Спосіб отримання людського інтерферону з використанням наночастинок оксиду церію

Реферат: Винахід належить до мікробіології та медицини, зокрема до способів отримання людського лейкоцитарного інтерферону (інтерферону-α) із застосуванням вірусного індуктора синтезу інтерферону - алантоїсного вірусу хвороби Ньюкасла та наночастинок діоксиду церію. UA 106111 C2 (12) UA 106111 C2 UA 106111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до мікробіології та медицини, зокрема до способів отримання людського лейкоцитарного інтерферону (інтерферону-α) зі застосуванням вірусного індуктора синтезу інтерферону. Відомо, що індукторами інтерферону можуть бути: інактивовані температурою або УФвипроміненням віруси грипу, інші віруси, дволанцюгові РНК, деякі поліаніонні речовини (бактеріальні ендотоксини, полікарбонові кислоти), синтетичні дволанцюгові полірибонуклеотиди та т.д. [1]. Серед вірусів, що використовують для продукції інтерферону, поширеним безпечним індуктором є вірус хвороби Ньюкасла (ВХН), що зовсім нечутливий до противірусної дії інтерферону. Загальновідомі технології виробництва людського лейкоцитарного інтерферону, включають таку послідовність операцій: виділення лейкоцитів з донорської крові, лейкоцитарної або еритроцитарної маси, суспендування їх в поживному середовищі при температурі переважно (37±0,5)°С, додавання до лейкоцитів культивованого у алантоїсній порожнині курячих ембріонів вірус-індуктора ВХН та інкубування переважно при температурі (30±0,5)°С. Після цього відділяють вірус-індуктор, а до осаду лейкоцитів додають живильне середовище і суспензію витримують переважно при (37±0,5)°С протягом 18-20 г. Таким чином відбувається біосинтез інтерферону в лейкоцитах і накопичення його в живильному середовищі. Відомий російський "Регламент производства человеческого лейкоцитарного интерферона" [2], згідно з яким вірус-індуктор виготовляють шляхом культивування штаму "Н" ВХН у 9-104 денних курячих ембріонах. Інфікуюча доза вірусу, яка становить 10 ЦПД50/мд (цитопатична доза вірусу, яка викликає пошкодження або загибель 50 % інфікованої культури), вводиться в алантоїсну порожнину ембріона шприцом з дотриманням умов стерильності. Потім ембріони інкубують протягом 48 год. при 37±0,5 °C. Після інкубування ембріони охолоджують при 4 °C і відкачують алантоїсну рідину, яка використовується як вірус-індуктор інтерферону. Лейкоцити суспендують у живильному середовищі при температурі 37±0,5 °C, додають вірус-індуктор та інкубують при 30±0,5 °C. Після цього відділяють вірус-індуктор, а до осаду лейкоцитів додають живильне середовище і суспензію витримують при 37±0,5 °C протягом 18-20 годин. Синтезований таким чином і накопичений в живильному середовищі інтерферон має противірусну активність 800-1000 МО (міжнародних одиниць) в 1 мл препарату. З метою збільшення продукції інтерферону може бути додана так звана стадія праймінгу, під час якої суспензію лейкоцитів витримують при 37 °C протягом 2-10 годин у живильному середовищі, що містить 100-200 од./мл людського лейкоцитарного інтерферону та 0,0015 од./мл інсуліну, додають вірус-індуктор на 1-2 години, потім видаляють вірус-індуктор, а до осаду лейкоцитів додають живильне середовище і суспензію витримують при 37 ºС протягом 18-20 годин, надосадову рідину, що містить інтерферон, піддають інактивації. Введення стадії праймінгу значно підвищує продукцію інтерферону лейкоцитами, а противірусна активність інтерферону, отриманого цим способом, становить 4000-5000 МО/мл. Відомий спосіб підвищення продукції інтерферону [3], у якому стадію праймінгу проводять в умовах поступовою підвищення температури суспензії з 20 °C до (36,6±0,1)°С протягом 4-6 годин, що дає можливість ще вдвічі підвищити вихід інтерферону порівняно з [2]. Відомий [4] спосіб отримання людського лейкоцитарною інтерферону, у якому для індукції використовують алантоїсний ВХН, очищений і концентрований методом ультрафільтрації на мембранах з розміром пор 0,1-0,45 мм. Противірусна активність отриманого у такий спосіб інтерферону складає 8000-10000 МО на мл. Цей метод дозволяє виключити з регламентної технології етап центрифугування після стадії індукції та вести біосинтез інтерферону одночасно з індукцією без зміни живильного середовища. Однак отриманий цим способом інтерферон характеризується нестабільними значеннями титру активності, а індуктор має високу