Кон’югат, що містить похідну оксинтомодуліну, fc-ділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, та його застосування

Реферат: Винахід стосується кон'югата, що містить похідну оксинтомодуліну, Fc-ділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, де непептидильний полімер є ковалентно зв'язаним з похідною оксинтомодуліну та Fc-ділянкою імуноглобуліну. Винахід стосується також фармацевтичної UA 114709 C2 (12) UA 114709 C2 композиції, що містить вказаний кон'югат, та застосування кон'югата у приготуванні ліків для запобігання або лікування ожиріння. UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Заявлений винахід стосується кон'югату, що містить оксинтомодулін та фрагмент імуноглобуліну та його застосування. Більш докладно, заявлений винахід стосується кон'югату, що містить оксинтомодулін, Fc-ділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, де кон'югат отримано шляхом ковалентного зв'язування оксинтомодуліну з Fc-ділянкою імуноглобуліну через непептидильний полімер та фармацевтичної композиції для запобігання або лікування ожиріння, що містить кон'югат. Останнім часом економічне зростання та змінення у способі життя також ведуть до змінень звичок харчування. Головними причинами зростання випадків надмірної ваги та показників ожиріння у сучасних людей є споживання висококалорійних продуктів, як-то їжі з фаст-фудів та бракування фізичних вправ. Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ) вважає, що більше 1 мільярда людей у всьому світі мають надмірну вагу та щонайменше 300 мільйонів з них страждають ожирінням. Зокрема, в Європі щороку в результаті надмірної ваги помирає біля 250 тисяч осіб та у всьому світі через цю недугу щорічно гине більше 2,5 млн. людей (Всесвітня організація охорони здоров'я, глобальна стратегія з харчування, фізичної активності та здоров'ю, 2004). Надмірна вага та ожиріння збільшує кров'яний тиск та рівень холестерину, викликаючи виникнення або загострення різних захворювань, як-то серцево-судинні захворювання, діабет та артрит, а також є головними причинами зростання коефіцієнту частоти захворювань на атеросклероз, гіпертонію, гіперліпідемію або серцево-судинних захворювань у дорослих, дітей або підлітків. Ожиріння є серйозним станом, який викликає різні захворювання у всьому світі. Вважають, що воно може бути подолано шляхом індивідуальних зусиль, однак також вважають, що пацієнтам, що страждають цією хворобою не вистачає самовладання. Проте лікувати ожиріння дуже важко, тому що воно є складним захворюванням, до якого залучені регуляція апетиту та енергетичний обмін. Для лікування ожиріння треба розглядати аномальні дії, пов'язані з регуляцією апетиту та енергетичним обміном спільно з зусиллями пацієнтів, що страждають на цю хворобу. Було здійснено багато спроб розробки медичних препаратів, здатних до лікування цих аномальних дій, в ході яких були отримані наступні ліки, як-то римонабант (Sanofi-Aventis), сибутрамін (Abbott), контрав (Takeda) та ористат (Roche), але вони мають ряд недоліків, що полягають у серйозних несприятливих наслідках або у дуже слабкої ефективності лікування ожиріння. Наприклад, було повідомлено, що препарат римонабант (Sanofi-Aventis) має побічний вплив на центральну нервову систему, побічні дії препаратів сибутрамін (Abbott) та контрав (Takeda) зачіпають серцево-судинну систему та вживання протягом року препарату ористат (Roche) призвело до втрати ваги лише на 4 кг. На жаль, досі немає жодних терапевтичних засобів для лікування ожиріння, що можуть бути безпечно призначені пацієнтам з цією хворобою. Багато досліджень було спрямовано на розвиток терапевтичних агентів для лікування ожиріння, що були б позбавлені проблем, притаманних звичайним лікам проти цієї недуги. Нещодавно багато уваги отримали похідні глюкагону. Глюкагон виробляється підшлунковою залозою, коли рівень глюкози в крові падає в результаті дії інших ліків або захворювань чи гормональних або ферментних нестач. Глюкагон стимулює розщеплення глікогену в печінці та сприяє вивільненню глюкози для підйому рівня глюкози у крові до нормального значення. Крім підвищення рівня глюкози у крові, глюкагон також пригнічує апетит та активує чутливу до гормонів ліпазу (HSL) адипоцитів для полегшення ліполізу та тим самим демонструє дії, що спрямовані проти ожиріння. Одну з похідних глюкагону, глюкагоноподібний пептид -1 (GLP-1) зараз досліджують у якості розробки можливого терапевтичного агенту для лікування гіперглікемії у пацієнтів з діабетом. Дія GLP-1 полягає у стимулюванні синтезу та секреції інсуліну, пригніченні секреції глюкагону, уповільненні спорожнення шлунка, підвищенні засвоювання глюкози та у пригніченні прийому їжі. Ексендин-4, виділений з отрути ящірки має приблизно 50 % амінокислотної тотожності до GLP-1 та, як також повідомляють, здатен активувати рецептор GLP-1, тим самим зменшуючи гіперглікемію у пацієнтів з цукровим діабетом. Однак було повідомлено, що ліки, спрямовані проти ожиріння, в тому числі GLP-1 демонструють також побічні прояви, як-то блювання та нудоту. Отже, в якості альтернативи GLP-1, велику увагу було зосереджено на оксінтомодуліні, який являє собою пептид, отриманий з пре-глюкагону (попередника глюкагону) та зв'язується з рецепторами двох інших пептидів - GLP-1 та глюкагону. Оксінтомодулін демонструє потужну терапевтичну дію, спрямовану проти ожиріння завдяки тому, що він, подібно до GLP-1, також пригнічує прийом їжі, сприяє ситості та на додачу, подібно глюкагону, ще має ліполітичну активність. Завдяки своєї подвійній функції оксинтомодуліновий пептид активно досліджують для можливого застосування у якості ліків для лікування ожиріння. Наприклад, Korean Patent No. 1 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 925017 присвячений фармацевтичній композиції, що містить оксинтомодулін у якості активного інгредієнту для лікування надлишкової маси тіла людини та яку вводять пероральним, парентеральним, трансмукозальним, ректальним, підшкірним або трансдермальним шляхом. Однак, повідомляється, що ці ліки проти ожиріння, в тому числі оксинтомодулін, мають короткий час напівжиття in vivo та слабку терапевтичну ефективність навіть при триразовому введенні протягом дня з високою дозою. Отже, було зроблено багато спроб покращення часу напівжиття in vivo або поліпшення терапевтичної дії оксинтомодуліну щодо лікування ожиріння шляхом його модифікації. Наприклад, шляхом заміщення L-серину на D-серин у положенні 2 оксинтомодуліну для підвищення його стійкості до дипептидилпептидази-IV був отриманий його подвійний агоніст (Merck) (DPP-IV). Приєднання холестеринової функціональної групи до C-кінця водночас дозволило підвищити час напівжиття цієї сполуки у крові. Сполука ZP2929 (Zealand) була отримана шляхом заміщення L- серину на D-серин у положенні 2 для посилення стійкості до DPP-IV, заміщення аргініну на аланін у положенні 17 для посилення стійкості до протеази, заміщення метіоніну на лізин у положенні 27 для посилення оксидативної стійкості та заміщення глютаміну на аспарагінову кислоту та аланін у положеннях 20 та 24 та аспарагіну на серин у положенні 28 для посилення стійкості дезамінування. Однак, навіть при збільшенні часу напівжиття подвійного агоністу оксинтомодуліну (Merck), що став на 8~12 хвилин довшим, ніж у нативного оксинтомодуліну, він також залишається дуже коротким, дорівнює 1.7 годин та потребує введення дози розміром аж до декількох міліграмів на кілограм. На жаль, оксинтомодулін або його похідні мають недоліки, пов'язані з щоденним введенням великої дози через короткий час напівжиття та низьку ефективність. Винахідники здійснили багато спроб з метою отримання способу підвищення часу напівжиття оксинтомодуліну у крові разом зі збереженням його активності in vivo. В результаті вони знайшли, що кон'югат, отриманий шляхом зв'язування носія з оксинтомодуліном з застосуванням непептидильного полімеру демонструє покращений час напівжиття у крові разом зі збереженням його активності in vivo, отже демонструє відмінну дію, спрямовану проти ожиріння, що тим самим довело заявлений винахід до завершення. Предметом заявленого винаходу є отримання кон'югату, що містить оксинтомодулін, Fcділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, де кон'югат отримано шляхом ковалентного зв'язування оксинтомодуліну з Fc-ділянкою імуноглобуліну через непептидильний полімер. Іншим предметом заявленого винаходу є отримання фармацевтичної композиції для запобігання або лікування ожиріння, що містить кон'югати. Також іншим предметом заявленого винаходу є отримання способу запобігання або лікування ожиріння, що, зокрема, полягає у введенні суб'єкту кон'югату або композиції. Іншим предметом заявленого винаходу є отримання способу застосування кон'югату або композиції для отримання лікарських препаратів для запобігання або лікування ожиріння. На відміну від нативного оксинтомодуліну, кон'югат, що містить оксинтомодулін та Fcімуноглобулін заявленого винаходу зменшує прийом їжі, пригнічує спорожнення шлунка, полегшує ліполіз без побічних ефектів, а також демонструє, у порівнянні з оксинтомодуліном, відмінну дію, спрямовану на активування рецептора та довготривалу стійкість, отже, його можна широко застосувати у лікуванні ожиріння з безпечністю та ефективністю. На відміну від нативного оксинтомодуліну, новий пептид заявленого винаходу також зменшує прийом їжі, пригнічує спорожнення шлунка, полегшує ліполіз без побічних ефектів та демонструє відмінну дію, спрямовану на активування рецептору, отже, його також можна широко застосувати у лікуванні ожиріння з безпечністю та ефективністю. Опис малюнків. Фіг. 1 є графіком, де наведені змінення у прийом їжі відповідно до введення дози оксинтомодуліну або похідної оксинтомодуліну. Фіг. 2a є графіком, де наведено результат очищення моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну за допомогою очисної колонки SOURCE S. Фіг. 2b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеного моноПЕГільованого оксинтомодуліну. Фіг. 2c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, в тому числі оксинтомодуліну та Fc-імуноглобуліну за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 3a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Фіг. 3b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) та Fc-імуноглобуліну за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. 