Штам streptomyces violarus, який має комбіновану антагоністичну активність стосовно фітопатогенних мікроорганізмів та нематод

Реферат: Винахід належить до штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027, який виявляє комбіновану антагоністичну активність стосовно нематод та фітопатогенних мікроорганізмів, зокрема, грибів і бактерій. UA 107240 C2 (12) UA 107240 C2 UA 107240 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до нового штаму актиноміцетів, що характеризується високою антагоністичною активністю стосовно фітопатогенної мікрофлори та нематод та може використовуватися для одержання біопрепаратів проти збудників грибних та бактеріальних хвороб рослин, а також нематодозів. Останні 2-3 роки бактеріальні хвороби рослин вийшли на рівень епіфітотій, викликаючи втрати урожаю до 30 %, а в окремих випадках 50-80 %. Має місце розвиток як бактеріозів, так і змішаних інфекцій, викликаних декількома збудниками, зокрема, бактеріомікозів. Фітопатогени, окрім зниження кількості і якості урожаю, сприяють накопиченню в рослинах, особливо в продуктах урожаю, мікотоксинів, небезпечних для здоров'я людини і тварин: знижують імунітет, сприяють зростанню онкологічних захворювань. На сьогодні провідне місце у системі захисту рослин від фітопатогенів та запобігання зниження врожаю посідають хімічні засоби. Проте використання пестицидів призводить до небажаних екологічних наслідків. Розвиток та впровадження екологічно орієнтованих систем сільського господарства, одержання екологічно чистих продуктів є одним з найбільш перспективних напрямків розвитку сучасного сільського господарства. Основна роль у цьому підході належить біопрепаратам на основі корисних мікроорганізмів, які забезпечують захист рослин від фітопатогенів за рахунок екологічно безпечних засобів. Біопрепарати, створені на основі живих культур мікроорганізмів чи продуктів їх метаболізму, є високо ефективними, екологічно безпечними і все ширше впроваджуються в практику сільського господарства. Проте асортимент біологічних засобів захисту рослин, на відміну від хімічних, на сьогоднішній день є недостатнім. Тому одним з важливих напрямків досліджень є створення ефективних та екологічно безпечних біопрепаратів на основі нових штамів мікроорганізмів, зокрема, стрептоміцетів. Стрептоміцети - широко розповсюджена в ґрунті група мікроорганізмів. Вони завжди привертали до себе увагу дослідників, завдяки їх здатності утворювати у процесі життєдіяльності різноманітні біологічно активні речовини. Серед ґрунтових мікроорганізмів стрептоміцети відомі як продуценти біологічно активних сполук, зокрема, антибіотиків. Такі сполуки являються собою макроциклічні лактони, хінони, ароматичні сполуки, аміноглікозиди, пептоліпіди, пептиди, амінокислоти тощо. Спектр їх дії доволі широкий: пригнічення синтезу клітинних оболонок бактерій і грибів, порушення функцій мембран, пригнічення синтезу білків, пуринів, піримідинів, нуклеїнових кислот, енергетичного метаболізму, окислювального фосфорилювання тощо; серед них є також антибіотики антиметаболіти та імунодепресанти. Відомий штам Streptumyces avermitilis ІMB Ас-5015, який є продуцентом авермектинів сполук з антипаразитарною активністю, що використовуються у складі інсектоакаронематоцидних препаратів (UA69639, опубл. 15.08.2006 року). Вказаний штам є основою нематоцидного препарату "Аверком", який ефективний стосовно паразитів рослин, проте не виявляє активності щодо фітопатогенних бактерій. У Росії було одержано штам актиноміцета Streptomyces felleus, що виявляє антагоністичні властивості по відношенню до фітопатогенних грибів (RU2052501, опубл. 