. Промотор може бути конститутивним, індуцибельним, який має перевагу до стадії розвитку, типу клітин, тканині або органу. Конститутивні промотори мають активність у більшості ситуацій. Прикладами конститутивних промоторів є промотори CaMV 198 й 35S (Odell й ін., Nature 313, 1985, стор.810-812), промотор 35S штаму sX CaMV (Kay й ін., Science 236, 1987, стор.1299-1302), промотор Sep1, промотор актину рису (McElroy й ін., Plant Cell 2, 1990, стор.163-171), промотор актину Arabidopsis, промотор убікитину (Christensen і ін. Plant Molec. Віоl. 18, 1989, сс.675-689); pEmu (Last й ін., Theor. Appl. Genet 81, 1991, сс.581-588), промотор 35S вірусу мозаїки ранника шишкуватого, промотор Smas (Velten й ін., ЕМВО J. 3, 1984, стор.2723-2730), промотор GRP1-8, промотор дегідрогенази цинамілового спирту (U.S. 5683439), промотори з Т-ДНК Agrobacterium, такі як промотор манопінсинтази, нопалінсинтези й октопінсинтази, малої субодиниці рибулозобіфосфаткарбоксилази (ssu-RUBISCO) і т.п. Індуцибельні промотори проявляють активність за певних умов навколишнього середовища, таких як присутність або відсутність поживної речовини або метаболіту, тепло або холод, світло, ураження патогеном, анаеробні умови й т.п. Наприклад, промотор hsp80 з Brassica індукується тепловим шоком; промотор PPDK індукується сві 92716 38 тлом; промотор PR-1 з тютюну, Arabidopsis і кукурудзи індукується зараженням патогеном; а промотор Adhl індукується гіпоксією й холодовим стресом. Експресію гена в рослинах можна полегшувати також за допомогою індуцибельного промотору (див. огляд в Gatz, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Моl. Biol. 48, 1997, стор.89-108). Індуковані хімічними стимулами промотори є особливо переважними, якщо потрібна експресія гена в певні моменти часу. Прикладами таких промоторів є індукований саліциловою кислотою промотор (заявка РСТ WO 95/19443), індукований тетрацикліном промотор (Gatz й ін., Plant J. 2, 1992, стор.397404) і індукований етанолом промотор (заявка РСТ WO 93/21334). Переважні для певної стадії розвитку промотори експресуються насамперед на певній стадії розвитку. Переважні для певної тканини й органа промотори включають промотори, які насамперед експресуються в певних тканинах або органах, таких як листя, корені, насіння або ксилема. Прикладами переважних для тканини й переважних для органів промоторів є (але не обмежуючись ними) переважні для плода, переважні для насінних зачатків, переважні для чоловічої тканини, переважні для насіння, переважні для інтегументу, переважні для бульби, переважні для черешка, переважні для оплодня й переважні для листя, переважні для приймочки, переважні для пилку, переважні для пиляка, переважні для пелюстки, переважні для чашолистка, переважні для плодоніжки, переважні для стручка, переважні для стебла, переважні для кореня промотори, і т.п. Переважні для насіння промотори експресуються насамперед у процесі розвитку й/або дозрівання насіння. Наприклад, переважні для насіння промотори можуть бути переважними для зародка, для ендосперму й насінного покриття (див. Thompson й ін., BioEssays 10, 1989, с.108.) Приклади переважних для насіння промоторів включають (але не обмежуючись ними), промотор целюлозосинтази (се1А), Сіm1, гамма-зеїну, глобуліну-1, зеїну 19кДа кукурудзи (CZ19B1) і т.п. Інші придатні переважні для тканини або переважні для органа промотори включають промотор гена nаріn з насінного рапсу (U.S. 5608152), USP-промотор з Vicia faba (Baeumlein й ін., Моl Gen Genet 225(3), 1991, стор.459-467), промотор олеозину з Arabidopsis (заявка РСТ WO 98/45461), промотор фазеоліну з Phaseolus vulgaris (U.S. 5504200), Все4-промотор з Brassica (заявка РСТ A. WO 91/13980) або промотор В4 легуміну (LeB4; Baeumlein й ін., Plant Journal, 2(2), 1992, сс.233239), а також промотори, які забезпечують специфічну для насіння експресію, в однодольних рослинах типу кукурудзи, ячменю, пшениці, жита, рису й т.