2 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 4a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Фіг. 4b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеної похідної моноПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30). Фіг. 4c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 5a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Фіг. 5b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 6a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Фіг. 6b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеної похідної моноПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2). Фіг. 6c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 6d є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO. Фіг. 7a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3), допомогою очисної колонки SOURCE S. Фіг. 7b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеної похідної моноПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3). Фіг. 7c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fc-імуноглобулін за допомогою бутилової високошвидкісної очисної колонки. Фіг. 7d є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 8a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) за допомогою очисної колонки SOURCE S; Фіг. 8b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q; Фіг. 8c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO; Фіг. 9a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) за допомогою очисної колонки SOURCE S; Фіг. 9b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q; Фіг. 9c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO; Фіг. 10a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) за допомогою очисної колонки SOURCE S; Фіг. 10b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q; Фіг. 10c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO; Фіг. 11a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) за допомогою очисної колонки SOURCE S; 3 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 11b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q; Фіг. 11c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO; Фіг. 12 є графіком, де наведені змінення маси тіла мишей відповідно від дози та типу введення кон'югатів похідної оксинтомодуліну з Fc-імуноглобуліном. Фіг. 13 є графіком, де наведені змінення маси тіла мишей відповідно від дози та типу введення кон'югатів похідної оксинтомодуліну з Fc-імуноглобуліном. У одному аспекті, для досягнення вищезазначеної мети, заявленим винаходом передбачено кон'югат, що містить оксинтомодулін, Fc-ділянку імуноглобуліну та непептидильний полімер, де означений кон'югат можна отримати шляхом ковалентного зв'язування оксинтомодуліну з Fcділянкою імуноглобуліну через непептидильний полімер. Як тут застосовано, термін "кон'югат" має відношення до кон'югату, що містить оксинтомодулін та інші фактори. Ці інші фактори можуть бути будь-якою речовиною, яка може викликати підвищену стійкість у крові, призупиняти виділення через нирки або мати інші корисні ефекти. До таких факторів у заявленому винаході може бути віднесено Fc-ділянку імуноглобуліну. Переважним чином, кон'югат може складатися з оксинтомодуліну та Fc-ділянки імуноглобуліну, зв'язаних непептидильним полімером. Непептидильний полімер може зв'язувати оксинтомодулін та Fc-ділянку імуноглобуліну за допомогою ковалентних зв'язків. Два кінця непептидильного полімеру можуть бути відповідно зв'язані з аміногрупою або тіоловою групою Fc-ділянки імуноглобуліну та похідних оксинтомодуліну. Передбачається, що кон'югат заявленого винаходу буде мати покращену тривалість ефективної дії in-vivo у порівнянні з нативним оксинтомодуліном та кон'югат тривалої дії може охоплювати, але без обмеження по типу, оксинтомодулін, отриманий шляхом модифікації, заміщення, додавання або делеції амінокислотної послідовності нативного оксинтомодуліну, оксинтомодулін, кон'югований з біорозкладаним полімером, як-то поліетиленгліколь (ПЕГ), оксинтомодулін, кон'югований з білком тривалої дії, як-то альбумін або імуноглобулін, оксинтомодулін, кон'югований з жирною кислотою, що має здатність зв'язуватися з альбуміном у організмі або оксинтомодулін, інкапсульований у біорозкладаних наночастинках. Як тут застосовано, термін" оксинтомодулін" має відношення до пептиду, що походить від пре-глюкагону (білка-попередника глюкагону) та охоплює нативний оксинтомодулін та його попередники, похідні, фрагменти та варіанти. Переважним чином, він може мати амінокислотну послідовність, зазначену, як SEQ ID NO.1 (HSQG TFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA). Термін “ варіант оксинтомодуліну ” має відношення до пептиду, що має одну або декілька амінокислотних послідовностей, які відрізняються від амінокислотних послідовностей нативного оксинтомодуліну, зберігає функцію активування рецепторів GLP-1 та глюкагону та може бути отриманий шляхом будь-якого заміщення, додавання, делеції та модифікації або шляхом комбінації означених змінень у частині амінокислотної послідовності нативного оксинтомодуліну. Термін "похідна оксинтомодуліну" охоплює пептиди, похідні або міметики пептидів, отримані шляхом додавання, делеції або заміщення амінокислот оксинтомодуліну за умови отримання більш високого, у порівнянні з нативним оксинтомодуліном, рівня активування рецепторів GLP-1 та глюкагону. Термін "фрагмент оксинтомодуліну" має відношення до фрагменту, що має додавання (при якому можуть бути додані амінокислоти, що не зустрічаються у природі (наприклад, амінокислоти D-типу)) або делецію однієї або декількох амінокислот до N- або C- кінця нативного оксинтомодуліну та який має функцію активування рецепторів GLP-1 та глюкагону. Кожен спосіб отримання варіантів, похідних та фрагментів оксинтомодуліну можна застосувати окремо або у комбінації. Наприклад, заявлений винахід передбачає пептид, який має одну або декілька амінокислот, що відрізняються від амінокислот нативного пептиду та дезамінування N- кінцевого амінокислотного залишку та здатен до активування рецепторів GLP1 та глюкагону. Зазначені ту амінокислоти мають наступну абревіатуру згідно з правилом номенклатури IUPAC-IUB: аланін - A, аргінін - R, аспарагін - N,аспарагінова кислота - D, цистеїн - C, глютамінова кислота - E, глютамін - Q, гліцин - G, гістидин - H, ізолейцин - I, лейцин - L, лізин - K, метіонін - M, фенілаланін - F, пролін - P, серин - S, треонін - T, триптофан - W, тирозин- Y, валін - V. 4 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Похідна оксинтомодуліну у заявленому винаході охоплює будь-який пептид, отриманий шляхом заміщень, додавань, делецій або пост-трансляційних модифікацій (наприклад, метилування, ацилування, убиквитинилування, внутрішньомолекулярного ковалентного зв'язування) у амінокислотній послідовності оксинтомодуліну (HSQGTFTS DYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA, SEQ ID NO.1) за умови одночасного активування ним рецепторів глюкагону та GLP-1. Для зазначеного заміщення або додавання може бути застосована будь-яка з 20 амінокислот, яких звичайно можна зустріти у білках людини, а також атипові та штучні амінокислоти. Атипові амінокислоти можна придбати від відомих виробників, як-то Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. та Genzyme Pharmaceuticals. Пептиди, які містять ці амінокислоти та атипові пептидні послідовності можна синтезувати та придбати від промислових постачальників, наприклад, від American Peptide Company або Bachem (США) або Anygen (Корея). У одному особливому втіленні, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу є новим пептидом, що містить амінокислоти за наступною Формулою 1. R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20X21-X22-X23-X24-R2 (Формула 1). де R1 є гістидином, дезаміно-гістидилом, диметил-гістидилом (N-диметил-гістидил), бетагідроксиімідазопропіонілом, 4-імідазоацетилом, бета-карбокси імідазопропіонілом або тирозином; X1 є Aib (аміноізомасляною кислотою), d-аланіном, гліцином, Sar (N-метилгліцином), серином або d- серином; X2 є глютаміновою кислотою або глютаміном; X3 є лейцином або тирозином; X4 є серином або аланіном; X5 є лізином або аргініном; X6 є глютаміном або тирозином; X7 є лейцином або метіоніном; X8 є аспарагіновою кислотою або глютаміновою кислотою; X9 є глютаміновою кислотою, серином, альфа-метил-глютаміновою кислотою або видалено; X10 є глютаміном, глютаміновою кислотою, лізином, аргініном, серином або видалено; X11 є аланіном, аргініном, валіном або видалено; X12 є аланіном, аргініном, серином, валіном або видалено; X13 є лізином, глютаміном, аргініном, альфа-метил-глютаміновою кислотою або видалено; X14 є аспарагіновою кислотою, глютаміновою кислотою, лейцином або видалено; X15 є фенілаланіном або видалено; X16 є ізолейцином, валіном або видалено; X17 є аланіном, цистеїном, глютаміновою кислотою, лізином, глютаміном, альфа-метилглютаміновою кислотою або видалено; X18 є триптофаном або видалено; X19 є аланіном, ізолейцином, лейцином, серином, валіном або видалено; X20 є аланіном, лізином, метіоніном, глютаміном, аргініном або видалено; X21 є аспарагіном або видалено; X22 є аланіном, гліцином, треоніном або видалено; X23 є цистеїном, лізином або видалено; X24 є пептидом, що має 2-10 амінокислот та складається з комбінацій аланіну, гліцину та серину або видалено; та R2 є послідовністю KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO. 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO. 