20.01.1996 року). Зазначений штам входить до складу біопрепарату Арілін, який використовується для боротьби з фітопатогенними грибами. Вказаний штам є вибраним за прототип даного винаходу. Основним недоліком цього штаму с тс, що його активність направлена на грибкові інфекції у рослин та не проявляється стосовно бактеріальних збудників захворювань. Задача даного винаходу полягає у розширенні спектру антагоністичної активності, направленої проти фітопатогенів, таких, як гриби, бактерії та нематоди. Вказана задача вирішується за рахунок одержання нового штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027, який виявляє комбіновану антагоністичну активність стосовно нематод та фітопатогенних мікроорганізмів, зокрема, грибів і бактерій. Штам Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 було ізольовано у 2009 році з каштанового ґрунту мису Каліакра методом поверхневого розсівання водної суспензії ґрунту. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму: Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 утворює спіральні конідієносці; поверхня спор вкрита шипами. Культура утворює колонії округлої форми складчасті, шкіряні. Забарвлення колоній від біло-рожевого до рожевофіолетового в залежності від складу агаризованого середовища. Культуральні та фізіологобіохімічні властивості наведені в Таблицях 1 та 2. Активність штаму: штам Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 утворює комплекс біологічно активних речовин, що виявляють високу антагоністичну активність проти фітопатогенних бактерій, грибів та нематод. Спосіб, умови та склад середовища для довгострокового зберігання штаму: 1 UA 107240 C2 5 10 15 20 найкраще зберігається у ліофілізованому стані. Штам попередньо вирощують на вівсяному агарі протягом 10-14 діб при 28 °C. Спори і міцелій змивають стерильною водою, змішують з захисним сахарозно-желатозним середовищем (1:1) і ліофілізують в ампулах. Після висушування ампули запаюють і зберігають при кімнатній температурі у темряві. Вівсяний агар (г/л): вівсяні пластівці 20,0; агар 18,0; вода водогінна до 1л; рН 7,2. Сахарозно-желатозне захисне середовище: 30 % - вий розчин сахарози та 10 % - вий розчин желатину готують окремо. Сахарозу стерилізують текучим паром три рази; желатин стерилізують 20 хв. при 1,5 атм, в результаті чого утворюється желатоза. Готові компоненти з'єднують перед застосуванням у співвідношенні 1:1. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму: Streptomyces violarus 1MB Ас-5027 добре росте на багатьох агаризованих (див. Табл.1) та відповідних рідких середовищах при температурі 26-28 °C. Склад рідкого середовища для визначення антагоністичної активності проти фітопатогенних бактерій та грибів (г/л): соєва мука -12,0; дріжджовий автолізат - 4,0; кукурудзяний екстракт - 3,0; СаСО3-4,5; К2НРО4-0,5; глюкоза - 50,0; вода водогінна до 1 л; рН 7,2. Генетичні особливості штаму /ауксотрофність, резистентність до антибіотиків, фагів та т.п.): Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 - типовий гетеротроф - утворює спіральні спороносці (конідієносці) і спори (конідії) з шиловидними виростами. Штам чутливий до рифампіцину, тетрацикліну, фурадоніну, фуразалідону, олеандоміцину, азитроміцину, стрептоміцину, канаміцину, офлоксацину, неоміцину, еритроміцину, поліміксину (зони затримки росту - від 2 до 20 мм), не чутливий до ністатину, ампіциліну, бензилпеніциліну, цефапімому, цефтазидину, метициліну. Таблиця 1 Культуральні властивості штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 Пігментне забарвлення Субстратний міцелій Повітряний міцелій Розчинний пігмент Мінеральний агар (Гаузе-1) Фіолетовий Білий Рожево-фіолетовий РожевоОрганічний агар (Гаузе-2) Темно-фіолетовий Сірувато-білий фіолетовий Глюкозо-нітратний Рожево-бузковий Фіолетово-рожевий Рожевий агар(модиф.