Застосування n-стеароїлетаноламіну як речовини з активною антигрипозною, антивірусною, антинейрамінідазною, інтерфероніндукуючою та антигемаглютинуючою дією та засіб для профілактики та лікування грипозної інф

Реферат: Застосування N-стеароїлетаноламіну як речовини з активною антигрипозною, антивірусною дією, засіб з антинейрамінідазною, інтерфероніндукуючою та антигемаглютинуючою дією для профілактики та лікування грипозної інфекції належить до медицини, зокрема до вірусології та інфекційних захворювань, і можуть бути використані для профілактики та лікування грипу. Застосування N-стеароїлетаноламіну як речовини з активною антигрипозною, антивірусною дією показано на клітинах МДСК (культура клітин нирки собаки) (банк культур клітин лабораторії експериментальної хіміотерапії вірусних інфекцій, ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського" НАМН України). За показниками максимально переносимої концентрації, мінімальної активної концентрації по відношенню до вірусу грипу та хіміотерапевтичного індексу N-стеароїлетаноламін належить до речовин з активною антигрипозною дією. Засіб з антинейрамінідазною, інтерфероніндукуючою та антигемаглютинуючою дією на основі N-стеароїлетаноламіну для профілактики та лікування грипозної інфекції типу H1N1 використовують шляхом застосування його в інтраназальній та ін'єкційній формах. Індекс UA 104650 C2 (12) UA 104650 C2 -9 протигрипозної ефективності NSE складає 100 % у дозі 0,2 мл 10 М при лікувальній схемі -8 введення та в дозі 0,2 мл 10 М при профілактичній схемі введення. N-стеароїлетаноламін є ефективним вітчизняним засобом для профілактики та лікування грипу шляхом блокування поверхневих глікопротеїнів вірусу грипу, інгібування його нейрамінідазної активності та індукування продукції гамма- та альфа-інтерферонів, захисту клітин від атипової проліферативної активності, не втрачає своєї противірусної активності протягом тривалого часу (до 5 діб). UA 104650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Винахід належить до медицини, зокрема до вірусології та інфекційних захворювань, і може бути використаний для профілактики та лікування грипу. Грип є епідемічним вірусним захворюванням, причиною важких ускладнень і, навіть, смерті. Для запобігання цього захворювання та його ускладнень використовують актуальні протигрипозні вакцини та антивірусні препарати. Часто застосування противірусних препаратів супроводжується появою побічних наслідків і є ефективним лише проти певного штаму вірусу грипу. Так відомо застосування Римантадину, що є похідним Амантадину, для лікування та профілактики грипу. Але Римантадин активний лише проти вірусів грипу А, до того ж, він викликає серйозні побічні ефекти з боку нервової системи, до препаратів цієї групи швидко розвивається стійкість [1]. Відомо, що український препарат Амізон є протигрипозним, протизапальним та жарознижувальним засобом - ненаркотичним анальгетиком з протизапальним ефектом, який знижує жар та має інтерфероногенні й імуномодулюючі властивості [2]. Недоліком Амізону є той факт, що препарат не впливає безпосередньо на віруси. Крім того, застосування Амізону протипоказано дітям віком до 6 років, а також особам із підвищеною чутливістю до препаратів йоду та вагітним жінкам на першому триместрі вагітності. Відомо, що амінокапринова кислота (АКК) належить до групи інгібіторів протеолізу, які гальмують протеоліз, що впливає на зменшення можливості проникнення вірусів до клітин, наслідком чого є зниження кількості інфекційного вірусу [3]. На моделі експериментального грипу продемонстровано не тільки пряму противірусну, але й позитивну патогенетичну та імуномодулюючу дію АКК. Недоліком застосування АКК є необхідність її комплексного застосування з тим же Амізоном із відповідними побічними ефектами. Найближчим аналогом корисної моделі, що заявляється, за