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO. 40) або видалено (за виключенням випадку, якщо амінокислотна послідовність за Формулою 1 є ідентичною до амінокислотній послідовності SEQ ID NO. 1). З метою підсилення активності оксинтомодуліну дикого типу до глюкагонового рецептора та рецептора GLP-1, пептид заявленого винаходу може бути заміщено 4-імідазоацетилом, де видалено альфа-карбон гістидину у положенні 1 амінокислотної послідовності, позначеної тут, як SEQ ID NO. 1; дезаміно-гістидилом, у якому видалено N-кінцеву аміногрупу; диметилгістидилом (N-диметил-гістидил), у якому N-кінцеву аміногрупу модифіковано двома метильними групами; бета-гідрокси-імідазопропіонілом, у якому N-кінцеву аміногрупу заміщено гідроксильною групою або бета-карбокси-імідазопропіонілом, у якому N-кінцеву аміногрупу заміщено карбоксильною групою. Крім того, ділянка зв'язування рецептора GLP-1 також може бути заміщена амінокислотами, що підсилюють гідрофобні та іонні зв'язки або їх комбінації. Для 5 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 підсилення активності до рецептора GLP-1, частину послідовності оксинтомодуліну може бути заміщено амінокислотною послідовністю GLP-1 або ексендину-4. Крім того, частину послідовності оксинтомодуліну може бути заміщено послідовністю, що стабілізує альфа-спіраль. Переважним чином, амінокислоти у положеннях 10, 14, 16, 20, 24 та 28 амінокислотної послідовності за Формулою 1 можуть бути заміщені амінокислотами або похідними амінокислот, що охоплюють Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-тіеніл) та Ala(бензотіеніл) та, як відомо, стабілізують альфа-спіраль без обмежень по типу чи по кількості амінокислот або їх похідних, що стабілізують альфа-спіраль та можуть бути вставленими. Переважним чином, амінокислоти у положеннях 10 та 14, 12 та 16, 16 та 20, 20 та 24 та 24 та 28 також можуть бути заміщені на глютамінову кислоту або лізин, відповідно щоб утворювати кільця, але також не існує обмежень по кількості кілець, що буде вставлена. Найбільш переважніше, пептид може мати амінокислотну послідовність, вибрану з наступних Формул 1-6. У одному особливому втіленні, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу є новим пептидом, що містить амінокислотну послідовність за наступною Формулою 2, де амінокислотну послідовність оксинтомодуліну заміщено амінокислотною послідовністю ексендину або GLP-1. R1-A-R3 (Формула 2). У іншому особливому втіленні, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу є новим пептидом, що містить амінокислотну послідовність за наступною Формулою 3, отриманим шляхом з'єднання частини амінокислотної послідовності оксинтомодуліну та частини амінокислотної послідовності ексендину або GLP-1 через прийнятний амінокислотний лінкер. R1-B-C-R4 (Формула 3). У іншому особливому втіленні, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу є новим пептидом, що містить амінокислотну послідовність за наступною Формулою 4, у якої частину амінокислотної послідовності оксинтомодуліну заміщено амінокислотою, здатною до підсилення спорідненості зв'язування до рецептора GLP-1, наприклад, амінокислоту Leu у положенні 26, яка зв'язується з рецептором GLP-1 шляхом гідрофобної взаємодії заміщено гідрофобним залишком, Ile або Val. R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3 (Формула 4). У іншому особливому втіленні, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу є новим пептидом, в тому числі пептидом за наступною Формулою 5, де частина амінокислотної послідовності є видаленою, доданою, або заміщеною іншими амінокислотами для підсилення активних властивостей нативного оксинтомодуліну до рецепторів GLP-1 та глюкагону. R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5 (Формула 5). Радикал R1, наведений у Формулах 2-5 відповідає опису за Формулою 1; A вибрано з групи, що охоплює послідовності SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQ WLMNT (SEQ ID NO. 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO. 42), SQ GTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO. 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRL FIEWLKNG (SEQ ID NO. 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO. 45), GEGTFTSDLSRQMEEEA VRLFIEWAA (SEQ ID NO. 46) та SQGTFTSDYSRQMEEEAVR LFIEWLMNG (SEQ ID NO. 47); B вибрано з групи, що охоплює послідовності SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFV QWLMNT (SEQ ID NO. 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO. 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO. 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVR LFIEWLKNG (SEQ ID NO. 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO. 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO. 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAV RLFIEWLMNG (SEQ ID NO. 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO. 48) та SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO. 49); C є пептидом, який має 2-10 амінокислот та складається з комбінацій аланіну, гліцину та серину; D1 є серином, глютаміновою кислотою або аргініном; D2 є аргініном, глютаміновою кислотою або серином; D3 є аргініном, аланіном або валіном; D4 є аргініном, валіном або серином; D5 є глютаміном, аргініном або лізином; D6 є ізолейцином, валіном або серином; D7 є метіоніном, аргініном або глютаміном; D8 є треоніном, гліцином або аланіном; E1 є серином, Aib, Sar, d-аланіном або d-серином; E2 є серином або глютаміновою кислотою; 6 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 E3 є аргініном або лізином; E4 є глютаміном або лізином; E5 є аспарагіновою кислотою або глютаміновою кислотою; E6 є глютаміном, цистеїном або лізином; E7 є цистеїном, лізином або видалено; R3 є послідовністю KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36) або GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37); R4 є послідовністю HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO. 38), HSQGTFTSDYSRYL DK (SEQ ID NO. 39) або HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO. 40); та R5 є послідовністю KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37) або видалено (за виключенням випадку, коли амінокислотні послідовності за Формулою 2-5 є ідентичними до послідовності SEQ ID NO. 1). Переважним чином, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу може бути новим пептидом за наступною Формулою 6. R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20X21-X22-X23-X24-R2 (Формула 6). Де R1 є гістидином, дезаміно-гістидилом, 4-імідазоацетилом або тирозином; X1 є Aib (аміноізомасляною кислотою), гліцином або серином; X2 є глютаміновою кислотою або глютаміном; X3 є лейцином або тирозином; X4 є серином або аланіном; X5 є лізином або аргініном; X6 є глютаміном або тирозином; X7 є лейцином або метіоніном; X8 є аспарагіновою кислотою або глютаміновою кислотою; X9 є глютаміновою кислотою, альфа-метил-глютаміновою кислотою або видалено; X10 є глютаміном, глютаміновою кислотою, лізином, аргініном або видалено; X11 є аланіном, аргініном або видалено; X12 є аланіном, валіном або видалено; X13 є лізином, глютаміном, аргініном, альфа-метил-глютаміновою кислотою або видалено; X14 є аспарагіновою кислотою, глютаміновоюкислотою, лейцином або видалено; X15 є фенілаланіном або видалено; X16 є ізолейцином, валіном або видалено; X17 є аланіном, цистеїном, глютаміновою кислотою, глютаміном, альфа-метилглютаміновою кислотою або видалено; X18 є триптофаном або видалено; X19 є аланіном, ізолейцином, лейцином, валіном або видалено; X20 є аланіном, лізином, метіоніном, аргініном або видалено; X21 є аспарагіном або видалено; X22 є треоніном або видалено; X23 є цистеїном, лізином або видалено; X24 є пептидом, що має 2-10 амінокислот, які є гліцином або видалено; та R2 є послідовністю KRNRNNIA (SEQ ID NO. 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO. 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO. 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO. 38), HSQGTFTSD YSRYLDK (SEQ ID NO. 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO. 40) або видалено (за виключенням випадку, коли амінокислотна послідовність за Формулою 6 є ідентичною послідовності SEQ ID NO. 1). Більш переважним чином, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу може бути вибраною з групи, що охоплює пептиди SEQ ID NO. 2-34. Ще переважніше, похідна оксинтомодуліну заявленого винаходу може бути похідною оксинтомодуліну, описаною у Таблиці 1 Прикладу 2-1. Оксинтомодулін має активні властивості двох пептидів, GLP-1 та глюкагону. GLP-1 зменшує рівень глюкози у крові, зменшує прийом їжі та пригнічує спорожнення шлунка та глюкагон підвищує рівень глюкози у крові, полегшує ліполіз та зменшує масу тіла шляхом підвищення енергетичних метаболізмів. Різні біологічні дії двох пептидів можуть викликати різні небажані ефекти, як-то підвищення рівня глюкози у крові, якщо глюкагон демонструє більш домінантний ефект, ніж GLP-1, або викликання нудоти та блювання, якщо GLP-1 демонструє більш домінантний ефект, ніж глюкагон. Наприклад, кон'югат, отриманий у наведеному нижче Прикладі 10 демонструє більш сильну спорідненість до рецептора GLP-1, ніж кон'югат, отриманий у Приклад 12, але в результаті експерименту in vivo, наведеного у Прикладі 18 було 7 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 показано, що ефективність першого з них була нижчою, ніж ефективність другого, що могло бути пов'язано з підвищенням ефективності кон'югатів по відношенню до рецептора глюкагону в прикладі 12, незважаючи на його низьку ефективність по відношенню до рецептора GLP-1. Отже, похідні оксинтомодуліну та їх кон'югати, що охоплюються заявленим винаходом не обмежуються тільки тими похідними, що демонструють безумовне покращення активних функцій. Наприклад, для контролю співвідношення активності глюкагону та GLP-1, амінокислоти можуть бути модифіковані у положеннях 1 та 11 оксинтомодуліну, що, як відомо, пригнічує активність глюкагону. Кон'югати заявленого винаходу можуть викликати підвищену стійкість у крові, подовжене вивільнення з нирок та змінення спорідненості до рецепторів шляхом ковалентного зв'язування носія з оксинтомодуліном або шляхом утворення мікросфер. Носій, здатний утворювати кон'югат, що містить оксинтомодулін може бути вибраним з групи, що охоплює альбумін, трансферин, антитіла, фрагменти антитіл, еластин, гепарин, полісахариди, як-то хітин, фібронектин та, ще більш бажано, Fc-ділянку імуноглобуліну, де кожна з вищеозначених сполук може підвищити час напівжиття кон'югатів у крові при зв'язуванні з оксинтомодуліном. Термін "Fc-ділянка імуноглобуліну" як тут застосовано, має відношення до білка, що містить важколанцюгову сталу ділянку 2 (CH2) та важколанцюгову сталу ділянку 3 (CH3) імуноглобуліну, за винятком його змінних ділянок важкого та легкого ланцюгів, важколанцюгової сталої ділянки 1 (CH1) та легколанцюгової сталої ділянки 1 (CL1). Також він може додатково містити петельну ділянку у важколанцюговій сталій ділянці та частину або всі Fc-ділянки, в тому числі важколанцюгову сталу ділянку 1 (CH1) та/або легколанцюгову сталу ділянку 1 (CL1), за винятком змінних ділянок важкого та легкого ланцюгів, за умови, що він має фізіологічні функції суттєво схожі або кращі, ніж у нативного білка. Також Fc-ділянка імуноглобуліну може бути фрагментом з делецією відносно великої частини амінокислотної послідовності CH2 та/або CH3. Отже, Fc-ділянка імуноглобуліну заявленого винаходу може містити 1) домен CH1, домен CH2, домен CH3 та домен CH4, 2) домен CH1 та домен CH2, 3) домен CH1 та домен CH3, 4) домен CH2 та домен CH3, 5) комбінацію одного або декількох доменів та петельної ділянки (або частини петельної ділянки) імуноглобуліну