Детекція нуклеїновокислотної послідовності-мішені в аналізі із розщепленням та подовженням рто

Реферат: Винахід належить до способу детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені в аналізі з РТОСЕ (розщепленням та подовженням РТО). В даному винаході здійснюють детекцію нуклеїновокислотної послідовності-мішені, при цьому РТО (олігонуклеотид, що зондує та UA 110815 C2 (12) UA 110815 C2 мітить), гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, розщеплюється з вивільненням фрагмента, і цей фрагмент гібридизується з СТО (захоплюючим та матричним олігонуклеотидом) з утворенням подовженого дуплекса, після чого відбувається детекція присутності подовженого дуплекса. Подовжений дуплекс забезпечує одержання сигналів (генерацію, підсилення, гасіння або ослаблення сигналів) від міток, що вказують на присутність подовженого дуплекса, і має регульовану величину Т пл., яка є добре придатною для детекції присутності нуклеїновокислотної послідовності-мішені. UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ОБЛАСТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені в аналізі с PTOCE (розщепленням та подовженням PTO). ВІДОМОСТІ ПРО СПОРІДНЕНИЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Гібридизація ДНК є фундаментальним процесом в молекулярній біології, і на нього впливають іонна сила, склад основ, довжина фрагмента, до якого вкорочено нуклеїнову кислоту, ступінь помилкового спарювання та присутність денатуруючих агентів. Основані на гібридизації ДНК-технології були б надзвичайно корисним засобом у визначенні конкретної нуклеїновокислотної послідовності та були б, безперечно, необхідні в області клінічної діагностики, генетичних досліджень та лабораторної судово-медичної експертизи. Однак, в традиційних методах та способах, основаних головним чином на гібридизації, з великою вірогідністю отримують псевдопозитивні результати внаслідок неспецифічної гібридизації між зондами та послідовностями, що не є мішенями. Зважаючи на це, залишаються проблеми, які потребують вирішення з метою підвищення надійності цих способів. Крім гібридизаційних способів з використанням зондів були запропоновані різні підходи з використанням додаткових ферментативних реакцій, наприклад, спосіб із застосуванням TaqMan™-зондів. У способі із застосуванням TaqMan™-зондів мічений зонд, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, розщеплюється під дією 5'-нуклеазної активності ДНК-полімерази, залежної від розташованого "угору по течії" праймера, генеруючи сигнал, що вказує на присутність послідовності-мішені (патенти США №№ 5210015, 5538848 та 6326145). Відповідно до способу із застосуванням TaqMan™-зондів передбачаються два підходи для генерації сигналу: залежне від полімеризації розщеплення та незалежне від полімеризації розщеплення. При залежному від полімеризації розщепленні подовження розташованого "угору по течії" праймера повинно відбуватися до того, як полімераза нуклеїнових кислот зістрінеться з 5'-кінцем міченого зонда. По мірі проходження реакції подовження полімераза поступово розщеплює 5'-кінець міченого зонда. При незалежному від полімеризації розщепленні розташований "угору по течії" праймер та мічений зонд гібридизуються з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню в безпосередній близкості, так що зв'язування полімерази нуклеїнових кислот з 3'-кінцем розташованого "угору по течії" праймера приводить її у контакт з 5'-кінцем міченого зонда, результатом чого є вивільнення мітки. Крім того, у способі із застосуванням TaqMan™-зондів описується, що мічений зонд, який має на своему 5'-кінці 5'-хвостову ділянку, що не гібридизується з послідовністю-мішенню, також розщеплюється з утворенням фрагмента, що містить цю 5'-хвостову ділянку. Повідомлялося про деякі способи, у яких зонд, що має 5'-хвостову ділянку, некомлементарну послідовності-мішені, розщеплюється під дією 5'-нуклеази з вивільненням фрагмента, який містить цю 5'-хвостову ділянку. Наприклад, в патенті США № 5691142 описується розщеплювана структура, яка повинна переварюватися під дією 5'-нуклеазної активності ДНК-полімерази. Наводиться приклад даної розщеплюваної структури, у якій олігонуклеотид, що містить 5'-ділянку, некомплементарну до матриці, та 3'-ділянку, комплементарну до матриці, гібридизується з даною матрицею, і в безпосередній близкості з цією матрицею гібридизується розташований "угору по течії" олігонуклеотид. Така розщеплювана структура розщеплюється ДНК-полімеразою, яка виявляє 5'-нуклеазну активність, або модифікованою ДНК-полімеразою зі зниженою здатністю до синтезу з вивільненням 5'-ділянки, некомплементарної даній матриці. Вивільнена 5'-ділянка далі гібридизується з олігонуклеотидом, що має шпильчасту структуру, з утворенням розщеплюваної структури, індукуючи тим самим прогресуючі реакції розщеплення, необхідні для детекції послідовності-мішені. В патенті США № 7381532 описується спосіб, у якому розщеплювана структура, що містить розташований "угору по течії" олігонуклеотид з блокованим 3'-кінцем, розщеплюється ДНКполімеразою, яка виявляє 5'-нуклеазну активність, або нуклеазою FEN (флеп-ендонуклеазою; від англ. Flap EndoNuclease) з вивільненням некомплементарної 5'-кінцевої одноланцюгової "звисаючої" ділянки (флепа), і детекцію цієї вивільненої 5'-кінцевої "звисаючої" ділянки здійснюють, використовуючи аналіз за розміром або систему двох взаємодіючих міток. В патенті США № 6893819 описується, що детектовані вивільнені "звисаючі" ділянки утворюються в результаті застосування залежного від синтезу нуклеїнової кислоти, флеп-опосередкованого способу ампліфікації послідовностей. В цьому способі вивільнена з першої розщеплюваної структури "звисаюча" ділянка опосередковує у залежний від синтезу нуклеїнової кислоти спосіб розщеплення другої розщеплюваної структури, що необхідно для вивільнення "звисаючої" ділянки з другої розщеплюваної структури, і вивільнені "звисаючі" ділянки детектують. 1 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовуючи гібридизацію мічених флуоресцентною міткою зондів в рідкій фазі, можна здійснити одночасну детекцію множини нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней із застосуванням флуоресцентної мітки навіть одного типу шляхом аналізу кривої плавлення. Однак, традиційні технології детекції послідовностей-мішеней із застосуванням 5'-нуклеазаопосередкованого розщеплення зондів, що містять систему двох взаємодіючих меток, потребують наявності флуоресцентних міток різних типів для різних послідовностей-мішеней при детекції численних мішеней, що обмежує число детектованих послідовностей-мішеней внаслідок обмеженої кількості типів флуоресцентних міток. В публікації заявки на патент США 2008/0241838 описується спосіб детекції мішені з використанням розщеплення зонда, що містить 5'-кінцеву ділянку, некомплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені, та гібридизації зонда захоплення. Мітка розташована на некомплементарній 5'-кінцевій ділянці. Мічений зонд, гібридизований з послідовністюмішенню, розщеплюється з вивільненням фрагмента, після чого цей фрагмент далі гібридизується із зондом захоплення для детекції присутності послідовності-мішені. В цьому способі необхідно, щоб нерозщеплений/інтактний зонд не гібридизувався із зондом захоплення. Для цього зонд захоплення, який має меншу довжину, має бути іммобілізованим на твердій підкладці. Однак таке обмеження приводить до зниження ефективності гібридизації на твердій підкладці, а також до ускладнень при оптимізації реакційних умов. Таким чином, в даній області залишається давно назріла необхідність в розробці нових підходів до детекції послідовності-мішені, краще, численних послідовностей-мішеней, в рідкій фазі та на твердій фазі, не тільки шляхом гібридизації, але також з використанням ферментативних реакцій, таких як 5'-нуклеолітична реакція, у більш зручний, надійний та відтворюваний спосіб. Крім того, в даній області також існує необхідність в новому способі детекції мішені, не обмеженому кількістю типів міток (зокрема, флуоресцентними мітками). По всій цій заявці зроблені посилання на різні патенти та публікації, і згадки про них наведені у круглих дужках. Тим самим опис цих патентів та публікацій в усій своїй повноті включений до даної заявки шляхом посилання з метою більш повного опису даного винаходу та стану області, до якої цей винахід має відношення. СУТЬ ВИНАХОДУ Автори даного винаходу провели інтенсивні дослідження з метою розробки нових підходів для детекції послідовностей-мішеней, які характеризуються більш високою точністю та зручністю, крім іншого, в режимі множинної детекції. В результаті автори винаходу розробили нові протоколи для детекції послідовностей-мішеней, у яких детекція мішені здійснюється шляхом гібридизації зонда, ферментативного розщеплення зонда, подовження та детекції подовженого дуплекса. Протоколи за даним винаходом добре адаптовані як до реакцій у рідкій фазі, так і до реакцій на твердій фазі, і дають можливість здійснювати детекцію численних послідовностей-мішеней з більш високою точністю та більш зручно. Відповідно, даним винаходом вирішується задача розробки способу детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені з ДНК або суміші нуклеїнових кислот в аналізі з PTOCE (розщепленням та подовженням PTO). Іншою задачею даного винаходу є розробка набору для детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені з ДНК або суміші нуклеїнових кислот в аналізі з PTOCE (розщепленням та подовженням PTO). Інші задачі та переваги даного винаходу будуть очевидні з наведеного далі детального опису у поєднанні з прикладеною формулою винаходу та графічними матеріалами. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ На Фіг. 1 схематично показані структури PTO (олігонуклеотиду, що зондує та мітить (probing and tagging oligonucleotide)) та CTO (захоплюючого та матричного олігонуклеотиду (capturing and templating oligonucleotide)), використовуваних в аналізі із розщепленням та подовженням PTO (PTOCE-аналізі). Краще, щоб 3'-кінці PTO та CTO були блоковані, щоб заважати їх подовженню. На Фіг. 2 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй матричній ділянці (templating portion). На Фіг. 3 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй матричній ділянці. Репортерна молекула повинна демонструвати різну інтенсивність сигналу в залежності від її присутності на одноланцюговій формі або на дволанцюговій формі. На Фіг. 4 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. CTO містить остаток ізо-dC (ізодезоксицитозину) та репортерну молекулу на своїй матричній ділянці. Структура гасник-ізо-dGTP (дезоксигуанозинтрифосфат) вбудовується в подовжений дуплекс 2 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 під час реакції подовження. На Фіг. 5 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. PTO містить репортерну молекулу на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить (5'-tagging portion), а CTO містить залишок ізо-dC на своїй матричній ділянці. Структура гасник-ізо-dGTP вбудовується в подовжений дуплекс під час реакції подовження. На Фіг. 6 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. PTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить. На Фіг. 7 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. PTO містить репортерну молекулу на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить. Репортерна молекула повинна демонструвати різну інтенсивність сигналу в залежності від її присутності на одноланцюговій формі або дволанцюговій формі. На Фіг. 8 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення. PTO містить молекулу-гасник на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить, а CTO містить репортерну молекулу на своїй захоплюючій ділянці (capturing portion). На Фіг. 9 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає детекцію при попередньо заданій температурі. CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй матричній ділянці. CTO іммобілізований на твердій підкладці своїм 3'-кінцем. На Фіг. 10 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає детекцію при попередньо заданій температурі. Мічений репортерною молекулою dATP (дезоксіаденозинтрифосфат) вбудовується в подовжений дуплекс під час реакції подовження. CTO іммобілізований на твердій підкладці своїм 3'-кінцем. На Фіг. 11 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає детекцію при попередньо заданій температурі. CTO містить залишок ізо-dC на своїй матричній ділянці, а структура репортер-ізо-dGTP вбудовується в подовжений дуплекс під час реакції подовження. CTO іммобілізований на твердій підкладці своїм 3'-кінцем. На Фіг. 12 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає детекцію при попередньо заданій температурі. PTO містить репортерну молекулу на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить. CTO іммобілізований на твердій підкладці своїм 5'-кінцем. На Фіг. 13 схематично представлений PTOCE-аналіз, який включає детекцію при попередньо заданій температурі з використанням інтеркалюючого барвника. CTO іммобілізований на твердій підкладці своїм 5'-кінцем. На Фіг. 14 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae з використанням PTOCEаналізу, який включає аналіз плавлення. CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй матричній ділянці. На Фіг. 15 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae з використанням PTOCEаналізу, який включає аналіз плавлення. PTO містить молекулу-гасник на своєму 5'-кінці, а CTO містить репортерну молекулу на своєму 3'-кінці. На Фіг. 16 показані результати, які свідчать про те, що величини Тпл для подовжених дуплексів узгоджуються з послідовностями CTO. На Фіг. 17 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae шляхом PTOCE-аналізу з використанням ПЛР-ампліфікації. CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй матричній ділянці. На Фіг. 17A показані результати PTOCE-аналізу, який включає детекцію з використанням ПЛР в режимі реального часу, а на Фіг. 17B показані результати PTOCEаналізу, який включає аналіз плавлення після проведення ПЛР. На Фіг. 18 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae шляхом PTOCE-аналізу з використанням ПЛР-ампліфікації. CTO містить залишок ізо-dC та репортерну молекулу на своєму 5'-кінці. Структура гасник-ізо-dGTP вбудовується в подовжений дуплекс під час реакції подовження. На Фіг. 18A показані результати PTOCE-аналізу, який включає детекцію з використанням ПЛР в режимі реального часу, а на Фіг. 18B показані результати PTOCE-аналізу, який включає аналіз плавлення після проведення ПЛР. На Фіг. 19 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae шляхом PTOCE-аналізу з використанням ПЛР-ампліфікації. PTO містить молекулу-гасник на своєму 5'-кінці, а CTO містить репортерну молекулу на своєму 3'-кінці. На Фіг. 19A показані результати PTOCE-аналізу, який включає детекцію з використанням ПЛР в режимі реального часу, а на Фіг. 19B показані результати PTOCE-аналізу, який включає аналіз плавлення після проведення ПЛР. На Фіг. 20 показані результати одночасної детекції гена Neisseria gonorrhoeae (NG) та гена Staphylococcus aureus (SA) з використанням PTOCE-аналізу, який включає аналіз плавлення після проведення ПЛР. CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник на своїй матричній ділянці. На Фіг. 21 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae з використанням PTOCE 3 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналізу, який включає аналіз плавлення на мікрочіпі. CTO іммобілізований своїм 5'-кінцем. PTO містить репортерну молекулу на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить. На Фіг. 22 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae з використанням PTOCEаналізу, який включає детекцію в режимі реального часу при попередньо заданій температурі на мікрочіпі. CTO іммобілізований своїм 5'-кінцем. PTO містить репортерну молекулу на своїй 5'кінцевій ділянці, що мітить. На Фіг. 23 показані результати детекції гена Neisseria gonorrhoeae з використанням PTOCEаналізу, який включає детекцію в режимі реального часу при попередньо заданій температурі на мікрочіпі. CTO іммобілізований своїм 3'-кінцем і містить репортерну молекулу та молекулугасник на своїй матричній ділянці. На Фіг. 24 показані результати детекції однієї мішені та численних мішеней з використанням PTOCE-аналізу, який включає детекцію в режимі кінцевої точки при попередньо заданій температурі на мікрочіпі. CTO іммобілізований своїм 5'-кінцем. PTO містить репортерну молекулу на своїй 5'-кінцевій ділянці, що мітить. Як нуклеїновокислотні послідовності-мішені використовували ген Neisseria gonorrhoeae (NG) та ген Staphylococcus aureus (SA). ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується нового способу детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені в аналізі з PTOCE (розщепленням та подовженням PTO) та набору для детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені в PTOCE-аналізі. Даний винахід включає не тільки реакції гібридизації, але також й ферментативні реакції, перебіг яких залежить від присутності нуклеїновокислотної послідовності-мішені. I. Спосіб детекції мішені в PTOCE-аналізі, який включає аналіз плавлення В одному з аспектів даного винаходу запропонований спосіб детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені з ДНК або суміші нуклеїнових кислот в аналізі з PTOCE (розщепленням та подовженням PTO), який включає: (a) гібридизацію нуклеїновокислотної послідовності-мішені з розташованими "угору по течії" олігонуклеотидом та PTO (олігонуклеотидом, що зондує та мітить); при цьому розташований "угору по течії" олігонуклеотид містить нуклеотидну послідовність, що гібридизується, комплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені; PTO містить (1) 3'-кінцеву ділянку, що впізнає мішень (3'-targeting portion), яка включає нуклеотидну послідовність, що гібридизується, комплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені, та (2) 5'-кінцеву ділянку, що мітить, яка включає нуклеотидну послідовність, некомплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені; при цьому 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, а 5'-кінцева ділянка, що мітить, не гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню; розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований "угору по течії" відносно PTO; (b) приведення в контакт продукту зі стадії (a) з ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність, в умовах, придатних для розщеплення PTO; при цьому розташований "угору по течії" олігонуклеотид або його подовжений ланцюг індукує розщеплення PTO ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність, так що в результаті розщеплення вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить; (c) гібридизацію фрагмента, вивільненого з PTO, із CTO (захоплюючим та матричним олігонуклеотидом); при цьому CTO містить в напрямку 3'→5' (1) захоплюючу ділянку, яка містить нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, або частині 5'-кінцевій ділянки PTO, що мітить, та (2) матричну ділянку, яка містить нуклеотидну послідовність, некомплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 3'-кінцевій ділянці PTO, що впізнає мішень; при цьому фрагмент, вивільнений з PTO, гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO; (d) проведення реакції подовження з використанням продукту зі стадії (c) та матричної полімерази нуклеїнових кислот; при цьому фрагмент, гібридизований із захоплюючою ділянкою CTO, подовжується з утворенням подовженого дуплекса; причому подовжений дуплекс має величину Т пл, регульовану (1) послідовністю та/або довжиною цього фрагмента, (2) послідовністю та/або довжиною CTO, або (3) послідовністю та/або довжиною фрагмента і послідовністю та/або довжиною CTO; (e) плавлення подовженого дуплекса в діапазоні температур з одержанням сигналу від мішені (target signal), що вказує на присутність подовженого дуплекса; при цьому сигнал від мішені забезпечується за допомогою (1) принаймні однієї мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, (2) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, (3) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, та мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, або (4) інтеркалюючої мітки; і 4 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (f) детекцію подовженого дуплекса шляхом вимірювання сигналу від мішені; тим самим присутність подовженого дуплекса вказує на присутність нуклеїновокислотної послідовностімішені. Автори даного винаходу провели інтенсивні дослідження з метою розробки нових підходів для детекції послідовностей-мішеней, які характеризуються більш високою точністю та зручністю, крім іншого, в режимі множинної детекції. В результаті автори винаходу розробили нові протоколи для детекції послідовностей-мішеней, у яких детекція мішені здійснюється шляхом гібридизації зонда, ферментативного розщеплення зонда, подовження та детекції подовженого дуплекса. Протоколи за даним винаходом добре адаптовані як до реакцій в рідкій фазі, так і до реакцій на твердій фазі, та дають можливість здійснювати детекцію численних послідовностей-мішеней з більш високою точністю та більш зручно. В даному винаході реалізуються почергові події в такій послідовності: гібридизація зонда; розщеплення PTO (олігонуклеотиду, що зондує та мітить) і подовження; утворення мішеньзалежного подовженого дуплекса; та детекція подовженого дуплекса. Тому спосіб називається аналізом PTOCE (із розщепленням та подовженням PTO). В даному винаході подовжений дуплекс характеризується присутністю мітки (міток), яка забезпечує (які забезпечують) одержання сигналу, що вказує на присутність подовженого дуплекса, в результаті аналізу плавлення або детекції при попередньо заданій температурі. При цьому даний подовжений дуплекс характеризується регульованою величиною Тпл, що відіграє вирішальну роль при детекції численних мішеней або для того, щоб провести відмінність від сигналу, не пов'язаного з мішенню (non-target signal). Оскільки подовжений дуплекс утворюється тільки тоді, коли є нуклеїнова кислота-мішень, присутність подовженого дуплекса вказує на присутність цієї нуклеїнової кислоти-мішені. PTOCE-аналіз, який включає аналіз плавлення, далі будет описаний більш детально. Стадія (a). Гібридизація розташованого "угору по течії" олігонуклеотиду та PTO з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню Згідно з даним винаходом, нуклеїновокислотна послідовність-мішень спочатку гібридизується з розташованими "угору по течії" олігонуклеотидом та PTO (олігонуклеотидом, що зондує та мітить). Використовуваний в даному описі термін "нуклеїнова кислота-мішень", "нуклеїновокислотна послідовність-мішень" або "послідовність-мішень" стосується нуклеїновокислотної послідовності, що представляє інтерес для детекції, на якій відпалюють праймер, або яку гібридизують з праймером в умовах гібридизації, відпалу або ампліфікації. Використовуваний в даному описі термін "зонд" стосується молекули одноланцюгової нуклеїнової кислоти, яка містить ділянку або ділянки, посуті комплементарну (комплементарні) нуклеїновокислотній послідовності-мішені. Термін "праймер", як він використовується в даному описі, стосується олігонуклеотиду, який є здатним діяти як точки ініціації синтезу у випадку його уміщування в умови, при яких індукується синтез продукту подовження праймера, комплементарного ланцюгу нуклеїнової кислоти (матриці), тобто, в присутності нуклеотидів і агента для полімеризації, такого як ДНКполімераза, та при придатних значеннях температури та pH. Краще, щоб зонд та праймер були молекулами одноланцюгових дезоксирибонуклеотидів. Зонди та праймери, використовувані в даному винаході, можуть містити природний dNMP (дезоксинуклеозид-монофосфат) (тобто dAMP (дезоксіаденозин-монофосфат), dGMP (дезоксигуанозин-монофосфат), dCMP (дезоксицитидин-монофосфат) та dTMP (дезокситимідин-монофосфат)), модифікований нуклеотид або неприродний нуклеотид. Зонди та праймери також можуть включати рибонуклеотиди. Праймер повинен мати достатню довжину, щоб праймувати синтез продуктів подовження в присутності агента для полімеризації. Точна довжина праймерів буде залежати від багатьох факторів, включаючи температуру, спосіб застосування та джерело праймера. Термін "відпал" або "праймування", як він використовується в даному описі, стосується приєднання олігодезоксинуклеотиду або нуклеїнової кислоти до нуклеїнової кислоти, яка є матрицею, при цьому таке приєднання дозволяє полімеразі здійснювати полімеризацію нуклеотидів з утворенням молекули нуклеїнової кислоти, що є комплементарною до нуклеїнової кислоти, яка є матрицею, або її частини. Термін "гібридизація", використовуваний в даному описі, стосується утворення дволанцюгової нуклеїнової кислоти з комплементарних одноланцюгових нуклеїнових кислот. Гібридизація может здійснюватися між двома ланцюгами нуклеїнової кислоти, повністю спареними або по суті спареними з певним числом помилкових спарювань. Комплементарність, необхідна для гібридизації, може залежати від умов гібридизації, зокрема, від температури. 5 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Гібридизація нуклеїновокислотної послідовності-мішені з розташованими "угору по течії" олігонуклеотидом та PTO може бути здійснена в придатних умовах гібридизації, визначених у встановленому порядку шляхом оптимізації методик. Такі умови, як температура, концентрація компонентів, тривалість гібридизації та промивання, компоненти буферів, їх pH та іонна сила, можуть бути змінені в залежності від різних факторів, включаючи довжину та GC-склад олігонуклеотиду (розташованого "угору по течії" олігонуклеотиду та PTO) та нуклеотидної послідовності-мішені. Наприклад, коли використовується відносно короткий олігонуклеотид, краще, щоб були прийняті умови низької жорсткості. Детальні умови гібридизації можна знайти у Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); та M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999). Не передбачається різниці між термінами "відпал" та "гібридизація", і ці терміни будуть використовуватися взаємозамінно. Розташований "угору по течії" олігонуклеотид та PTO містять нуклеотидні послідовності, що гібридизуються, комплементарні нуклеїновокислотній послідовності-мішені. Термін "комплементарний" використовується в даному описі для вказівки на те, що праймери або зонди є в достатньому ступені комплементарними, щоб селективно гібридизуватися з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню в намічених умовах відпалу або в жорстких умовах, охоплюючи терміни "по суті комплементарний" та "повністю комплементарний", краще, "повністю комплементарний". 5'-Кінцева ділянка PTO, що мітить, має нуклеотидну послідовність, некомплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені. Матрична ділянка CTO (захоплюючего та матричного олігонуклеотиду) має нуклеотидну послідовність, некомплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 3'-кінцевій ділянці PTO, що впізнає мішень. Термін "некомплементарний" використовується в даному описі для вказівки на те, що праймери або зонди є в достатньому ступені некомплементарними, щоб селективно гібридизуватися з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню в намічених умовах відпалу або в жорстких умовах, охоплюючи терміни "по суті некомплементарний" та "повністю некомплементарний", краще, "повністю некомплементарний". Використовуваний в даному описі термін "PTO (олігонуклеотид, що зондує та мітить)” означає олігонуклеотид, який містить (1) 3'-кінцеву ділянку, що впізнає мішень, яка служить зондом, та (2) 5'-кінцеву ділянку, що мітить, з нуклеотидною послідовністю, некомплементарною нуклеїновокислотній послідовності-мішені, яка вивільняється в результаті нуклеолітичної реакції з PTO після гібридизації з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню. 5'-Кінцева ділянка, що мітить, та 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, в PTO повинні розташовуватися в напрямку 5'→3'. PTO схематично показаний на Фіг. 1. Гібридизацію на стадії (a) краще проводять в жорстких умовах, так що 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, а 5'-кінцева ділянка, що мітить, не гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню. Для PTO не передбачається якої-небудь конкретної довжини. Наприклад, довжина PTO може складати 15-150 нуклеотидів, 15-100 нуклеотидів, 15-80 нуклеотидів, 15-60 нуклеотидів, 15-40 нуклеотидів, 20-150 нуклеотидів, 20-100 нуклеотидів, 20-80 нуклеотидів, 20-60 нуклеотидів, 20-50 нуклеотидів, 30-150 нуклеотидів, 30-100 нуклеотидів, 30-80 нуклеотидів, 3060 нуклеотидів, 30-50 нуклеотидів, 35-100 нуклеотидів, 35-80 нуклеотидів, 35-60 нуклеотидів або 35-50 нуклеотидів. 3'-Кінцева ділянка PTO, що впізнає мішень, може бути будь-якої довжини за умови, що вона специфічно гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями-мішенями. Наприклад, довжина 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, може складати 10-100 нуклеотидів, 10-80 нуклеотидів, 10-50 нуклеотидів, 10-40 нуклеотидів, 10-30 нуклеотидів, 15-100 нуклеотидів, 15-80 нуклеотидів, 15-50 нуклеотидів, 15-40 нуклеотидів, 15-30 нуклеотидів, 20-100 нуклеотидів, 20-80 нуклеотидів, 20-50 нуклеотидів, 20-40 нуклеотидів або 20-30 нуклеотидів. 5'Кінцева ділянка, що мітить, може бути будь-якої довжини за умови, що вона специфічно гібридизується з матричною ділянкою CTO і потім подовжується. Наприклад, довжина 5'кінцевої ділянки PTO, що мітить, може складати 5-50 нуклеотидів, 5-40 нуклеотидів, 5-30 нуклеотидів, 5-20 нуклеотидів, 10-50 нуклеотидів, 10-40 нуклеотидів, 10-30 нуклеотидів, 10-20 нуклеотидів, 15-50 нуклеотидів, 15-40 нуклеотидів, 15-30 нуклеотидів або 15-20 нуклеотидів. На 3'-кінці PTO може знаходитися група 3'-OH. Краще, 3'-кінець PTO "блокований", щоб не допустити його подовження. Блокування може бути досягнуто традиційними методами. Наприклад, блокування можна здійснити шляхом додавання до 3'-гідроксильної групи останнього нуклеотиду хімічного угрупування, такого як біотин, мітка, фосфатна група, алкільна група, ненуклеотидний лінкер, 6 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фосфоротіонат або алкандіол. Альтернативно, блокування може бути здійснене шляхом видалення 3'-гідроксильної групи останнього нуклеотиду або шляхом використання нуклеотиду, позбавленого 3'-гідроксильної групи, такого як дидезоксинуклеотид. Альтернативно, PTO може бути сконструований так, щоб приймати шпильчасту структуру. Відсутність гібридизації між 5'-кінцевою ділянкою PTO, що мітить, та нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню означає відсутність утворення з них стабільної дволанцюгової структури у визначених умовах гібридизації. Відповідно до кращого втілення, 5'-кінцева ділянка PTO, що мітить, не залучена до гібридизації з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, утворює одноланцюгову структуру. Розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований "угору по течії" відносно PTO. Крім цього, розташований "угору по течії" олігонуклеотид або його подовжений ланцюг, гібридизована з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, індукує розщеплення PTO ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність. Індукція розщеплення PTO за допомогою розташованого "угору по течії" олігонуклеотиду може відбуватися двома шляхами: (1) як індукція розщеплення, незалежна від подовження розташованого "угору по течії" олігонуклеотиду; та (2) як індукція розщеплення, залежна від подовження розташованого "угору по течії" олігонуклеотиду. В тому випадку, коли розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований досить близко від PTO, щоб індукувати розщеплення PTO ферментом, який виявляє 5'-нуклеазну активність, фермент, що зв'язався із розташованим "угору по течії" олігонуклеотидом, розщеплює PTO без реакції подовження. На відміну від цього, коли розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований у віддаленні від PTO, фермент, що виявляє полімеразну активність, (наприклад, матрична полімераза) каталізує подовження розташованого "угору по течії" олігонуклеотиду (наприклад, розташованого "угору по течії" праймера), а фермент, що виявляє 5'-нуклеазну активність, який зв'язався з подовженим продуктом, розщеплює PTO. Отже, розташований "угору по течії" олігонуклеотид може бути локалізований відносно PTO двома способами. Розташований "угору по течії" олігонуклеотид може бути локалізований досить близко від PTO, щоб індукувати розщеплення PTO у незалежний від подовження спосіб. Альтернативно, розташований "угору по течії" олігонуклеотид може бути локалізований досить далеко від PTO, щоб індукувати розщеплення PTO у залежний від подовження спосіб. Використовуваний в даному описі термін "прилеглий" по відношенню до розташувань або локалізацій означає, що розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований поблизу 3'кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, з утворенням "ніка" (одноланцюгового розриву). Крім того, цей термін означає, що розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований на відстані 1-30 нуклеотидів, 1-20 нуклеотидів або 1-15 нуклеотидів, від 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень. Використовуваний в даному описі термін "віддалений" по відношенню до розташувань або локалізацій, включає будь-які расположения або локалізації, достатні для забезпечення проходження реакцій подовження. Відповідно до кращого втілення, розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований на достатньому віддаленні від PTO, щоб індукувати розщеплення PTO у залежний від подовження спосіб. Відповідно до кращого втілення, розташований "угору по течії" олігонуклеотид є розташованим "угору по течії" праймером або розташованим "угору по течії" зондом. Розташований "угору по течії" праймер є придатним для індукції незалежного від подовження розщеплення або для індукції залежного від подовження розщеплення, а розташований "угору по течії" зонд є придатним для індукції незалежного від подовження розщеплення. Альтернативно, розташований "угору по течії" олігонуклеотид може мати послідовність, яка частково перекривається з 5'-кінцевою частиною 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень. Краще, щоб довжина перекривної послідовності складала 1-10 нуклеотидів, ще краще, 1-5 нуклеотидів, навіть ще краще, 1-3 нуклеотиди. В тому випадку, коли розташований "угору по течії" олігонуклеотид має послідовність, яка частково перекривається з 5'-кінцевою частиною 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, ця 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, частково переварюється разом з 5'-кінцевою ділянкою, що мітить, в реакції розщеплення на стадії (b). Крім цього, присутність перекривної послідовності дозволяє розщеплювати бажаний сайт 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень. Відповідно до кращого втілення, розташований "угору по течії" праймер індукує за допомогою свого подовженого ланцюга розщеплення PTO ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність. 