досягнутим лікувальним ефектом за умов грипозної інфекції є противірусний препарат Озельтамівір [4], який належить до групи інгібіторів нейрамінідазної активності вірусу грипу. Озельтамівір блокує нейрамінідазний поверхневий антиген вірусів А і В, захищає від інфікування клітини респіраторного епітелію і запобігає розповсюдженню вірусу в організмі. Недоліками його застосування є значна вартість, побічні ефекти, пов'язані з підвищенням температури, та досить швидкий розвиток резистентності збудника до вказаних препаратів [4]. Крім того, Озельтамівір не рекомендовано використовувати дітям до 1 року, а можна застосовувати лише дітям з вагою не менше 15 кг у віці після 1 року. В основу винаходу, що заявляється, поставлена задача створити ефективний та безпечний засіб з антигрипозною, антивірусною, антинейрамінідазною та інтерфероніндукуючою дією для профілактики та лікування грипозної інфекції. Задачу винаходу, що заявляється, вирішують шляхом застосування Nстеароїлетаноламіну (NSE) як речовини з активною антигрипозною, антивірусною, антинейрамінідазною та інтерфероніндукуючою дією для створення на основі NSE ефективного та безпечного засобу для профілактики та лікування грипозної інфекції на моделі грипозної пневмонії в мишей при застосуванні його в інтраназальній або ін'єкційній формах для профілактики грипу та лікування хворих, уражених грипозною інфекцією (індекс ефективності в обох випадках складає від 40,0 до 100,0, в залежності від дозування). NSE індукує продукцію гамма- та альфа - інтерферону, пригнічує нейрамінідазну та гемаглютинуючу активність вірусу грипу, не втрачає своєї противірусної активності протягом тривалого часу в порівнянні з найближчим аналогом. N - стеароїлетаноламін має структурну формулу: H HO CH2 CH2 N C O 50 55 R , де R - вуглеводневий ланцюг стеаринової кислоти. NSE - дрібнодисперсний кристалічний порошок білого кольору, масний на дотик, без специфічного запаху та смаку, розчинний в органічних розчинниках, не розчинні у воді, не виділяє токсичних речовин і не створює вибухонебезпечних сумішей. Температура плавлення 98 - 101 °C [5]. Викладене вище ілюструється прикладами. Приклад 1. Протигрипозна активність NSE На клітинах МДСК (культура клітин нирки собаки) (банк культур клітин лабораторії експериментальної хіміотерапії вірусних інфекцій, ДУ "Інститут епідеміології та інфекційних 1 UA 104650 C2 5 хвороб ім. Л.В. Громашевського" НАМН України) визначають максимально переносиму концентрацію (МПК) NSE: в експериментах використовують десять лунок у пластикових плашках із культурою клітин для кожного розведення препарату в поживному середовищі. Планшети з культурою клітин інкубують при температурі 37 °C із подачею 5 % СО2 протягом 5 діб. Щоденно проводять перегляд дослідних та контрольних культур із метою виявлення наявності або відсутності цитопатичної дії (ЦПД) на клітини. Ступінь ЦПД визначають за зміною морфології клітин (закруглення та зморщення клітин, відторгнення від поверхні лунок клітин, що дегенерували) за 4-плюсовою системою від "1+" до "4+". За МПК вважають найбільшу кількість -5 NSE, яка не викликає дегенерацію клітин. МПК NSE становить 10 М (табл. 1). 10 Таблиця 1 Результати визначення МПК NSE Концентрація препарату, М 0 (Інтактний контроль) -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 10 -10 10 15 2+ 2+ Показники цитопатичної дії в лунках 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Згідно з методичними рекомендаціями, речовину або препарат вважають таким, що виявляє противірусну активність, якщо рівень репродукції вірусу під його дією зменшується на 2,0 lg та -6 -7 більше [6] NSE пригнічує репродукцію вірусу грипу на 3,0 lg ID 50 в дозах 10 та 10 М/мл (табл. -7 2), мінімальна активна концентрація (МАК) NSE становить 10 М (табл. 3). Таблиця 2 МАК NSE по відношенню до вірусу грипу