Чапека) Картопляно-глюкозний Рожево-фіолетовий Ніжно-рожевий агар (КГА) Гліцерин-аспарагіновий Оранжево-рожевий агар (ГасА) Глюкозо-нітратний агар РожевоФіолетово-карміловий (CP-і) фіолетовий Глюкозо-аспарагіновий Оранжево-рожевий агар (ГлАсА) Сахарозо-нітратний агар Рожевий Блідо-рожевий Блідо-бузковий (Чапека) Гліцерин-нітратний агар Блідо-рожевий (ГНА) РожевоСусло-агар (СА) Блідо-рожевий Білий фіолетовий Органічний агар Праузера Буро-коричневий Білий Жовто-бурий № 79 Дріжджево-солодовий Біло-теракотовий Білосніжний агар (ISP-2) Желатиновий агар (ЖА) Кремовий Білий Яєчно-альбуміновий агар Рожево-білий (ЯА) Білий з рожевим 3 рожевим Вівсяний агар (ISP-3) Оранжево-рожевий відтінком відтінком Середовище 25 2 UA 107240 C2 Таблиця 2 Фізіолого-біохімічні властивості штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 Показник Утилізація джерел вуглецю Утворення меланіну Розрідження желатину Пептонізація молока Коагуляція молока Гідроліз крохмалю Відновлення нітратів Утворення H2S Руйнування клітковини Відношення до антибіотиків 5 10 15 20 25 30 35 Результат спостереження Росте на глюкозі, рамнозі, арабінозі. ксилозі, фруктозі, целюлозі, лактозі, целобіозі, мальтозі, маніті, інозиті, сорбіті; слабо росте на сахарозі, рафінозі, інозиті Не утворює Не розріджує але росте Пептонізує Не коагулює Гідролізує Відновлює до аміаку Не утворює Росте, не руйнує Чутливий до стрептоміцину, канаміцину, офлоксацину, азитроміцину, неоміцину, фуразалідону, рифампіцину, еритроміцину, тетрацикліну, фурадоніну, поліміксину. олеандоміцину; не чутливий до ампіциліну, бензилпеніциліну, цефапімому, цефтазидину, метициліну, цефтазидин. Запропонований згідно з винаходом штам Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 може бути використаний для одержання комплексного біопрепарату, направленого як проти фітопатогенної мікрофлори, так і нематод. Даний винахід може бути проілюстрований приведеними нижче прикладами конкретного здійснення. Приклад 1В експерименті досліджували антагоністичну активність заявленого штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027. Культуру заявленого штаму вирощували на агаризованому або у рідкому середовищі (глибинним способам), при температурі +28±1 °C протягом 10 діб. У першому випадку використовували чашки Нетрі або пробірки (по 20 мл середовища у кожну). У другому випадку культури вирощували на роторних качалках (n=240 об./хв.) у скляних колбах об'ємом 750 мл (50 мл на одну колбу). Посівний матеріал (маточна культура) вирощували впродовж доби і засівали ферментаційне середовище у кількості 5 % від об'єму. Склад агаризованих середовищ для вирощування стрептоміцетів (г/л): Вівсяний агар (ISP-3) - вівсяні пластівці 20; розчин мікроелементів (FeSO4·7H2O-0,1; МnСl2·4Н2О-0,1; ZnSO4·7H2O-0,1 в 100 см3 дистильованої води) 1 мл; агар 18; дистильована вода 1 л; рН 7,2. Вівсяні пластівці заливали гарячою водою на 10 годин, потім доводили до кипіння, відфільтрувати через кілька шарів марлі, поєднували з розплавленим у воді агаром і доводили об'єм до 1 л. Склад рідких поживних середовищ для вирощування стрептоміцетів в умовах глибинного культивування (г/л): - середовище для посівної культури (МС) (г/л): соєве борошно - 15; дріжджі сухі - 5; глюкоза 20; водогінна вода до 1л, рН 6,2; - ферментаційне середовище (ФС 2) (г/л): соєве борошно - 