7 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В даному винаході можуть бути застосовані традиційні технології для реакцій розщеплення з використанням розташованих "угору по течії" олігонуклеотидів за умови, що розташований "угору по течії" олігонуклеотид індукує розщеплення PTO, гібридизованого з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню з вивільненням фрагмента, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить. Наприклад, в даному винаході можуть бути застосовані патенти США №№ 5210015, 5487972, 5691142, 5994069 та 7381532 і публікація заявки на патент США № 2008/0241838. Відповідно до кращого втілення, виконання даного способу здійснюють в присутності розташованого "вниз по течії" праймера. Розташований "вниз по течії" праймер додатково генерує нуклеїновокислотну послідовність-мішень, яка буде гібридизуватися з PTO, підвищуючи чутливість детекції мішені. Відповідно до кращого втілення, коли використовують розташований "угору по течії" праймер та розташований "вниз по течії" праймер, додатково для подовження цих праймерів застосовують матричну полімеразу нуклеїнових кислот. Відповідно до кращого втілення, розташований "угору по течії" олігонуклеотид (розташований "угору по течії" праймер або розташований "угору по течії" зонд), розташований "вниз по течії" праймер та/або 5'-кінцева ділянка PTO, що мітить, мають структуру олігонуклеотиду з подвійним праймуванням (DPO), розроблену авторами даного винаходу. Олігонуклеотиди, що мають структуру DPO, демонструють значно покращену специфічність до мішені у порівнянні з традиційними праймерами та зондами (див. WO 2006/095981; Chun et. al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35: 6e40(2007)). Відповідно до кращого втілення, 3'-кінцева ділянка PTO, що впізнає мішень, має структуру модифікованого олігонуклеотиду з подвійною специфічністю (mDSO), розроблену авторами даного винаходу. Модифікований олігонуклеотид з подвійною специфічністю (mDSO) демонструє значно покращену специфічність до мішені у порівнянні з традиційними зондами (див. WO 2011/028041). Стадія (b). Вивільнення фрагмента з PTO Далі, продукт зі стадії (a) приводять у контакт з ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність, в умовах, придатних для розщеплення PTO. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється ферментом, що виявляє 5'нуклеазну активність, вивільняючи фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить. Використовуваний в даному описі термін "умови для розщеплення PTO" означає умови, достатні для перетравлювання PTO, гібридизованого з нуклеїновокислотною послідовністюмішенню, ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність, такі як температура, pH, іонна сила, буфер, довжина та послідовність олігонуклеотидів, і ферменти. Наприклад, коли як фермент, що виявляє 5'-нуклеазну активність, використовують ДНК-полімеразу Taq, умови для розщеплення PTO включают буфер трис-HCl, KCl, MgCl2 та температуру. Коли PTO гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, його 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, залучена у гібридизацію, а 5'-кінцева ділянка, що мітить, утворює одноланцюгову структуру без гібридизації з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню (див. Фіг. 2). По суті, олігонуклеотид, що містить як одноланцюгову, так і дволанцюгову структури, може бути переварений з використанням ферменту, що виявляє 5'-нуклеазну активність, із застосуванням різноманітних технологій, відомих фахівцю в даній області. Сайти розщеплення PTO варіюють в залежності від типу розташованих "угору по течії" олігонуклеотидів (розташованого "угору по течії" зонда або розташованого "угору по течії" праймера), сайтів гібридизації розташованих "угору по течії" олігонуклеотидів та умов розщеплення (див. патенти США №№ 5210015, 5487972, 5691142, 5994069 та 7381532 і публікацію заявки на патент США № 2008/0241838). Велике число традиційних технологій можуть бути застосовані для проведення реакції розщеплення PTO, що приводить до вивільнення фрагмента, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'-кінцевої ділянки, що мітить. Стисло, на стадії (b) можуть бути присутніми три сайти розщеплення. По-перше, сайтом розщеплення є з'єднувальний сайт (junction site) між ділянкою гібридизації PTO (3'-кінцевою ділянкою, що впізнає мішень) та ділянкою, що не гібридизується (5'-кінцевою ділянкою, що мітить). Другим сайтом розщеплення є сайт локалізації декількох нуклеотидів в 3'-напрямку від 3'-кінця 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить. Другий сайт розщеплення локалізований в 5'-кінцевій частині 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень. Третій сайт розщеплення є сайтом локалізації декількох нуклеотидів в 5'-напрямку від 3'-кінця 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить. 8 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до кращого втілення, початковим сайтом розщеплення PTO матричною полімеразою, що виявляє 5'-нуклеазну активність, після подовження розташованого "угору по течії" праймера, є вихідна точка подвійного ланцюга між PTO та нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню або сайт на відстані 1-3 нуклеотидів від цієї вихідної точки. У зв'язку з цим, використовуваний в даному описі термін "фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить" по відношенню до розщеплення PTO ферментом, який виявляє 5'-нуклеазну активність, застосовується для позначення (1) 5'-кінцевої ділянки, що мітить, (2) 5'-кінцевої ділянки, що мітить, та 5'-кінцевої частини 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, і (3) частини 5'-кінцевої ділянки, що мітить. В даній заявці термін "фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'кінцевої ділянки PTO, що мітить", також можна описати як "фрагмент PTO". Термін "частина", використовуваний по відношенню до PTO або CTO, як частини 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, 5'-кінцевої частини 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, та 5'кінцевої частини захоплюючої ділянки CTO, стосується нуклеотидної послідовності, що містить 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 або 1-5 нуклеотидів, краще 1, 2, 3 або 4 нуклеотиди. Відповідно до кращого втілення, фермент, що виявляє 5'-нуклеазну активність, є ДНКполімеразою, яка виявляє 5'-нуклеазну активність, або нуклеазою FEN, ще краще, термостабільною ДНК-полімеразою, що виявляє 5'-нуклеазну активність, або нуклеазою FEN. Придатною ДНК-полімеразою, що виявляє 5'-нуклеазну активність, в даному винаході є термостабільна ДНК-полімераза, одержана з ряду бактеріальних видів, включаючи Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus та Aquifex aeolieus. Найкраще, щоб термостабільна ДНК-полімераза була Taq-полімеразою. Альтернативно, в даному винаході можна використовувати ДНК-полімерази, що виявляють 5'-нуклеазну активність, модифіковані з метою зниження полімеразної активності. Використовувана нуклеаза FEN (флеп-ендонуклеаза) є флеп-специфічною 5'-нуклеазою. Придатна для даного винаходу нуклеаза FEN включає нуклеази FEN, одержані з ряду бактеріальних видів, включаючи Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix та Archaeaglobus veneficus. Коли розташований "угору по течії" праймер використовують на стадії (a), краще, щоб умови для розщеплення PTO були умовами для здійснення реакції подовження розташованого "угору по течії" праймера. Відповідно до кращого втілення, на стадії (a) використовують розташований "угору по течії" праймер, для подовження розташованого "угору по течії" праймера використовують матричну полімеразу, і ця матрична полімераза є ідентичною ферменту, що виявляє 5'-нуклеазну активність. В деяких випадках на стадії (a) використовують розташований "угору по течії" праймер, для подовження розташованого "угору по течії" праймера використовують матричну полімеразу, і ця матрична полімераза відрізняється від ферменту, що виявляє 5'-нуклеазну активність. Стадія (c). Гібридизація фрагмента, вивільненого з PTO, з CTO Фрагмент, вивільнений з PTO, гібридизується з CTO (захоплюючим та матричним олігонуклеотидом). CTO містить в напрямку 3'→5' (1) захоплюючу ділянку, яка містить нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, або частині 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, та (2) матричну ділянку, що містить нуклеотидну послідовність, некомплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 3'-кінцевій ділянці PTO, що впізнає мішень. CTO діє як матриця для подовження фрагмента, вивільненого з PTO. Цей фрагмент, що служить як праймер, гібридизується з CTO та подовжується з утворенням подовженого дуплекса. Матрична ділянка може містити будь-яку послідовність за умови, що вона не комплементарна 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 3'-кінцевій ділянці PTO, що впізнає мішень. 9 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, матрична ділянка може містити будь-яку послідовність за умови, що вона може діяти як матриця для подовження фрагмента, вивільненого з PTO. Як описано вище, коли вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку PTO, що мітить, краще, щоб захоплююча ділянка CTO була сконструйована так, щоб вона містила нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить. Коли вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, та 5'-кінцеву частину 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, краще, щоб захоплююча ділянка CTO була сконструйована так, щоб вона містила нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 5'-кінцевій частині 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень. Коли вивільняється фрагмент, який містить частину 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, краще, щоб захоплююча ділянка CTO була сконструйована так, щоб вона містила нуклеотидну послідовність, комплементарну части 5-кінцевої ділянки, що мітить. Крім того, можливе конструювання захоплюючої ділянки CTO з передбачуваними сайтами розщеплення PTO. Наприклад, якщо захоплююча ділянка CTO сконструйована так, щоб вона містила нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, тоді або фрагмент, який містить частину 5'-кінцевої ділянки, що мітить, або фрагмент, який містить 5'кінцеву ділянку, що мітить, міг би гібридизуватися із захоплюючою ділянкою і потім подовжуватися. Коли вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, та 5'кінцеву частину 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, він може гібридизуватися із захоплюючою ділянкою CTO, сконструйованою так, щоб вона містила нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, і потім успішно подовжуватися, незважаючи на присутність помилково спарених нуклеотидів на 3'-кінцевій ділянці фрагмента. Це можливо тому, що праймери можуть подовжуватися в залежності від реакційних умов, незважаючи на те, що їх 3'-кінець містить деяку кількість помилково спарених нуклеотидів (наприклад, 1-3 помилково спарених нуклеотидів). Коли вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, та 5'-кінцеву частину 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, 5'-кінцева частина захоплюючої ділянки CTO може бути сконструйована так, щоб вона містила нуклеотидну послідовність, комплементарну розщеплюваній 5'-кінцевій частині 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, в результаті чого долаються проблеми, зв'язані з помилково спареними нуклеотидами (див. Фіг. 1). Краще, нуклеотидна послідовність 5'-кінцевої частини захоплюючої ділянки CTO, комплементарна розщеплюваній 5'-кінцевій частині 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, може бути вибрана в залежності від передбачуваних сайтів розщеплення на 3'-кінцевій ділянці PTO, що впізнає мішень. Краще, щоб нуклеотидна послідовність 5'-кінцевої частини захоплюючої ділянки CTO, комплементарна розщеплюваній 5'-кінцевій частині 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, складала 1-10 нуклеотидів, ще краще 1-5 нуклеотидів, навіть ще краще, 1-3 нуклеотиди. На 3'-кінці CTO можуть міститися додаткові нуклеотиди, не залучені в гібридизацію з фрагментом. Крім того, захоплююча ділянка CTO може містити нуклеотидну послідовність, комплементарну тільки частині фрагмента (наприклад, частині фрагмента, що містить його 3'кінцеву ділянку), за умови, що вона стабільно гібридизується з цим фрагментом. Використовуваний термін "захоплююча ділянка, що містить нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, або частині 5'-кінцевої ділянки, що мітить", охоплює в даному описі різні конструкції та склади захоплюючої ділянки CTO, як обговорювалося вище. CTO може бути сконструйований так, щоб приймати шпильчасту структуру. Довжина CTO може варіюватися в широких межах. Наприклад, довжина CTO складає 71000 нуклеотидів, 7-500 нуклеотидів, 7-300 нуклеотидів, 7-100 нуклеотидів, 7-80 нуклеотидів, 760 нуклеотидів, 7-40 нуклеотидів, 15-1000 нуклеотидів, 15-500 нуклеотидів, 15-300 нуклеотидів, 15-100 нуклеотидів, 15-80 нуклеотидів, 15-60 нуклеотидів, 15-40 нуклеотидів, 20-1000 нуклеотидів, 20-500 нуклеотидів, 20-300 нуклеотидів, 20-100 нуклеотидів, 20-80 нуклеотидів, 2060 нуклеотидів, 20-40 нуклеотидів, 30-1000 нуклеотидів, 30-500 нуклеотидів, 30-300 нуклеотидів, 30-100 нуклеотидів, 30-80 нуклеотидів, 30-60 нуклеотидів або 30-40 нуклеотидів. Захоплююча ділянка CTO може мати будь-яку довжину за умови, що вона специфічно гібридизується з фрагментом, вивільненим з PTO. Наприклад, довжина захоплюючої ділянки CTO складає 5-100 нуклеотидів, 5-60 нуклеотидів, 5-40 нуклеотидів, 5-30 нуклеотидів, 5-20 нуклеотидів, 10-100 нуклеотидів, 10-60 нуклеотидів, 10-40 нуклеотидів, 10-30 нуклеотидів, 10-20 нуклеотидів, 15-100 нуклеотидів, 15-60 нуклеотидів, 15-40 нуклеотидів, 15-30 нуклеотидів або 15-20 нуклеотидів. Матрична ділянка CTO може мати будь-яку довжину за умови, що вона може діяти як матриця при подовженні фрагмента, вивільненого з PTO. Наприклад, довжина матричної ділянки CTO складає 2-900 нуклеотидів, 2-400 нуклеотидів, 2-300 нуклеотидів, 2-100 нуклеотидів, 2-80 10 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидів, 2-60 нуклеотидів, 2-40 нуклеотидів, 2-20 нуклеотидів, 5-900 нуклеотидів, 5-400 нуклеотидів, 5-300 нуклеотидів, 5-100 нуклеотидів, 5-80 нуклеотидів, 5-60 нуклеотидів, 5-40 нуклеотидів, 5-30 нуклеотидів, 10-900 нуклеотидів, 10-400 