інфекційність, що викликає загибель до 40 % клітин-продуцентів інтерферону вже в першу годину після додавання вірусу. Але центрифугування у виробництві виявляється трудомісткою багатоступінчатою та витратною операцією, допускає можливість травмування лейкоцитів, що може призвести до зниження продукції інтерферону. Способи [2-4] є аналогами запропонованого технічного рішення. Прототипом способу, що пропонують автори винаходу, є відомий спосіб отримання людського лейкоцитарного інтерферону [5], в якому також використано очищення і концентрування вірусу методом ультрафільтрації на мембранах з розміром пор 0,1-0,45 мм, біосинтез інтерферону проводять одночасно з індукцією без зміни живильної о середовища, але додатково для індукції використовують холодоадаптований ВХН, отриманий через послідовні до 30 пасажі у курячих ембріонах при температурі нижче 35 °C. Спосіб дозволяє отримати 1 UA 106111 C2 5 10 15 20 25 30 інтерферон зі стабільними значеннями титру противірусної активності 11000-14000 МО/мл та знизити відсоток загибелі клітин, що продукують інтерферон, до 25 %. Суть способів отримання інтерферону за допомогою вірусного індуктора полягає у контрольованому зараженні безпечним для людини вірусом лейкоцитів людської крові, які у відповідь на проникнення вірусів продукують інтерферон, але самі лейкоцити при цьому гинуть. Для розуміння особливостей способів отримання інтерферону дуже важливо, що перші молекули інтерферону з'являються лише через декілька годин (див. наприклад рівень інтерферонової відповіді на введення російського препарату Аллокін-альфа, http://www.allokin.ru/specialist/mechanism-of-action/induction) після інфікування лейкоцитів вірусами. Перелічені відомі рішення способів-аналогів спрямовані на прискорення початку та інтенсивності індукції синтезу інтерферону, а також на зменшення відсотка загибелі клітин, що продукують інтерферон, тобто на зниження цитопатичної дії вірусу-індуктора. Недоліками аналогів та прототипу є те, що зниження цитопатичної дії вірусу-індуктора та підвищення виходу інтерферону досягається через досить складну та витратну послідовність технологічних операцій, не виключена можливість травмування лейкоцитів, продуктивність способів недостатньо висока. Задачею запропонованого винаходу є підвищення виходу інтерферону за спрощеною процедурою зниження цитопатичної дії вірусу-індуктора після початку продукції інтерферону. Авторами запропонованого винаходу була показана можливість зменшення цитопатичної активності вірусів за допомогою універсального фізичного механізму взаємодії між вірусами та наночастинками, який не пов'язаний з хімічними властивостями наночастинок та вірусів [6]. Спільною для вірусів особливістю є наявність протеїнової білкової оболонки, в багатьох випадках сферичної форми, всередині якої міститься вірусна нуклеїнова кислота (ДНК або РНК). Це означає, що вірус як ціле може розглядатись як нанорозмірний об'єкт з достатньо великими значеннями нелінійної поляризованості. Якщо поблизу вірусу буде розташована поляризована наночастинка з розмірами порядку або меншими за лінійні розміри вірусу, з дуже великою вірогідністю між вірусом та частинкою виникне взаємодія, яка обумовлена флуктуаційними полями. Нелінійна взаємодія дипольних моментів наночастинки та вірусу призводить до утворення потенціалу, що на великих відстанях має характер притягування, а на відстанях порядку розмірів цих об'єктів - відштовхування, з утворенням достатньо глибокої потенційної ями. Залежність такого потенціалу U від відстані між частинками d виглядає так:  An Bn   6n  3n  d , n 2,3  d де Аn та Вn - коефіцієнти, що залежать від розмірів, форми та матеріалу частинок. Характерною особливістю такого потенціалу є те, що його мінімум формується на відстанях порядку двох-трьох діаметрів наночастинки de (кресл…). Система вірус-наночастинка, де наночастинка має радіус декілька манометрів, а вірус десятки нанометрів, знаходиться у стабільному стані, коли наночастинка розташовується на відстані ~10 нм від вірусної оболонки. Стабільною буде також система вірус-декілька наночастинок, якщо певна кількість наночастинок розташовується навкруги вірусу на вказаній відстані. Потенційна енергетична яма тим глибше, тобто міцність взаємодії вірусу з наночастинкою тим вище, чим менше розмір наночастинки та чим більше її поляризованість. Взагалі поляризованість діелектриків