д. Прийнятними промоторами, які слід згадати, є промотор гена Ipt2 або Ipt1 з ячменю (заявка РСТ A. WO 95/15389 і заявка РСТ WO 95/23230) або промотори, описані в заявці РСТ WO 99/16890 (промотори гена хордеїну (hordein) з ячменю, гена глутеліну (glutelin) з рису, гена оризину (oryzin) з рису, гена проламіну (prolamin) з рису, гена гліадину (gliadin) із пшениці, гена глутеліну (glutelin) із пшениці, гена глутеліну (glutelin) з вівса, гена каси 39 рину (kasirin) із сорго й гена секаліну (secalin) з жита). Інші промотори, які можна застосовувати в касетах експресії, запропонованих у винаході, являють собою (але не обмежуючись ними), промотор основного білка, який зв'язує хлорофіл а/b, промотори гістону, промотор Ар3, промотор βконгліцину, промотор напіну, промотор тектину із сої, промотор зеїну 15кДа, промотор зеїну 22кДа, промотор зеїну 27кДа, промотор g-зеїну з кукурудзи, промотори waxy, shrunken 1, shrunken 2 й bronze, промотор Zm13 (U.S. 5086169), промотори полігалактуронази (PG) кукурудзи (U.S. 5412085 й 5545546) і промотор SGB6 (U.S. 5470359), а також синтетичні або інші промотори, що зустрічаються в природних умовах. Додаткову гнучкість контролю експресії в рослинах гетерологічного гена можна забезпечувати за допомогою зв'язувальних ДНК доменів і реагуючих елементів з гетерологічних джерел (тобто ДНК-зв'язувальні домени із джерела, відмінного від рослини). Прикладом такого ДНКзв'язувального домену є ДНК-зв'язувальний домен LexA (Brent й Ptashne, Cell 43,19895, стор.729736). Наступним об'єктом винаходу є клітини-хазяї, у які інтродукують рекомбінантний експресійний вектор, запропонований у винаході. Поняття «клітина-хазяїн» й «рекомбінантна клітина-хазяїн» у контексті даного опису використовуються взаємозамінно. Слід розуміти, що ці поняття стосуються не лише конкретної індивідуальної клітини, але й потомства або потенційного потомства такої клітини. Оскільки наступні покоління можуть нести певні модифікації, зв'язані з мутацією або впливами навколишнього середовища, фактично таке потомство може бути не ідентичне до батьківської клітин и, але воно проте підпадає під обсяг даного винаходу. Клітина-хазяїн може являти собою прокаріотичну або еукаріотичну клітину. Наприклад, полінуклеотид ІМІ можна експресувати у бактеріальних клітинах, таких як С. glutamicum, клітинах комах, клітинах грибів або клітинах ссавців (таких як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або COS-клітини), водоростях, війчастих, рослинних клітинах, грибах або інших мікроорганізмах типу С. glutamicum. Інші придатні клітини-хазяї відомі фахівцям у даній галузі. Клітину-хазяїн, запропоновану у винаході, таку як прокаріотичну або еукаріотичну клітину-хазяїн в культурі, можна застосовувати для одержання (тобто експресії) полінуклеотиду ІМІ. Таким чином, винахід стосується також способів одержання поліпептидів ІМІ за допомогою клітин-хазяїв, запропонованих у винаході. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу спосіб полягає в тому, що культивують клітину-хазяїна, запропоновану винаході (у яку інтродукований рекомбінантний експресійний вектор, який кодує поліпептид ІМІ, або в геном якої інтродукований ген, який кодує поліпептид дикого типу або поліпептид ІМІ) у прийнятному середовищі до одержання поліпептиду ІМІ. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу спосіб полягає також у тому, що виділяють поліпептиди ІМІ із середовища або із клітини 92716 40 хазяїна. Наступним об'єктом винаходу є виділені поліпептиди ІМІ й їх біологічно активні фрагменти. Поняття «виділений» або очищений поліпептид або його біологічно активний фрагмент означає, що він не містить якогось клітинного матеріалу при його одержанні за допомогою методів рекомбінантної ДНК або хімічних попередників або інших хімічних речовин при його одержанні хімічним синтезом. Вираз «практично не містить клітинного матеріалу» застосовно до препаратів поліпептиду ІМІ, у яких поліпептид відділений від яких-небудь клітинних компонентів клітини, у яких його одержують природним шляхом або рекомбінантно. У цьому варіанті здійснення винаходу вираз «практично не містить клітинного матеріалу» стосується препаратів поліпептиду ІМІ, які містять менше ніж приблизно 30% (у перерахунку на суху масу) неІМІ матеріалу (позначеного також у контексті даного опису як «забруднюючий (домішковий) поліпептид»), більш переважно менше ніж приблизно 20% не-ІМІ матеріалу, ще більш переважно менше ні ж приблизно 10% не-ІМІ матеріалу й найбільш переважно менше ніж приблизно 5% не-ІМІ матеріалу. Коли поліпептид ІМІ або його біологічно активний фрагмент одержують рекомбінантно, то він також переважно практично не містить культурального середовища, тобто на частку культурального середовища припадає менше приблизно 20%, більш переважно менше приблизно 10% і найбільш переважно менше приблизно 5% від об'єму поліпептидного препарату. Вираз «практично не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин» стосується препаратів поліпептиду ІМІ, у яких поліпептид відділений від хімічних попередників або інших хімічних речовин, які використовуються для синтезу поліпептиду. У цьому варіанті здійснення винаходу вираз «практично не містить хімічних попередників або інших хімічних речовин» стосується препаратів поліпептиду ІМІ, у яких присутні менше ніж приблизно 30% (у перерахунку на суху масу) хімічних попередників або не-ІМІ хімічних речовин, більш переважно менше ніж приблизно 20% хімічних попередників або неІМІ хімічних речовин, більш переважно менше ніж приблизно 10% хімічних попередників або не-ІМІ хімічних речовин і найбільш переважно менше ніж приблизно 5% хімічних попередників або не-ІМІ хімічних речовин. У переважних варіантах здійснення винаходу у виділених поліпептидах або їх біологічно активних фрагментах відсутні забруднюючі поліпептиди з того організму, з якого одержують поліпептид ІМІ. Як правило, такі поліпептиди одержують шляхом рекомбінантної експресії, наприклад поліпептиду ІМІ Тrіtісum turgidum у рослинах, відмінних від Triticum turgidum, або в мікроорганізмах, таких як С. glutamicum, війчасті, водорості або гриби. Полінуклеотидні й поліпептидні послідовності ІМІ, запропоновані у винаході, можна застосовувати для різних цілей. Нуклеотидні й амінокислотні послідовності, запропоновані в даному винаході, можна використовувати для трансформації рослин, модулюючи тим самим толерантність рослин до імідазолінонових гербіцидів. Таким чином, винахід стосується способу одержання трансгенної 41 рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, який полягає в тому, що (а) трансформують рослинну клітину одним або декількома експресійними векторами, які містять одну або декілька нуклеїнових кислот ІМІ, і (б) одержують із рослинної клітини трансгенну рослину, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу багато нуклеїнових кислот ІМІ одержують із різних геномів. Даний винахід стосується також способів одержання трансгенної рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, який полягає в тому, що (а) трансформують рослинну клітину експресійним вектором, який містить нуклеїнову кислоту ІМІ, де нуклеїнова кислота не являє собою нуклеїнову кислоту Iml, і (б) одержують із рослинної клітини трансгенну рослину, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом рослини дикого типу. Даний винахід стосується також способів модифікації толерантності рослин до імідазолінонового гербіциду, який полягає в тому, що модифікують експресію однієї або декількох нуклеїнових кислот ІМІ. Переважно нуклеїнові кислоти локалізовані в різних