нуклеотидів, 10-300 нуклеотидів, 15900 нуклеотидів, 15-100 нуклеотидів, 15-80 нуклеотидів, 15-60 нуклеотидів, 15-40 нуклеотидів або 15-20 нуклеотидів. На 3'-кінці CTO може знаходитися група 3'-OH. Краще, 3'-кінець CTO блокований, щоб не допустити його подовження. Блокування CTO, яке не допускає подовження, може бути досягнуто традиційними методами. Наприклад, блокування можна здійснити шляхом додавання хімічного угрупування, такого як біотин, мітка, фосфатна група, алкільна група, ненуклеотидний лінкер, фосфоротіонат або алкандіол, до 3'-гідроксильної групи останнього нуклеотиду CTO. Альтернативно, блокування може бути здійснене шляхом видалення 3'-гідроксильної групи останнього нуклеотиду або шляхом використання нуклеотиду, позбавленого 3'-гідроксильної групи, такого як дидезоксинуклеотид. Фрагмент, вивільнений з PTO, гібридизується з CTO, в результаті чого утворюється структура, придатна для подовження фрагмента. Незважаючи на те, що непереварений PTO також гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO через свою 5'-кінцеву ділянку, що мітить, його 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, не гібридизується з CTO, що перешкоджає утворенню подовженого дуплекса. Гібридизація на стадії (c) може бути описана більш детально з посиланням на описи, наведені на стадії (a). Стадія (d). Подовження фрагмента Реакцію подовження проводять, використовуючи продукт зі стадії (c) та матричну полімеразу нуклеїнових кислот. Фрагмент, гібридизований із захоплюючою ділянкою CTO, подовжується з утворенням подовженого дуплекса. На відміну від цього, нерозщеплений PTO, гібридизований із захоплюючою ділянкою CTO, не подовжується, і в результаті цього подовжений дуплекс не утворюється. Використовуваний в даному описі термін "подовжений дуплекс" обозначає дуплекс, утворений шляхом реакції подовження, у якій фрагмент, гібридизований із захоплюючою ділянкою CTO, подовжується з використанням матричної ділянки CTO як матриці та матричної полімерази нуклеїнових кислот. Подовжений дуплекс має величину Т пл, що відрізняється від такої для гібрида, утвореного нерозщепленим PTO та CTO. Краще, щоб подовжений дуплекс мав більш високу величину Т пл, ніж гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO. Величина Тпл такого подовженого дуплекса регулюється в залежності від (1) послідовності та/або довжини фрагмента, (2) послідовності та/або довжини CTO, або (3) послідовності та/або довжини фрагмента та послідовності та/або довжини CTO. Дивовижною ознакою даного винаходу є те, що можливість регулювання величини Т пл подовженого дуплекса використовується для одержання сигналу від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса, в результаті плавлення подовженого дуплекса на стадії (e). Використовуваний в даному описі термін "Т пл" стосується температури плавлення, при якій половина популяції дволанцюгових молекул нуклеїнової кислоти дисоціює до одноланцюгових молекул. Величина Тпл визначається довжиною та вмістом G/C-пар в гібридизованих нуклеотидах. Величина Тпл може бути розрахована традиційними методами, такими як правило Wallace (R.B. Wallace et al., Nucleic Acids Research, 6: 3543-3547(1979)) та метод найближчих сусідів (SantaLucia J. Jr., et al., Biochemistry, 35: 3555-3562(1996)); Sugimoto N., et al., Nucleic Acids Res., 24: 4501-4505(1996)). Відповідно до кращого втілення, величина Т пл стосується фактичних величин Т пл в реакційних умовах, реально використовуваних на практиці. Матрична полімераза нуклеїнових кислот, використовувана на стадії (d), може включати будь-яку полімеразу нуклеїнових кислот, наприклад, кленовський фрагмент ДНК-полімерази I з E. coli, термостабільну ДНК-полімеразу та ДНК-полімеразу бактеріофага T7. Краще, полімераза є термостабільною ДНК-полімеразою, яка може бути одержана з ряду бактеріальних видів, включаючи Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus (Pfu), Pyrococcus woesei, 11 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus та Aquifex aeolieus. Найкраще, матрична полімераза нуклеїнових кислот є полімеразою Taq. Найкраще, щоб матрична полімераза нуклеїнових кислот була полімеразою Taq. Відповідно до кращого втілення, фермент, що виявляє 5'-нуклеазну активність, використовуваний на стадії (b), є ідентичним матричній полімеразі нуклеїнових кислот, використовуваній на стадії (d). ще краще, щоб фермент, що виявляє 5'-нуклеазну активність, використовуваний на стадії (b), матрична полімераза нуклеїнових кислот, використовувана для подовження розташованого "угору по течії" праймера, та матрична полімераза нуклеїнових кислот, використовувана на стадії (d), були ідентичні один одному. Подовжений дуплекс містить мітку, що походить з (1) принаймні однієї мітки, з'єднаної з фрагментом PTO та/або з CTO, (2) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, (3) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, та мітки, з'єднаної з фрагментом PTO та/або з CTO, або (4) інтеркалюючої мітки. Присутність подовженого дуплекса може вказувати на присутність нуклеїновокислотної послідовності-мішені, тому що подовжений дуплекс утворюється, коли присутня нуклеїновокислотна послідовність-мішень. Щоб детекцію присутності подовженого дуплекса проводити безпосередньо, утворення подовженого дуплекса, що містить мітку, яка забезпечує одержання детектованого сигналу, здійснюють на стадії (d). Мітка, використовувана в подовженому дуплексі, забезпечує реєстрацію зміни сигналу в залежності від того, чи є подовжений дуплекс дволанцюговою структурою або одноланцюговою структурою, в кінцевому підсумку надаючи сигнал від мішені, який вказує на присутність подовженого дуплекса, в результаті плавлення цього подовженого дуплекса. Стадія (e). Плавлення подовженого дуплекса Після закінчення реакції подовження подовжений дуплекс піддають плавленню в діапазоні температур з одержанням сигналу від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса. Сигнал від мішені забезпечується за допомогою (1) принаймні однієї мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, (2) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, (3) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, та мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, або (4) інтеркалюючої мітки. Використовуваний в даному описі термін "сигнал від мішені" означає будь-який сигнал, здатний вказати на присутність подовженого дуплекса. Наприклад, термін "сигнал від мішені" включає сигнал від міток (генерацію або гасіння сигналу), зміну сигналу від міток (підсилення або ослаблення сигналу), криву плавлення, картину плавлення та температуру плавлення (або величину Тпл). Відповідно до кращого втілення, сигнал від мішені є зміною сигналу від мітки на подовженому дуплексі на стадії плавлення. Зміна сигналу може бути одержана шляхом вимірювання сигналів не менш ніж при двох різних температурах. Альтернативно, сигнал від мішені є кривою плавлення, картиною плавлення та температурою плавлення (або величиною Тпл), одержаними шляхом вимірювання сигналів від мітки на подовженому дуплексі в діапазоні температур. Краще, щоб діапазон температур був діапазоном температур для аналізу кривої плавлення або був температурою, близькою до величини Тпл подовженого дуплекса. Подовжений дуплекс має більш високу величину Т пл, ніж гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO. Зважаючи на це, подовжений дуплекс та гібрид демонструють відмінні одну від одної картини плавлення. Такі разні картини плавлення дозволяють провести відмінність сигналу від мішені від сигналів, що не належать до мішені. Інша картина плавлення або температура плавлення описує сигнал від мішені спільно з придатною системою міток. Плавлення може бути здійснене з використанням традиційних технологій, включаючи, без обмеження, нагрівання, обробку лугом, формамідом, сечовиною та гліоксалем, ферментативні методи (наприклад, дія гелікази) та застосування зв'язуючих білків, але без обмеження ними. Наприклад, плавлення можна досягти шляхом нагрівання при температурі, що змінюється в діапазоні від 80 °C до 105 °C. Загальні способи здійснення такої обробки наведені в Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001). Придатні системи міток, використовувані в цьому винаході, відрізняються з погляду їх типів, розташування та способу генерації сигналу. Системи міток, корисні в цьому винаході, будуть обговорені більш детально нижче. (1) Мітка, з'єднана з фрагментом та/або CTO Відповідно до кращого втілення, одержання сигналу від мішені забезпечується принаймні однією міткою, з'єднаною з фрагментом та/або CTO. Як тільки відбудеться утворення 12 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 подовженого дуплекса між фрагментом PTO та CTO, на подовженому дуплексі з'явиться мітка або від фрагмента PTO, або від CTO, яка забезпечує сигнал від мішені на стадії плавлення. Така мітка включає систему двох взаємодіючих міток та одиночну мітку. (1-1) Система двох взаємодіючих міток Система взаємодіючих міток є генеруючою сигнал системою, у якій енергія передається від донорної молекули акцепторній молекулі без участі радіоактивності. Як репрезентативна система взаємодіючих міток, система міток при FRET (резонансному перенесенні енергії флуоресценції) включає флуоресцентну репортерну молекулу (донорну молекулу) та молекулу-гасник (акцепторну молекулу). При FRET донор енергії є флуоресцентним, а акцептор енергії може бути флуоресцентним або не бути флуоресцентним. Для іншої форми систем взаємодіючих міток донор енергії не є флуоресцентним, наприклад, є хромофором, а акцептор енергії є флуоресцентним. Для ще однієї іншої форми систем взаємодіючих міток донор енергії є люмінесцентним, наприклад, біолюмінесцентним, хемілюмінесцентним, електрохемілюмінесцентним, а акцептор є флуоресцентним. Донорна молекула та акцепторна молекула можуть бути описані в даному винаході як репортерна молекула та молекула-гасник, відповідно. Краще, щоб сигнал, який вказує на присутність подовженого дуплекса (тобто, на присутність нуклеїновокислотної послідовності-мішені), генерувался системами взаємодіючих міток, ще краще, системою FRET-міток (тобто, системою двох взаємодіючих міток). Перше втілення (внутрішньоланцюгова система двох взаємодіючих міток) В першому втіленні системи двох взаємодіючих міток фрагмент або CTO містить систему двох взаємодіючих міток, яка складається з репортерної молекули та молекули-гасника; при цьому плавлення подовженого дуплекса на стадії (e) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені на стадії (e). Перше втілення такої системи двох взаємодіючих міток проілюстроване на Фіг. 2, 6 та 9. Перше втілення називається внутрішньоланцюговою системою двох взаємодіючих міток. Перше втілення, наведене на Фіг. 2, (внутрішньоланцюгова система двох взаємодіючих міток) Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 2. Матрична ділянка CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється, вивільняючи фрагмент, цей фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO та подовжується з утворенням подовженого дуплекса. Якщо на стадії (d) утворюється подовжений дуплекс, то репортерна молекула та молекулагасник на CTO конформаційно розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули; при цьому, якщо на стадії (e) цей подовжений дуплекс піддають плавленню, то репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розташовуються близько одна до одної, що дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули, так що доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Використовуваний в даному описі вираз "репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розташовуються близько одна до одної" означає, що репортерна молекула та молекула-гасник просторово наближені одна до одної завдяки конформаційній структурі фрагмента або CTO, такої як випадкова спіраль та шпильчаста структура. Використовуваний в даному описі вираз "репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розділяються" означає, що репортерна молекула та молекула-гасник просторово розділяються в результаті зміни конформаційної структури фрагмента або CTO після утворення подвійного ланцюга. Краще, щоб сигнал від мішені, що доставляється на стадії (e), був кривою плавлення, картиною плавлення або величиною Т пл, одержуваною шляхом вимірювання зміни сигналу флуоресценції, генерованого на стадії (d). Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник можуть бути розташовані в будь-якому місці на CTO, за умови, що гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснюється в залежності від плавлення подовженого дуплекса. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник обидві з'єднані з матричною ділянкою або із захоплюючою ділянкою CTO. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник розташовані на 5'-кінці та 3'-кінці CTO. 13 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відповідно до кращого втілення, одна з молекул на CTO, репортерна молекула або молекула-гасник, розташована на його 5'-кінці або на відстані 1-5 нуклеотидів від його 5'-кінця, а інша розташована так, щоб гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснювалося в залежності від конформації CTO. Відповідно до кращого втілення, одна з молекул на CTO, репортерна молекула або молекула-гасник, розташована на його 3'-кінці або на відстані 1-5 нуклеотидів від його 3'-кінця, а інша розташована так, щоб гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснювалося в залежності від конформації CTO. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник розташовані на відстані не більше 80 нуклеотидів, ще краще, не більше 60 нуклеотидів, навіть ще краще, не більше 30 нуклеотидів, ще істотно краще, не більше 25 нуклеотидів одна від одної. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник розділені принаймні 4 нуклеотидами, ще краще, принаймні 6 нуклеотидами, навіть ще краще, принаймні 10 нуклеотидами, ще істотно краще, принаймні 15 нуклеотидами. В даному винаході можливе одержання гібрида, утвореного нерозщепленим PTO та CTO. Якщо матрична ділянка CTO помічена з використанням системи двох взаємодіючих міток, як показано на Фіг. 2, то індукції зміни сигналу від мітки на гібриді, утвореному нерозщепленим PTO та CTO, не відбувається. Внаслідок цього гібрид не дає сигналу, який не відноситься до мішені. Якщо захоплююча ділянка CTO помічена з використанням системи двох взаємодіючих міток, то гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені, на стадії плавлення. У цьому випадку різниця у величинах Т пл для подовженого дуплекса та гібрида дозволяє відрізнити сигнал від подовженого дуплекса, що відноситься до мішені, від сигналу гібрида, який не відноситься до мішені. Перше втілення, наведене на Фіг. 6 (внутрішньоланцюгова система двох взаємодіючих міток). Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 6. 5'-Кінцева ділянка PTO, що мітить, містить репортерну молекулу та молекулу-гасник. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється, вивільняючи фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, з репортерною молекулою та молекулою-гасником. Цей фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO. Якщо на стадії (d) утворюється подовжений дуплекс, то репортерна молекула та молекулагасник на фрагменті конформаційно розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули; при цьому, якщо на стадії (e) цей подовжений дуплекс піддають плавленню, то репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розташовуються близько одна до одної, що дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули, так що доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник можуть бути розташовані в будь-якому місці на фрагменті, за умови, що гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснюється в залежності від плавлення подовженого дуплекса. Відповідно до кращого втілення, одна з молекул на фрагменті, репортерна молекула або молекула-гасник, розташована на його 5'-кінці або на відстані 1-5 нуклеотидів від його 5'-кінця, а інша розташована так, щоб гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснювалося в залежності від конформації фрагмента. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник розташовані на відстані не більше 50 нуклеотидів, ще краще, не більше 40 нуклеотидів, навіть ще краще, не більше 30 нуклеотидів, ще істотно краще, не більше 20 нуклеотидів одна від одної. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник розділені принаймні 4 нуклеотидами, ще краще, принаймні 6 нуклеотидами, навіть ще краще, принаймні 10 нуклеотидами, ще істотно краще, принаймні 15 нуклеотидами. Як представлено на Фіг. 6, гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені, на стадії плавлення. У цьому випадку різниця у величинах Т пл для подовженого дуплекса та гібрида дозволяє відрізнити сигнал від подовженого дуплекса, що відноситься до мішені, від сигналу гібрида, який не відноситься до мішені. Друге втілення (міжланцюгова система двох взаємодіючих міток) В другому втіленні системи взаємодіючих міток фрагмент містить одну з двох взаємодіючих міток, що включають репортерну молекулу та молекулу-гасник, а CTO містить іншу з двох 14 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 взаємодіючих міток; при цьому плавлення подовженого дуплекса на стадії (e) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені на стадії (e). Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 8. Якщо на стадії (d) утворюється подовжений дуплекс, то сигнал від репортерної молекули, з'єднаної з CTO, гаситься молекулою-гасником, з'єднаною з PTO. Якщо на стадії (e) подовжений дуплекс піддають плавленню, то репортерна молекула та молекула-гасник розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули, так що доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Краще, щоб сигнал від мішені, що доставляється на стадії (e), був кривою плавлення, картиною плавлення або величиною Т пл, одержаними шляхом вимірювання зміни сигналу флуоресценції від системи двох взаємодіючих міток. Репортерна молекула та молекула-гасник можуть бути розташовані в будь-якому місці фрагмента PTO та CTO, за умови, що сигнал від репортерної молекули гаситься молекулоюгасником в подовженому дуплексі. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула або молекула-гасник на фрагменті PTO розташована на 5'-кінці 5'-кінцевої ділянки, що мітить. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула або молекула-гасник на CTO розташована на його 3'-кінці. Як представлено на Фіг. 8, гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені, на стадії плавлення. У цьому випадку різниця у величинах Т пл для подовженого дуплекса та гібрида дозволяє відрізнити сигнал від подовженого дуплекса, що відноситься до мішені, від сигналу гібрида, який не відноситься до мішені. Репортерна молекула та молекула-гасник, корисні в даному винаході, можуть включати будь-які молекули, відомі в даній області техніки. Їх прикладами є такі: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), кальцеїн (517), FITC (флуоресцеїнізотіоціанат) (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), родамін 110 (520), Oregon Green™ (орегон зелений) 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (родаміновий зелений) (527), родамін 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (2',7'-диметокси-4',5'-дихлорофлуоресцеїн) (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (тетраметилродамін-ізотіоціанат) (572), Magnesium Orange™ (575), фікоеритрин R&B (575), родамін-фалоїдин (575), Calcium Orange™ (576), піронін Y (580), родамін B (580), TAMRA (тетраметилродамін) (582), Rhodamine Red™ (родамін червоний) (590), Cy3.5™ (596), ROX (6-карбокси-X-родамін) (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), техаський червоний (615), нільський червоний (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-фікоціанін (642), Cфікоціанін (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), тіадикарбоціанін (671) та Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (карбоксифлуоресцеїн) (520), флуоресцеїн (520), флуоресцеїн-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) та Quasar 705 (610). Числа в дужках є довжиною хвилі, що відповідає максимуму випромінювання, в нанометрах. Краще, щоб репортерна молекула та молекула-гасник були JOE, FAM, TAMRA, ROX та іншою міткою на основі флуоресцеїну. Придатні пари репортер-гасник описані в ряді публікацій, які вказані нижче: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of nd Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2 Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of th Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6 Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; патенти США №№ 3996345 та 4351760. Варто відзначити, що в даному винаході може бути використана нефлуоресцентна "чорна" молекула-гасник, здатна гасити флуоресценцію в широкому діапазоні довжин хвиль або на конкретній довжині хвилі. Прикладами таких гасников є BHQ (Black Hole 1) та DABCYL (4-((4(диметиламіно)феніл)азо)бензойна кислота). Для FRET-міток, адаптованих до CTO, термін "репортерна молекула" включає донора FRET, а термін "гасник" включає іншого партнера (акцептора) FRET. Наприклад, 15 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 як репортерну молекулу використовують флуоресцентний барвник, а як гасник родаміновий барвник. (1-2) Одиночна мітка Даний винахід також чудово здійснюється з використанням систем із одиночною міткою для одержання сигналів, що вказують на присутність нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. Відповідно до кращого втілення, фрагмент або CTO містить одиночну мітку, а плавлення подовженого дуплекса на стадії (e) індукує зміну сигналу від цієї одиночної мітки з одержанням сигналу від мішені на стадії (e). Перше втілення, наведене на Фіг. 3 (система з одиночною міткою) Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 3. Матрична ділянка CTO містить одиночну флуоресцентну мітку. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється, вивільняючи фрагмент. Цей фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO та подовжується з утворенням подовженого дуплекса. В результаті утворення подовженого дуплекса інтенсивність флуоресценції від одиночної флуоресцентної мітки збільшується. Якщо на стадії (e) подовжений дуплекс піддають плавленню, то інтенсивність флуоресценції від одиночної флуоресцентної мітки зменшується, так що доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Відповідно до кращого втілення, одиночна мітка може бути розташована в будь-якому місці CTO, за умови, що рівень сигналу від одиночної мітки змінюється в залежності від плавлення подовженого дуплекса. Відповідно до кращого втілення, одиночна мітка з'єднана з матричною ділянкою або із захоплюючою ділянкою CTO. Якщо матрична ділянка CTO помічена одиночною міткою, як показано на Фіг. 3, то індукції зміни сигналу від мітки на гібриді, утвореному нерозщепленим PTO та CTO, не відбувається. Внаслідок цього гібрид не дає сигналу, який не відноситься до мішені. Якщо захоплююча ділянка CTO помічена одиночною міткою, то гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені, на стадії плавлення. У цьому випадку різниця у величинах Т пл для подовженого дуплекса та гібрида дозволяє відрізнити сигнал від подовженого дуплекса, що відноситься до мішені, від сигналу гібрида, який не відноситься до мішені. Друге втілення, наведене на Фіг. 7 (система з одиночною міткою) Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 7. 5'-Кінцева ділянка PTO, що мітить, містить одиночну флуоресцентну мітку. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється, вивільняючи фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, з одиночною флуоресцентною міткою. В результаті гібридизації інтенсивність сигналу від одиночної флуоресцентної мітки на 5'-кінцевій ділянці, що мітить, збільшується. Якщо на стадії (e) подовжений дуплекс піддають плавленню, то інтенсивність сигналу від одиночної флуоресцентної мітки зменшується, так що доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Відповідно до кращого втілення, одиночна мітка може бути розташована в будь-якому місці фрагмента PTO, за умови, що рівень сигналу від одиночної мітки змінюється в залежності від плавлення подовженого дуплекса. Як представлено на Фіг. 7, гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені, на стадії плавлення. У цьому випадку різниця у величинах Т пл для подовженого дуплекса та гібрида дозволяє відрізнити сигнал від подовженого дуплекса, що відноситься до мішені, від сигналу гібрида, який не відноситься до мішені. Використання в даному винаході одиночної мітки має забезпечити одержання різних сигналів в залежності від її присутності на дволанцюговій або одноланцюговій структурі. Одиночна мітка є флуоресцентною міткою, люмінесцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, електрохімічною міткою та металічною міткою. Краще, щоб одиночна мітка була флуоресцентною міткою. Типи та кращі сайти зв'язування одиночних флуоресцентних міток, використовуваних в даному винаході, описані в патентах США №№ 7537886 та 7348141, ідеї яких включені до даного опису шляхом посилання в усій своїй повноті. Краще, щоб одиночна флуоресцентна мітка була JOE, FAM, TAMRA, ROX та іншою міткою на основі флуоресцеїну. Мічений нуклеотидний залишок краще розташований в позиції внутрішнього нуклеотидного залишку в межах олігонуклеотиду, а не на 5'-кінці або 3'-кінці. 16 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Одиночна мітка, використовувана в даному винаході, може бути описана з посиланням на вказані вище описи для репортерної молекули та молекули-гасника. Зокрема, якщо даний винахід здійснюють на твердій фазі із застосуванням одиночної мітки, то можна використовувати звичайну флуоресцентну мітку, і не потрібно спеціальної флуоресцентної мітки, здатної забезпечити одержання сигналів флуоресценції з різними інтенсивностями в залежності від її присутності на дволанцюговій або одноланцюговій структурі. Сигнал від мішені, створюваний на твердій підкладці, вимірюють. Таке втілення системи з одиночною міткою разом з іммобілізованим CTO проілюстроване на Фіг. 12. В тому випадку, коли застосовують CTO, іммобілізований на твердій підкладці, можна використовувати хімічні мітки (наприклад, біотин) або ферментативні мітки (наприклад, лужну фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу та β-глюкозидазу). В системах з міткою, що використовують "метку, з'єднану з фрагментом та/або CTO", ці мітки можуть бути розташовані таким чином, що, якщо утворюється гібрид, який складається з нерозщепленого PTO та CTO, то цей гібрид на стадії (e) не дає сигналу, який не відноситься до мішені. Альтернативно, мітки можуть бути розташовані таким чином, що, якщо утворюється гібрид, який складається з нерозщепленого PTO та CTO, то цей гібрид на стадії (e) дає сигнал, який не відноситься до мішені; при цьому величина Т пл для подовженого дуплекса більше такої для гібрида, утвореного нерозщепленим PTO та CTO. Зокрема, якщо мітки розташовані таким чином, що гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, не дає сигналу, який не відноситься до мішені, то для вибору величини Т пл подовженого дуплекса з метою детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені можна використовувати діапазон, що включає величину Т пл для гібрида. (2) Мітка, вбудовувана в подовжений дуплекс В даному винаході можна застосовувати мітку, вбудовувану в подовжений дуплекс під час реакції подовження, для одержання сигналу від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса. Незважаючи на те, що фрагмент PTO або CTO не містить жодної мітки, успішно використовується мітка, вбудовувана в подовжений дуплекс під час реакції подовження, що дає можливість зробити подовжений дуплекс міченим. На Фіг. 10 та 11 проілюстроване втілення, у якому нуклеотид з одиночною міткою вбудовується в подовжений дуплекс під час реакції подовження (див. C та D на Фіг. 10 та 11). Це втілення також є застосовним до інших втілень з використанням аналізу плавлення. Відповідно до кращого втілення, одержання сигналу від мішені забезпечується за допомогою одиночної мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження; причому вбудовувана одиночна мітка з'єднана з нуклеотидом, вбудовуваним під час реакції подовження; при цьому плавлення подовженого дуплекса на стадії (e) індукує зміну сигналу від одиночної мітки з одержанням сигналу від мішені на стадії (e). Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 10. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється, вивільняючи фрагмент. Цей фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO, іммобілізованого на твердій підкладці, та подовжується в присутності нуклеотидів, мічених одиночною флуоресцентною міткою, з утворенням подовженого дуплекса. Флуоресцентний сигнал від подовженого дуплекса можна детектувати у плямі на твердій підкладці з іммобілізованим CTO. Коли подовжений дуплекс піддають плавленню, ланцюг, що містить флуоресцентну мітку, вивільняється, та флуоресцентний сигнал в цій плямі більше не детектується (на Фіг. 10 не показано). Таким чином, зміна сигналу у плямі може бути одержана шляхом плавлення подовженого дуплекса. При цьому доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Сигнал від мішені, що доставляється на стадії (e), є кривою плавлення, картиною плавлення або величиною Тпл, одержаними шляхом вимірювання зміни сигналу флуоресценції у плямі з іммобілізованим CTO. Відповідно до кращого втілення, нуклеотид, вбудовуваний під час реакції подовження, містить першу неприродну основу, а CTO містить нуклеотид, що містить другу неприродну основу з афінністю специфічного зв'язування (specific binding affinity) з першою неприродною основою, як показано на Фіг. 11. Нуклеотид, що містить другу неприродну основу, краще розташований в будь-якому сайті на матричній ділянці CTO. Використовуваний в даному описі термін "неприродна основа" стосується похідних природних основ, таких як аденін (A), гуанін (G), тимін (T), цитозин (C) та урацил (U), які здатні утворювати зв'язані водневими зв'язками пари основ. Використовуваний в даному описі термін "неприродна основа" включає основи, які характеризуються іншими картинами утворення пар 17 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 основ у порівнянні з природними основами як вихідними сполуками (mother compounds), як описано, наприклад, в патентах США №№ 5432272, 5965364, 6001983 та 6037120. Утворення пар основ між неприродними основами полягає в утворенні двох або трьох водневих зв'язків, як і у природних основ. Утворення пар основ між неприродними основами також відбувається з урахуванням специфічности. Конкретні приклади неприродних основ включають такі основи в комбінаціях пар основ ізоC/ізо-G, ізо-dC/ізо-dG, K/X, H/J та M/N (див. патент США № 7422850). Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 11. Фрагмент гібридизується з CTO, що містить нуклеотид, який має другу неприродну основу (наприклад, ізо-dC) з афінністю специфічного зв'язування з першою неприродною основою (наприклад, ізо-dG). Подовження здійснюють в присутності нуклеотиду, що містить першу неприродну основу, мічену одиночною флуоресцентною міткою, з утворенням подовженого дуплекса. В реакції подовження нуклеотид, що містить першу неприродну основу, вбудовується в сайт, розташований навпроти нуклеотиду, що містить другу неприродну основу. Флуоресцентний сигнал від подовженого дуплекса можна детектувати у плямі на твердій підкладці з іммобілізованим CTO. Коли подовжений дуплекс піддають плавленню, ланцюг, що містить флуоресцентну мітку, вивільняється, і флуоресцентний сигнал у цій плямі більше не детектується (на Фіг. 11 не показано). Таким чином, зміна сигналу у плямі може бути одержана шляхом плавлення подовженого дуплекса. При цьому доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Якщо застосовується мітка, вбудовувана в подовжений дуплекс під час реакції подовження, то ця мітка не вбудовується в гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, оскільки гібрид не подовжується. Таким чином, даний гібрид не дає сигналу, який не відноситься до мішені. Типи та характеристики використовуваних одиночних міток можуть бути описані з посиланням на описи для системи міток, у якій використовується "мітка, з'єднана з фрагментом та/або CTO", як зазначено вище. (3) Мітка, вбудовувана в подовжений дуплекс, та мітка, з'єднана з фрагментом або CTO В даному винаході можна застосовувати систему міток, у якій використовується спільна дія мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, та мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, як показано на Фіг. 4 та 5. Відповідно до кращого втілення, одержання сигналу від мішені забезпечується за допомогою мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, та мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, і така вбудовувана мітка з'єднана з нуклеотидом, вбудовуваним під час реакції подовження; причому ці дві мітки є системою двох взаємодіючих міток, яка складається з репортерної молекули та молекули-гасника; при цьому плавлення подовженого дуплекса на стадії (e) індукує зміну сигналу від цієї системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені на стадії (e). Краще, щоб нуклеотид, вбудовуваний під час реакції подовження, містив першу неприродну основу, а CTO містив нуклеотид, що містить другу неприродну основу з афінністю специфічного зв'язування з першою неприродною основою. Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 4. Фрагмент гібридизується з CTO, що містить репортерну молекулу або молекулу-гасник та нуклеотид, який має другу неприродну основу (наприклад, ізо-dC) з афінністю специфічного зв'язування з першою неприродною основою (наприклад, ізо-dG). Подовження здійснюють в присутності нуклеотиду, що містить першу неприродну основу, мічену молекулою-гасником або репортерною молекулою, з утворенням подовженого дуплекса, у якому сигнал від репортерної молекули гаситься молекулою-гасником. В реакції подовження нуклеотид, що містить першу неприродну основу, вбудовується в сайт, розташований навпроти нуклеотиду, що містить другу неприродну основу. Якщо на стадії (e) подовжений дуплекс піддають плавленню, то репортерна молекула та молекула-гасник розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули, так що доставляється сигнал від мішені, який вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Краще, щоб сигнал від мішені, що доставляється на стадії (e), був кривою плавлення, картиною плавлення або величиною Т пл, одержаними шляхом вимірювання зміни сигналу флуоресценції від системи двох взаємодіючих міток. Місцезнаходження мітки на CTO та сайта вбудовування вбудовуваної мітки визначається в тій мірі, у якій ці дві мітки діють як система двох взаємодіючих міток для індукції зміни сигналу на стадії плавлення. 18 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Навіть ще краще, щоб матрична ділянка CTO містила репортерну молекулу або молекулугасник та нуклеотид, який має другу неприродну основу. Реакцію подовження на стадії (d) проводять в присутності нуклеотиду, що містить молекулу-гасник або репортерну молекулу та першу неприродну основу з афінністю специфічного зв'язування з другою неприродною основою в CTO. Ці дві неприродні основи в подовженому дуплексі на стадії (d) утворюють пару основ, викликаючи гасіння сигналу від репортерної молекули за допомогою молекули-гасника, та індукуючи зміну сигналу, внаслідок чого забезпечується одержання сигналу від мішені. Альтернативно, фрагмент містить репортерну молекулу або молекулу-гасник, а матрична ділянка CTO містить нуклеотид, який має другу неприродну основу. Реакцію подовження на стадії (d) проводять в присутності нуклеотиду, що містить молекулу-гасник або репортерну молекулу та першу неприродну основу з афінністю специфічного зв'язування з другою неприродною основою в CTO. Ці дві неприродні основи в подовженому дуплексі на стадії (d) утворюють пару основ, індукуючи зміну сигналу від репортерної молекули шляхом гасіння, внаслідок чого забезпечується одержання сигналу від мішені. Інше пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 5. В цьому втіленні фрагмент, який містить репортерну молекулу або молекулу-гасник, гібридизується з CTO, що містить нуклеотид, який має другу неприродну основу (наприклад, ізо-dC) з афінністю специфічного зв'язування з першою неприродною основою (наприклад, ізо-dG). Подовження здійснюють в присутності нуклеотиду, що містить першу неприродну основу, мічену молекулоюгасником або репортерною молекулою, з утворенням подовженого дуплекса, у якому сигнал від репортерної молекули гаситься молекулою-гасником. В реакції подовження нуклеотид, що містить першу неприродну основу, вбудовується в сайт, розташований навпроти нуклеотиду, що містить другу неприродну основу. Якщо на стадії (d) утворюється подовжений дуплекс, то репортерна молекула та молекулагасник конформаційно розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули; при цьому якщо на стадії (e) цей подовжений дуплекс піддають плавленню, то репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розташовуються близько одна до одної, що дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули, так що доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Краще, щоб сигнал від мішені, що доставляється на стадії (e), був кривою плавлення, картиною плавлення або величиною Т пл, одержаними шляхом вимірювання зміни сигналу флуоресценції від системи двох взаємодіючих міток. Місцезнаходження мітки на PTO та сайта вбудовування вбудовуваної мітки визначається в тій мірі, у якій ці дві мітки діють як система двох взаємодіючих міток для індукції зміни сигналу на стадії плавлення. Якщо застосовується мітка, вбудовувана в подовжений дуплекс під час реакції подовження, то ця мітка не вбудовується в гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, оскільки гібрид не подовжується. Таким чином, даний гібрид не дає сигналу, який не відноситься до мішені. (4) Інтеркалююча мітка В даному винаході можна застосовувати інтеркалюючу мітку для одержання сигналу від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса. Інтеркалююча мітка більш корисна в реакції на твердій фазі з використанням іммобілізованих CTO, через те, що генерувати сигнали можуть дволанцюгові молекули нуклеїнових кислот, присутні у зразках. Приклади інтеркалюючих барвників, корисних в даному винаході, включають SYBR™ Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PRO™1, TO-PRO™1, SYTO™11, SYTO™13, SYTO™15, SYTO™16, SYTO™20, SYTO™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ та триазоловий оранжевий. Ці інтеркалюючі барвники специфічно інтеркалюють в дволанцюгові молекули нуклеїнових кислот, генеруючи сигнали. На Фіг. 13 проілюстроване втілення, у якому інтеркалюючі барвники інтеркалюють між парами основ подовженого дуплекса (C та D на Фіг. 13). Дане втілення також є застосовним до іншого втілення з використанням аналізу плавлення. Пояснене прикладом втілення описане з посиланням на Фіг. 13. Фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO, іммобілізованого на твердій підкладці. Подовження здійснюють в присутності інтеркалюючого барвника (наприклад, SYBR™ Green) та одержують подовжений дуплекс з інтеркалюючими барвниками. Флуоресцентний сигнал від подовженого дуплекса у плямі на твердій підкладці з іммобілізованим CTO можна детектувати з використанням інтеркалюючих флуоресцентних барвників. Коли подовжений дуплекс піддають плавленню, інтеркалюючі флуоресцентні барвники вивільняються, і флуоресцентний сигнал в цій плямі 19 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більше не детектується (на Фіг. 13, не показано). При цьому доставляється сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса на стадії (e). Гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені, на стадії плавлення. У цьому випадку різниця у величинах Т пл для подовженого дуплекса та гібрида дозволяє відрізнити сигнал від подовженого дуплекса, що відноситься до мішені, від сигналу гібрида, який не відноситься до мішені (Фіг. 13, не показано). Краще, щоб сигнал від мішені, що доставляється на стадії (e), був кривою плавлення, картиною плавлення або величиною Тпл, одержаними шляхом вимірювання зміни сигналу від системи двох взаємодіючих міток. Стадія (f). Детекція сигналу від мішені Остаточно, детекцію подовженого дуплекса здійснюють шляхом вимірювання сигналу від мішені, доставляємого на стадії (e); тим самим присутність подовженого дуплекса вказує на присутність нуклеїновокислотної послідовності-мішені. Детекція може бути здійснена різними способами в залежності від типів сигналу від мішені. Відповідно до кращого втілення, детекцію сигналу від мішені здійснюють з використанням аналізу плавлення. Використовуваний в даному описі термін "аналіз плавлення" означає метод, з використанням которого сигнал від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса, одержують в результаті плавлення подовженого дуплекса, включаючи метод вимірювання сигналів при двох різних температурах, аналіз кривої плавлення, аналіз картини плавлення та аналіз піків плавлення. Краще, аналіз плавлення є аналізом кривої плавлення. Відповідно до кращого втілення, за плавленнем, здійснюваним на стадії (e), йде гібридизація з одержанням сигналу від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса. У цьому випадку детекцію подовженого дуплекса здійснюють з використанням аналізу кривої гібридизації. Крива плавлення або крива гібридизації може бути одержана з використанням традиційних технологій, наприклад, як описано в патентах США №№ 6174670 та 5789167, Drobyshev et al., Gene 188: 45 (1997); Kochinsky and Mirzabekov, Human Mutation, 19: 343 (2002); Livehits et al., J. Biomol. Structure Dynam., 11: 783 (1994) та Howell et al., Nature Biotechnology, 17: 87 (1999). Наприклад, крива плавлення або крива гібридизації може бути графічним зображенням або відображенням зміни виходного сигналу в залежності від зміни такого параметра, як жорсткість умов гібридизації. Можна побудувати графік залежності вихідного сигналу безпосередньо від параметра гібридизації. В типовому випадку крива плавлення або крива гібридизації будуть характеризуватися вихідним сигналом, наприклад, флуоресценцією, який вказує на відносну кількість дуплексної структури (тобто, на ступінь гібридизації), відкладеним по осі Y, та параметром гібридизації, відкладеним по осі X. PTO та CTO можуть складатися з природних dNMP. Альтернативно, PTO та CTO можуть складатися з модифікованих нуклеотидів або неприродних нуклеотидів, таких як PNA (пептидонуклеїнова кислота (peptide nucleic acid), див. публікацію PCT № WO 92/20702) та LNA ("закрита" нуклеїнова кислота (locked nucleic acid), див. публікації PCT №№ WO 98/22489, WO 98/39352 та WO 99/14226). PTO та CTO можуть містити універсальні основи, такі як дезоксіінозин, інозин, 1-(2'-дезокси-бета-D-рибофуранозил)-3-нітропірол та 5-нітроіндол. Термін "універсальна основа" стосується основи, здатної утворювати пари основ з кожною з природних основ ДНК/РНК з невеликою різницею між ними. Як описано вище, PTO може розщеплюватися в сайті, локалізованому в 3'-напрямку від 3'кінця 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить. Цей сайт розщеплення може бути розташований в 5'кінцевій частині 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень. В тому випадку, коли фрагмент PTO містить 5'-кінцеву частину 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, сайт CTO, гібридизований з 5'-кінцевою частиною 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, може містити універсальну основу, вироджену послідовність або їх комбінацію. Наприклад, якщо PTO розщеплюється в сайті, локалізованому на відстані одного нуклеотиду в 3'-напрямку від 3'-кінця 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, то вигідно, щоб 5'-кінцева частина захоплюючої ділянки CTO містила універсальну основу для гібридизації з даним нуклеотидом. Якщо PTO розщеплюється в сайті, локалізованому на відстані двох нуклеотидів в 3'-напрямку від 3'-кінця 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, то вигідно, щоб 5'-кінець захоплюючої ділянки CTO містив вироджену послідовність, а його суміжний в 3'-напрямку нуклеотид містив універсальну основу. Відповідно, в тому випадку, коли розщеплення PTO відбувається в різних сайтах 5'-кінцевої частини 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень, використання універсальних основ та вироджених послідовностей в CTO є корисним. На додаток до цього, коли для скринінгу численних нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней в умовах індукції розщеплення, залежного від подовження 20 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розташованого "угору по течії" праймера, використовують PTO, що містять одну й ту саме 5'кінцеву ділянку, що мітить, можуть бути створені фрагменти PTO, що містять різні 5'-кінцеві части 3'-кінцевої ділянки, що впізнає мішень. В таких випадках корисно використання в CTO універсальних основ та вироджених послідовностей. Стратегії з використанням універсальних основ та вироджених послідовностей в CTO дозволяють застосовувати один тип або мінімальну кількість типів CTO для скринінгу численних нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. Відповідно до кращого втілення, спосіб додатково включає повторення стадій (a)-(b), (a)-(d) або (a)-(f) з денатурацією між повторюваними циклами, краще, з використанням розташованого "вниз по течії" праймера. Це повторення дозволяє ампліфікувати нуклеїновокислотну послідовність-мішень та/або сигнал від мішені. Відповідно до кращого втілення, стадії (a)-(f) здійснюють в реакційній посудині або в окремих реакційних посудинах. Наприклад, стадії (a)-(b), (c)-(d) або (e)-(f) можуть бути здійсненн в окремих реакційних посудинах. Відповідно до кращого втілення, стадії (a)-(b) та (c)-(f) можуть бути проведені одночасно або роздільно навіть в одній реакційній посудині в залежності від реакційних умов (зокрема, температури). В даному винаході не потрібно, щоб нуклеїновокислотні послідовності-мішені, які підлягають детекції та/або ампліфікації, мали будь-яку визначену послідовність або довжину, включаючи будь-які молекули ДНК (гДНК та кДНК) та РНК. Якщо як вихідний матеріал використовують мРНК, перед проведенням стадії відпалу необхідна стадія зворотної транскрипції, деталі якої можна знайти в Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); та Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res., 16: 10366 (1988)). Для зворотної транскрипції можна використовувати випадковий гексамер або олігонуклеотид dT як праймер, здатний гібридизуватися з мРНК. Нуклеїновокислотні послідовності-мішені, які можуть підлягати детекції та/або ампліфікації, включають будь-яку прокаріотичну, еукаріотичну (наприклад, з найпростіших та паразитів, грибів, дріжджів, вищих рослин, нижчих та вищих тварин, в тому числі ссавців та людину), вірусну (наприклад, з вірусу герпесу, ВІЛ (вірусу імунодефіциту людини), вірусу грипу, вірусу Епштейна-Барр, вірусу гепатиту, поліовірусу і т.