характеризується безрозмірною величиною діелектричною проникністю. Діелектрики з високою діелектричною проникністю - це оксиди металів, наприклад, ZrO2 і НfO2 Ta2O5, або складні оксидні сполуки: ВаTіО3, SrTiO3, BaSrTiO3. Діелектрична проникність масивних матеріалів змінюється від одиниць до десятків тисяч: у SiO2 вона дорівнює 3,9; Аl2О3-9, BaSrTiO3-300. Діелектрична проникність оксиду церію СeО2-26, кристалів СеАlO3-3000-10000. Стабільність утворених комплексів вірус/наночастинки означає, що вірус з наночастинками переміщуються разом у будь-якому середовищі, яким можуть вода, дисперсний розчин або колоїд, рідина, що містить білок, суспензія лейкоцитів, фізіологічний сольовий розчин тощо. Взаємодія вірусу з наночастинками може бути резонансною - так званий конфігураційний резонанс, що призведе до аномально ефективного поглинання системою "вірус-наночастинка" енергії вакууму або будь-якої зовнішньої енергії. Оцінки вказаної енергії для системи, що складається з вірусу розміром ~100 нм та наночастинки розміром ~10 нм, дають величину від 0,003 до 0,3 еВ. Поглинання такої енергії Ud  35 40 45 50 55  2 UA 106111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 має призводити до незворотних перетворень в структурі вірусу, та відповідного зменшення або взагалі знешкодження патогенності вірусу. Запропонований новий механізм взаємодії вірусів з наночастинками на основі ефекту підсилення локального електромагнітного поля, притаманного тільки нанорозмірним фізичним системам, є універсальним, не залежить від форми і структури наночастинки та вірусу. Поле вакуумних флуктуацій, яке завжди існує у будь-якій фізичній системі, з великою вірогідністю впливає на вірус навіть за відсутності зовнішнього опромінення. Дуже важливий практичний висновок полягає ще й у тому, що через запропонований механізм буде взаємодіяти з вірусом наночастинка будь-якої речовини, незалежно від її хімічної природи, ступінь взаємодії залежить тільки від ступеня поляризації наночастинки. Знешкодження вірусної активності може відбуватись до проникнення вірусу всередину живої клітини та всередині клітини. Механізм знешкодження є таким: a. Стала система "вірус-наночастинка" має геометричні характеристики, відмінні від характеристик окремого вірусу. Оскільки здатність вірусу проникати через клітинну мембрану суттєво визначається геометричним фактором, вірус з приєднаною наночастинкою (або декількома наночастипками) втрачає можливість проникнення всередину клітини і тим самим його інфекційна активність зменшується; b. Завдяки дії локального поля на рецептори, що знаходяться на поверхні вірусу, молекулярні групи на рецепторах можуть модифікуватись аж до руйнування. Оскільки рецептори вірусу взаємодіють з відповідними утворенням на клітинній оболонці за принципом комплементарності (взаємодія типу ключ-замок), то будь-яке ушкодження рецептора призводить до неможливості проникнення вірусу всередину клітини; с. Дія локального поля на вірусну частинку може носити характер термічної дії. Через локальний нагрів вірусної капсиди остання може втрачати свої властивості і тим самим активність вірусу знижується; d. Якщо всередину клітини проникає вірус з локалізованою на ньому наночастинкою (або декількома наночастинками) дія локального ноля, яке має флуктуаційне походження, на систему "вірус-наночастинка" знову може реалізуватись за механізмами а. - с; e. Існує можливість блокування наночастинками процесів реплікації вірусної ДНК всередині клітини. Таким чином, взаємодія між наночастинкою та вірусом призведе до сильного зменшення вірусної активності. Щодо вибору речовини, з якої можуть бути виготовлені наночастинки, то головними вимогами мають бути її нетоксичність для людини та достатньо висока діелектрична проникність. Існує ряд речовин, наночастинки яких не мають токсичної дії та навіть корисні для живого. Наприклад, наночастинки оксидів заліза Fе2О3 у дозах 2-6 мкг/кг навіть стимулюють ріст тварин, бактерицидну активність сироватки крові, зростання загального білка у крові. Оксиди ітрію забезпечують захист нервових клітин від окислювального стресу, при цьому прояв захисного ефекту не залежить від розміру наночастииок. Наночастинки оксидів ітрію виступають безпосередньо як антиоксиданти і зменшують вміст згубних для клітин реакційноздатних кисневмісних сполук. Найбільш корисними для живих істот є наночастинки диоксиду