геномах або отримані з різних геномів. Толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду можна підвищувати або знижувати шляхом підвищення або зниження відповідно експресії полінуклеотиду ІМІ. Переважно толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду підвищують шляхом підвищення експресії полінуклеотиду ІМІ. Експресію полінуклеотиду ІМІ можна модифікувати за допомогою будь-якого методу, відомого фахівцям у даній галузі. Можна застосовувати способи підвищення експресії полінуклеотиду ІМІ, у яких використовують або трансгенну, або нетрансгенну рослину. У тих випадках, коли рослина є трансгенною, рослину можна трансформувати, наприклад, вектором, який містить будь-яку з описаних вище нуклеїнових кислот, які кодують ІМІ, або рослину можна трансформувати за допомогою промотору, який забезпечує експресію ендогенних полінуклеотидів ІМІ в рослині. Відповідно до винаходу такий промотор може бути являти собою тканинноспецифічний або регульований стадією розвитку промотор. В альтернативному варіанті в нетрансгенних рослинах експресію ендогенного полінуклеотиду ІМІ модифікують за допомогою індукції нативним промотором. Експресія полінуклеотидів, які містять полінуклеотидну послідовність, яка представлена в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 або SEQ ID NO:23, у рослинах-мішенях може забезпечуватися одним з наступних факторів (але не обмежуючись ними): (а) конститутивним промотором, (б) хімічно індукованим промотором й (в) створеної за допомогою генної інженерії понадекспресії промотору з використанням, наприклад, отриманих з «цинкових пальців» факторів транскрипції (Greisman й Pabo, Science 275, 1997, с.657). Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу транскрипцію полінуклеотиду ІМІ модулюють за допомогою факторів транскрипції «ци 92716 42 нкових пальців (ZFP) відповідно до методу, описаному в Greisman й Pabo, Science 275, 1997, с.657, і за допомогою набору фірми Sangamo Biosciences, Inc. Ці ZFP містять як домен, який розпізнає ДНК, так і функціональний домен, який викликає активацію або пригнічення нуклеїнової кислоти-мішені, такої як нуклеїнова кислота ІМІ. Для цієї мети можна створювати активуючі або пригнічуючі ZFP, які специфічно розпізнають описані вище промотори полінуклеотиду ІМІ і використовують для підвищення або зниження експресії полінуклеотиду ІМІ у рослині, модулюючи тим самим толерантність рослини до гербіцидів. Як більш докладно було описано вище, рослини, отримані способами, запропонованими в даному винаході, можуть бути однодольними або дводольними. Рослини можна вибирати з таких рослин, як, наприклад, кукурудза, пшениця, жито, овес, тритікале, рис, ячмінь, соя, арахіс, бавовник, насінний рапс і канола, маніок, перець, соняшник, чорнобривці, пасльонові культури, такі як картопля, тютюн, баклажан і томат, види роду Vicia (віка), горох, люцерна, кава, какао, чай, види сімейства вербових (Salix), олійна пальма, кокос, багаторічні трави й кормові культури. Кормові культури включають (але не обмежуючись ними) пирій, канарник канарський, бромус, дике жито, тонконіг, грястицю збірню, люцерну, салфойн (Salfoin), лядвинець рогатий, конюшину червоно-білий, конюшину червону й солодку конюшину. У переважному варіанті здійснення винаходу рослина являє собою рослину пшениці. У кожному з описаних вище способів рослинна клітина представляє (але не обмежуючись ними), протопласт, гаметопродукуючу клітину й клітину, з якої регенерується ціла рослина. У контексті даного опису поняття «трансгенний» стосується будь-якої рослини, рослинної клітини, калюсу, рослинної тканини або частини рослини, які містять всю або частину принаймні одного рекомбінантного полінуклеотиду. У багатьох випадках весь рекомбінантний полінуклеотид або його частина стабільно інтегровані в хромосому або являють собою стабільний позахромосомний елемент, такий, котрий переходить у наступні покоління. Як вказане вище, даний винахід стосується композицій і способів підвищення толерантності до імідазолінонів рослини пшениці або її насіння в порівнянні із сортом рослини або насінням дикого типу. У переважному варіанті здійснення винаходу толерантність до імідазолінонів рослини пшениці або її насіння підвищують так, що рослина або насіння можуть витримувати обробку імідазолінонових гербіцидом переважно з використанням його норми витрати приблизно 10-400г д.