д.) або віроїдну нуклеїнову кислоту природного походження. Крім того, даний винахід є корисним для детекції варіабельності нуклеотидів. Краще, нуклеїновокислотна послідовність-мішень має варіабельність нуклеотидів. Термін "варіабельність нуклеотидів", використовуваний в даному описі, стосується будь-яких одиночних або численних нуклеотидних замін, делецій або вставок в послідовності ДНК в конкретному положенні поміж безперервних сегментів ДНК, які в інших випадках є однаковими в послідовності. Такі безперервні сегменти ДНК включають ген або будь-яку іншу частину хромосоми. Такі варіабельності нуклеотидів можуть бути результатом мутації або бути варіабельностями поліморфних алелів. Наприклад, варіабельність нуклеотидів, детектована в даному винаході, включає SNP (однонуклеотидний поліморфізм), мутацію, делецію, вставку, заміну та транслокацію. Прикладом варіабельності нуклеотидів є численні варіації в геномі людини (наприклад, варіації в гені MTHFR (метилентетрагідрофолатредуктази)), варіації, які залучені у виникнення лікарської стійкості у патогенних мікроорганізмів, та приводять до онкогенезу варіації. В даному винаході для детекції варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені в тому випадку, коли використовувані праймери або зонди містять послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені, ця нуклеїновокислотна послідовність-мішень, що має варіабельність нуклеотидів, описується в даному винаході як порівнянна матриця (matching template). В тому випадку, коли використовувані праймери або зонди містять послідовність, некомплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені, ця нуклеїновокислотна послідовність-мішень, що має варіабельність нуклеотидів, описується в даному винаході як непорівнянна матриця (mismatching template). Для детекції варіабельностей нуклеотидів 3'-кінець розташованого "угору по течії" праймера можна сконструювати таким чином, щоб вона розташовувалася навпроти сайта з варіабельністю нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені. Відповідно до кращого втілення, 3'-кінець розташованого "угору по течії" праймера містить послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені. 3'-Кінець розташованого "угору по течії" праймера, що містить послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в 21 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїновокислотній послідовності-мішені, відпалюють з порівнянною матрицею та подовжують, щоб індукувати розщеплення PTO. Одержаний фрагмент PTO гібридизується з CTO з одержанням сигналу від мішені. На відміну від цього, коли 3'-кінець розташованого "угору по течії" праймера не відповідає варіабельності нуклеотидів в непорівнянній матриці, вона не подовжується в умовах, які необхідні для відпалу 3'-кінця праймерів та є суттєвими для подовження, навіть коли розташований "угору по течії" праймер гібридизується з непорівнянною матрицею, і внаслідок цього ніякого сигналу від мішені не генерується. Альтернативно, можна використовувати розщеплення PTO в залежності від гібридизації PTO, що містить послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені. Наприклад, в регульованих умовах PTO, що містить послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені, гібридизується з порівнянною матрицею і потім розщеплюється. Одержаний фрагмент PTO гібридизується з CTO з одержанням сигналу від мішені. Разом з тим в регульованих умовах PTO не гібридизується з непорівнянною матрицею, що містить некомплементарну послідовність в місці розташування варіабельності нуклеотидів, та не розщеплюється. У цьому випадку краще, щоб послідовність, комплементарна з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в PTO, була розташована в середині її 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень. Альтернативно, краще, щоб 5'-кінцева частина 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, була орієнтована по відношенню до варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені для детекції цієї варіабельності нуклеотидів, а 5'-кінцева частина 3'кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, містила послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів в нуклеїновокислотній послідовності-мішені. В одному з втілень для детекції однонуклеотидної варіабельності 5'-кінець 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, містить послідовність, комплементарну з урахуванням цієї однонуклеотидної варіабельності в нуклеїновокислотній послідовності-мішені. Як описано вище, розщеплення PTO, гібридизованого з порівнянною матрицею, може бути індуковане в сайті, безпосередньо прилеглому в 3'-напрямку до 5'-кінця 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень, наприклад, в умовах індукції розщеплення, залежного від подовження розташованого "угору по течії" праймера. 3'-Кінець фрагмента PTO містить нуклеотид, комплементарний з урахуванням даної однонуклеотидної варіабельності. Фрагмент PTO гібридизується з CTO, що містить захоплюючу ділянку, яка містить послідовність, що відповідає варіабельності нуклеотидів, і потім подовжується з утворенням подовженого дуплекса, забезпечуючи одержання сигналу від мішені. Якщо з непорівнянною матрицею, що містить послідовність, ідентичну порівнянній матриці, за винятком однонуклеотидної варіабельності, гібридизується один й той самий PTO, то розщеплення PTO може відбуватися в сайті, розташованому на відстані двох нуклеотидів в 3'-напрямку від 5'-кінця 3'-кінцевої ділянки PTO, що впізнає мішень. 3'-Кінець фрагмента PTO містить ще один розщеплюваний нуклеотид крім нуклеотиду, комплементарного з урахуванням даної однонуклеотидної варіабельності. Коли сайт CTO, гібридизованого з додатковим розщеплюваним нуклеотидом, конструюють таким, щоб він містив послідовність, некомплементарну цьому додатковому розщеплюваному нуклеотиду, 3'-кінець фрагмента PTO не гібридизується з CTO, результатом чого є відсутність якого-небудь подовження фрагмента PTO в регульованих умовах. Навіть якщо фрагмент PTO подовжується з утворенням подовженого дуплекса, даний дуплекс характеризується величиною Т пл, відмінною від такої для дуплекса, утворюваного в результаті гібридизації між PTO та непорівнянною матрицею. Відповідно до кращого втілення, сайт розщеплення PTO, що містить послідовність, комплементарну з урахуванням даної варіабельності нуклеотидів у своїй 5'-кінцевій частині 3'кінцевої ділянки, що впізнає мішень, буде різним в залежності від того, чи відбувається гібридизація з порівнянною матрицею або з непорівнянною матрицею, у зв'язку з чим фрагмент PTO, що вивільняється в результаті будь-якої з цих двох подій гібридизації, має різну послідовність, краще, у своїй 3'-кінцевій частині, ще краще, на своєму 3'-кінці. Відповідно до кращого втілення, вибор нуклеотидної послідовності в CTO з урахуванням разниці в 3'-кінцевих частинах фрагментів PTO дозволяє відрізнити порівнянну матрицу від непорівнянної матриці. Відповідно до кращого втілення, використовувана в даному винаході нуклеїновокислотна послідовність-мішень є попередньо ампліфікованою нуклеїновокислотною послідовністю. Використання попередньо ампліфікованої нуклеїновокислотної послідовності дає можливість значно підвищити чутливість та специфічність детекції мішені за даним винаходом. Відповідно до кращого втілення, спосіб здійснюють в присутності розташованого "вниз по течії" праймера. 22 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переваги даного винаходу можуть бути особливо відзначені при одночасній (множинній) детекції принаймні двох нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. Відповідно до кращого втілення, спосіб здійснюють з метою детекції принаймні двох типів (краще, принаймні трьох типів, ще краще, принаймні п'яти типів) нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. Відповідно до кращого втілення, спосіб здійснюють з метою детекції принаймні двох типів (краще принаймні трьох типів, ще краще, принаймні п'яти типів) нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней; причому розташований "угору по течії" олігонуклеотид включає принаймні два типи (краще, принаймні три типи, ще краще, принаймні п'ять типів) олігонуклеотидів, PTO включає принаймні два типи (краще, принаймні три типи, ще краще, принаймні п'ять типів) PTO, а CTO включає принаймні один тип (краще, принаймні два типи, ще краще, принаймні три типи, ще краще, принаймні п'ять типів) CTO; при цьому коли присутні принаймні два типи нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, даний спосіб забезпечує одержання принаймні двох типів сигналів від мішеней, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. 5'-Кінцеві ділянки, що мітять, принаймні двох PTO можуть мати ідентичні одна одній послідовності. Наприклад, якщо даний винахід здійснюють для скринінгу нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, то 5'-кінцеві ділянки PTO, що мітять, можуть мати ідентичні послідовності. Крім того, один тип CTO можна використовувати для детекції множини нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. Наприклад, коли для скринінгу нуклеїновокислотних послідовностеймішеней застосовують PTO, що містять ідентичну послідовність у своїх 5'-кінцевих ділянках, що мітять, можна використовувати один тип CTO. Відповідно до кращого втілення, подовжені дуплекси, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, мають відмінні одна від одної величини Тпл. Відповідно до кращого втілення, принаймні два типи сигналів від мішеней, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, створюються за допомогою відмінних одна від одної типів міток. Відповідно до кращого втілення, принаймні два типи сигналів від мішеней, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, створюються за допомогою міток одного й того самого типу. Відповідно до кращого втілення, принаймні два типи сигналів від мішеней, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, створюються за допомогою міток одного й того самого типу; при цьому подовжені дуплекси, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, мають відмінні одна від одної величини Тпл. Використовуваний в даному описі термін "різні типи міток" стосується міток з різними характеристиками детектованих сигналів. Наприклад, FAM та TAMRA як флуоресцентні репортерні мітки, розглядаються як різні типи міток, оскільки довжини хвиль збудження та емісії для них відрізняються одна від одної. Коли даний винахід здійснюють з метою одночасної детекції принаймні двох типів нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней з використанням аналізу кривої плавлення, і подовжені дуплекси, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, мають відмінні одна від одної величини Т пл, можна здійснити детекцію принаймні двох типів нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней із застосуванням мітки навіть одного типу (наприклад, FAM). Детекція мішені з використанням CTO, іммобілізованого на твердій фазі Значна перевага даного винаходу полягає в ефективній детекції нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней навіть на твердій фазі, такій як мікрочіп. Відповідно до кращого втілення, даний винахід здійснюють на твердій фазі, і CTO іммобілізують на твердій підкладці через його 5'-кінець або 3'-кінець. У випадку використання твердої фази проводять вимірювання сигналу, створюваного на твердій підкладці. Коли застосовують іммобілізований CTO, аналіз плавлення, у якому використовуються описані вище системи міток, є застосовним до реакції на твердій фазі за даним винаходом. Відповідно до кращого втілення, одержання сигналу від мішені забезпечується за допомогою одиночної мітки, з'єднаної з фрагментом, або за допомогою одиночної мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження. Зокрема, якщо даний винахід здійснюють на твердій фазі із застосуванням одиночної мітки, то можна використовувати звичайну флуоресцентну мітку, і не потрібно спеціальної флуоресцентної мітки, здатної 23 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечити сигнали флуоресценції з різними інтенсивностями в залежності від її присутності на дволанцюговій або одноланцюговій структурі. В тому випадку, коли застосовують CTO, іммобілізований на твердій підкладці, можна використовувати хімічні мітки (наприклад, біотин) або ферментативні мітки (наприклад, лужну фосфатазу, пероксидазу, β-галактозидазу та β-глюкозидазу). Для проведення реакції на твердій фазі CTO іммобілізують безпосередньо або опосередковано (краще, опосередковано) через його 5'-кінець або 3'-кінець (краще, 3'-кінець) на поверхні твердої підкладки. Крім того, іммобілізацію CTO на поверхні твердої підкладки можна проводити у ковалентний або нековалентний спосіб. В тих випадках, коли іммобілізовані CTO є CTO, іммобілізованими на поверхні твердої підкладки опосередковано, використовують придатні лінкери. Лінкери, корисні в даному винаході, можуть включати будь-які лінкери, використовувані для іммобілізації зондів на поверхні твердої підкладки. Наприклад, алкільні чи арильні сполуки з амінною функціональною групою або алкільні чи арильні сполуки з тіоловою функціональною групою служать лінкерами для іммобілізації CTO. Крім цього, лінкерами може служити полі(T)-хвіст або полі(A)-хвіст. Відповідно до кращого втілення, тверда підкладка, використовувана в даному винаході, є мікрочіпом. Мікрочіп, який забезпечує дотримання умов реакції в даному винаході, може включати будь-який з мікрочіпів, які відомі фахівцю в даній області. Усі процеси в даному винаході, тобто, гібридизацію з нуклеїновокислотними послідовностями-мішенями, розщеплення, подовження, плавлення та детекцію флуоресценції здійснюють на мікрочіпі. Іммобілізовані на мікрочіпі CTO служать гібридизованими елементами чіпа. Тверда підкладка для виготовлення мікрочіпа включає метали (наприклад, золото, сплав золота та міді, алюміній), оксид металу, скло, керамику, кварц, кремній, напівпроводник, пластинку з Si/SiO 2, германій, арсенид галію, вуглець, вуглецеві нанотрубки, полімери (наприклад, полістирол, поліетилен, поліпропилен та поліакриламід), сефарозу, агарозу та колоїди, без обмеження ними. Більшість використовуваних в даному винаході іммобілізованих CTO може бути іммобілізована на доступній ділянці або двох чи більше доступних ділянках на твердій підкладці, яка може містити 2-1000000 доступних ділянок. Щоб одержати мікрочіп або мікрочіпи для заданого застосування, іммобілізовані CTO можуть бути виготовлені з використанням традиційних технологій виготовлення, таких як фотолітографія, технологія струминного друку, механічне точкове нанесення плям та їх похідні. Згідно з даним винаходом, здійснюваним на твердій фазі, можна проводити одночасну детекцію множини нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней з використанням мітки навіть одного типу, оскільки мітки на іммобілізованих CTO фізично відокремлені одна від одної. В цьому відношенні, кількість нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней за даним винаходом, що підлягають детекції на твердій фазі, є необмеженою. II. Краще втілення з ампліфікацією нуклеїновокислотної послідовності-мішені Даний винахід краще здійснюють одночасно з ампліфікацією нуклеїновокислотної послідовності-мішені, використовуючи пару праймерів, яка складається з розташованого "угору по течії" праймера та розташованого "вниз по течії" праймера, здатних брати участь в синтезі даної нуклеїновокислотної послідовності-мішені. В іншому аспекті даного винаходу запропонований спосіб детекції нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней з ДНК або суміші нуклеїнових кислот в аналізі з PTOCE (розщепленням та подовженням PTO), який включає: (a) гібридизацію нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней з парою праймерів, що складається з розташованого "угору по течії" праймера та розташованого "вниз по течії" праймера, та PTO (олігонуклеотидом, що зондує та мітить); при цьому кожен з праймерів, розташований "угору по течії" праймер та розташований "вниз по течії" праймер, містить нуклеотидну послідовність, що гібридизується, комплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені; PTO містить (1) 3'-кінцеву ділянку, що впізнає мішень, яка містить нуклеотидну послідовність, що гібридизується, комплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені, та (2) 5'-кінцеву ділянку, що мітить, яка містить нуклеотидну послідовність, некомплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені; при цьому 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, а 5'-кінцева ділянка, що мітить, не гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню; PTO локалізований між розташованими "угору по течії" праймером та розташованими "вниз по течії" праймером; при цьому PTO блокований по його 3'-кінцю, щоб не допустити його подовження; (b) приведення в контакт продукту зі стадії (a) з матричною полімеразою нуклеїнових 24 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислот, що виявляє 5'-нуклеазну активність, в умовах, придатних для подовження праймерів та для розщеплення PTO; при цьому, коли PTO гібридизується з нуклеїновокислотними послідовностями-мішенями, розташований "угору по течії" праймер подовжується, і подовжений ланцюг індукує розщеплення PTO матричною полімеразою нуклеїнових кислот, що виявляє 5'-нуклеазну активність, так що в результаті розщеплення вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частина 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить; (c) гібридизацію фрагмента, вивільненого з PTO, з CTO (захоплюючим та матричним олігонуклеотидом); при цьому CTO містить в напрямку 3'→5' (1) захоплюючу ділянку, яка містить нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, або частини 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, та (2) матричну ділянку, яка містить нуклеотидну послідовність, некомплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 3'кінцеву ділянку, що впізнає мішень; при цьому фрагмент, вивільнений з PTO, гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO; (d) проведення реакції подовження з використанням продукту зі стадії (c) та матричної полімерази нуклеїнових кислот; при цьому фрагмент, гібридизований із захоплюючою ділянкою CTO, подовжується з утворенням подовженого дуплекса; причому подовжений дуплекс має величину Т пл, регульовану (1) послідовністю та/або довжиною цього фрагмента, (2) послідовністю та/або довжиною CTO, або (3) послідовністю та/або довжиною фрагмента та послідовністю та/або довжиною CTO; (e) плавлення подовженого дуплекса в діапазоні температур з одержанням сигналу від мішені, що вказує на присутність подовженого дуплекса; при цьому сигнал від мішені забезпечується за допомогою (1) принаймні однієї мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, (2) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, (3) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, та мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, або (4) інтеркалюючої мітки; і (f) детекцію подовженого дуплекса шляхом вимірювання сигналу від мішені; тим самим присутність подовженого дуплекса вказує на присутність нуклеїновокислотної послідовності-мішені. Оскільки в кращому втіленні даного винаходу застосовуються стадії способу за даним винаходом, описаного вище, спільний для них опис опущений, щоб уникнути надмірного дублювання, яке призводить до ускладнення даного опису. Відповідно до кращого втілення, спосіб додатково включає повторення стадій (a)-(b), (a)-(d) або (a)-(f) з денатурацією між повторюваними циклами. Повторення реакцій супроводжується ампліфікацією нуклеїновокислотної послідовності-мішені. Ампліфікацію краще здійснюють відповідно до ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), описаної в патентах США №№ 4683195, 4683202 та 4800159. Відповідно до кращого втілення, спосіб здійснюють для детекції принаймні двох типів нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней. Відповідно до кращого втілення, принаймні два типи сигналів від мішеней, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, створюються за допомогою міток одного й того самого типу; при цьому подовжені дуплекси, що відповідають принаймні двом типам нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней, мають відмінні одна від одної величини Тпл. III. Спосіб детекції мішені з використанням PTOCE, який включає детекцію при попередньо заданій температурі Даний винахід може бути модифікований з метою використання сигналу від мішені, генерованого спільно з утворенням подовженого дуплекса. Ще в одному аспекті даного винаходу запропонований спосіб детекції нуклеїновокислотної послідовності-мішені з ДНК або суміші нуклеїнових кислот в аналізі з PTOCE (розщепленням та подовженням PTO), який включає: (a) гібридизацію нуклеїновокислотної послідовності-мішені з розташованими "угору по течії" олігонуклеотидом та PTO (олігонуклеотидом, що зондує та мітить); при цьому розташований "угору по течії" олігонуклеотид містить нуклеотидну послідовність, що гібридизується, комплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені; PTO містить (1) 3'-кінцеву ділянку, що впізнає мішень, яка містить нуклеотидну послідовність, що гібридизується, комплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені, та (2) 5'-кінцеву ділянку, що мітить, яка містить нуклеотидну послідовність, некомплементарну нуклеїновокислотній послідовності-мішені; при цьому 3'-кінцева ділянка, що впізнає мішень, гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, а 5'-кінцева 25 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянка, що мітить, не гібридизується з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню; розташований "угору по течії" олігонуклеотид локалізований "угору по течії" відносно PTO; (b) приведення в контакт продукту зі стадії (a) з ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність, в умовах, придатних для розщеплення PTO; при цьому розташований "угору по течії" олігонуклеотид або його подовжений ланцюг індукує розщеплення PTO ферментом, що виявляє 5'-нуклеазну активність, так що в результаті розщеплення вивільняється фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, або частину 5'кінцевої ділянки PTO, що мітить; (c) гібридизацію фрагмента, вивільненого з PTO, з CTO (захоплюючим та матричним олігонуклеотидом); при цьому CTO містить в напрямку 3'→5' (1) захоплюючу ділянку, що містить нуклеотидну послідовність, комплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, або частині 5'-кінцевої ділянки PTO, що мітить, та (2) матричну ділянку, що містить нуклеотидну послідовність, некомплементарну 5'-кінцевій ділянці, що мітить, та 3'кінцевій ділянці PTO, що впізнає мішень; при цьому фрагмент, вивільнений з PTO, гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO; (d) проведення реакції подовження з використанням продукту зі стадії (c) та матричної полімерази нуклеїнових кислот; при цьому фрагмент, гібридизований із захоплюючою ділянкою CTO, подовжується з утворенням подовженого дуплекса; причому подовжений дуплекс має величину Т пл, регульовану (1) послідовністю та/або довжиною цього фрагмента, (2) послідовністю та/або довжиною CTO, або (3) послідовністю та/або довжиною фрагмента та послідовністю та/або довжиною CTO; при цьому подовжений дуплекс забезпечує одержання сигналу від мішені за допомогою (1) принаймні однієї мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, (2) мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, (3) принаймні однієї мітки, з'єднаної з фрагментом та/або CTO, та мітки, вбудовуваної в подовжений дуплекс під час реакції подовження, або (4) інтеркалюючої мітки; і (e) детекцію подовженого дуплекса шляхом вимірювання сигналу від мішені при попередньо заданій температурі, при якій подовжений дуплекс зберігає свою дволанцюгову форму; тим самим присутність подовженого дуплекса вказує на присутність нуклеїновокислотної послідовності-мішені. Оскільки в кращому втіленні даного винаходу застосовуються стадії описаного вище способу за даним винаходом, за винятком стадії плавлення, спільний для них опис опущений, щоб уникнути надмірного дублювання, яке призводить до ускладнення даного опису. В даному винаході, що використовує описаний вище аналіз плавлення, необхідна детекція сигналів від міток не менш ніж при двох різних температурах, тому що сигнал від мішені одержують у вигляді зміни сигналу, спостережуваного при плавленні подовженого дуплекса. В цьому аспекті даного винаходу малоймовірно, що подовжений дуплекс як такий видасть сигнал, за допомогою якого можна відрізнити, відбулося чи не відбулося утворення подовженого дуплекса, і цей сигнал детектують при попередньо заданій температурі, при якій подовжений дуплекс зберігає свою дволанцюгову форму; тим самим встановлюють присутність нуклеїновокислотної послідовності-мішені. Даний винахід стосується вимірювання сигналу від мішені, зв'язаного з утворенням подовженого дуплекса, для детекції присутності нуклеїновокислотної послідовності-мішені. В даному винаході подовжений дуплекс містить мітку, завдяки чому подовжений дуплекс забезпечує одержання сигналу від мішені. Краще, сигнал від мішені є сигналом (генерацією сигналу або гасінням сигналу) від мітки на подовженому дуплексі при попередньо заданій температурі. Введення мітки в даному винаході може бути здійснене у такий саме спосіб, як і для описаного вище способу з використанням аналізу плавлення. Цей аспект даного винаходу з невеликими змінами щодо детекції при попередньо заданій температурі може бути проілюстрований на Фіг. 2-13. Робочий принцип, покладений в основу одержання сигналу від мішені від подовженого дуплекса, виглядає так: (1) подовження фрагмента індукує зміну сигналу від мітки, що дає сигнал від мішені; або (2) гібридизація фрагмента та CTO індукує зміну сигналу від мітки, що дає сигнал від мішені, а подовжений дуплекс зберігає сигнал від мішені. Пояснене прикладом втілення робочого принципу (1) можна описати з посиланням на Фіг. 9. Якщо використовують іммобілізовані CTO, то в даному винаході детектують множину 26 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїновокислотних послідовностей-мішеней у суттєво більш ефективний спосіб. Матрична ділянка іммобілізованого CTO містить репортерну молекулу та молекулу-гасник. Репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розташовуються близько одна до одної, що дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули. В тому випадку, коли цей фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO, молекула-гасник гасить сигнал від репортерної молекули. В результаті утворення подовженого дуплекса репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули. Сигнал від мішені доставляється на стадії подовження (C та D на Фіг. 9). Зображений на Фіг. 9 гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, не утворює подовженого дуплекса. Внаслідок цього, молекула-гасник, як і раніше, може гасити сигнал від репортерної молекули. Цей гібрид не дає сигналу, який не відноситься до мішені. Пояснене прикладом втілення робочого принципу (2) можна описати з посиланням на Фіг. 6. На даному малюнку проілюстрований аспект даного винаходу, а також спосіб з використанням аналізу плавлення. 5'-Кінцева ділянка PTO, що мітить, містить репортерну молекулу та молекулу-гасник. Репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розташовуються близько одна до одної, що дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули. PTO, гібридизований з нуклеїновокислотною послідовністю-мішенню, переварюється, вивільняючи фрагмент, який містить 5'-кінцеву ділянку, що мітить, з репортерною молекулою та молекулою-гасником, і цей фрагмент гібридизується із захоплюючою ділянкою CTO. В результаті гібридизації репортерна молекула та молекула-гасник конформаційно розділяються, що не дозволяє молекулі-гаснику гасити сигнал від репортерної молекули. Сигнал від мішені доставляється на стадії гібридизації фрагмента, а подовжений дуплекс зберігає сигнал від мішені (C та D на Фіг. 6). Зображений на Фіг. 6 гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, дає сигнал, який не відноситься до мішені (C та D на Фіг. 6), і необхідно провести дисоціацію цього гібрида, щоб виключити сигнал, який не відноситься до мішені. Внаслідок цього температура для вимірювання сигналу від мішені визначається температурою, необхідною для дисоціації гібрида. Відповідно до кращого втілення, далі цю температуру визначають з урахуванням величини Тпл для гібрида. Відповідно до кращого втілення, детекцію подовженого дуплекса можна здійснювати при температурах, при яких гібрид дисоційований частково. Попередньо задана температура перевищує величину Тпл для гібрида мінус 10 °C, краще, перевищує величину Т пл для гібрида мінус 5 °C, ще краще, перевищує величину Т пл для гібрида, і навіть ще краще, перевищує величину Т пл для гібрида плюс 5 °C. Відповідно до кращого втілення, сигнал від мішені, забезпечуваний подовженим дуплексом, доставляється під час стадії подовження (d); при цьому гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, не дає сигналу, який не відноситься до мішені, як представлено на Фіг. 2-4 та 9-11. Відповідно до кращого втілення, сигнал від мішені, забезпечуваний подовженим дуплексом, доставляється в результаті гібридизації фрагмента та CTO на стадії (c), а утворення подовженого дуплекса зберігає сигнал від мішені на стадії (d); при цьому гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, дає сигнал, який не відноситься до мішені; при цьому попередньо задана температура перевищує величину Т пл для гібрида, як представлено на Фіг. 5-8 та 12-13. Коли гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, дає сигнал, який не відноситься до мішені (панель D на Фіг. 6), необхідно провести дисоціацію цього гібрида, щоб виключити сигнал, який не відноситься до мішені. Внаслідок цього температура для вимірювання сигналу від мішені визначається температурою, необхідною для дисоціації гібрида. Системи міток, корисні в цьому винаході, будуть обговорені більш детально нижче. (1) Мітка, з'єднана з фрагментом та/або CTO (1-1) Система двох взаємодіючих міток У втіленні, яке стосується системи двох взаємодіючих міток, CTO містить систему двох взаємодіючих міток, яка складається з репортерної молекули та молекули-гасника; при цьому подовження фрагмента на стадії (d) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені. Перше втілення такої системи двох взаємодіючих міток проілюстроване на Фіг. 2. Сигнал від мішені доставляється синхронізовано з генерацією сигналу при подовженні. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник можуть бути розташовані на матричній ділянці CTO. Відповідно до кращого втілення, одна з молекул на CTO, репортерна молекула або молекула-гасник, розташована на його 5'-кінці або на відстані 1-5 нуклеотидів від його 5'-кінця, а 27 UA 110815 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інша розташована так, щоб гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснювалося в залежності від конформації CTO. У втіленні, яке відноситься до системи двох взаємодіючих міток, CTO містить систему двох взаємодіючих міток, яка складається з репортерної молекули та молекули-гасника; при цьому гібридизація фрагмента та CTO на стадії (c) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені, а подовжений дуплекс зберігає сигнал від мішені. Відповідно до кращого втілення, репортерна молекула та молекула-гасник можуть бути розташовані на захоплюючій ділянці CTO. Відповідно до кращого втілення, одна з молекул на CTO, репортерна молекула або молекула-гасник, розташована на його 3'-кінці або на відстані 1-5 нуклеотидів від його 3'-кінця, а інша розташована так, щоб гасіння та негасіння сигналу від репортерної молекули здійснювалося в залежності від конформації CTO. В цьому втіленні гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, дає сигнал, який не відноситься до мішені; причому температуру для вимірювання сигналу від мішені визначають з урахуванням величини Т пл для гібрида. У втіленні, яке відноситься до системи двох взаємодіючих міток, фрагмент містить систему двох взаємодіючих міток, яка складається з репортерної молекули та молекули-гасника; при цьому гібридизація фрагмента та CTO на стадії (c) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені, а подовжений дуплекс зберігає сигнал від мішені. Перше втілення такої системи двох взаємодіючих міток проілюстроване на Фіг. 6. Відповідно до кращого втілення, одна з молекул на фрагменті, репортерна молекула або молекула-гасник, розташована на його 5'-кінці або на відстані 1-5 нуклеотидів від 5'-кінця фрагмента, а інша розташована так, щоб гасіння сигналу від репортерної молекули здійснювалося в залежності від конформації фрагмента. В цьому втіленні гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, дає сигнал, який не відноситься до мішені; причому температуру для вимірювання сигналу від мішені визначають з урахуванням величини Т пл для гібрида. У втіленні, яке відноситься до системи взаємодіючих міток, фрагмент містить одну з двох взаємодіючих міток, які включають репортерну молекулу та молекулу-гасник, а CTO містить іншу з двох взаємодіючих міток; при цьому гібридизація фрагмента та CTO на стадії (c) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені, а подовжений дуплекс зберігає сигнал від мішені. Таке втілення системи двох взаємодіючих міток проілюстроване на Фіг. 8. Репортерна молекула та молекула-гасник можуть бути розташовані в будь-якому місці фрагмента PTO та CTO, за умови, що сигнал від репортерної молекули гаситься молекулоюгасником. Згідно з даним втіленням, репортерна молекула або молекула-гасник на фрагменті PTO розташована краще на його 5'-кінці. Згідно з даним втіленням, репортерна молекула або молекула-гасник на CTO розташована краще на його 5'-кінці. В цьому втіленні гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені; причому температуру для вимірювання сигналу від мішені визначають з урахуванням величини Т пл для гібрида. (1-2) Одиночна мітка У втіленні, яке відноситься до системи з одиночною міткою, CTO містить одиночну мітку, і подовження фрагмента на стадії (d) індукує зміну сигналу від цієї одиночної мітки з одержанням сигналу від мішені. Таке втілення системи з одиночною міткою проілюстроване на Фіг. 3. Сигнал від мішені доставляється синхронізовано з генерацією сигналу при подовженні. Згідно з даним втіленням матрична ділянка CTO помічена одиночною міткою. У втіленні, яке відноситься до системи з одиночною міткою, CTO містить одиночну мітку, і гібридизація фрагмента та CTO на стадії (c) індукує зміну сигналу від системи двох взаємодіючих міток з одержанням сигналу від мішені, а подовжений дуплекс зберігає сигнал від мішені. Згідно з даним втіленням захоплююча ділянка CTO помічена одиночною міткою. В цьому втіленні гібрид, утворений нерозщепленим PTO та CTO, забезпечує одержання сигналу, який не відноситься до мішені; причому температуру для вимірювання сигналу від мішені визначають з урахуванням величини Т пл для гібрида. У втіленні, яке відноситься до системи з одиночною міткою, фрагмент містить одиночну мітку, і гібридизація фрагмента та CTO на стадії (c) індукує зміну сигналу від системи двох 28