церію СеО2. Наночастинки СеО2 на відміну від наночастинок багатьох інших матеріалів мають навпаки сприятливі для живих клітин властивості. Найбільш малотоксичні наночастинки СеО2 розміром менше 10 нм. Зниження токсичності і зростання антиоксидантної активності наночастинок СеО 2 спостерігається аж до розміру наночастинок 0,6-0,8 нм. Нижче цих розмірів коректно говорити вже про молекулярні або іонні системи. Численні дослідження впливу наночастинок СеО2 на людину свідчать про його дуже низьку токсичність, нанокристалічний оксид церію є безпечним для застосування in vivo, є активним у біохімічних окислювально-відновлюваних процесах у живих клітинах. Діелектрична проникність масивного оксиду церію СеО2 дорівнює 26. Поставлена задача винаходу - підвищення виходу інтерферону за спрощеною процедурою зниження цитопатичної дії вірусу-індуктора після початку продукції інтерферону досягається тим, що у запропонованому способі отримання людського інтерферону, який включає виділення людських лейкоцитів, їх суспендування у живильному середовищі, індукцію алантоїсним вірусом хвороби Ньюкасла, біосинтез інтерферону, інактивацію вірусу-індуктора, після введення у суспензію лейкоцитів розчину алантоїсного вірусу хвороби Ньюкасла, через деякий час, переважно через 2-4 години, у суспензію, яка вже містить лейкоцити і вірус хвороби Ньюкасла, додають наночастинки речовини, яка може бути будь-якою, але з числа речовин, здатних 3 UA 106111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поляризуватись, переважно з числа таких, що не мають токсичного впливу на клітини живого організму, а розмір наночастинок вибирають якнайменшим, але не більше 10 нм. Початковий період часу 2-4 години протягом якого у суспензії разом з лейкоцитами знаходиться вірус-індуктор ВХН, є фактично періодом індукції. Протягом періоду індукції починає з'являтися і виходити у живильне середовище Інтерферон, що синтезують лейкоцити у відповідь на проникнення скрізь клітинну оболонку віруса-індуктора. Після завершення періоду індукції цитопатична дія віруса має бути зменшена, і саме для цього у суспензію додають поляризовані наночастинки, які утворюють стабільні комплекси з вірусом [6]. Новизною запропонованого способу є саме те, що на відміну від прототипу у запропонованому способі що після введення у суспензію лейкоцитів розчину алантоїсного вірусу хвороби Ньюкаслу, через деякий час, переважно через 2-4 години, у суспензію, яка вже містить лейкоцити і вірус хвороби Ньюкасла, додають наночастинки речовини, яка може бути будь-якою, але з числа речовин, здатних поляризуватись, переважно з числа таких, що не мають токсичного впливу на клітини живого організму, а розмір наночастинок вибирають якнайменшим, але не більше 10 нм. Переваги винаходу над прототипом полягають у тому, що у запропонованому способі зниження цитопатичної дії вірусу-індуктора досягається простим додаванням наночастинок вибраної речовини у суспензію лейкоцитів, в яку вже введено алантоїсний вірус-індуктор хвороби Ньюкасла, на відміну від складної та витратної послідовності технологічних операцій у прототипі. Приклад реалізації запропонованого способу. Визначення здатності нанокристалічного діоксиду церію впливати на продукцію інтерферону проводили in vitro в культурі лейкоцитів периферичної крові донорів. До 3 млн. лейкоцитів крові додавали еталонний індуктор інтерферону - вірус хвороби Ньюкасла - та інкубували при 37 °C протягом 24 год., тобто біосинтез інтерферону проходив одночасно з індукцією без зміни живильного середовища. Через 24 години надосадову рідину збирали, доводили її рН до 2,0 та залишали при 4 °C протягом 48 год. Потім рH рідини відновлювали до 7,2 та визначали рівень інтерферону за стандартним методом пригнічення цитопатичної дії вірусу-індикатора (вірус везикулярного стоматиту, штам Індіана) у перещеплюваній культурі Μ19 або L41, в культуральному середовищі RPMI-1640 з 10 % фетальної сироватки (Sigma), як описано у [8]. Для цього культуру клітин в 96-лункових планшетах (Costar, США) обробляли відповідними розведеннями ІФІІ-вмісної рідини, через 18 годин інкубації при 37 °C в присутності 5 % СО2 культуральну рідину видаляли, клітини промивали одноразово розчином Хенкса, заражали вірусом везикулярного стоматиту, штам Індіана (ВВС) з множинністю інфекції 100 ЦПД50/мл. Після інкубації при 37 °C клітини відмивали розчином Хенкса і