12,0; дріжджовий автолізат - 3,0; кукурудзяний екстракт - 3.0 мл; глюкоза - 70,0; СаСО3-4,5; К2НРO4-0,3; водогінна вода до 1 л, рН 6,8-7,0, стерилізація 0,75 атм 20 хвилин; Фітопатогенні мікроміцети для визначення антагоністичної активності запропонованого штаму вирощували протягом 7 діб у термостаті за температури 28 °C при використанні наступних агаризованих середовищ: Агар Чапека (АЧ) (г/л) - глюкоза - 20; NaNO3-2; К2НРО4-1; MgSO4·7H2O-0,5; КСl-0,5; FeSO40,01; агар - 15; дистильована вода - до 1 л; рН 7,0-7,3, доводили молочною кислотою до рН 5,05,5. Сусло агар (СА) (г/л) - сусло 7° по Баллінгу - 1 л; СаСО3 - 1; агар - 15-25. До відповідної концентрації цукру сусло доводили водогінною водою. Сусло стерилізували при 0,5 атм протягом 20-30 хв., рН 5,3. Фармакопейні бактерії (Basillus subtil is В-901, В. subtil is B-903, Proteus vulgaris, Staphylococus aureus, Eshirihiya coli, Candida albicans) вирощували на м'ясо-пептонному агарі. 3 UA 107240 C2 5 10 15 20 25 30 Антагоністичні властивості стрептоміцетів визначали методом агарових блоків (поверхневе вирощування) або методом циліндриків (глибинне вирощування) (Бурцева С.А., Сирбу Т.Ф., Сланина Т.Ф. Антагонистические свойства новых штаммов микроорганизмов, выделенных из почв Молдовы // Мікробіологія і біотехнологія. 2007. № 1. С. 40-45 або Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д. Г. Звягинцева. - М.: Изд-во Московского университета, 1991.-303 с). Вказані методи базуються на дифузії продуктів метаболізму стрептоміцетів або рідкої культури у поживний агар, засіяний тест-культурою. Тест-культури висівали на поверхню відповідного поживного середовища, розтирали скляним стерильним шпателем для отримання рівномірного суцільного росту, накладали агарові блоки культури стрептоміцету, або розміщували скляні циліндрики, в які вносили по 0,2 мл культуральної рідини чи етанольних екстрактів біомаси стрептоміцета. Про наявність антагоністичної активності стрептоміцету свідчили зони відсутності росту тест-об'єкту навколо блоків після інкубації від 2 до 7 діб у термостаті за температури 28 °C. Вимірювали діаметр зон відсутності росту, мм. У дослідах використовували наступні фітопатогенні бактерії, отримані з колекції відділу Т фітопатогенних бактерій ІMB ПАНУ: Pseudomonas syringae 8511 (УКМ В-1027 ) - збудник захворювань бузку; P. syringae pv. atrofaciens 8291 (УКМ В-1015) - пшениці; Р. syringae pv. atrofaciens 7886 (УКМ В-1016) - пшениці; P. syringae pv. atrofaciens 9129 (УКМ B-1154) - вівса і пшениці; P. syringae pv. coronafaciens 9060 - вівса; P. savastanoipv, glicinea 8571 - сої; P. savastanoi pv. glicinea 8541 (УКМ В-1019) - сої; P. corrugata 9070 - томатів; Xanlhomonas vesicatoriae 7790 - томатів і перцю; X. transhicem 7696 - пшениці; X, axonopodis pv. glycines 9075 (УКМ B-l 162) - сої; X. axonopodis pv. glycines 8609 - сої; Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis 102 - картоплі і томатів; Pantoea agglomerans 8490 - бобових, а також фітопатогенні гриби, отримані з колекції відділу фізіології і систематики мікроміцетів 1MB НАНУ: Aliernaria altemata 16814 - збудник альтернаріозу плодів томатів; Fusarium oxysporum 54201 збудник фузаріозу плодів томатів; F. oxysporum n.33 - збудник кореневої гнилі гороху; Nigrospora oryzae 16864 - збудник нігроспоріозу кукурудзи. Антагоністична активність заявленого штаму Streptomyces violarus 1MB Ас-5027 стосовно фармакопейних культур с представленою у Таблиці 3. Антагоністична активність запропонованого штаму стосовно фітопатогенних мікроорганізмів та грибів представлена у Таблиці 4. Таблиця 3 Антагоністична