р. на га, більш переважно 20-160г д.р. на га й найбільш переважно 40-80г д.р. на га. У контексті даного опису поняття «витримувати» обробку імідазолінонових гербіцидом означає, що рослина або не гине, або не ушкоджується при такій обробці. Крім того, у даному винаході запропонований спосіб боротьби з бур'янами поблизу рослин пшениці або рослин тритікале, який полягає в тому, що обробляють імідазоліноновим гербіцидом бур'яни й рослини пшениці або тритікале, де рослина пшениці або тритікале має підвищену толерант 43 ність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні із сортом дикого типу рослини пшениці або тритікале, і де рослина пшениці або тритікале містить одну або декілька нуклеїнових кислот ІМІ. Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу рослина пшениці або тритікале містить багато нуклеїнових кислот ІМІ, локалізованих у різних геномах або отриманих з різних геномів, де нуклеїнові кислоти ІМІ вибирають із групи, яка включає нуклеїнову кислоту Іmі 1, нуклеїнову кислоту Іmі 2 і нуклеїнову кислоту Іmі 3. В іншому варіанті здійснення винаходу рослина містить нуклеїнову кислоту Imi 2 і нуклеїнову кислоту Imi 3. У результаті надання рослинам пшениці й тритікале підвищеної толерантності до імідазолінону можна застосовувати багато композицій для захисту рослин пшениці й тритікале від бур'янів, що сприяє росту рослин і знижує конкуренцію за поживні речовини. Імідазоліноновий гербіцид можна застосовувати індивідуально для обробки перед проростанням, обробки після проростання, передпосівної обробки й обробки в процесі посіву з метою боротьби з бур'янами в ділянках, які оточують рослини пшениці, вказані у винаході, або можна застосовувати препаративну форму імідазолінонового гербіциду, яка містить інші добавки. Імідазоліноновий гербіцид можна використовувати також для обробки насіння. Добавки, які входять до складу препаративної форми імідазолінонового гербіциду, включають інші гербіциди, поверхнево-активні речовини, ад'юванти, речовини, які підвищують змочувальну здатність, прилипачі, стабілізатори або т.п. Препаративна форма імідазолінонового гербіциду може являти собою мокрий або сухий препарат і може являти собою (але не обмежуючись ними) плинні порошки, емульгувальні концентрати й рідкі концентрати. Імідазоліноновий гербіцид і препаративні форми гербіциду можна застосовувати за допомогою загальноприйнятих методів, наприклад, шляхом обприскування, зрошення, обпилювання або т.п. У даному описі наведені посилання на різні публікації. Опис всіх цих публікацій і посилань, процитованих у цих публікаціях, у всій їх повноті включений в даний опис як посилання для того, щоб більш докладно описати рівень техніки, до якої належить винахід. Слід розуміти також, що попередній опис стосується переважних варіантів здійснення даного винаходу й що можна здійснювати численні зміни без відхилення від обсягу винаходу. Нижче винахід проілюстрований на прикладах, які ніяким чином не обмежують його обсяг. Навики, слід чітко розуміти, що можна реалізовувати різні інші варіанти здійснення винаходу, його модифікації й еквіваленти, які після вивчення даного опису фахівці в даній галузі можуть запропонувати самі без відхилення від суті даного винаходу та/або обсягу формули винаходу. Приклади Приклад 1 Мутагенез і