додавали свіже живильне середовище. Результати визначали через 24-48 годин, коли в контрольному дослідженні з внесеним ВХН відбувалася повна дегенерація клітин, при незмінному моношарі в контрольних лунках культури клітин. За титр інтерферону приймали число, зворотне розведенню препарату, при якому культура клітин в 50 % лунок була повністю захищена від патогенної дії індикаторного вірусу. При вивченні впливу нанокристалічного діоксиду церію використовували наночастинки СеО 2 розміром 2-3 нм з вихідною концентрацією 0,1 М/л (Моль на літр). Умови досліду з застосуванням діоксиду церію були такі: 1 група - наночастинки діоксиду церію вносили одночасно з вірусом хвороби Ньюкасла; 2 група - наночастинки СеО2 вносили через 2 та 4 години після внесення вірусу-індуктору ВХП. Було проведено 6 серій дослідів. Одержані результати представлені у табл. 1. Результати дослідів. Назви горизонтальних рядків у таблиці означають таке: - "Спонтанна продукція" - рівень інтерферону у вихідній суспензії лейкоцитів; - "Контроль церію" - рівень інтерферону після додавання тільки суспензії СеО 2; - "Контроль ВХН" - рівень інтерферону після додавання тільки суспензії ВХН; - "ВХН + СеО2 0 год.» - наночастинки СеО2 вносили одночасно з ВХП; - "ВХН + СеО2-2 год.» - наночастинки СеО2 вносили через 2 години після ВХН; - "ВХН + СеО2-4 год.» - наночастинки СеО2 вносили через 2 години після ВХН. З таблиці видно, що коли суспензію наночастинок додавали через 2 або 4 години після інфікування лейкоцитарної суспензії вірусом хвороби Ньюкасла, максимальний титр інтерферону сягав 12800 МО/мл, що у 8 разів вище, ніж 1600 МО/мл у контрольному дослідженні без додавання наночастинок, та у 4 рази вище, ніж 3200 МО/мл у випадку додавання суспензії наночастинок одночасно з інфікуванням лейкоцитів. Рівень інтерферону 800-1600 МО/мл у контролі ВХН відповідає аналогу [2] без стадії праймінгу. 4 UA 106111 C2 5 10 15 20 Внесення наночастинок СеО2 одночасно з ВХН подвоює вихід інтерферону. Максимальний рівень інтерферону 12800 МО/мл у серіях дослідів "ВХН + СеО 2-2 год." та "ВХН + СеО2-4 год." практично такий самий, яку прототипі [5]. Приклад реалізації доводить дієвість способу отримання людського інтерферону з використанням поляризованих наночастинок через послідовне додавання у суспензію лейкоцитів почергово спочатку суспензії вірусу, потім із затримкою 2-4 години - суспензії наночастинок СеО2. Посилання: 1. Ершов Ф.И., Киселев О.И. - Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). Москва. - 2005 2. "Регламент производства человеческого лейкоцитарного интерферона" N 302-82, 1982 3. Патент РФ "Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона" № 2080873, приоритет от 27.12.1993 4. Патент РФ "Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона" № 2066188, приоритет от 13.04.1993 5. Патент РФ "Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона" № 2140284, приоритет от 06.07.1998 6. Свідоцтово № 44780 від 18.07.2012 р. про реєстрацію авторського права на твір "Антивірусна терапія: взаємодія між вірусними та наночастинками" 8. Спивак Н.Я., Назаренко Л.Н., Михайленко О.Н. Интерферон и система мопонуклеарных фагоцитов, 2002, Киев, Фитосоциоцентр, 166 с. Таблиця Титри інтерферону при додаванні ВХН та наночастинок СеО2 Титр інтерферону МО/мл Серії дослідів 2 3 4 100 0 0 100 0 0 800 800 1600 1600 1600 3200 3200 6400 12800 6400 6400 12800 Препарати 1 2 3 4 5 6 25 30 Спонтанна продукція Контроль СеО2 Контроль ВХН ВХН + СеО2 0 год. ВХН + СеО2-2 год. ВХН + СеО2-4 год. 1 100 100 800 1600 1600 3200 5 100 100 1600 3200 12800 12800 6 0 0 400 800 800 1600 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб отримання людського інтерферону з використанням наночастинок, який включає виділення людських лейкоцитів, їх суспендування у живильному середовищі, індукцію алантоїсним вірусом хвороби Ньюкасла, біосинтез інтерферону, інактивацію вірусу-індуктора, який відрізняється тим, що після введення у суспензію лейкоцитів розчину алантоїсного вірусу хвороби Ньюкасла через проміжок часу 2-4 години у суспензію, яка вже містить лейкоцити і вірус хвороби Ньюкасла, додають наночастинки діоксиду церію, які здатні поляризуватись, не мають токсичного впливу на клітини живого організму і мають розмір наночастинок 2-3 нм, а їх концентрація становить 0,1 М/л. 5 UA 106111 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6