та 6) димер кожного домену важколанцюгових та легколанцюгових сталих ділянок. Fc-ділянка імуноглобуліну заявленого винаходу містить нативну амінокислотну послідовність та послідовність, яка походить від неї (мутантну). Такою похідною амінокислотної послідовності є послідовність, що відрізняється від нативної амінокислотної послідовності завдяки наявності делецій, вставок, неконсервативних або консервативних заміщень одного або декількох амінокислотних залишків або комбінацій таких змінень. Наприклад, у Fc-ділянці антитіл IgG, прийнятною метою для модифікації можуть бути амінокислотні залишки, що, як відомо, відіграють важливу роль у зв'язуванні та знаходяться у положеннях 214-238, 297-299, 318-322 або 327-331. Також можна застосувати різні інші похідні, в тому числі похідні, у яких видалено ділянку, здатну утворювати дисульфідний зв'язок або видалено певні амінокислотні залишки на N-кінці нативної Fc-ділянки або додано метіоніновий залишок. Крім того, для видалення ефекторних функцій також можна внести делецію у сайт зв'язування з комплементом, як-то у сайт зв'язування C1q та у сайт ADCC (залежної від антитіл клітинно-опосередкованої цитотоксичності). Способи отримання таких похідних послідовності Fc-ділянки імуноглобуліну наведені у WO 97/34631 та WO 96/32478. У цій галузі також відомі заміни амінокислот у складі білків та пептидів, що суттєво не змінюють їх активності (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Найбільш часто зустрічаються наступні заміни у обох напрямках, як-то Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu та Asp/Gly. Крім того, по бажанню можна модифікувати Fc-ділянку шляхом фосфорилювання, сульфатування, акрилування, глікозилювання, метилювання, фарнезилювання, ацетилювання, амідування тощо. Вищезгадані Fc-похідні є похідними, що мають біологічну активність, ідентичну біологічній активності Fc-ділянки заявленого винаходу або покращену структурну стійкість, наприклад, проти нагрівання, pH, тощо. Крім того, ці Fc-ділянки також можна отримати з нативних форм, отриманих від людини та інших тварин, в тому числі корів, кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів та морських свинок або можуть бути рекомбінантними конструкціями або їх похідними, отриманими з трансформованих тваринних клітин або мікроорганізмів. У даному випадку вони можуть бути отримані з нативного імуноглобуліну шляхом виділення цілих імуноглобулінових молекул з організму людини або тварин та їх обробки протеолітичним ферментом. Папаїн розщеплює 8 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нативний імуноглобулін на Fab та Fc-ділянки та обробка пепсином веде до отримання фрагментів pF'c та F(ab)2. Для виділення фрагментів Fc або pF'c ці фрагменти можна піддати ексклюзійній хроматографії. Переважним чином, Fc-ділянка людського походження є рекомбінантною імуноглобуліновою Fc-ділянкою, отриманою з мікроорганізмів. На додачу, Fc-ділянка імуноглобуліну заявленого винаходу може мати нативні цукрові ланцюги, які є збільшеними або зменшеними порівняно з нативною формою або може знаходитися у деглікозилованій формі. Збільшення, зниження або усунення Fcімуноглобулінових цукрових ланцюгів може бути здійснено за допомогою відомих у цій галузі способів, як-то хімічного, ферментативного та генно-інженерного способу з застосуванням мікроорганізмів. Усунення цукрових ланцюгів Fc-ділянки веде до різкого зниження спорідненості зв'язування до частини C1q першого комплементарного компоненту C1 та до зниження або взагалі до втрати залежної від антитіл клітинно-опосередкованої цитотоксичності або залежної від комплементу цитотоксичності, тим самим не викликаючи небажаної імунної відповіді in-vivo. У зв'язку з цим, для заявленого винаходу більш прийнятним буде застосування Fc-ділянки імуноглобуліну у деглікозилованій або аглікозилованій формі у якості носія ліків. Як тут застосовано, термін "деглікозилування" має відношення до ферментного видалення цукрових функціональних груп з Fc-ділянки та термін "аглікозилування" має відношення до Fcділянки, отриманої з прокаріот, переважно E. Coli у неглікозилованій формі. В той же час Fc-ділянку імуноглобуліну можна отримати від людини та інших тварин, в тому числі корів, кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів та морських свинок та переважно від людини. На додачу, Fc-ділянка імуноглобуліну може бути Fc-ділянкою, отриманою з антитіл IgG, IgA, IgD, IgE та IgM або з застосуванням їх комбінацій або гібридів. Переважним чином, її отримують з антитіл IgG або IgM, які є одними з найпоширеніших білків у крові людини та, найбільш переважніше, її отримують з антитіл IgG, що, як відомо, підсилюють час напівжиття білків, що зв'язуються з лігандом. З іншого боку, термін "комбінація", як тут застосовано, має відношення до поліпептидів, що кодують одноланцюгові Fc-ділянки імуноглобуліну однакового походження, приєднані до одноланцюгового поліпептиду іншого походження з утворенням димеру або мультимеру. Інакше кажучи, можна отримати димер або мультимер, що складається з двох або більше фрагментів, вибраних з групи, що охоплює Fc-фрагменти IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc та IgE. Термін “ непептидильний полімер ” має відношення до біосумісного полімеру, що містить дві або більше одиниць, що повторюються, зв'язаних між собою будь-яким ковалентним зв'язком за винятком пептидного. У заявленому винаході, непептидильний полімер може бути взаємозамінне застосовано з непептидильним лінкером. Корисний для заявленого винаходу непептидильний полімер може бути вибраний з групи, що охоплює біорозкладаний полімер, ліпідний полімер, хітин, гіалуронову кислоту та їх комбінації та, переважним чином, біорозкладаний полімер може бути поліетиленгліколем, поліпропіленгліколем, етиленгліколь - пропіленгліколевим сополімером, поліоксіетильованим поліолом, полівініловим спиртом, полісахаридом, декстраном, полівініловим етиловим ефіром, полімолочною кислотою (PLA) або полімолочно-гліколевою кислотою (PLGA) та, більш переважно, він є поліетиленгліколем (PEG; ПЕГ). На додачу, до обсягу заявленого винаходу також можна включити відомі у цій галузі похідні цих речовин, що можуть бути легко отримані за допомогою добре відомих у цей галузі способів. Пептидний лінкер, застосований у злитому (гібридному) білку, отриманому за допомогою загальноприйнятного способу злиття у межах рамки зчитування має певні недоліки через те, що він легко розщеплюється протеолітичним ферментом in-vivo, отже, у цьому випадку не варто очікувати на достатній ефект підвищення сивороткового часу напівжиття введених за допомогою носія активних ліків. Однак, у заявленому винаході, для підтримання сироваткового часу напівжиття пептиду, подібного до пептиду носія, може бути застосовано полімер, що має стійкість до протеолітичного ферменту. Отже, тут може бути застосовано будь-який непептидильний полімер без обмеження за умови, що цьому полімеру буде притаманна функція стійкості in-vivo до протеолітичного ферменту. Непептидильний полімер має молекулярну масу у межах 1-100 кДа, переважно 1-20 кДа. Приєднаний до Fc-ділянки імуноглобуліну непептидильний полімер заявленого винаходу може бути або одним полімером або комбінацією різних типів полімерів. Застосований у заявленому винаході непептидильний полімер має хімічно активну групу, здатну до зв'язування з Fc-ділянкою імуноглобуліну та білковими ліками. Непептидильний полімер має хімічно активну групу на обох кінцях, яка переважно є вибраною з групи, що містить хімічно активний альдегід, як-то пропіональдегід, бутіральдегід, малеімід та похідну сукцініміду. 9 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Похідна сукцініміду може бути сукцініміділ-пропіонатом, гідрокси-сукцініміділом, сукцініміділкарбоксиметилом або сукцініміділ-карбонатом. Зокрема, коли непептидильний полімер на обох своїх кінцях має хімічно активну альдегідну групу, він також на обох кінцях є ефективним щодо зв'язування фізіологічно активного поліпептиду та імуноглобуліну з мінімальними неспецифічними реакціями. Кінцевий продукт, отриманий шляхом відновного алкілування через альдегідний зв'язок є набагато більш стійким, ніж продукт, зв'язаний шляхом амідного зв'язку. Альдегідна хімічно активна група вибірково зв'язується з N- кінцем при низьких значеннях pH та зв'язується з лізиновим залишком при високих значеннях pH, як-то pH 9.0, з утворенням ковалентного зв'язку. Хімічно активні групи на обох кінцях непептидильного полімеру можуть бути однаковими або різними. Наприклад, непептидильний полімер може мати малеімідну групу на одному кінці та альдегідну групу, пропіональдегідну групу або бутиральдегідну групу на іншому кінці. При застосуванні поліетиленгліколя з хімічно активними гідрокси- групами на обох кінцях у якості непептидильного полімеру, подібну гідрокси- групу можна активувати до різних хімічно активних груп шляхом відомих хімічних реакцій або для отримання кон'югату заявленого винаходу тривалої дії можна застосувати наявний у продажу поліетиленгліколь з модифікованою хімічно активною групою. Кон'югат заявленого винаходу може бути таким, у якому обидва кінця непептидильного полімеру з двома хімічно активними кінцевими групами є приєднаними до аміногрупи або тіолової групи Fc-ділянки імуноглобуліну та похідних оксинтомодуліну, відповідно. Хімічно активна група на обох кінцях непептидильного полімеру переважно є вибраною з групи, що охоплює хімічно активну альдегідну групу, пропіональдегідну групу, бутиральдегідну групу, малеімідну групу та сукцинімідну похідну. Сукцинімідна похідна може бути сукцинімідилпропіонатом, гідрокси-сукцинімідилом, сукцинімідил карбоксиметилом або сукцинімідилкарбонатом. Дві хімічно активні кінцеві групи непептидильного полімеру можуть бути однаковими або відрізнятися між собою. Наприклад, непептидний полімер може мати малеімідну групу на одному кінці та альдегідну групу, пропіональдегідну групу або бутиральдегідну групу на іншому кінці. Наприклад, коли непептидильний полімер має хімічно активну альдегідну групу на одному кінці та малеімідну групу на іншому кінці, тоді він є ефективним на обох кінцях до зв'язування з фізіологічно активним поліпептидом та імуноглобуліном з мінімальними неспецифічними реакціями. Згідно з Прикладами заявленого винаходу, кон'югати були отримані шляхом ковалентного зв'язування оксинтомодуліну або його похідної та Fc-ділянки імуноглобуліну з застосуванням ПЕГ, тобто непептидильного полімеру, що містив виключно пропіональдегідну групу