селекція толерантних ліній пшениці дурум Толерантні до імідазолінону лінії пшениці одержували шляхом мутації й наступних стандартних методів селекції. Спочатку мутагенез насіння ви 92716 44 кликали шляхом обробки насіння пшениці сорту дурум з використанням 3 або 3,5мл ЕМС (етилметансульфонат) на літр протягом 2год. і попереднього замочування в проточній воді протягом 5,5год., після чого їх промивали дистильованою водою. У процесі ЕМС-обробки насіння струшували через кожні 10-15хв. Після 2-годинної ЕМСобробки мутаген зливали й заміняли фосфатним буфером (0,001М, рН3,5). Потім насіння обробляли азидом натрію (2мл/л 1М маточного розчину), у процесі обробки насіння струшували періодично через 1год. Рідину зливали й насіння двічі промивали дистильованою водою, спускали воду й викладали для сушіння на піддони в теплиці протягом 24-36год., після чого висаджували в польових умовах у вологий ґрунт. Рослини покоління М1, отримані з обробленого насіння, збирали повністю й висаджували отримані насіння рослин покоління М2. Рослини покоління М2 обробляли гербіцидом Raptor з використанням норми витрати 10 унцій/акр (88,6г імазамоксу/га) на стадії трьох справжніх листів. Рослини, які вижили після обробки гербіцидом, переносили в теплицю для одержання насіння покоління М3. Лінії М2:3 піддавали скринінгу в теплиці з використанням або 10 унцій/акр (88,6г імазамоксу/га), або 12 унцій/акр (106,3г імазамоксу/га) гербіциди Raptor. Гербіцид застосовували на стадії трьох справжніх листків. Насіння М3:4 одержували з найбільш толерантних рослин покоління М3. Приклад 2 Толерантність ліній пшениці дурум до імідазолінінових гербіцидів Польові досліди (1): Дев'ять ліній М4:6, отриманих із чотирьох ліній рослин М2 (СІ19, СІ32, СІ37, CO12) оцінювали в досліді, проведеному з дублюванням в одній ділянці вирощування пшениці дурум в Італії. 75г/га імазамоксу застосовували для обробки 21-25 рослин на стадії росту ВВСН. Як правило, норма витрати 35г/га приводила до практично 100%-ної загибелі чутливих рослин пшениці. Вплив на вирощувану культуру (загальне ушкодження) змінювався від 0 до 13% через 21 день після обробки (ДПО) і від 0 до 17% через 43 ДПО. Урожай (в %) від урожаю необробленої лінії змінювався в межах від 85 до 102%. Польові досліди (2): 110 ліній М3:4, виведених з 60 рослин покоління М2 піддавали скринінгу з використанням норм витрати імазомоксу 71г/га й 160г/га. Кількість ліній М4 на рослину М2 змінювалася від 1 до 20. Толерантність рослин ліній М3:4 була порівнянна з толерантністю рослин тієї ж самої лінії на необроблених ділянках, а також сорту рослин дикого типу на оброблених ділянках, з якого були виведені деякі із вказаних рослин. Результати узагальнені в таблиці 1. Всі тестовані лінії виживали при обох нормах витрати гербіциду, у той час як всі рослини дикого типу гинули при обох нормах витрати. На основі порівняння з лінією дикого типу всі тестовані лінії характеризувалися вираженою толерантністю до застосовуваних норм витрати, насамперед віднос 45 92716 но зменшення висоти рослини по відношенню до рослин на необроблених ділянках. Норма витрати 35г/га імазамоксу приводила до загибелі чутливих рослин пшениці дурум. Таким чином, тестовані 46 лінії виявилися толерантними до норм, які перевищують вказану норму від майже 3 до більше ніж 4 разів. Таблиця 1 Оцінка толерантності в балах ліній М3:4, виведених з 14 різних рослин покоління М2, оброблених двома різними нормами витрати імазамоксу Хлороз (%) 14 ДПО1 Позначення рослин покоління М2 Дикий тип UT01 UT03 UT05 UT07 UT08 UT10 UT12 UT13 UT14 UT15 UT16 UT17 UT19 UT20 Зменшення росту (%) 14 ДПО 30 ДПО 30 ДПО 0 72 1603 0 71 160 0 71 160 0 71 160 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 90 0-10 0 5-10 0-5 0-10 5-10 0-10 5 5-10 30-70 5-10 5-20 30-40 0-5 90 1-10 5 5-15 5-10 0-10 10 10-15 5 10 30-70 