активність штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 стосовно фармакопейних культур мікроорганізмів Культура стрептоміцету Streptomyces violarus ІMB Ac-5027 Зони відсутності росту тест-культури, мм B. subtilis B B. subtilis B P. vulgaris S. aureus C. albicans 901 903 23,5 26,5 35 4 40,5 32 0 E. coli 33 UA 107240 C2 Таблиця 4 Антагоністична активність штаму Streptomyces violarus ІMB Ac-5027 стосовно фітопатогенних бактерій та грибів Фітопатогенні бактерії та гриби Т Pseudomonas syringae В-1027 P. syringae pv, atrofaciens B-1015 P. syringae pv. atrofaciens B-1016 P. syringae pv. coronafaciens B-1154 P. syringae pv. coronafaciens 9060 P. savastanoi pv. glycinea 8571 (соя) P. savastanoi pv. glycinea B-l 019 P. corrugata 9070 Xanthomonas visicatoriae 7790 X. translucens 7696 X. anoxopodis pv. glycines B-1162 X. anoxopodis pv. glycines 8609 Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis 102 Pantoea agglomerans 8490 Alternaria alternate 16814 Fusarium oxysporum 54201 F. oxysporum n.33 Nigrospora oryzae 16864 Зони відсутності росту тест-культур, мм о/о 0/38 0/14 -* 28/0 0/0 38/0 0/0 12/14 20/0 22/16 28/0 14/18/12 21/17/15/18/12 Примітка: *«-» - не визначали. ** у чисельнику - екстракт з міцелію; у знаменнику - культуральна рідина; 5 10 15 20 25 Приклад 2 Визначення в системах in vitro нематоцидної активності проводили на основі вивчення здатності штаму пригнічувати рухливість нематод у водних розчинах. У дослідах використовували нематоди роду Meloidogyne, які викликають захворювання кореневої системи рослин мелойдогіноз. Живий матеріал отримували з яйцевих мішків, оскільки з яєць з'являються личинки II віку, які однорідні за віком та розміром. Для цього в тепличних умовах вирощували рослини томатів нестійкого до нематод сорту, потім проводили їх зараження личинками галових нематод. Через 40 днів вегетації рослини викопували, а з галів, які утворились на коренях, вилучали яйцеві мішки та отримували живі личинки нематод. Нематоди в кількості 10-20 особин розміщували у комірках мікропланшету, де їх культивували у 100 мкл дистильованої води в присутності етанольних екстрактів біомаси штаму Streptomyces violarus 1MB Ас-5027 протягом 0,5-24 годин при 28+1 °C. Дослід проводили в чотирьохкратній повторності. Через 0,5; 1; 2; 3; 4 та 24 години культивування визначали під мікроскопом: - загальну кількість нематод А; - кількість активно рухомих нематод В; - кількість напіврухомих нематод С; - кількість нерухомих нематод D. Величину показника нематоцидної активності оцінювали за відсотком загибелі нематод, який вираховували за формулою B (C 0,5) (D 0) 1 100 % . (1) A Дані щодо нематоцидної ефективності штаму Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 представлені у Таблиці 5. 5 UA 107240 C2 Таблиця 5 Нематоцидна активність запропонованого штаму у порівнянні із препаратом "Аверком" Варіант Аверком Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 5 % загибелі нематод при різній тривалості інкубації 0,5 год. 1 год. 2 год. 3 год. 4 год. 24 год. 83 95 100 100 100 100 59 67 58 85 81 100 Таким чином, запропонований новий штам Streptomyces violarus ІMB Ас-5027 виявляє виражену комбіновану активність стосовно широкого спектру фітопатогенних мікроорганізмів, а також нематод, що являє собою значну перевагу у порівнянні із відомими технічними рішеннями. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Штам Streptomyces violarus ІMB Ас-5027, який має комбіновану антагоністичну активність стосовно фітопатогенних мікроорганізмів та нематод. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6