або малеімідну та альдегідну групи разом. У порівнянні з нативним оксинтомодуліном, кон'югати заявленого винаходу демонструють відмінну активність відносно рецепторів GLP-1 та глюкагону та, завдяки з'єднанню з Fcділянкою, також мають підвищений час напівжиття у крові зі збереженням таким чином активності in vivo протягом тривалого часу. У іншому аспекті, заявлений винахід стосується фармацевтичної композиції для запобігання або лікування ожиріння, що містить пептид. Як тут застосовано, термін "запобігання" має відношення до всіх дій, завдяки яким можна затримати або загальмувати виникнення захворювання. Термін "запобігання" у заявленому винаході означає, що виникнення ожиріння завдяки таким факторам, як-то підвищення маси тіла або жиру в організмі затримується або загальмовується шляхом введення кон'югатів заявленого винаходу. Як тут застосовано, термін "лікування" має відношення до всіх дій, завдяки яким можуть бути пом'якшені, покращені або послаблені симптоми захворювання. Термін "лікування" у заявленому винаході має відношення до пом'якшення, покращення або послаблення симптомів ожиріння шляхом введення кон'югатів заявленого винаходу, що веде до зменшення маси тіла або жиру в організмі. Як тут застосовано, термін "ожиріння" припускає накопичення надмірної кількості жирової тканини в організмі та індекс маси тіла (маса тіла (кг), поділена на зріст у квадраті (м)) вищий, ніж 25, слід розглядати як ожиріння. Звичайно ожиріння виникає внаслідок дисбалансу енергії, коли кількість харчового раціону перевищує кількість енергії, що витрачається протягом тривалого періоду часу. Ожиріння є метаболічним захворюванням, що впливає на весь організм та підвищує ризик розвитку діабету, гіперліпідемії, сексуальної дисфункції, артриту та серцевосудинних захворювань та в деяких випадках воно пов'язане з захворюваністю на рак. Кон'югати заявленого винаходу, отримані шляхом зв'язування оксинтомодуліну або його похідних з Fc-ділянкою імуноглобуліну демонструють відмінну зв'язувальну спорідненість до 10 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рецепторів глюкагону та GLP-1 (Tаблиця 3) та відмінну стійкість in-vivo до протеолітичних ферментів, а також зберігають активність in-vivo протягом тривалого періоду, отже демонструють відмінні ефекти, спрямовані проти ожиріння, як-то зменшення маси тіла (Фіг. 12). Фармацевтична композиція заявленого винаходу може додатково містити фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розчинник. Як тут застосовано, термін "фармацевтично прийнятний" має відношення до такої композиції, якої буде достатньо для досягнення терапевтичного ефекту без наявності шкідливих побічних проявів та яку можна буде легко визначити в залежності від типу захворювань, віку, маси тіла та стану здоров'я пацієнта, гендерної чутливості та чутливості до ліків, шляху, способу та частоти введення, тривалості лікування, ліків, застосованих у комбінації або співпадаючих з композицією цього винаходу та від інших відомих у медицині факторів. Фармацевтична композиція, в тому числі похідна заявленого винаходу може додатково містити фармацевтично прийнятний носій. Для перорального введення, носій може містити, але без обмеження, зв'язуючу речовину, змащувач, розпушувач, наповнювач, розчинник, диспергуючий агент, стабілізатор, суспендуючий агент, барвник та ароматизатор. Для ін'єкційних препаратів, носій може містити буферизуючий агент, консервант, анальгетик, розчинник, ізотонічний агент та стабілізатор. Для препаратів для місцевоговведення, носій може містити основу, наповнювач, змащувач та консервант. Композицію заявленого винаходу можна отримати у вигляді різних лікарських форм у комбінації з вищезазначеними фармацевтично прийнятними носіями. Наприклад, для перорального введення, фармацевтичну композицію можна отримати у вигляді таблеток, пластинок, пастилок, капсул, еліксирів, суспензій або сиропів. Для ін'єкційних препаратів, фармацевтичну композицію можна отримати у вигляді одиничних стандартних лікарських форм в ампулах або у мультидозовому контейнері. Фармацевтичну композицію також можна отримати у вигляді розчинів, суспензій, таблеток, пігулок, капсул та препаратів довготривалої дії. З іншого боку, приклади прийнятних для фармацевтичних препаратів носіїв, наповнювачів та розчинників охоплюють лактозу, декстрозу, цукрозу, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит, мальтит, крохмаль, гуміарабік, каучук, альгінат, желатин, фосфат кальцію, силікат кальцію, целюлозу, метилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, воду, метилгідроксибензоат, пропілгідроксибензоат, тальк, стеарат магнію та мінеральні оливи. Крім того, фармацевтичні препарати додатково можуть містити наповнювачі, антикоагулянти, змащувачі, зволожувачі, ароматизатори та антисептики. Фармацевтичну композицію заявленого винаходу також може мати будь-який препарат, вибраний з групи, що охоплює таблетки, пігулки, порошки, гранули, капсули, суспензії, розчини для внутрішнього застосування, емульсії, сиропи, стерильні водні розчини, безводні розчинники, ліофілізовані препарати та супозиторії. Композиції також можуть бути отримані у вигляді прийнятних для організму пацієнта одиничних стандартних лікарських форм та переважно у вигляді препарату, корисного для пептидних ліків відповідно за типовим прийнятним у фармацевтичній галузі способом за умови введення пероральним або парентеральним шляхом, як-то, але без обмеження, шляхом черезшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язевого, внутрішньоартеріального, інтрамедулярного, інтравентрикулярного, трансдермального, легеневого, підшкірного, внутрішньочеревного, інтраназального, внутрішньокишкового, місцевого, сублінгвального, вагінального або ректального введення. Композицію також можна застосувати шляхом змішування з різними фармацевтично прийнятними носіями, як-то фізіологічний розчин або органічні розчинники. Для підвищення стійкості або поглинальної здатності можуть бути застосовані вуглеводи, як-то глюкоза, цукроза або декстрани, антиоксиданти, як-то аскорбінова кислота або глутатіон, хелатуючі агенти, низькомолекулярні білки або інші стабілізатори. Доза та частота введення фармацевтичної композиції заявленого винаходу визначаються типом активного інгредієнту разом з різними факторами, як-то типом захворювання, що підлягає лікуванню, шляхом введення, віком пацієнта, статтю та масою тіла та ступенем тяжкості хвороби. Загальна ефективна доза композиції заявленого винаходу може бути введена пацієнту у вигляді одиничної дози або може бути введена протягом тривалого часу у багатьох дозах згідно з розділеним протоколом лікування. Вміст активного інгредієнту у фармацевтичній композиції заявленого винаходу може змінюватися в залежності від тяжкості захворювання. Переважним чином, загальна щоденна доза пептиду заявленого винаходу може приблизно дорівнювати 0.0001 мкг - 500 мг/кг маси тіла пацієнта. Переважним чином, ефективну дозу пептиду 11 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначають з урахуванням різних факторів, в тому числі віку, маси тіла, статі та стану здоров'я пацієнта, тяжкості захворювання, харчування та швидкості секреції на додачу до урахування шляху введення фармацевтичної композиції та частоти лікування. У зв'язку з цим, фахівець у даній галузі може легко визначити ефективну дозу, відповідну для конкретного застосування фармацевтичної композиції заявленого винаходу. Фармацевтична композиція відповідно до заявленого винаходу особливо не обмежується препаратом, а також шляхом та типом введення за умови, що вона демонструє ефекти заявленого винаходу. Фармацевтична композиція заявленого винаходу демонструє відмінну тривалість ефективної дії in-vivo та титр, що дозволяє значно зменшити її кількість та частоту введення. Крім того, фармацевтичну композицію може бути введено окремо або у комбінації або її введення може співпадати з введенням інших фармацевтичних препаратів, що демонструють профілактичні або терапевтичні ефекти, спрямовані проти ожиріння. Такі фармацевтичні препарати не є певним чином обмеженими та можуть охоплювати агоніст рецептора GLP-1, агоніст рецептора лептину, інгібітор DPP-IV, антагоніст рецептора Y5, антагоніст рецептора меланіноконцентруючого гормону (MCH), агоніст рецептора Y2/3, агоніст рецептора MC3/4, інгібітор шлункової / підшлункової ліпази, агоніст 5HT2c, агоніст рецептора β3A, агоніст рецептора аміліну, антагоніст греліну та/або антагоніст рецептора греліну. У іншому аспекті, заявлений винахід стосується способу запобігання або лікування ожиріння, що, зокрема, полягає у введенні суб'єкту кон'югату або фармацевтичної композиції, яка містить кон'югат. Як тут застосовано, термін "введення" має відношення до введення пацієнту кількості заздалегідь визначеної речовини шляхом певного прийнятного способу. Композицію заявленого винаходу може бути введено за допомогою будь-якого з загальноприйнятних шляхів за умови його здатності досягати до бажаної тканини, наприклад, але без обмеження, шляхом внутрішньочеревинного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, внутрішньошкірного, перорального, місцевого, інтраназального, внутрішньолегеневого або ректального введення. Однак, оскільки при пероральному введенні виникає розчинення пептидів, то активні інгредієнти композиції для перорального введення повинні бути вкриті оболонкою або отримані у захищеному проти деградації у шлунку стані. Термін "суб'єкт" у заявленому винаході має відношення до особи, у якої є підозра на наявність ожиріння та яка є ссавцем, в тому числі людиною, мишею та хатньою худобою з ожирінням або з можливістю його виникнення, однак, це може бути будь-який без обмеження суб'єкт, що може підлягати лікуванню з пептидом або фармацевтичною композицією заявленого винаходу. Фармацевтичну композицію, що містить пептид заявленого винаходу вводять суб'єкту з підозрою на ожиріння, забезпечуючи тим самим його ефективне лікування. Термін "ожиріння" розкрито вище. Терапевтичний спосіб заявленого винаходу може, зокрема, полягати у введенні композиції, що містить фармацевтично ефективну кількість пептиду. Загальна добова доза повинна бути визначена лікарем шляхом відповідного медичного висновку та її вводять один або кілька разів. По відношення до об'єктів заявленого винаходу, певний рівень терапевтично ефективної дози для будь-якого певного пацієнта може варіювати в залежності від різних факторів, добре відомих у цій галузі медицини, в тому числі від виду та ступеню