10-20 5-30 40 5-10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 5 5-10 5-15 0-15 0-10 0-5 5 0 0-110 0 0 0 0 100 0-5 5 5-20 5-15 0-15 5 5-10 5-10 0 0-15 0-5 0-5 0-5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0 10 5-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0 0-10 0 0-20 0-10 0 100 0 10 10-30 0-10 0-10 0-20 0-20 0-10 0-10 0-10 0-10 0-30 0-10 0-20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 0-10 5 5-10 0-5 0-10 0-5 0-10 5 0-10 5-20 0-10 5-20 5-20 5-10 100 0-20 5 5-20 0-10 5-20 0-10 5-10 5 0-10 5-30 0-10 5-30 10-20 10-15 1 ДПО означає кількість днів після обробки певною нормою витрати гербіциду, коли проводили оцінку Цифри являють собою норми витрати гербіциду в г/га Цифри в таблиці являють собою діапазон реакцій ліній М3:4, виведених з кожного вказаної рослини покоління М2 2,3 Дослід у теплиці У досліді в теплиці проводили оцінку 15 ліній пшениці дурум, кожна з яких була отримана з різних рослин покоління М2, і двох ліній пшениці дикого типу відносно толерантності до імідазолінонового гербіциду імазамоксу, застосовуваному в нормах витрати 100 й 160г/га. Оцінки толерантності проводили на 14 й 21 день після обробки. Ушкодження оцінювали по 0-9-бальній шкалі, де 0 відповідав відсутності ушкоджень й 9 відповідав загибелі рослини. Результати узагальнені в таблиці 2. У всіх ліній була виявлена більш висока толерантність у порівнянні з лініями дикого типу, яка виявилася в тому, що всі рослини дикого типу загинули через 21 день після обробки, тобто на той час, коли навіть лінії, у яких через 14 днів були виявлені серйозні ушкодження, починали відновлюватися. Норма витрати імазамоксу 35 г/га приводила до загибелі чутливих рослин пшениці дурум. Таким чином, всіх 15 ліній, виведені шляхом мутагенезу, мали дуже високу толерантність по відношенню до імазамоксу. Таблиця 2 Усереднені бали ушкодження рослин потомства, виведеного з 15 рослин пшениці дурум покоління М2 й однієї лінії пшениці дурум дикого типу, оброблених двома різними нормами витрати 14 ДПО1 Лінія UT01 UT03 UT05 UT07 UT08 UT10 UT12 100г/га 4,0· 4,8 3,0 3,7 4,5 5,8 4,8 21 ДПО 160г/га 4,1 5,2 3,3 4,45,5 6,5 5,7 100г/га 1,4 2,2 1,3 1,9 1,9 4,3 2,1 160г/га 2,6 2,8 1,8 2,5 3,0 5Д 2,8 47 92716 48 Продовження таблиці 2 UT13 UT14 UT15 UT16 UT17 UT19 UT20 СІ19 Лінія дикого типу UT 4,7 зд 4,3 5,4 4,1 3,3 5,0 4,8 5,8 4,8 4,6 4,9 4,7 3,6 5,3 4,9 2,3 1,7 2,7 2,0 2,5 ІД 2Д 1,0 3,4 3,5 3,0 2,8 3,1 1,7 2,5 1,4 8,9 9,0 9,0 9,0 1 ДПО означає кількість днів після обробки певною нормою витрати гербіциду, коли проводили оцінку Числа в таблиці являють собою середні значення, отримані для 24 рослин для конкретного виду обробки. Рослини оцінювали по 0-9-бальній шкалі, де 0 відповідає відсутності ушкоджень й 9 відповідає загибелі рослини. Приклад 3 Біохімічна основа толерантності Фермент, який є мішенню для імідазодинонових гербіцидів, являє собою синтазу ацетогідроксикислот (AHAS), перший каталітичний фермент у шляху біохімічного синтезу амінокислот з розгалуженим ланцюгом валіну, лейцину й ізолейцину. Передбачається, що гербіцид зв'язується із сайтами в «кишені» ферменту, але не зв'язується з активним сайтом. Активність in vitro ферменту AHAS, екстрагованого з рослини, можна оцінювати біохімічними методами. У таблиці 3 проілюстрований вплив додавання різних концентрацій імідазолінонового гербіциду, такого як імазамокс, на активність білка AHAS, екстрагованого з рослин пшениці дурум дикого типу (лінія UT). Навіть при додаванні відно сно невеликих концентрацій активність AHAS швидко знижувалася. У таблиці 3 наведені також дані про активність AHAS у декількох толерантних до імідазолінонового гербіциду ліній, отриманих з М2. Інгібування активності виявилося істотно більш низьким при використанні більш низьких концентрацій імазамоксу й навіть при використанні найбільш високих