Титр вірусу, lg ТЦД50 6,0 6,0 3,0 3,0 6,0 6,0 6,0 20 25 Концентрація препарату 0 (Контроль вірусу) -5 10 M -6 10 М -7 10 М -8 10 M -9 10 М -10 10 М Інгібуюча активність lg ID50 0 3,0 3,0 0 0 0 Хіміотерапевтичний індекс (ХТІ) NSE відносно вірусу грипу визначають шляхом встановлення співвідношення МПК до мінімально активної концентрації (МАК), яка є мінімальною кількістю препарату, що пригнічує розвиток вірусоспецифічної цитопатичної дії на 50 % [6, 7]. Для визначення МАК тест - вірус у дозі 100 ТЦД50 /0,1 мл вносять у культуру клітин МДСК та інкубують протягом 1 год. при температурі 37 °C. Після адсорбції вірусу на клітинах його видаляють, клітини промивають поживним середовищем RPMI- 1640, після чого в підтримуюче середовище (RPMI- 1640+2 % фетальної сироватки) вносять NSE в концентрації -5 -10 від 10 до 10 М. Таблиця 3 Результати визначення МПК, МАК та ХТІ NSE Препарат NSE МПК, М -5 10 МАК, М -7 10 ХТІ 100 Згідно даних табл. 3 за показниками МПК, МАК та ХТІ NSE належить до активних антивірусних речовин. 2 UA 104650 C2 5 10 15 20 25 30 Таким чином, згідно даних табл. 3 за показниками максимально переносимої концентрації, мінімальної активної концентрації по відношенню до вірусу грипу та хіміотерапевтичного індексу N - стеароїлетаноламін стосується активних антивірусних речовин. Приклад 2 Для визначення антигрипозної активності NSE in vivo використовують модель грипозної пневмонії в мишей. Для цієї мети застосовують штам вірусу грипу A/FM/1/47 (H1N1), адаптований до легенів білих мишей, який пройшов 15 пасажів на мишах, інфекційний титр - 4,0 lg LD50. Через 5 діб летальність мишей становить 100 %. Визначення протигрипозної активності NSE in vivo проводять за профілактичною та лікувальною схемами в інтраназальній формі, для цього використовують 92 неімбредні миші (середньоювагою 50 г). Для профілактичної схеми мишам інтраназально одноразово вводять -6 -8 0,2 мл водної суспензії NSE в концентраціях 10 та 10 за 24 год. До інтраназального зараження вірусом грипу, адаптованого до легеневої тканини мишей, в дозі 10 LD 50; для лікувальної схеми мишам інтраназально одноразово вводять 0,2 мл водної суспензії NSE в -6 -8 -10 концентраціях 10 , 10 та 10 М через 24 год. після зараження вірусом грипу, адаптованого до легеневої тканини мишей, в дозі 10 LD50. Одночасно ставлять контроль вірусу грипу для профілактичної та лікувальної схеми дослідів. Облік ефективності дії препарату здійснюють за індексом протигрипозної ефективності пригнічення летальності та інфекційного титру вірусу грипу в легеневій тканині мишей. Оцінку активності NSE проводять шляхом порівняння ступеню летальності в дослідній і контрольній групах. При цьому враховують, що відсоток летальності тварин в контрольній групі через 5 діб становить 100 %. Індекс протигрипозної ефективності (IE) препарату визначають за формулою [6]: КЗ  1 ІЕ   100 % КЗ , КЗ - кратність зменшення кількості мишей (частка від ділення кількості мишей, що де: загинули в дослідній групі, на кількість мишей, що загинули в контрольній групі). Для порівняння використовують відомий і широковживаний препарат Озельтамівір (комерційна назва "Таміфлю"). NSE захищає мишей від летальної грипозної інфекції (при -8 -9 профілактичній та лікувальній схемах введення) в концентраціях 10 та 10 М відповідно (табл. 4) протягом 5 діб. Таблиця 4 Ефект профілактичної та лікувальної дії NSE на моделі експериментальної грипозної інфекції in vivo Умови Концентрація експерименту NSE, М Кількість мишей Із них загинуло Всього (n) тварин % Титр (lg) Індекс Коефіцієнт вірусу ефективності захисту (КЗ) грипу в (IE, %) легенях мишей Профілактична схема Контроль вірусу Таміфлю NSE Контроль вірусу Таміфлю NSE 0 12 12 1000 мкг/мл -6 10 М -8 10 М 10 10 10 0 10 10 1000 мкг/мл -6 10 М -8 10 М -9 10 М 10 10 10 10 3 6 8 0 100 4,0 5,0 1,66 80 40 100,0 1,5 2,0