очікуваної відповіді, певних композицій відповідно до наявності чи відсутності застосування з ними інших агентів, а також від віку, маси тіла, статі та стану здоров'я пацієнта, харчування та шляху введення, швидкості секреції композиції, часу тривалості терапії, застосованих у комбінації інших ліків або ліків, застосування яких співпадає з застосуванням композиції цього винаходу та від подібних добре відомих у медицині факторів. У іншому аспекті, заявлений винахід передбачає застосування кон'югату або фармацевтичної композиції, що його містить у лікарському препараті для запобігання або лікування ожиріння. Надалі заявлений винахід буде більш детально описано з посиланням на наступні приклади. Однак ці приклади наведені тут лише з ілюстративною метою без обмеження заявленого винаходу. Приклад 1. Отримання активованої клітинної лінії in vitro. Приклад 1-1. Отримання клітинної лінії, що демонструє відповідь циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) до GLP-1. Реакцію ПЛР проводили з застосуванням ділянки, відповідної до ORF (відкритої рамки зчитування) кДНК (OriGene Technologies, Inc. USA) гена рецептора GLP-1 людини у якості матриці та наступних прямих та зворотних праймерів, що містили кожен з сайтів рестрикції HindIII та EcoRI для отримання продукту ПЛР. 12 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 Прямий праймер: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'(SEQ ID NO. 47) Зворотній праймер: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'(SEQ ID NO. 48) Для отримання рекомбінантного вектора x0GC/GLP1R продукт ПЛР клонували у відомий вектор експресії тваринних клітин x0GC/dhfr. Клітинну лінію CHO DG44 культивували у середовищі DMEM/F12 (10 % FBS). Середовище трансфікували рекомбінантним вектором x0GC/GLP1R з застосуванням ліпофектаміну (Invitrogen, USA) та проводили культивування у селективному середовищі, що містило 1 мг/мл G418 та 10 нM метотрексату з наступним відбором з нього одиничних клональних клітинних ліній за допомогою способу граничного розбавлення, звідки зрештою була відібрана така клітинна лінія, що демонструє відмінну та залежну від концентрації відповідь цАМФ до GLP-1. Приклад 1-2. Отримання клітинної лінії, що демонструє відповідь цАМФ до глюкагону. Реакцію ПЛР проводили з застосуванням ділянки, відповідної до ORF (відкритої рамки зчитування) кДНК (OriGene Technologies, Inc. USA) гена рецептора глюкагону людини у якості матриці та наступних прямих та зворотних праймерів, що містили кожен з сайтів рестрикції XhoI та EcoRI, розташовані належним чином для отримання продукту ПЛР. Прямий праймер: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(SEQ ID NO. 49) Зворотній праймер: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'(SEQ ID NO. 50). Для отримання рекомбінантного вектора x0GC/GCGR продукт ПЛР клонували у відомий вектор експресії тваринних клітин x0GC/dhfr. Клітинну лінію CHO DG44 культивували у середовищі DMEM/F12 (10 % FBS) Середовище трансфікували рекомбінантним вектором x0GC/GCGR з застосуванням ліпофектаміну та проводили культивування у селективному середовищі, що містило 1 мг/мл G418 та 10 нM метотрексату з наступним відбором з нього одиничних клональних клітинних ліній за допомогою способу граничного розбавлення, звідки зрештою була відібрана така клітинна лінія, що демонструє відмінну та залежну від концентрації відповідь цАМФ на глюкагон. Приклад 2. Перевірка активності похідних оксинтомодуліну in vitro. Приклад 2-1. Синтез похідних оксинтомодуліну. Для вимірювання активних властивостей похідних оксинтомодуліну in vitro був проведений синтез похідних оксинтомодуліну з наступними амінокислотними послідовностями (Таблиця 1). 30 Таблиця 1 Оксинтомодулін та похідні оксинтомодуліну SEQ ID NO. SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 12 SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 14 SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16 SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 18 SEQ ID NO. 19 SEQ ID NO. 20 SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 22 SEQ ID NO. 23 SEQ ID NO. 24 Амінокислотна послідовність HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS CA-GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNGGPSSGAPPPSK CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIXWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVKLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNNIA DA-SQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTK HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC 13 UA 114709 C2 Таблиця 1 Оксинтомодулін та похідні оксинтомодуліну SEQ ID NO. SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 26 SEQ ID NO. 27 SEQ ID NO. 28 SEQ ID NO. 29 SEQ ID NO. 30 SEQ ID NO. 31 SEQ ID NO. 32 SEQ ID NO. 33 SEQ ID NO. 34 5 10 15 20 25 Амінокислотна послідовність HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYSKYLDEQAAKEFICWLMNT HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNT H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA CA-AibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC HAibQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNTC YAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC Виділені жирним шрифтом та підкреслені амінокислоти у Таблиці 1 відображають утворення кільця та амінокислоти, позначені літерою X є штучною амінокислотою (альфа-метилглютаміновою кислотою). Абревіатурою CA позначено 4-імідазоацетил та абревіатурою DA позначено дезаміно-гістидил. Приклад 2-2: Перевірка активності похідних оксинтомодуліну in vitro. Для вимірювання спрямованої проти ожиріння ефективності синтезованих у Прикладі 2-1 похідних оксинтомодуліну була виміряна клітинна активність in vitro з застосуванням отриманих у Прикладах 1-1 та 1-2 клітинних ліній. Для експресії гена рецептора GLP-1 людини та гена рецептора глюкагону шляхом трансфікування клітин CHO (клітин яєчників китайського хом'яка) були отримані відповідні клітинні лінії, прийнятні для вимірювання активних властивостей GLP-1 та глюкагону. Отже, активність кожної похідної оксинтомодуліну вимірювали з застосуванням кожної трансформованої клітинної лінії. Точніше кажучи, кожну клітинну лінію пересівали двічі або тричі 5 на тиждень та нанесли аліквоти у кожну з лунок 96-лункового планшету зі щільністю у 1×10 клітин та наступним 24-годинним культивуванням. Культивовані клітини промили буфером KRB та суспендували у 40 мл буферу KRB, що містив 1 мМ IBMX та залишили на 5 хвилин при кімнатній температурі. Оксинтомодулін (SEQ ID NO.1) та похідні оксинтомодуліну (відображені, як послідовності SEQ ID NO. 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 та 32-34) розвели шляхом 5 - разового серійного розведення до 1000 нМ - 0.02 нМ та кожний зразок (40 мл) цих розведень додали до клітин та культивували при 37 °C протягом години у інкубаторі з CO2. Потім, для лізису клітин до них додали 20 мл клітинного лізуючого буферу та клітинні лізати застосували для вимірювання концентрацій цАМФ за допомогою набору cAMP assay kit (Molecular Device, USA). На підставі отриманих результатів було проведено обчислення значень EC50 з порівнянням їх між собою. Значення EC50 наведені у наступній Таблиці 2. Таблиця 2 Порівняння активних властивостей in vitro оксинтомодуліну та похідних оксинтомодуліну відносно рецепторів GLP-1 та глюкагону EC50 (нM) SEQ ID NO. SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 6 SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 12 CHO/GLP-1R 50-210 51.8 >1,000 5.5 5.9 500.1 419.6 >1,000 >1,000 >1,000 14 CHO/GCGR 10-43 12.8 637.7 >1,000 >1,000 >1,000 >1,000 >1,000 >1,000 >1,000 UA 114709 C2 Таблиця 2 Порівняння активних властивостей in vitro оксинтомодуліну та похідних оксинтомодуліну відносно рецепторів GLP-1 та глюкагону SEQ ID NO. SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 18 SEQ ID NO. 23 SEQ ID NO. 24 SEQ ID NO. 25 SEQ ID NO. 27 SEQ ID NO. 28 SEQ ID NO. 32 SEQ ID NO. 33 SEQ ID NO. 34 5 10 15 20 25 30 35 40 EC50 (нM) >1,000 97.9 96.3 2.46 1.43 1.9 2.8-5.5 3.1 14.25 2.20 12.5 >1,000 >1,000 >1,000 5.8 6.95 1.3 3.1-5.6 0.3 17.3 80.2 1.0 Як наведено у Таблиці 2, існують похідні оксинтомодуліну, що демонструють відмінні активні властивості in vitro та інші, порівняно з нативним оксинтомодуліном (SEQ ID NO. 1), співвідношення активних властивостей, спрямованих до рецептора GLP-1 та рецептора глюкагону. Відомо, що оксинтомодулін активує обидва рецептори - рецептор GLP-1 та рецептор глюкагону для пригнічення апетиту, полегшення ліполізу та сприяння безпечності, що таким чином демонструє ефекти, спрямовані проти ожиріння. Похідні оксинтомодуліну згідно з заявленим винаходом демонструють сильніші, ніж оксинтомодулін дикого типу активні властивості in vitro, спрямовані до обох цих рецепторів, отже їх можна застосувати в якості терапевтичного агенту для лікування ожиріння з більшою ефективністю, ніж відомий дослідникам оксинтомодулін. Приклад 3. Перевірка активності похідних оксинтомодуліну in vivo. Для вимірювання in vivo терапевтичної активності похідних оксинтомодуліну, дослідники перевірили змінення у прийом їжі, що виникли в результаті введення похідних оксинтомодуліну у мишах ob/ob з застосуванням нативного оксинтомодуліну в якості контролю. Точніше кажучи, діабетичних мишей з ожирінням ob/ob, яких звичайно застосовують для перевірки ефективних властивостей терапевтичних агентів для лікування ожиріння та діабету спочатку утримували від прийому їжі протягом 16 годин з наступним введенням 1 або 10 мг/кг оксинтомодуліну або 0.02, 0.1, 1 або 10 мг/кг похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2), після чого дослідники перевіряли прийом їжі тваринами протягом двох годин (Фіг. 1). Фіг. 1 є графіком, де наведені змінення у прийом їжі відповідно до введення дози оксинтомодуліну або похідної оксинтомодуліну. Як видно з Фіг. 1, введення 1 мг/кг похідної оксинтомодуліну призвело до покращених ефектів пригнічення прийому їжі, ніж введення 10 мг/кг оксинтомодуліну. Взяті разом, похідні оксинтомодуліну заявленого винаходу мають сильніші ефективні властивості, спрямовані проти ожиріння, ніж оксинтомодулін дикого типу навіть незважаючи на меншу дозу введення, що свідчить про покращення проблем, пов'язаних з оксинтомодуліном дикого типу, який демонструє низькі спрямовані проти ожиріння ефективні властивості та який треба вводити тричі на день з великою дозою. Приклад 4. Отримання кон'югатів, які містять оксинтомодулін та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання лізинового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 1) 3.4 K пропіонALD(2) ПЕГом (ПЕГ з двома пропіл альдегідними групами, NOF, Japan), була проведена реакція між оксинтомодуліном та 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом з молярним співвідношенням 1:12 та концентрацією білка 5 мг/мл, яка тривала при температурі 4 °C протягом 4.5 годин. Весь цей час реакція відбувалася у суміші для розчинення, що містила 100 мМ Na-боратний буфер (pH 9.0) та 45 % ізопропанол, до якої додали 20 мМ ціаноборогідриду натрію (ціаноборогідрид (SCB, NaCNBH3), NaCNBH 3) у якості агента - відновника. Після завершення реакції, реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE S (XK16, Amersham Biosciences) для очищення оксинтомодуліну, що має моно- ПЕГільований лізин (колонка: SOURCE S (XK16, Amersham Biosciences), швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20 мМ цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 2a). Фіг. 2a є графіком, де наведено результат очищення моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну за допомогою очисної колонки SOURCE S. Моно-ПЕГілювання елюйованих 15 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піків перевіряли за допомогою SDS-PAGE (електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію по Лемлі) та вибірковість лізину перевіряли шляхом пептидного картування з застосуванням протеази Asp-N (Фіг. 2b). Фіг. 2b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеного моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну. Потім була проведена реакція між очищеним моно-ПЕГільованим оксинтомодуліном та Fcімуноглобуліном з молярним співвідношенням 1:10 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала 16 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента відновника. Після завершення реакції реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE 15Q очисної колонки для очищення кон'югатів, які містять оксинтомодулін та Fc-імуноглобулін (колонка: SOURCE 15Q (XK16, Amersham Biosciences), швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 20 % 100 хв. B (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 2c). Фіг. 2c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять оксинтомодулін та Fc-імуноглобулін. Приклад 5. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання лізинового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом, була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) та 3.4 K пропіон ALD(2)ПЕГом з молярним співвідношенням 1:12 та концентрацією білка 5 мг/мл, яка тривала 4.5 годин з температурою 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у суміші для розчинення, що містила 100 мМ натрій боратного буферу (pH 9.0) та 45 % ізопропанолу з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Після завершення реакції, реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE S для очищення похідної оксинтомодуліну, що мала моно-ПЕГільований лізин (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 3a). Фіг. 3a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1:10 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала 16 годин з температурою 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Після завершення реакції, реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE 15Q для очищення кон'югатів, що містили похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) та Fcімуноглобулін (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 20 % 100 хв. B (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 3b). Фіг. 3b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 29) та Fc-імуноглобулін. Приклад 6. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання лізинового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) та 3.4 K пропіон ALD(2)ПЕГом з молярним співвідношенням 1:15 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала 4.5 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у суміші для розчинення, що містила 100 мМ буфер HEPES (pH 7.5) та 45 % ізопропанол з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Після завершення реакції, реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE S для очищення похідної оксинтомодуліну з моно-ПЕГільованим лізином (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 4a). Фіг. 4a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно- ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Моно-ПЕГілювання елюйованих піків перевіряли за допомогою SDS-PAGE та вибірковість лізину перевіряли шляхом пептидного картування з застосуванням протеази Asp-N (Фіг. 4b). Фіг. 4b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеної похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30). Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1:10 з концентрацією білка, що дорівнювала 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., 16 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 градієнт: 0 → 20 % 100 хв. B (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 4c). Фіг. 4c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 30) та Fc-імуноглобуліну. Приклад 7. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання лізинового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом, була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) та 3.4 K пропіонALD(2) ПЕГом з молярним співвідношенням 1:15 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала 4.5 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у суміші для розчинення, що містила 100 мМ буфер HEPES (pH 7.5) та 45 % ізопропанол з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моно-ПЕГільованим лізином. реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 5a). Фіг. 5a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 10 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, що містили похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) та Fc-імуноглобулін, після завершення реакції реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE15Q. (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 20 % 100 хв. B (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 5b). Фіг. 5b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 31) та Fcімуноглобулін. Приклад 8. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fcімуноглобуліну. Спочатку для ПЕГілювання лізинового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом, була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та 3.4 K пропіонALD(2) ПЕГом з молярним співвідношенням 1:10 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у суміші для розчинення, що містила 100 мМ буфер HEPES (pH 7.5) та 45 % ізопропанол з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моно-ПЕГільованим лізином, після завершення реакції реакційну суміш нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 6a). Фіг. 6a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Моно-ПЕГілювання елюйованих піків перевіряли за допомогою SDS-PAGE та вибірковість лізину перевіряли шляхом пептидного картування з застосуванням протеази Asp-N (Фіг. 6b). Фіг. 6b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеної похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2). Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1:8 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 6c) та Source ISO (колонка: SOURCE ISO (XK16, Amersham Biosciences), швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 100 % 100 хв. B, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.3M AS))(Фіг. 6d). Фіг. 6c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO та Фіг. 6d є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 2) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO. Приклад 9. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fcімуноглобулін. 17 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спочатку для ПЕГілювання лізинового залишку у положенні 27 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та 3.4 K пропіон ALD(2)ПЕГом з молярним співвідношенням 1:10 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у суміші для розчинення, що містила 100 мМ буфер HEPES (pH 7.5) та 45 % ізопропанол з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моно-ПЕГільованим лізином, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 7a). Фіг. 7a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Моно-ПЕГілювання елюйованих піків перевіряли за допомогою SDS-PAGE та вибірковість лізину перевіряли шляхом пептидного картування з застосуванням протеази Asp-N (Фіг. 7b). Фіг. 7b є графіком, де наведено результат пептидного картування очищеної похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3). Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 8 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на бутилову високошвидкісну очисну колонку (колонка: Butyl FF(XK16, Amersham Biosciences), швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 5 хв. A(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.5M NaCl)) (Фіг. 7c) та на очисну колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 7d). Фіг. 7c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fc-імуноглобулін за допомогою бутилової високошвидкісної очисної колонки та Фіг. 7d є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 3) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Приклад 10. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 24 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) MAL-10K-ALD ПЕГом (NOF., Japan) була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1: 3 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом 3 годин при кімнатній температурі. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ буфері Tris (pH 8.0) з додаванням до реакційної суміші 45 % ізопропанолу та 1M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моно-ПЕГільованим цистеїном, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →100 % 50 хв. B (A: 20мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 8a). Фіг. 8a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO.23) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 5 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 8b) та Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)) (Фіг. 8c). Фіг. 8b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 8c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO. Приклад 11. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобулін. 