концентрацій активність, як правило, становила від однієї третини до однієї другої від активності в контролі. Ці дані в сукупності з даними про толерантність, отриманими в теплиці й у польових дослідах, очевидно, підтверджують гіпотезу про те, що зміна в результаті мутагенезу принаймні одного гена AHAS у геномі пшениці дурум, приводить до утворення білка AHAS зі зниженою здатністю інгібуватися імазамоксом. Таблиця 3 Результати аналізу активності AHAS in vitro, виражені у відсотках відносно контролю, для 13 ліній пшениці дурум і контрольної лінії дикого типу (UT) при впливі різних концентрацій імазамоксу Лінія СІ19 UT01 UT03 UT05 UT07 UT08 UT10 UT12 UT13 UT14 UT16 UT17 UT20 UT 0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 13 54,0 61,6 73,7 54,1 64,3 60,3 68,4 58,3 73,2 62,4 51,9 59,3 63,4 15,9 Концентрація імазамоксу (мкМ) 25 50 56,3 55,3 58,5 54,1 63,5 60,3 59,5 56,9 61,3 46,9 55,3 49,6 59,7 54,9 55,6 52,7 60,4 51,8 53,5 56,8 46,7 45,5 48,0 48,0 61,8 50,3 11,1 10,2 Приклад 4 Молекулярна основа толерантності Визначення характеристик на молекулярному рівні толерантних до імідазолінону ліній підтвердило наявність специфічних мутацій у генах, які 100 41,9 49,6 52,2 45,4 50,6 41,2 46,6 44,9 46,5 55,6 41,7 36,5 40,3 5,4 кодують фермент AHAS (Als 2 й Als 3). Толерантна до імідазолінону лінія СІ19 мала заміну пари основ (гуаніну на аденін) у гені Als 2, що приводило до заміни серину на аспарагін у домені Ε ферменту AHAS. Лінія СІ19 не містила ніяких мутацій у гені 49 Als 3. Аналогічно до цього толерантні до імідазолінону лінії UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17, UT20 усі містили послідовність гена Als 3 дикі типи й заміну пари основ (гуаніну на аденін) у гені Als 2. Толерантна до імідазолінону лінія UT12 містила в гені Als 3 заміну пари основ (гуаніну на аденін), що приводило до заміни серину на аспарагін у домені Ε ферменту AHAS. Лінія UT12 не містила ніяких мутацій у гені Als 2. Толерантні до імідазолінону лінії Utopia UT15 й UT19 містили в гені Als 3 нові мутації, а саме заміну пари основ (гуаніну на аденін), що приводило до заміни амінокислоти аланіну на треонін в Nкінцевій ділянці ферменту AHAS. Толерантна до імідазолінону лінія Utopia UT15 містила також у гені Als 2 заміну пари основ (тиміну на цитозин), що не приводило до амінокислотної заміни. Приклад 5 Створення толерантних до імідазолінону рослин пшениці Толерантні до імідазолінону рослини пшениці одержували методом, описаним в Ishida й ін., Natura Biotech., 14, 1996, стор.745-750. Незрілі зародки розміром 1-2мм виділяли через 10-15 днів 92716 50 після запилення й стерилізували етанолом й 30%ним розчином хлороксу. Незрілі зародки заражали клітинами Agrobacterium, які несуть конструкцію, що представляє інтерес, у векторі фірми Japan Tobacco на LS-середовищі для зараження й потім на LS-середовищі для спільного культивування протягом 3-7 днів (всі середовища одержували від Japan Tobacco) відповідно до методу, описаному в Ishida й ін., Natura Biotech., 14, 1996, стор.745-750. Потім експлантати переносили на LS-середовище, яке містить від 0,05 до 0,1мкМ PURSUIT® і культивували при слабкому освітленні протягом 1-2 тижнів. Активно зростаючі калюси переносили для 2-ої й 3-ої селекції на LS-середовище, доповнене 0,51,0мкМ імазетапіром (PURSUIT®), і культивували протягом 2-3 тижнів. Після 3-ої селекції калюси переносили на середовище для регенерації, доповнене 0,25-0,75мкМ імазетапіром (PURSUIT®), на три тижні. Потім паростки переносили на LSсередовище для вирощування половинної міцності й культивували протягом трьох тижнів перед пересадженням у ґрунт і вирощуванням у теплиці. Передбачувані трансгенні рослини обприскували імазамоксом (25-50г/га) (RAPTOR®) для знищення здичавілих культурних рослин. 51 92716 52 53 92716 54 55 92716 56 57 92716 58 59 92716 60