18 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) MAL-10K-ALD ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1: 3 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом 3 годин при кімнатній температурі. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ буфері Tris (pH 8.0) з додаванням до реакційної суміші 45 % ізопропанолу та 1M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моно-ПЕГільованим цистеїном, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →100 % 50 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 9a). Фіг. 9a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 5 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 9b) та на колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)) (Фіг. 9c) Фіг. 9b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 9c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 24) та Fc-імуноглобуліну за допомогою очисної колонки SOURCE ISO. Приклад 12. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) з MAL-10K-ALD ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1:3 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом 3 годин при кімнатній температурі. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ буфері Tris (pH 8.0) з додаванням до реакційної суміші 1M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моноПЕГільованим цистеїном, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →100 % 50 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 10a). Фіг. 10a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1:5 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобуліну, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 10b) та на колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)) (Фіг. 10c). Фіг. 10b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q. Фіг. 10c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 25) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO. Приклад 13. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) 3.4 K пропіон ALD(2) ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1:3 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом 3 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ натрій-боратному буфері (pH 9.0) з додаванням до реакційної суміші 2M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з 19 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 моно-ПЕГільованим лізином, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →3 % 1 хв. B → 40 % 222 хв. B (A: 20мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)) (Фіг. 11a). Фіг. 11a є графіком, де наведено результат очищення похідної моно-ПЕГільованого оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) за допомогою очисної колонки SOURCE S. Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 10 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) (Фіг. 11b) та на колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)) (Фіг. 11c). Фіг. 11b є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE 15Q та Фіг. 11c є графіком, де наведено результат очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 28) та Fc-імуноглобулін за допомогою очисної колонки SOURCE ISO. Приклад 14. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 32) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 32) з MAL-10K-ALD ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 32) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1: 3 та концентрацією білка 1 мг/мл, яка тривала протягом 3 годин при кімнатній температурі. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ буфері Tris (pH 8.0) з додаванням до реакційної суміші 2M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моноПЕГільованим цистеїном, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →100 % 50 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)). Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 32) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1:8 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 32) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) та Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)). Приклад 15. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 33) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 33) з MAL-10K-ALD ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 33) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1:1 та концентрацією білка 1 мг/мл, яка тривала протягом 3 годин при кімнатній температурі. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ буфері Tris (pH 8.0) з додаванням до реакційної суміші 2M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моноПЕГільованим цистеїном, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →100 % 50 хв. B (A: 20 мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)). Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 33) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 5 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 33) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20 мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) та на колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)). 20 UA 114709 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Приклад 16. Отримання кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 34) та Fc-імуноглобулін. Спочатку для ПЕГілювання цистеїнового залишку у положенні 30 амінокислотної послідовності похідної оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 34) з MAL-10K-ALD ПЕГом була проведена реакція між похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 34) та MAL-10K-ALD ПЕГом з молярним співвідношенням 1:1 та концентрацією білка 3 мг/мл, яка тривала протягом3 годин при кімнатній температурі. Весь цей час реакція відбувалася у 50 мМ буфері Tris (pH 8.0) з додаванням до реакційної суміші 1M гуанідину. Для очищення похідної оксинтомодуліну з моноПЕГільованим цистеїном, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE S (колонка: SOURCE S, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 →100 % 50 хв. B (A: 20мM цитрат натрію, pH 3.0+45 % етанол, B: + 1M KCl)). Потім була проведена реакція між очищеною моно-ПЕГільованою похідною оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 34) та Fc-імуноглобуліном з молярним співвідношенням 1: 5 та концентрацією білка 20 мг/мл, яка тривала протягом 4 годин при температурі 4 °C. Весь цей час реакція відбувалася у 100 мМ буфері фосфату калію (pH 6.0) з додаванням до реакційної суміші 20 мМ SCB у якості агента - відновника. Для очищення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 34) та Fc-імуноглобулін, реакційну суміш після завершення реакції нанесли на колонку SOURCE 15Q (колонка: SOURCE 15Q, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: 0 → 4 % 1 хв. B → 20 % 80 хв. B(A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1M NaCl)) та на колонку Source ISO (колонка: SOURCE ISO, швидкість потоку: 2.0 мл/хв., градієнт: B 0 → 100 % 100 хв. A, (A: 20мM Tris-HCl, pH 7.5, B: + 1.1M AS)). Приклад 17: Активність in vitro кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну та Fcімуноглобулін. Для вимірювання ефективних властивостей, спрямованих проти ожиріння, притаманних отриманим у вищенаведених Прикладах кон'югатам, що містять оксинтомодулін або його похідну та Fc-імуноглобулін, були проведені експерименти таким саме чином, як і у Прикладі 22. Точніше кажучи, кожен з отриманих у Прикладах 1-1 та 1-2 трансформантів пересівали два або три рази на тиждень з нанесенням аліквот у кожну з лунок 96-лункового планшету зі 5 щільністю у 1×10 клітин та наступним 24-годинним культивуванням. Потім кожен зразок культивованих трансформантів промили буфером KRB, суспендували у 40 мл буферу KRB, що містив 1 мМ IBMX та залишили на 5 хвилин при кімнатній температурі. GLP-1, глюкагон та кон'югати, що містили похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23, 24, 25, 32, 33 або 34) та Fcімуноглобулін розвели шляхом 5 - разового серійного розведення до 1000 нМ - 0.02 нМ, кожний зразок (40 мл) цих розведень додали до кожного трансформанту та культивували при 37 °C протягом години у інкубаторі з CO2. Потім для лізису клітин до них додали 20 мл клітинного лізуючого буферу та клітинні лізати застосували для вимірювання концентрацій цАМФ за допомогою набору cAMP assay kit (Molecular Device, USA) з застосуванням скануючого планшет-рідера Victor (Perkin Elmer, USA). На підставі отриманих результатів було проведено обчислення значень EC50 з порівнянням їх між собою (Таблиця 3). Таблиця 3 Активність іn vitro кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну та Fc-імуноглобулін EC50 (нM) SEQ ID NO. CHO/GLP-1R 1.7±0.82 >1,000 5.4 8.4 5.5 68.7 11.7 168.0 GLP-1 глюкагон кон'югати SEQ ID NO. 23-Fc кон'югати SEQ ID NO. 24-Fc кон'югати SEQ ID NO. 25-Fc кон'югати SEQ ID NO. 32-Fc кон'югати SEQ ID NO. 33-Fc кон'югати SEQ ID NO. 34-Fc 45 CHO/GCGR >1,000 1.7±1.69 15.8 76.8 9.4 11.9 85.9 8.0 Як видно з Таблиці 3, було виявлено, що кон'югати, які містять похідну оксинтомодуліну та Fc-імуноглобулін демонструють активність in vitro до рецепторів GLP-1 та глюкагону. Приклад 18: Активність in vivo кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну та імуноглобулін. 21 UA 114709 C2 5 10 У цих дослідженнях була перевірена здатність кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну та Fc-імуноглобулін проявляти відмінні ефективні властивості, спрямовані на зменшення маси тіла in vivo. Більш докладно кажучи, піддослідних нормальних мишей C57BL/6 віком 6 тижнів протягом 24 тижнів годували їжею з підвищеним вмістом жиру (60 ккал) для підвищення їх маси тіла в середньому на приблизно 50 г. Протягом трьох тижнів тваринам підшкірно вводили кон'югати, що містили похідну оксинтомодуліну (SEQ ID NO. 23, 24 або 25) та імуноглобулін Fc з дозою, що дорівнювала 0.03 або 0.06 мг/кг/тиждень, після чого були проведені вимірювання змінення маси тіла мишей (Фіг. 12 та Фіг. 13). Фіг. 12 та Фіг. 13 є графіками, що демонструють змінення маси тіла мишей відповідно до типу та дози введення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну та Fc-імуноглобулін. Як видно з Фіг. 12 та Фіг. 13, при підвищенні дози введення кон'югатів, які містять похідну оксинтомодуліну та Fc-імуноглобулін, маса тіла прямо пропорційно зменшується навіть при існуванні відмінностей між такими кон'югатами, що свідчить про те, що ці кон'югати зменшують масу тіла дозозалежним чином. 15 22 UA 114709 C2 23 UA 114709 C2 24 UA 114709 C2 25 UA 114709 C2 26 UA 114709 C2 27 UA 114709 C2 28